zunia.vn

Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z

zunia.vn

» Khoa Học Tự Nhiên

Bài giảng Các phương pháp điện di và chuyển lên màng lai trong phân tích - Trần Nhật Phương

Chia sẻ: Năm Tháng Tĩnh Lặng | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:62

Báo xấu

190
lượt xem 28
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài giảng "Các phương pháp điện di và chuyển lên màng lai trong phân tích" trình bày những nội dung chính sau: Điện di trên Gel, Polyacrylamide Gels, các hệ dung dịch đệm dùng trong điện di Protein, các chất tẩy rửa và chất biến tính, các thiết bị dùng trong điện di,... Mời các bạn cùng tham khảo để có thêm tài liệu phục vụ nhu cầu học tập và nghiên cứu.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Bài giảng Các phương pháp điện di và chuyển lên màng lai trong phân tích - Trần Nhật Phương

Caùc Phöông phaùp ñieän di vaø chuyeån leân maøng lai trong phaân tích Electrophoresis and Blotting methods in Analysis of Biomolecules Ñaïi hoïc Noâng Laâm TP Hoà Chí Minh Thaùng 10/2007 CBGD: Traàn Nhaät Phöông
Caùc Phöông phaùp ñieän di vaø chuyeån leân maøng lai Trong Phaân tích Khaùi nieäm cô baûn
Ñieän di treân Gel Gel Electrophoresis - Taùch caùc phaân töû sinh hoïc (DNA, RNA, Protein) baèng caùch cho ñi qua chaát neàn laø Gel trong moät ñieän tröôøng. Ngöôøi ta thöôøng söû duïng caùc loaïi gel agarose hay polyacrylamide. - DNA hay RNA thöôøng tích ñieän aâm. Trong ñieän di treân gel, maãu ñöôïc cho vaøo nhöõng gieáng naèm gaàn dieän cöïc aâm vaø DNA hay RNA seõ di chuyeån veà phía cöïc döông. Söï di chuyeån tæ leä nghòch vôùi kích thöôùc phaân töû, phaân töû caøng nhoû caøng di chuyeån nhanh. - Protein coù khaù nhieàu ñieän tích treân beà maët, cho neân chuùng thöôøng ñöôïc xöû lyù vôùi SDS ñeå chuyeån sang daïng tích ñieän aâm.
Ñieän di treân Gel Gel Electrophoresis Söï di chuyeån cuûa caùc phaàn töû mang ñieän trong ñieän tröôøng ñöôïc goïi laø Ñieän di (Electrophoresis) Moät phaân töû coù ñieän tích q trong moät ñieän tröôøng E taïo ra moät löïc F =q.E Ñieän di treân gel ñaõ laø phöông phaùp phaân tích höõu duïng trong caùc pheùp phaân tích sinh-hoaù hoïc.
Ñieän di treân Gel Gel Electrophoresis Toác ñoä di chuyeån cuûa protein trong ñieän tröôøng: V = Ez/f V: toác ñoä di chuyeån E: Löïc ñieän tröôøng z: Ñieän tích cuûa protein f: Heä soá ma saùt, tuøy thuoäc vaøo khoái löôïng vaø hình daïng protein vaø ñoä nhôùt cuûa moâi tröôøng.
• GEL
Ñieän di treân Gel Gel Electrophoresis Gel: Traïng thaùi trung gian giöõa hai pha raén vaø loûng Caùc vaät lieäu duøng laøm gel: Starch, Agarose, Acrylamide… Caáu truùc cuûa gel Agarose töông töï Acrylamid: Maïng löôùi caáu truùc ba chieàu. Agarose: caàu noái hydrogen giöõa caùc thaønh phaàn. Polyacrylamide: caùc noái cheùo ñoàng hoùa trò giöõa caùc fiber vaø acrylamide
Ñieän di treân Gel Gel Electrophoresis Agarose: polysaccharide töï nhieân ñöôïc phaân laäp töø taûo bieån, coù kích thöôùc loå gel lôùn, thích hôïp cho phaân taùch caùc phaân töû coù kích thöôùc lôùn vaø ñieän di döïa treân ñoä tích ñieän Duøng ñeå phaân taùch caùc protein > 500kDa vaø caùc DNA coù kích thöôùc > 2000bp. Caùc loaïi agarose khaùc nhau döïa treân caùc ñaëc tính lyù hoùa nhö nhieät ñoä ñoâng ñaëc, ñoä dai, kích thöôùc loå gel, vaø ñoä ñieän thaåm.
Ñieän di treân Gel Gel Electrophoresis Acrylamide: laø saûn phaåm toång hôïp, coù - pH oån ñònh - Trô - Trong suoát - Coù theå hình thaønh nhieàu gel coù kích thöôùc loå gel khaùc nhau
Ñieän di treân Gel Gel Electrophoresis Gel polyacrylamide ñöôïc hình thaønh bôûi quaù trình ñoàng truøng hôïp giöõa acrylamide (CH2=CH-CO-NH2) vaø cross linker, thoâng thöôøng laø N,N’-methylenebisacrylamide (bis acrylamide – CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2) +
Ñieän di treân Gel Gel Electrophoresis Gel Polyacrylamide (PAGE) a) Chöùc naêng: Löôùi phaân töû b) Kích thöôùc loå gel ñöôïc xaùc ñònh theo noàng ñoä cuûa acrylamide vaø linker c) Noàng ñoä thoâng thöôøng: 15% gel d) Theo gradient: 5 – 25% gel.
Ñieän di treân Gel Gel Electrophoresis Quaù trình hình thaønh gel ñöôïc khôûi ñoäng khi theâm vaøo (NH4)2SO4 vaø chaát gia toác (accelerator) laø tetramethylethylenediamine (TEMED). TEMED laøm taêng toác ñoä phaân huûy (NH4)2SO4 thaønh 2 nhoùm sulfate töï do, caùc goác töï do naøy khôûi ñoäng quaù trình taïo thaønh gel. Söï polyme hoùa acrylamide seõ laø ngaãu nhieân neáu khoâng coù crosslinker, laø moät dung dòch nhôùt => Crosslinker = kích thöôùc caùc loå trong gel.
Ñieän di treân Gel Gel Electrophoresis Toác ñoä hình thaønh gel phuï thuoäc vaøo ba yeáu toá: - Noàng ñoä cuûa caùc monomer vaø caùc goác töï do - Nhieät ñoä - Ñoä tinh khieát cuûa hoùa chaát söû duïng Chuù yù: - TEMED phaûi ôû daïng caùc base töï do neân khoâng chuaån bò gel ôû pH thaáp. - Oxy laø taùc nhaân öùc cheá söï taïo thaønh baûn gel. Loaïi khí caùc dung dòch tröôùc khi chuaån bò gel.
Polyacrylamide gels (PAA) Theo quy öôùc, PAA ñöôïc moâ taû döïa treân 2 giaù trò xaùc ñònh kích thöôùc caùc loã trong gel: %T hay % khoái löôïng caùc monomer % C hay % khoái löôïng cross linker AA: Acrylamide; CL: Cross Linker
Polyacrylamide gels (PAA) Protein: 30%T vaø 2.7%C Baèng caùch: 29.2g acrylamide 0.8g bisacrylamide 100ml 72.5ml nöôùc caát * Coù theå loïc dung dòch monomer naøy vaø caát giöõ laïnh ñeå söû duïng. Nucleic Acid: 30%T vaø 3.3%C 29g Acrylamide 1g Bisacrylamide * Acrylamide laø hoùa chaát ñoäc, traùnh tieáp xuùc tröïc tieáp.
Polyacrylamide gels (PAA) Protein: 29 acrylamide : 1CL (3.3% - native protein) 37.5 acrylamide : 1 CL (2.7% - denatured protein) Nucleic Acid: 19 acrylamide: 1 CL (5%) * Acrylamide laø hoùa chaát ñoäc, traùnh tieáp xuùc tröïc tieáp.
Polyacrylamide gels (PAA) Phaûn öùng taïo thaønh gel Noàng ñoä APS vaø TEMED 0.05% ñuû ñeå gaây ñoâng gel ñoái vôùi gel bình thöôøng. Quaù trình ñoâng thaønh gel xaûy ra sau 15 – 20 phuùt sau khi cho hai chaát naøy vaøo dung dòch monomer. Gel ñoâng hoaøn toaøn sau 90 phuùt. 1% APS vaø TEMED duøng cho stacking gel Gel khoâng oån ñònh ôû pH töø 4 – 6. Gel bò thuûy phaân khi löu tröõ: nhoùm carboxamide (-CO-NH2) bò thuûy phaân giaûi phoùng nhoùm carboxyl (-COO-). => Toát nhaát söû duïng gel môùi cho moãi laàn thí nghieäm
Caùc heä dung dòch ñeäm duøng trong ñieän di protein Buffer xaùc ñònh ñieàu kieän doøng ñieän vaø coù aûnh höôûng leân söï phaân taùch vaø ñoä phaân giaûi protein trong quaù trình ñieän di. Continuous Buffer system (heä ñeäm lieân tuïc) trong gel vaø buffer coù ion nhö nhau (ôû pH oån ñònh): thöôøng söû duïng trong ñieän di caùc acid nucleic vaø protein coù noàng ñoä 1mg/ml hay cao hôn. Maãu ñöôïc tra tröïc tieáp vaøo gel, vaø taùch ra khi ñieän di. Ñoái vôùi gel coù kích thöôùc loå gel khoâng ñoåi, heä ñeäm lieân tuïc caàn söû duïng maãu coù noàng ñoä cao ñeå cho keát quaû toát hôn.
Caùc heä dung dòch ñeäm duøng trong ñieän di protein Discontinuous buffer system (heä ñeäm khoâng lieân tuïc) ion khaùc nhau giöõa gel vaø buffer: caàn ñoä phaân giaûi cao. Trong kyõ thuaät naøy, maãu ñöôïc tra vaøo moät lôùp gel (stacking gel) coù vai troø nhö laø moät moâi tröôøng giuùp cho toaøn boä löôïng maãu taäp trung treân beà maët resolving gel, giuùp cho keát quaû ñieän di coù ñoä phaân giaûi cao.
Caùc heä dung dòch ñeäm duøng trong ñieän di protein Heä buffer khoâng lieân tuïc söû duïng phoå bieán nhaát laø Laemmli buffer, trong buffer coù chöùa 0.1% SDS vaø caàn phaûi laøm bieán tính protein thaønh caùc chuoãi polypeptide phaàn töû tröôùc khi ñieän di. Khi hoãn hôïp protein ñöôïc laøm noùng leân trong dung dòch buffer coù chöùa SDS (2%) vaø moät chaát khöû thiol nhö 2 – Mercaptoethanol, protein seõ bò bieán tính hoaøn toaøn thaønh caùc chuoãi polypeptide vaø SDS bao boïc caùc polypeptide thaønh daïng thaúng.

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

THÔNG TIN

TRỢ GIÚP

HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG

Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.