intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE

Bài giảng Công cụ và kỹ thuật khám phá Protein

Chia sẻ: Năm Tháng Tĩnh Lặng | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:45

114
lượt xem
20
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Những nội dung chính được trình bày trong bài giảng "Công cụ và kỹ thuật khám phá Protein" gồm có: Giới thiệu về Proteomics, các phương pháp trong Proteomics, điện di 2 chiều,... Mời các bạn cùng tham khảo để nắm bắt kiến thức chi tiết, phục vụ nhu cầu học tập và nghiên cứu.

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Bài giảng Công cụ và kỹ thuật khám phá Protein

  1. Coâng cuï vaø kyõ thuaät khaùm phaù theá giôùi Protein Thaønh Phoá Hoà Chí Minh 5/2004
  2. Giôùi thieäu veà Proteomics Thuaät ngöõ Proteome: caùc phaàn protein chuyeân bieät veà thôøi gian vaø veà maët teá baøo ñöôïc bieåu hieän töø Genome. Boä gen: khaù oån ñònh, ñoàng nhaát trong teá baøo cuûa moät sinh vaät vaø khoâng coù nhieàu thay ñoåi trong loaøi. Protein laïi bieán ñoäng theo thôøi gian vaø deã daøng phaûn öùng vôùi caùc yeáu toá beân ngoaøi, vaø ñaëc bieät laø khaùc nhau raát nhieàu veà caên baûn giöõa caùc loaïi teá baøo khaùc nhau.
  3. Giôùi thieäu veà Proteomics Proteomics laø quaù trình nghieân cöùu toaøn boä protein hay caùc phaàn protein boå sung hình thaønh töø moät moâ hay moät doøng teá baøo. Ngaøy nay, proteomics coù theå ñöôïc chia thaønh proteomics kinh ñieån (Classical) vaø Proteomics chöùc naêng. Classical proteomics taäp trung nghieân cöùu vaøo toaøn boä heä protein töø hai doøng teá baøo ñöôïc xöû lyù khaùc nhau, trong khi ñoù Proteomics chöùc naêng nghieân cöùu vaøo moät nhoùm protein giôùi haïn hôn. Coù ba vaán ñeà chính ñöôïc ñaët ra cho Proteomics: 1) Caùc loaïi protein naøo hieän dieän? 2) Moät protein ñaëc tröng coù töông taùc gì vôùi caùc protein khaùc? 3) Protein ñaëc tröng ñoù nhö theá naøo (veà maët caáu truùc)?
  4. Giôùi thieäu veà Proteomics Thuaät ngöõ Proteomics bao haøm moät söï nghieân cöùu roäng nhaèm muïc ñích tìm hieåu vaø giaùm saùt hoaït ñoäng chöùc naêng cuûa caùc protein. Proteomics bao goàm caùc coâng vieäc töông töï tìm trình töï di truyeàn baèng caáu truùc khoâng gian ba chieàu cuûa protein vaø trong chöùc naêng protein, phaùt trieâûn caùc kyõ thuaät taùch chieát protein vaø laäp hoà sô protein, nghieân cöùu caùc töông taùc giöõa protein vôùi protein. Proteomics höùa heïn khaùm phaù ra nhöõng muïc tieâu môùi cho nghieân cöùu döôïc phaåm thoâng qua vieäc nghieân cöùu chöùc naêng cuûa haøng ngaøn protein chöa xaùc ñònh maø ngöôøi ta mong muoán seõ ñöôïc phaùt hieän trong nghieân cöùu boä gen ngöôøi. Proteomics cung caáp döõ lieäu nghieân cöùu ñeå caûi thieän caùc chöông ttrình phaàn meàm maùy tính nhaèm döï ñoaùn caáu truùc protein töø caùc trình töï DNA; Noù cho pheùp chuùng ta coù theå giaûi thích thoâng tin coù chöùa trong toaøn boä gen.
  5. Proteomes Nghieân cöùu caùc protein ñöôïc bieåu hieän töø Gene Phaân tích Protein moät caùch heä thoáng vaø ñoàng boä
  6. Boä gen seõ cung caáp nhöõng ñieàu kyø dieäu??? DNA Teá baøo mRNA proteins (genes)
  7. Boä gen seõ cung caáp nhöõng ñieàu kyø dieäu??? Nhöng, chæ coù 30,000 gene trong boä gene ngöôøi, maø coù tôùi hôn 100,000 protein trong heä Proteome ngöôøi. Genomics ñaõ cung caáp moät löôïng raát lôùn döõ lieäu, nhöng haàu heát chuùng ta vaãn chöa giaûi thích ñöôïc cho ñeán nay. Trong moät soá tröôøng hôïp, Genomics cho chuùng ta nhieàu caâu hoûi hôn laø caâu traû lôøi. Caùc vaán ñeà naûy sinh cuûa proteomics höùa heïn traû lôøi cho moät soá caâu hoûi ñoù baèng vieäc nghieân cöùu coù heä thoáng taát caû caùc protein ñöôïc maõ hoùa bôûi boä gene.
  8. CAÙC PHÖÔNG PHAÙP TRONG PROTEOMICS Ñieän di hai chieàu - Two-dimensional electrophoresis (2-DE) laø coâng cuï thí nghieäm truyeàn thoáng ñaùng tin caäy nhaát trong phaân taùch haøng ngaøn protein treân cuøng moät baûn gel. Xaùc ñònh Protein baèng khoái phoå (mass spectrometry) laø coâng cuï toát nhaát hieän nay trong phaân tích protein vaø laø moät trong nhöõng kyõ thuaät chuû yeáu trong caùc laõnh vöïc nghieân cöùu protein. Protein microarrays cung caáp moät quaù trình phaân tích ñònh löôïng moät löôïng lôùn caùc töông taùc giöõa caùc phaân töû. Nhieàu thí nghieäm söû duïng Microarray thöôøng thöïc hieän chung vôùi khoái phoå. Caùc phöông phaùp khaùc: X-ray crystallography, NMR, Edman degradation, etc.
  9. ÑIEÄN DI HAI CHIEÀU (2D-electrophoresis) • Keát hôïp giöõa isoelectic focusing (IEF) vaø SDS-PAGE – cho keát quaû coù ñoä phaân giaûi cao hôn raát nhieàu so vôùi töøng phöông phaùp rieâng bieät . • IEF- phaân taùch protein döïa treân ñieän tích hay ñeåm ñaúng ñieän (isoelectric points); • SDS-PAGE – Phaân taùch protein theo kích thöôùc (size).
  10. 2-D PAGE for Protein Separations IPG Sample SDS-PAGE Prep Cô quan / 2-D Array Stain / blot Phaân ñoaïn/ Nhuoäm hay moâ / 2-D array Hoøa tan chuyeån leân Teá baøo maøng lai
  11. Öùng duïng ñieän di hai chieàu trong nghieân cöùu Proteomics 1) Phaùc thaûo neân moät phöông phaùp ñeå khaùm phaù proteomics. 2) Xaùc ñònh caùc phöông phaùp ñeå toái öu hoùa caùc keát quaû ñieän di hai chieàu. 3) Ñöa ra caùc choïn löïa cho vieäc chuaån bò maãu ñeå phaân tích caùc heä thoáng phöùc taïp. 4) Cho pheùp phaân tích caùc bieåu hieän phaân bieät trong Proteomics.
  12. ÑIEÄN DI HAI CHIEÀU (2D-electrophoresis) Böôùc ñaàu tieân trong phaân tích 2-DE analysis laø quaù trình chuaån bò maãu; proteins coù trong teá baøo hay moâ caàn nghieân cöùu phaûi ñöôïc hoøa tan vaø taát caû DNA vaø caùc chaát taïp nhieãm phaûi ñöôïc loaïi ra khoûi dung dòch. Caùc phöông phaùp chuaån bò maãu tuøy thuoäc vaøo muïc ñích cuûa nghieân cöùu vaø ñaây chính laø chìa khoaù ñeå caùc thí nghieäm ñöôïc thöïc hieän thaønh coâng. Caùc yeáu toá nhö ñoä hoøa tan, kích thöôùc, ñieän tích vaø ñieåm ñaúng ñieän (pI) cuûa protein phaûi ñöôïc tính ñeán trong quaù trình chuaån bò maãu.
  13. ÑIEÄN DI HAI CHIEÀU (2D-electrophoresis) Ñieän di chieàu thöù hai: quaù trình ñieän di SDS-PAGE thoâng thöôøng, caùc strip IPG ñöôïc duøng nhö laø maãu ñieän di. Vieäc choïn löïa gel söû duïng cho ñieän di chieàu thöù hai tuøy thuoäc vaøo troïng löôïng phaân töû (MW) caàn taùch. Ñeå coù theå phaân tích löôïng lôùn protein, coù theå chaïy nhieàu gel cuøng luùc. Caùc thang protein chuaån ñöôïc duøng ñeå xaùc ñònh troïng löôïng phaân töû cuûa protein caàn phaân tích.
  14. ÑIEÄN DI HAI CHIEÀU Chuaån bò maãu – chìa khoùa thaønh coâng Quaù trình chuaån bò maãu hieäu quaû seõ: 1. Hoøa tan taát caû protein coù trong maãu 2. Ngaên caûn söï tích tuï vaø giaûm tính tan trong khi ñieän di 3. Ngaên caûn vieäc giaûm hoaït tính veà maët hoùa hoïc hay enzyme cuûa protein maãu. 4. Loaïi boû hoaëc tieâu huûy hoaøn toaøn caùc acid nucleic hay caùc phaân töû gaây aûnh höôûng khaùc. 5. Hieäu suaát thu hoài caùc protein mong muoán ôû möùc phaùt hieän ñöôïc.
  15. ÑIEÄN DI HAI CHIEÀU Chuaån bò maãu – chìa khoùa thaønh coâng Haàu heát caùc protein ñeàu caàn thieát moät soá thí nghieäm ñeå xaùc ñònh caùc ñieàu kieän toái öu cho ñieän di 2 chieàu. Söï khaùc nhau veà noàng ñoä caùc chaát söû duïng coù theå aûnh höôûng ñeán keát quaû phaân tích. Urea vaø thiourea ñöôïc duøng ñeå giuùp hoaø tan protein, Urea thöôøng ñöôïc söû duïng ôû noàng ñoä 8M. Caùc chaát taåy khaùc cuõng ñöôïc söû duïng ñeå laøm taêng tính hoøa tan cuûa protein ôû ñieåm ñaúng ñieän. Caùc chaát mang löôõng tính Ampholytes laøm trung hoøa vaø giuùp caùc protein khoâng keát tuûa trong quaù trình ñieän di.
  16. ÑIEÄN DI HAI CHIEÀU Chuaån bò maãu – chìa khoùa thaønh coâng Caùc chaát khöû nhö DTT hay TBP ñöôïc söû duïng ñeå phaù vôõ caàu noái disulfide. Noàng ñoä DTT quaù cao seõ aûnh höôûng ñeán gradient pH vì pKa cuûa DTT xaáp xæ 8. Bio-Rad cung caáp moät giaûi phaùp toái öu cho quaù trình chuaån bò maãu Protein: ReadyPrep sequential extraction Kit
  17. ReadyPrep Sequential Extraction Kit MAÃU 40–80% Dung dòch 1 Supernatant Tris, pH 9.5 Residue 1 12–49% Dung dòch 2 Urea/CHAPS/Tris Supernatant Bio-Lyte® / TBP Residue 2 5–8% Dung dòch 3 Urea/thiourea/CHAPS/SB3-10 Tris/Bio-Lyte® / TBP Supernatant Residue 3 1%– 6%
  18. Extract 1 8% Sequential Extraction 16% 4 7 Extract 2 Whole lysate 200 g of E. coli proteins - each gel Extract 3
  19. ÑIEÄN DI HAI CHIEÀU (2D-electrophoresis)
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2