Bài giảng nuôi cấy mô - tế bào thực vật bằng tế bào trần và kĩ thuật chuyển gen

Chia sẻ: saobachkim_90_hn

Tham khảo tài liệu 'bài giảng nuôi cấy mô - tế bào thực vật bằng tế bào trần và kĩ thuật chuyển gen', tài liệu phổ thông, sinh học phục vụ nhu cầu học tập, nghiên cứu và làm việc hiệu quả

Bạn đang xem 20 trang mẫu tài liệu này, vui lòng download file gốc để xem toàn bộ.

Nội dung Text: Bài giảng nuôi cấy mô - tế bào thực vật bằng tế bào trần và kĩ thuật chuyển gen

Chủ đề:
NUÔI CẤY MÔ – TẾ BÀO
THỰC VẬT BẰNG TẾ BÀO
TRẦN VÀ KĨ THUẬT
CHUYỂN GEN
KHÁI NIỆM




Nuôi cấy mô­ tế bào thực vật là kĩ thuật cho phép 
nuôi cấy dễ dàng những tế bào thực vật hay mô 
phân sinh sạch bệnh trong môi trường nhân tạo 
thích hợp để tạo ra những khối tế bào hay những 
cây hoàn chỉnh trong ống nghiệm.
   
CƠ SỞ SINH LÍ CỦA CÔNG NGHỆ
NUÔI CẤY MÔ- TẾ BÀO
TÍNH TOÀN NĂNG:


  Là khả năng của 1 tế bào 
hình thành 1 cây hòa 
chỉnh trong điều kiện nuôi 
cấy thích hợp, do trong tế 
bào có chứa bộ 
AND(NST) hoàn chỉnh, 
chứa toàn bộ thông tin di 
truyền cho 1 chu kì sống 
hoàn chỉnh.
        AND       mARN      
Protêin       tính trạng

   
 Tùy từng tế bào, từng
loại mô, từng thời kì sinh
trưởng, phát triển mà
các gen phù hợp hoạt
động; các gen không
cùng hoạt động như
nhau trong các giai đoạn
phát triển của cơ thể (do
cơ chế điều hòa hoạt
động của gen).
 SỰ PHÂN CHIA, PHÂN HÓA, PHẢN PHÂN HÓA CỦA
TẾ BÀO:
Phân hóa: 1 tế bào 1khối tế bào(phân hóa) mô cơ quan

hệ cơ quan.
Phản phân hóa: khi các tế bào đã phân hóa thành các

mô chức năng riêng biệt nhưng vẫn có thể quay về
trạng thái chức năng phôi sinh ban đầu ki gặp điều
kiện thuận lợi.
• Các đặc tính trên
được xác định dựa
trên cơ sở là đặc điểm
di truyền nhưng sự
thay đổi môi trường
cũng có ảnh hưởng
trực tiếp đến các đặc
tính đó.
CÁC NHÂN TỐ ĐẢM BỎ THÀNH 
CÔNG TRONG CÔNG NGHỆ NUÔI 
CẤY MÔ­ TẾ BÀO THỰC VẬT:
 Đảm  bảo điều kiện 
vô trùng, phòng thí 
nghiệm phải chuyên 
hóa cao.
 Chọn đúng môi 
trường và chuẩn bị 
môi trường đúng 
cách.
 Chọn mô cấy, xử lí 
mô cấy thích hợp 
trước và sau khi cấy.
   
CÁC BƯỚC TRONG KĨ THẬY NUÔI
CÁC
CẤY MÔ- TẾ BÀO THỰC VẬT
 Tạo vật liệu khởi đầu: thường chọn chồi là
bộ phận nuôi cấy thích hợp nhất khử
cấy trong môi trường khởi động để
trùng
tái sinh
 Giai đoạn nhân nhanh: vật liệu khởi đầu
được chuyển sang môi trường nhân nhanh có bổ
sung Xitokinin để tái sinh 1 thành nhiều chồi.
 Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh: tách riêng các
tách
chồi cho vào môi trường tạo rể (bố sung
ch
mỗi chồi ra rể thành 1 cây hoàn chỉnh.
Auxin)
 Giai đoạn ra cây: cây trong ống nghiệm đủ
tiêu chuẩn (chiều cao, số lá, số rể) sẽ được
chuyển sang môi trường tự nhiên.
CÁC HÌNH THỨC NUÔI 
CẤY MÔ
• Nuôi cấy mô thực vật
• Nuôi cấy mô bằng tế bào 
trần




   
NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT
NUÔI
 Nuôi cấy mô của cơ
quan tách rời:
VD: củ cà rốt cắt lát
VD:
tách mảnh mạch rây xử
tách
lí+ nuôi cấy mô phôi
phôi nảy mầm cây non
trong ống nghiệm cây
trưởng thành
Nuôi cấy từ mô hay cơ 

quan:
  VD: từ 1 mô lá   tách tế 
bào   nuôi cấy trên 
đĩa Pêtri    điều kiện 
thuận lợi sẽ hình 
thành những cây non  
 trồng chậu    phát 
triển cây trưởng 
thành.
   
 Nuôi cấy đỉnh sinh
trưởng:
tr
Từ 1 mô phân sinh của

đỉnh sinh trưởng của
rễ hoặc thân nuôi cấy
trong môi trường dinh
dưỡng sẽ tạo nên cây
con
Nuôi cấy mô sẹo từ hạt
Nuôi
phấn( Auxin rất quan
trọng):
Nuôi cấy bao phấn có hạt
Nuôi
phấn chín môi trường
thuận lợi bao phấn chín
sẽ phân hóa bằng cách:
nhân sinh sản sẽ tiêu
biến nhân sinh dưỡng
sẽ nguyên phân tạo mô
sẹo nuôi dưỡng cây
đơn bội(n) xử lí
cônxixin cây trưởng
thành(đơn bội kép).
NUÔI CẤY MÔ BẰNG TẾ BÀO
NUÔI
TRẦN
 Khái niệm tế bào trần:

Là tế bào thực vật bị

loại bỏ vách bởi 1 xử
lí enzim. Đó là tế bào
tự do, cô lập, không
định hướng( vì không
còn chịu sự tương
quan trong hệ thống
thực vật).
SỰ CÔ LẬP VÀ NUÔI CẤY TẾ BÀO
TRẦN

Sự cô lập:


Trước hết phải xử lí vật
liệu khởi đầu( lá, mô
sẹo, dịch treo tế bào…)
với enzim phân hủy
vách( Xenlulaza,
HemiXenlulaza,
Pectolyaza…).
Ví dụ: phương pháp tạo 
tế bào trần từ lá:
Lá  làm sạch lá bằng 
Clorox 10%      rửa lại 
lá 3 lần bằng nước cất 
tiệt trùng     tách lớp 
biểu bì dưới của lá+ 
gây co nguyên sinh 
1h bằng Mannitol 
10%   enzim  thu được 
tế bào trần.


   
 Sức trương tế bào bình
thường thì được cân
bằng với sức ép cơ
học của vách vách
mất, để tế bào không
bị vỡ thì cho vào những
chất gây co nguyên
sinh
sinh
(CaCl2,KCl,Mannitol…)
(CaCl ,KCl,Mannitol…)
hòa tan trong Enzim khi
xử lí

SỰ NUÔI CẤY
NUÔI
Thành phần của môi
trường nuôi cấy lỏng
hay đặc tùy thuộc vào
vaät liệu thực
vật.Môi trường này có
thêm Auxin và
thêm
Xitokinin để giúp sự
Xitokinin
tái tạo vách và các lần
phân cia đầu tiên
 Đảm bảo đủ các yếu
tố dinh dưỡng: axit
amin, polyamin,
amin,
Hydrolysat Cazein,
nước dừa, mạch nha…
 Đảm bảo điều kiện
nhiệt độ, PH, ánh
sáng,áp suát thẩm
thấu….
• Trong lần tự nhân đôi
đầu tiên, môi trường
phải có áp suất thẩm
thấu cao, Auxin,
Xitikinin thích hợp,
ánh sáng yếu.
• Sau đó cần giảm áp
suất thẩm thấu bắng
cách pha loãng môi
trường để giúp cho sự
tăng trưởng tế bào.
 Khi mô sẹo được hình
thành cần chuyển
chúng vào trong môi
chúng
trường rắn chứa Auxin
tr
ở nồng độ thấp hơn
và Xitokinin cao hơn.
 Sau cùng kích thích ra
Sau
rễ cần loại Xitokinin,
tăng nồng độ Auxin.
• Thông thường, tế 
bào trần cần 1­2 
ngày cho sự hình 
thành vách, 2­7 
ngày cho các lần 
nhân đôi đầu tiên, 
3­4 tuần cho sự 
tăng trưởng mô 
sẹo, sau đó 1­2 
tháng để có phôi 
hình cầu, 1tháng 
nữa để có cây nảy 
mầm.
   
ÍCH LỢI CỦA TẾ BÀO TRẦN
• Tế bào trần có khả năng tái 
tạo vách và cho phôi thể hệ.
• Nuôi cấy tế bào trần sẽ mở ra 
1 mô hình hấp dẫn để theo 
dõi quá trình sinh phôi thể hệ 
từ 1 tế bào cô lập. Đặc biệt 
biết được sự sắp xếp các sợi 
Xenluloz để xác định hướng 
kéo dài tế bào, vị trí và hướng 
của mặt phẳng phân chia.
   
• Thuận lợi cho sự
nghiên cứu về sinh
lí tế bào: tính thấm
của màng, vận
chuyển các chất
hòa tan, ion, cơ chế
hoạt động của
hoocmon thực
vật…
• Tế bào trần có thể
chịu các xử lí gây đột
biến và được dùng để
tạo ra các dòng tế
bào có nguồn gốc
đơn bào.
• Tế bào trần thiết yếu
cho sự lai thể
hệ( dung hợp tế bào
trần) và áp dụng các
kĩ thuật chuyển
gen( bơm AND, hóa
thẩm, điện thẩm…)
MỞ RỘNG NUÔI CẤY MÔ
BẰNG KĨ THUẬT DUNG HỢP
TẾ BÀO TRẦN VÀ KĨ THUẬT
CHUYỂN GEN
SỰ LAI THỂ HỆ BẰNG KĨ
THUẬT DUNG HỢP TẾ BÀO
TRẦN
• Khái niệm:
Dung hợp là hiện
tượng cắt đứt màng
sinh chất nơi tiếp xúc
giữa 2 tế bào trần
khác loài do tác động
của các nhân tố bên
ngoài. Sau đó là sự tái
tổ chức các màng ban
đầu thành 1 và bao
lấy tế bào chất và 2
nhân cha mẹ.
CÁC HÌNH THỨC DUNG HỢP
• Tự dung hợp:
 Vì màng sinh chất của 
tế bào(­) do nhóm P 
và Protein nên các 
tế bào trần đẩy nhau 
nên không tự dung 
hợp. Do đó phải làm 
các rế bào trần tiếp 
xúc nhau nhờ PEG 
hay sốc điện. 
   
Hóa dung hợp:

  Sự hóa dung hợp có thể thực hiện 
với NaNO3 0,25M, PVA 15 %…
nhưng tần số dung hợp thấp nên ít 
được sử dụng.
   Virut Senday đã giảm hoạt tính là 
chất thường dùng hiện nay bằng 
cách cho giọt hỗn hợp 2 loại tế 
bào trần tiếp xúc từ từ với các giọt 
PEG 25­ 50%

   
• Điện dung hợp 
(tốtnhất):
Khi đặt hỗn hợp 2 loại
tế bào trần trong 1
điện trường, các tế bào
trần sẽ di chuyển, tiếp
xúc nhau và xếp thành
1 chuỗi dài dưới lực
điện trường
Sau đó dùng xung điện
ngắn đẻ tạo vết đứt ở
màng, sự dung hợp sẽ
xảy ra tại nơi tiếp xúc.
NHỮNG BIẾN ĐỔI CỦA TẾ BÀO
• Phần lớn tế bào lai có bộ NST không bền, nhất là
từ cha mẹ xa nhau, 1 vài NST bị hủy bỏ sau 1 vài
lần phân bào. Tính bền chỉ thấy được sau nhiều
lần nhân đôi.
• Dung hợp tế bào trần có thể theo 2 kiểu:
 Dung hợp nhân 1 phần hay toàn phần: hình thành tế
bào lai.
 1 trong 2 nhân cha mẹ được giữ: tế bào chất lai
Cả 2 đều mang gen trong tế bào chất.
ÍCH LỢI VÀ TRỞ NGẠI CỦA
NUÔI CẤY TẾ BÀO TRẦN
• Ích lợi: giúp loại trừ tính bất thụ hửu tính, tạo
cây lai hữu thụ; Giúp chuyển những đặc tính có
lợi vào cây trồng, ít đòi hỏi phương tiện phức
tạp; Không cần hiểu biết chính xác về sự liên hệ
giữa các gen, ít tốn kém, nhanh và trực tiếp.
• Trở ngại: Quá trình cô lập nuôi cấy phải hoàn
thiện.
Chưa có phương pháp hiệu quả để
tuyển chọn các sản phẩm phù hợp.
SỰ CHUYỂN GEN 
TRONG KĨ THUẬT 
NUÔI CẤY MÔ

   
CÁC KHÁI NIỆM VỀ KĨ THUẬT 
DI TRUYỀN
• Lai phân tử:
Là sự dung hợp hai phân tử ADN có nguồn 
gốc khác nhau hình thành một phân tử ADN 
lai( ADN tái tổ hợp) hoặc hình thành một 
phân tử ADN lai gồm hai mạch: một mạch là 
chuỗi PolyNu, mạch đối xứng là chuỗi 
PolyRinu

   
Coâng ngheä di truyeàn (öùng duïng cuûa
kó thuaät di truyeàn) :
Laø quy trình söû duïng kó thuaät
di truyeàn ñeå saûn xuaát saûn
phaåm sinh hoïc treân quy moâ
coâng ngieäp ñeå ñaùp öùng nhu
caàu cho con ngöôøi. Laø quaù trình
coù tính toaùn ñeán saûn phaåm,
giaù thaønh, kinh teá.
• Kĩ thuật di truyền:
Là kĩ thuật thao tác trên
vật liệu di truyền dựa
trên những hiểu biết về
cấu trúc của AxitNucleic
và di truyền vi sinh vật.
Sự truyền Gen:
Là sự biến đổi bộ gen tế bào bởi sự xen vào đó 1 
đoạn ADN ngoại lai sinh.
ADN tái tổ hợp:
Là phân tử ADN lai đạt được do sự kết hợp giữa 2 
trình tự ADN của 2 loài khác nhau, hoặc cũng có 
thể được hình thành từ 1 mạch ARN và 1 mạch 
AND.



 
 
• Các Enzym công cụ:
Enzym cắt(restriction Enzym): có khả năng
nhận biết và cắt ADNsợi kép ở bhững vị
trí rất chính xác.
Ligaza: nối liền 2 đoạn ADN bắng cách tạo
các mối liên kết P dieste liên kết các Nu.
Reverse transcrip tase: cho phép sao chép
ngược( tức sự tổng hợp cADN từ mARN.
Véctơ truyền: Phân tử ADN nhỏ 
được dùng để ghép đoạn ADN cần 
nghiên cứu gọi là véctơ truyền.
                       Thường dùng 
là Plasmid vi khuẩn hay ADN 
virut.
Sự tạo dòng gen: Là quá trình cô lập và
thu nhận nhiều bản sao giống nhau
của 1 gen hay 1 đoạn gen dựa trên khả
năng tự nhân đôi của ADN. Đây là cơ
sở cho sự tăng bội đoạn ADN cần
nghiên cứu.
Sự sàng lọc và dò phân tử: Sự sàng lọc 
là quá trình tuyển chọn các Vectơ 
chứa đoạn ADN cần nghiên cứu. Sự 
tuyển chọn thực hiện nhờ lai phân tử 
kết hợp với 1 dò phân tử.
                                           Dò phân tử: 
Là các đoạn axit Nuclêôtit( ADN, 
ARN) sợi đơn: 20 đến vài trăm Nu; 
Người ta dùng để đánh dấu đoạn axit 
Nuclêôtit cần nghiên cứu trong 1 phản 
ứng gọi là’’ lai phân tử’’ nhờ được 
đánh dấu phóng xạ và có tính bổ 
sung và đối song với 1 vùng củ đoạn 
A.Nu cần nhận biết.
   
SỰ CHUYỂN GEN GIÁN TIẾP 
BỞI AGROBACTERIUM




   
   
   
   
   
 
 
   
SỰ CHUYỂN GEN TRỰC 
TIẾP(BIẾN NẠP)
• Các phương pháp chuyển gen trực tiếp: 
hoá thẩm, điện thẩm, súng bắn ADN:
Hoá thẩm: dùng PEG và dùng tế bào 
trần.(tần số chuyển gen thấp)




   
Điện thẩm: dùng xung điện cao áp và tế bào 
trần.
 Cơ sở củ điện thẩm là khi tế bào chịu sự 
tác động của xung điện cao áp, các lổ nhỏ 
tạm thời được tạo thành trên màng trở nên 
thấm, ADN vào tế bào được theo khuynh 
hướng nồng độ.  Tuy nhiên số lổ được tạo 
thành tăng theo điện thế cho tới 1 giá trị 
tới hạn( quá điểm này màng sẽ bị tổn thương 
không hoàn nghịch).


   
Sự thành lập các lỗ nhỏ có
thể do:
Điện trường làm thay đổi
cân bằng điện tích lớp P lipit
màng
Tính lỏng tạo nên những
chổ yếu tạm thời dễ bị đứt
dưới ảnh hưởng của điện
trường.
KĨ THUẬT BẮN ADN
• Các Plasmid có mang các gen lạ 
được cố đinh trên các hạt kim 
loại( vàng hay tungsten) có đường 
kính 0.000006m nhờ lực hút tĩnh 
điện. Các hạt kim loại­ Plasmid 
này được bắn với vận tốc lớn để 
xuyên qua vách, màng và xen vào 
bộ gen nhân tế bào đích.
    Màng tế bào có 1 tính dẻo hoàn 
hảo nên dễ dàng sửa chữa sau khi 
bị tổn thương.
Các phân tử ADN tách khỏi hạt kim loại sau
khi vào nhân tế bào gia nhập vào ADN NST
của tế bào.
Ưu điểm:   Nhanh, dễ thực hiện, ít công đoạn, 
hiệu quả kinh tế cao không chuyên biệt cho 
loài
                   Không đòi hỏi cô lập và nuôi cấy 
tế bào trần.
                   Dễ phát hiện các tế bào có mang 
gen được chuyển.
Nhược điểm: Thiết bị đắt tiền.
                     Tần số chuyển gen thấp.


   
• Cả phương pháp gián tiếp và trực tiếp: sau
khi tế bào thực vật đã mang gen đặc tính,
chúng sẽ nguyên phân nhiều lần tạo ra1
khối tế bào phân hoá tạo mô cơ quan
cây trưởng thành.
   
• Thaønh töïu – öùng duïng cuûa kó thuaät 
nuoâi caáy moâ baèng teá baøo traàn vaø 
kó thuaät chuyeån gen
     Baèng phöông phaùp dung hôïp teá baøo 
traàn vaø aùp duïng kó thuaät chuyeån gen 
caùc nhaø khoa hoïc ñaõ vöôït qua moïi raøo 
caûn sinh hoïc trong töï nhieân ñeå taïo caùc 
teá baøo lai vaø caùc gioáng thöïc vaät mang 
caùc gen mong muoán. Goùp phaàn quan 
troïng trong vieäc caûi tieán gioáng caây 
troàng, taêng naêng suaát. 
   
       Taêng tính choáng chòu vôùi 
caùc ñieàu kieän khí haäu, thoå 
nhöôõng baát lôïi
       Taêng khaû naêng khaùng thuoác 
dieät coû
       Taêng khaû naêng choáng chòu 
vôùi caùc coân truøng vaø boï caùnh 
cöùng (baèng caùch chuyeån gen maõ 
hoaù toång hôïp thuoác tröø saâu 
trong caây thöïc vaät)
   
Taêng khaû naêng phoøng tröø beänh caây
Taêng



Taêng naêng suaát caây troàng


Taïo thöùc aên chöùa khaùng theå ñaëc hieäu cho
Taïo


gia suùc
su




   
Tuy nhieân cuõng coù moät soá 
haïn cheá 
A Û nh  öôû ng  öùc 
h s khoeû   äng 
co
ñoàng
A Û nh  öôû ng  oâit öôøng  nh 
h m  r si
t ùi
ha  
A û nh  öôû ng  nh  eá  í t ò 
h ki t ch nh  r
xaõ  äi
ho
Đề thi vào lớp 10 môn Toán |  Đáp án đề thi tốt nghiệp |  Đề thi Đại học |  Đề thi thử đại học môn Hóa |  Mẫu đơn xin việc |  Bài tiểu luận mẫu |  Ôn thi cao học 2014 |  Nghiên cứu khoa học |  Lập kế hoạch kinh doanh |  Bảng cân đối kế toán |  Đề thi chứng chỉ Tin học |  Tư tưởng Hồ Chí Minh |  Đề thi chứng chỉ Tiếng anh
Theo dõi chúng tôi
Đồng bộ tài khoản