Bài thuyết trình Các phương pháp sắc kí cột

Chia sẻ: ngovanquang12c3

Sự tinh sạch của protein rất quan trọng vì từ protein tinh sạch chúng ta có thể xác định được trình tự acid amin, mối liên hệ về tiến hóa giữa các protein trong những cá thể khác nhau và khảo sát các chức năng sinh hóa của các protein đó. Để tinh sạch protein, người ta thường dựa vào các đặc điểm tương đồng và các tính chất khác nhau vốn có của nó.

Bạn đang xem 10 trang mẫu tài liệu này, vui lòng download file gốc để xem toàn bộ.

Nội dung Text: Bài thuyết trình Các phương pháp sắc kí cột

                              TS: 
Ngô Đại Nghiệp

 Lớp: SHO7B1                        
                                    
              Nhóm 4                
           MSSV                     
  
 Nguyễn Đinh Diễm Thụy            
30700514
 Huỳnh Thị Lệ Phương               
Sự tinh sạch của protein rất quan 
trọng vì từ protein tinh sạch chúng ta 
có thể xác định được trình tự acid 
amin, mối liên hệ về tiến hóa giữa các 
protein trong những cá thể khác nhau 
và khảo sát các chức năng sinh hóa của 
các protein đó. 
Để tinh sạch protein, người ta thường 
dựa vào các đặc điểm tương đồng và các 
tính chất khác nhau vốn có của nó. 
Trong một số trường hợp, để dễ dàng 
hơn cho việc tinh sạch, người ta gắn 
Tủa protein
Thẩm tích 
Siêu lọc 
Sắc ký (Sắc ký giấy, sắc ký cột, Sắc 
ký lỏng – khí, Sắc lý ái lực miễn dịch, 
Sắc ký ái lực, Sắc ký trao đổi ion, 
Sắc ký cao áp lỏng…)
Điện di protein (điện đi trên gel 
Agarose, điện di trên gel 
Polyacrylamide, điện di protein theo 
điểm đẳng điện… )
Phương pháp tốt nhất để phân đoạn 
   Sắc ký (Chromatography) là một phương
pháp phân tách quan trọng nhất trong sinh học
phân tử vì nó thích hợp với nhiều loại hợp
chất và sản phẩm tinh sạch có thể được sử
dụng ngay cho việc định lượng và định danh.
   
   
     Sắc ký cột là phương pháp mà 
chất nhồi (là pha tĩnh: hấp phụ, 
trao đổi ion, phân bố gen) được 
nhồi vào cột, dùng để phân chia 
các chất trong hỗn hợp và tinh 
chế các chất. Thông thường, người 
ta hoà tan hỗn hợp chất nghiên 
cứu vào một dung môi (pha động) 
với lượng vừa đủ, rồi nạp lên 
cột   theo cách phù hợp sao cho 
chất nghiên cứu lan thành một lớp 
      Phương pháp sắc ký dựa vào 
sự phân bố khác nhau của các 
chất giữa hai pha động và tĩnh. 
Có nhiều nguyên nhân đưa đến sự 
phân bố khác nhau của các chất, 
nhưng chính sự lặp đi lặp lại 
hiện tượng hấp phụ ­ phản hấp 
phụ của các chất khi dòng pha 
động chuyển động qua pha tĩnh là 
nguyên nhân chủ yếu của việc 
tách sắc ký. 
    

 
K=Cs/Cm=Nồng độ của hợp chất trong  
pha tĩnh/Nồng độ của hợp chất trong 
pha động.
 
     Dụng cụ: 
Cột sắc kí ( giống như cái buret), 
gồm 1 ống thủy tinh và 1 cái khóa, 
nhưng không cần vạch chia độ, kích 
thước lớn hoặc nhỏ tùy yêu cầu sử 
dụng
Chất nhồi cột (pha tĩnh, stationary 
phase, thường dùng silicagel,) Chất 
nhồi cột quyết định quá trình sắc kí. 
Dung môi: thông thường chọn dung môi 
phụ thuộc vào chất nhồi cột. 
Thực hiện:
   Bước 1 là nhồi cột: Sau khi đã chọn 
cột, làm khô và cân silicagel cần 
dùng, pha dung môi chạy hệ rồi thì hòa 
tan silicagel vào dung môi đó. 
   Bước 2 nạp mẫu chất vào: Có 2 loại 
nạp mẫu là nạp mẫu khô và nạp mẫu ướt. 
   Bước 3: sau khi hoàn tất việc nạp 
mẫu rồi thì lót 1 miếng bông gòn ở bên 
trên mẫu chất để ổn định hệ rồi tiếp 
tục châm dung môi vào, từ từ thay đổi 
độ phân cực của hệ, Bước 4 mở khóa: 
lúc này cột bắt đầu tách chất, hứng 
lượng dung môi chảy ra, mỗi lần hứng 
khoảng 1/5 hũ .Sau đó đem chấm bản các hủ 
bi, những hủ có vệt tương tự nhau sẽ được 
gom lại, đó là 1 chất. Tiếp tục như vậy 
   Đây là phương pháp sắc ký đơn 
giản nhất. ví dụ, hai chất A và 
B liên tục chảy qua cột có nạp 
sẵn các các chất hấp phụ. Người 
ta xác định nồng độ các cấu tử 
trong dung dịch chảy ra khỏi cột 
và xây dựng đồ thị theo hệ toạ 
độ: nồng độ cấu tử­ thể tích 
dung dịch chảy qua cột. đồ thị 
này thường gọi là sắc ký đồ hay 
đường cong thoát (có tác giả 
   Trong phương pháp rửa giải, đầu 
tiên người ta cho Vml dung dịch 
chứa hỗn hợp các cấu tử (ví dụ, hỗn 
hợp hai cấu tử A và B, trong đó A 
có ái lực với cột nhỏ hơn B) chạy 
qua cột. Các cấu tử A, B chứa trong 
Vml trước hết sẽ bị giữ lại ở phần 
trên của cột. Sau đó cho dung dịch 
rửa (thường là dung môi hoà tan các 
cấu tử) chảy qua cột. Lúc đó các 
cấu tử bị giữ ở phần trên của cột 
   Trong phương pháp rửa đẩy, 
sau khi đưa mẫu vào cột, ta cho 
chảy qua cột một dung dịch rửa 
chứa chất có ái lực với pha tĩnh 
lớn hơn các cấu tử cần tách. 
Các cấu tử cần tách sẽ bị chuyển 
dần xuống phía dưới khi ta tiến 
hành quá trình rửa cột và tuần 
tự thoát ra khỏi cột. Cấu tử 
thoát ra khỏi cột đầu tiên là 
cấu tử tương tác với pha tĩnh 
     V. PHÂN LOẠI CÁC
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ:
    Pha tĩnh: có thể là chất 
rắn hoặc chất lỏng. 
Pha tĩnh là chất rắn : 
thường là alumin hoặc silica 
gel đã được xử lý, nó có 
thể nạp nén vào trong một 
cột 
Pha tĩnh là chất lỏng: có 
thể là một chất lỏng được 
tẩm lên bề mặt một chất mang 
    Pha động : có thể là chất 
lỏng hoặc chất khí.
Pha động là chất khí: thí 
dụ trong kỹ thật sắc ký khí. 
Trong trường hợp này chất 
khí được gọi là khí mang hay 
khí vecto. 
Pha động là chất lỏng: thí 
dụ trong kỹ thuật sắc ký 
giấy, sắc ký lớp mỏng, sắc 
ký cột. Trong trường hợp này 
    Sắc ký phân chia (Partition 
chromatography)
Pha động là chất lỏng hoặc chất khí 
(trong sắc ký khí).

Pha tĩnh là chất lỏng, lớp chất lỏng
với chiều dày rất mỏng, chất lòng 
này được nối hóa học lên bề mặt của 
những hạt rắn, nhuyễn mịn và có tính 
   Sắc ký hấp thu (Adsorption 
chromatography)

Pha động là chất lỏng hoặc chất khí


Pha tĩnh là chất rắn: đó là những 
hạt rắn nhuyễn mịn, có tính trơ, 
được nhồi trong một cái ống. bản 
thân hạt rắn là pha tĩnh, pha tĩnh 
thường sử dụng là những hạt silica 
gel hoặc alumin.
    Sắc ký trao đổi ion (Ion 
exchange chromatography)

Pha động chỉ có thể là chất lỏng.


Pha tĩnh là chất rắn, là những 
hạt hình cầu rất nhỏ, có cấu tạo 
hóa học là polymer nên gọi là hạt 
nhựa. Bề mặt của hạt mang các 
nhóm chức hóa học ở dạng ion. Có 
hai loại nhựa: nhựa trao đổi 
anion và nhựa trao đổi cation. 
Sắc ký lọc gel ( Size exclusion 
chromatography; gel filtration
chromatography)

Pha động chỉ có thể là chất 
lỏng.

Pha tĩnh là chất rắn, đó là 
những hạt hình cầu bằng 
polymer, trên bề mặt có nhiều 
lỗ rỗng. 
Sắc ký ái lực (affinity 
chromatography):
Sắc ký ái lực dựa vào tính bám 
dính của một protein, các hạt 
trong cột có nhóm hóa học kết 
dính bằng liên kế cộng hóa trị. 
Một protein có ái lực với nhóm 
hóa học này sẽ gắn vào các hạt 
và di chuyển sẽ bị cản trở.
Đây là một phương pháp rất hiệu quả và
được ứng dụng rộng rãi trong việc tinh sạch
protein.
Một dạng rất phổ biến của sắc ký ái lực là
Sắc ký lỏng cao áp:

   Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp là 
một dạng mở rộng của kỹ thuật 
sắc ký cột có khả năng phân tách 
protein được cải thiện đáng kể. 
Bản thân vật liệu tạo cột vốn đã 
có sự phân chia rõ ràng và như 
thế sẽ có nhiều vị trí tương tác 
dẫn đến khả năng phân tách được 
tăng lên đáng kể. Bởi vì cột 
được làm từ vật liệu mịn hơn nên 
phải có một áp lực tác động lên 
cột để có được một tốc độ chảy 
thích hợp. 
    Sắc ký giấy và sắc ký lớp mỏng 
(paper and thin­ layer chromatography):
Trong sắc ký giấy:
         Pha tĩnh: một tờ giấy bằng 
cellulose
         Pha động : là chất lỏng.
Trong sắc ký lớp mỏng:
         Chất hấp thu thông dụng torng sắc 
ký lớp mỏng là silica gel, là loại pha tĩnh 
với tính chất rất phân cực.  
        Pha động: luôn luôn là chất lỏng
Trong sắc ký giấy và sắc ký lớp mỏng, 
   Sắc ký cột hở cổ điển là tên gọi 
để chỉ loại sắc ký sử dụng một ống 
hình trụ, được đặt dựng đứng, với 
đầu trên hở và đầu dưới có gắn một 
khóa. 
       Pha tĩnh rắn được nhồi vào 
ống trụ. Mẫu cần tách được đặt lên 
trên bề mặt của pha tĩnh. 
       Pha động là dung môi được 
liên tục rót vào đầu cột. 
Thời gian lưu (retention time): (tR)
     Với máy sắc ký khí và sắc ký 
lỏng hiệu năng cao (HPLC), pha tĩnh 
là bột rắn, nhuyễn cực mịn, được nén 
trong một ống hình trụ nên cần phải 
có một thiết bị tạo lực đẩy để giúp 
pha động di chuyển ngang qua pha 
tĩnh 
     Thiết bị cảm biến thường được 
gọi là đầu dò (detector) tạo ra các 
tín hiệu điện tử để ghi thành sắc ký 
đồ (chromatography).
 t’R = tR –tM
Độ phân giải(Resolution ,R)
Từ sắc ký đồ, người ta biết 
được độ phân giải, ký hiệu R.
Độ phân giải của cột sắc ký cho 
biết cột có khả năng tách các 
chất riêng ra hay không, được 
định nghĩa là sự khác nhau về 
thời gian lưu của hai pic kề 
sát nhau chia cho giá trị trung 
bình bề rộng đáy của 2 pic đó
Hình học Cấu hình Chiều di  Loại sắc ký
sắc ký chuyển của 
pha động
Phẳng Giấy Đi lên, đi  Phân chia
xuống, từ 
tâm lan tỏa 
tròn
Phẳng Lớp mỏng Đi lên, đi  Hấp thu, 
xuống, từ  phân chia, 
tâm lan tỏa  trao đổi 
tròn ion, lọc gel
Cột Cột hở Đi xuống Hấp thu, 
phân chia, 
trao đổi 
ion, lọc gel
Cột Sắc ký khí  Nhờ vào  Hấp thu, 
(GC) ngoại lực phân chia
VI. CÁC LOẠI PHA TĨNH 
SỬ DỤNG TRONG SẮC 
KÝ:
a. Silica gel pha thường:
Silica gel làm pha tĩnh trong sắc ký 
được chế tạo bằng cách thủy giải 
silica natri (cho tác dụng với acid 
sulfiric) để thành acid 
polysilisic, tiếp theo là sự ngưng 
tụ và polymer hóa để đạt các chỉ 
tiêu vật lý cần thiết như có các 
hạt với kích cỡ hạt, thể tích lỗ 
rỗng trên bề mặt, diện tích bề mặt… 
như yêu cầu.
Có thể hiệu chỉnh tính hấp thu của 
silica gel bằng các cho silica gel 
kết hợp với những hợp chất khác như 
các bazo, các dung dịch đệm ở mức pH 
b. Silica gel chế hóa:
Silica gel­ tạo nối dùng cho 
pha đảo
   Loại silica gel pha đảo có tính kém phân 
cực nên có ái lực mạnh với các hợp chất 
kém phân cực, giữ chặt các hợp chất này 
lại trong cột. Pha động thường là nước 
Silica gel­ tạo nối dùng cho 
pha thường
   Thực hiện các phản ứng điều chế tương tự 
như trên nhưng  nhóm chất cuối dãy thường 
là phenyl, cyano, amino, diol,…
Silica gel – tạo nối dùng cho 
Loại pha tĩnh thủ tính Cơ chế bắt giữ chất 
của pha tĩnh
Pirkle Tương qua ba điểm
Polymer hình xoắn ốc­  Các nối kỵ nước 
thủ tính  (hydrophobic bond)
(polysacarid)
Cyclodextrin và eter  Tương tác giữa chủ­ 
vòng (crown ether) khách (tương tác giữa 
chất tan đối với lỗ 
rỗng có tính thủ tính 
của chủ là 
cyclodextrin)
Enzyme bị giữ cố định  Ái lực thủ tính
(Immobilised enzymes)
   Alumina là oxid aluminium 
Al2O3 được điều chế với là 
hydroxid aluminium, có thể điều 
chỉnh độ pH của dung dịch phản 
ứng để sản xuất ra hạt alumina 
với bề mặt có tính acid, tính 
kiềm hay trung tính.
   Nhiệt độ lúc hoạt hóa trong 
quá trình điều chế là đặc điểm 
khác nhau giữa alumina và 
silica gel. Muốn có alumina 
hoạt tính mạnh, cần phải đun 
Với sắc ký giấy, rất thuận tiện 
khi sử dụng tờ giấy lọc làm pha 
tĩnh, nhưng việc sử dụng trực 
tiếp có nhiều nhược điểm.
Ngược lại, nếu pha tĩnh làm 
bằng bột giấy, các hạt nhuyễn 
mịn và cùng kích thước sẽ tạo 
nên pha tĩnh đồng nhất nên pha 
động di chuyển dễ dàng hơn và 
chất tan không lan rộng trên bề 
   Gel là tên gọi chung cho các 
loại pha tĩnh được điều chế từ 
tinh bôt, agar (polysaccarid) 
hoặc polyacrylamid, trong đó 
các chuỗi dây dài được nối mạng 
ngang để tạo thành mạng không 
gian ba chiều. Gel thường được 
sử dụng trong sắc ký cột hoặc 
điện di
Tên thương  Gel thích  Thể tích gel 
mại của Gel hợp để tách  trương nở 
các hợp  trong nước 
chất có  (ml /g gel 
trọng lượng  khô)
phân tử 
(đơn vị C)
P­2 100 – 2.000 3
P­4 800 – 4.000 4
P­6 1.000 –  6,5
6.000
P­10 1.500 ­  7,5
Loại gel Gel thích  Thể gel 
Sephadex hợp để tách  trương nở 
các hợp  trong nước 
chất có  (ml/g gel 
trọng lượng  khô)
phân tử 
( đơn vị C)
G ­10 0 – 700 2,5
G – 15 0 – 1.500 3
G – 25 100 – 5.000 5
G – 50 500 – 10.000 10
G­ 100 1.000 –  15
    Sắc ký cột khô (Dry – 
column chromatography)
 Sắc ký nhanh ( còn gọi là sắc 
ký chớp nhoáng) (Flash 
chromatography)
 Sắc ký nhanh­ cột khô (Dry – 
column flash chromatography; 
Vacuum liquid chromatography)
       Sắc ký nhanh cột khô là một 
biến đổi của sắc ký chớp nhoáng, 
với một vài khác biệt sau:
Để gia tăng vận tốc giải ly của pha 
động, sắc ký chớp nhoáng sử dụng một 
lực đẩy từ trên đầu cột xuống, còn sắc 
ký nhanh – cột khô dùng một lực hút tạo 
chân không ở đầu ra của cột nhờ một máy 
bơm hút loại nhẹ.
Sắc ký chớp nhoáng sử dụng pha tĩnh là 
silica gel loại dùng cho sắc ký cột, 
còn sắc ký nhanh­ cột khô sử dụng 
silica gel dùng cho loại sắc ký lớp 
mỏng, cỡ hạt 15­ 40 micromet.
Trong quá trình giải ly, sắc ký chớp 
nhoáng vẫn giữ một lớp dung môi ở trên 
 [1] Nguyễn Kim Phi Phụng; Phương pháp cô 
lập các hợp chất hữu cơ; nhà xuất bản ĐHQG 
Tp.HCM – 2007 .
 [2] A. Braithwaite, F.J.Smith. 
Chromatographic methods. Kluwer Academic 
Publishrs. Boston­ london, 45­501,1999.
 [3] W.Clark Still, Michael Kahn Abhijit 
Mitra. Rapid chromatographic technique for 
preparative separations with moderate 
resolution. J. Org. chem, 1978
 http://academics.vmi.edu/chem_aa/CH402/experime
 http://courses.cm.utexas.edu/jrobertus/ch339k/o
 
Đề thi vào lớp 10 môn Toán |  Đáp án đề thi tốt nghiệp |  Đề thi Đại học |  Đề thi thử đại học môn Hóa |  Mẫu đơn xin việc |  Bài tiểu luận mẫu |  Ôn thi cao học 2014 |  Nghiên cứu khoa học |  Lập kế hoạch kinh doanh |  Bảng cân đối kế toán |  Đề thi chứng chỉ Tin học |  Tư tưởng Hồ Chí Minh |  Đề thi chứng chỉ Tiếng anh
Theo dõi chúng tôi
Đồng bộ tài khoản