Vui lòng download xuống để xem tài liệu đầy đủ.

Bài thuyết trình Các phương pháp sắc kí cột

Chia sẻ: | Ngày: ppt 47 p | 224

1
589
views

Sự tinh sạch của protein rất quan trọng vì từ protein tinh sạch chúng ta có thể xác định được trình tự acid amin, mối liên hệ về tiến hóa giữa các protein trong những cá thể khác nhau và khảo sát các chức năng sinh hóa của các protein đó. Để tinh sạch protein, người ta thường dựa vào các đặc điểm tương đồng và các tính chất khác nhau vốn có của nó.

Bài thuyết trình Các phương pháp sắc kí cột
Nội dung Text

  1.                               TS:  Ngô Đại Nghiệp  Lớp: SHO7B1                                                                            Nhóm 4                            MSSV                          Nguyễn Đinh Diễm Thụy             30700514  Huỳnh Thị Lệ Phương               
  2. Sự tinh sạch của protein rất quan  trọng vì từ protein tinh sạch chúng ta  có thể xác định được trình tự acid  amin, mối liên hệ về tiến hóa giữa các  protein trong những cá thể khác nhau  và khảo sát các chức năng sinh hóa của  các protein đó.  Để tinh sạch protein, người ta thường  dựa vào các đặc điểm tương đồng và các  tính chất khác nhau vốn có của nó.  Trong một số trường hợp, để dễ dàng  hơn cho việc tinh sạch, người ta gắn 
  3. Tủa protein Thẩm tích  Siêu lọc  Sắc ký (Sắc ký giấy, sắc ký cột, Sắc  ký lỏng – khí, Sắc lý ái lực miễn dịch,  Sắc ký ái lực, Sắc ký trao đổi ion,  Sắc ký cao áp lỏng…) Điện di protein (điện đi trên gel  Agarose, điện di trên gel  Polyacrylamide, điện di protein theo  điểm đẳng điện… ) Phương pháp tốt nhất để phân đoạn 
  4.    Sắc ký (Chromatography) là một phương pháp phân tách quan trọng nhất trong sinh học phân tử vì nó thích hợp với nhiều loại hợp chất và sản phẩm tinh sạch có thể được sử dụng ngay cho việc định lượng và định danh.    
  5.    
  6.      Sắc ký cột là phương pháp mà  chất nhồi (là pha tĩnh: hấp phụ,  trao đổi ion, phân bố gen) được  nhồi vào cột, dùng để phân chia  các chất trong hỗn hợp và tinh  chế các chất. Thông thường, người  ta hoà tan hỗn hợp chất nghiên  cứu vào một dung môi (pha động)  với lượng vừa đủ, rồi nạp lên  cột   theo cách phù hợp sao cho  chất nghiên cứu lan thành một lớp 
  7.       Phương pháp sắc ký dựa vào  sự phân bố khác nhau của các  chất giữa hai pha động và tĩnh.  Có nhiều nguyên nhân đưa đến sự  phân bố khác nhau của các chất,  nhưng chính sự lặp đi lặp lại  hiện tượng hấp phụ ­ phản hấp  phụ của các chất khi dòng pha  động chuyển động qua pha tĩnh là  nguyên nhân chủ yếu của việc  tách sắc ký. 
  8.        K=Cs/Cm=Nồng độ của hợp chất trong   pha tĩnh/Nồng độ của hợp chất trong  pha động.  
  9.      Dụng cụ:  Cột sắc kí ( giống như cái buret),  gồm 1 ống thủy tinh và 1 cái khóa,  nhưng không cần vạch chia độ, kích  thước lớn hoặc nhỏ tùy yêu cầu sử  dụng Chất nhồi cột (pha tĩnh, stationary  phase, thường dùng silicagel,) Chất  nhồi cột quyết định quá trình sắc kí.  Dung môi: thông thường chọn dung môi  phụ thuộc vào chất nhồi cột. 
  10. Thực hiện:    Bước 1 là nhồi cột: Sau khi đã chọn  cột, làm khô và cân silicagel cần  dùng, pha dung môi chạy hệ rồi thì hòa  tan silicagel vào dung môi đó.     Bước 2 nạp mẫu chất vào: Có 2 loại  nạp mẫu là nạp mẫu khô và nạp mẫu ướt.     Bước 3: sau khi hoàn tất việc nạp  mẫu rồi thì lót 1 miếng bông gòn ở bên  trên mẫu chất để ổn định hệ rồi tiếp  tục châm dung môi vào, từ từ thay đổi  độ phân cực của hệ, Bước 4 mở khóa:  lúc này cột bắt đầu tách chất, hứng  lượng dung môi chảy ra, mỗi lần hứng  khoảng 1/5 hũ .Sau đó đem chấm bản các hủ  bi, những hủ có vệt tương tự nhau sẽ được  gom lại, đó là 1 chất. Tiếp tục như vậy 
  11.    Đây là phương pháp sắc ký đơn  giản nhất. ví dụ, hai chất A và  B liên tục chảy qua cột có nạp  sẵn các các chất hấp phụ. Người  ta xác định nồng độ các cấu tử  trong dung dịch chảy ra khỏi cột  và xây dựng đồ thị theo hệ toạ  độ: nồng độ cấu tử­ thể tích  dung dịch chảy qua cột. đồ thị  này thường gọi là sắc ký đồ hay  đường cong thoát (có tác giả 
  12.    Trong phương pháp rửa giải, đầu  tiên người ta cho Vml dung dịch  chứa hỗn hợp các cấu tử (ví dụ, hỗn  hợp hai cấu tử A và B, trong đó A  có ái lực với cột nhỏ hơn B) chạy  qua cột. Các cấu tử A, B chứa trong  Vml trước hết sẽ bị giữ lại ở phần  trên của cột. Sau đó cho dung dịch  rửa (thường là dung môi hoà tan các  cấu tử) chảy qua cột. Lúc đó các  cấu tử bị giữ ở phần trên của cột 
  13.    Trong phương pháp rửa đẩy,  sau khi đưa mẫu vào cột, ta cho  chảy qua cột một dung dịch rửa  chứa chất có ái lực với pha tĩnh  lớn hơn các cấu tử cần tách.  Các cấu tử cần tách sẽ bị chuyển  dần xuống phía dưới khi ta tiến  hành quá trình rửa cột và tuần  tự thoát ra khỏi cột. Cấu tử  thoát ra khỏi cột đầu tiên là  cấu tử tương tác với pha tĩnh 
  14.      V. PHÂN LOẠI CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ:
  15.     Pha tĩnh: có thể là chất  rắn hoặc chất lỏng.  Pha tĩnh là chất rắn :  thường là alumin hoặc silica  gel đã được xử lý, nó có  thể nạp nén vào trong một  cột  Pha tĩnh là chất lỏng: có  thể là một chất lỏng được  tẩm lên bề mặt một chất mang 
  16.     Pha động : có thể là chất  lỏng hoặc chất khí. Pha động là chất khí: thí  dụ trong kỹ thật sắc ký khí.  Trong trường hợp này chất  khí được gọi là khí mang hay  khí vecto.  Pha động là chất lỏng: thí  dụ trong kỹ thuật sắc ký  giấy, sắc ký lớp mỏng, sắc  ký cột. Trong trường hợp này 
  17.     Sắc ký phân chia (Partition  chromatography) Pha động là chất lỏng hoặc chất khí  (trong sắc ký khí). Pha tĩnh là chất lỏng, lớp chất lỏng với chiều dày rất mỏng, chất lòng  này được nối hóa học lên bề mặt của  những hạt rắn, nhuyễn mịn và có tính 
  18.    Sắc ký hấp thu (Adsorption  chromatography) Pha động là chất lỏng hoặc chất khí Pha tĩnh là chất rắn: đó là những  hạt rắn nhuyễn mịn, có tính trơ,  được nhồi trong một cái ống. bản  thân hạt rắn là pha tĩnh, pha tĩnh  thường sử dụng là những hạt silica  gel hoặc alumin.
Đồng bộ tài khoản