intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE
 » 

Báo cáo môn Công nghệ nuôi cấy mô và chọn giống - đề tài: "Hợp chất thứ cấp"

Chia sẻ: Tran Minh Kien | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:30

Thêm vào BST
Báo xấu
425
lượt xem 115
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Sản phẩm trao đổi chất bậc 2 hay hợp chất thứ cấp là những sản phẩm được tạo ra trong tế bào nhờ các quá trình trao đổi chất xảy ra trong tế bào, sau đó chúng thoát ra khỏi tế bào và đi ra môi trường ngoài. Phần lớn các hợp chất thứ cấp thường không có ý nghĩa sinh lý đối với bản thân các tế bào. Quá trình tạo ra những sản phẩm bậc 2 chỉ thông qua những cơ chế chuyển hóa rất tự nhiên của tế bào, cũng có thể do sự sai lệch về thông...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Báo cáo môn Công nghệ nuôi cấy mô và chọn giống - đề tài: "Hợp chất thứ cấp"

  1. LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Báo cáo môn Công nghệ nuôi cấy mô và chọn giống đề tài: "Hợp chất thứ cấp"
  2. Môn: CN nuôi cấy mô và chọn giống 2 GVHD: TS. Trần Thị Dung Đề tài: Hợp chất thứ cấp Mục lục 1.1. Định nghĩa .............................................................................. 4 1.2. Phân loại ................................................................................. 4 2.1 Đặc điểm sinh lý của tế bào đơn trong nuôi cấy ................. 7 2.2 Những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy tế bào đơn trong môi trường lỏng........................................................... 9 2.2.1 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng ........................ 9 2.2.2 Ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng .............................. 9 Nguồn carbon ......................................................................... 10 Ánh sáng ................................................................................. 10 Vi lượng và các chất khác...................................................... 10 3. Sự tích lũy các hợp chất thứ cấp trong tế bào thực vật....... 10 4. Phương pháp làm tăng sản lượng các hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy tế bào............................................................................. 11 4.1. Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy............................................. 11 4.2. Chọn lọc các dòng tế bào cho năng suất cao...................... 12 4.3. Cung cấp tiền chất (precursor feeding). ............................ 12 4.4. Sự kích kháng bảo vệ thực vật (elicitation). ...................... 13 5. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào đơn thu hợp chất thứ cấp ............ 13 Mẫu thực vật................................................................................. 13 Xử lý mẫu thực vật ....................................................................... 13 Nuôi cấy tạo thành mô sẹo............................................................ 13 Nuôi cấy trong môi trường lỏng trong bình thủy tinh có dung tích nhỏ, lắc liên tục............................................................................. 13 Nuôi cấy trong các thiết bị lên men có dung tích lớn, khuấy đảo liên tục .......................................................................................... 13 Ly tâm hoặc lọc ............................................................................ 13 Nuôi cấy tạo thành mô sẹo..................................................... 14 6. Các ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật trong sản xuất các hoạt chất sinh học ....................................................................... 15 SVTH: Trần Minh Kiển Trang 2 Nguyễn Văn Huẩn Phùng Thị Mỹ Trinh
  3. Môn: CN nuôi cấy mô và chọn giống 3 GVHD: TS. Trần Thị Dung Đề tài: Hợp chất thứ cấp 7. Ứng dụng cụ thể trong việc sản xuất hợp chất thứ cấp....... 21 Lê Thị Thủy Tiên(1), Bùi Trang Việt(2), Nguyễn Đức Lượng(1) ...................................................................................................... 21 1. MỞ ĐẦU.................................................................................. 21 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP................................. 22 2.1. Nguyên liệu........................................................................... 22 2.2. Phương pháp ........................................................................ 22 2.2.1. Nuôi cấy dịch treo tế bào ................................................... 22 2.2.2. Ảnh hưởng của hàm lượng saccharose, sự phối hợp 2,4-D và kinetin, PVP và acid ascorbic trên sự tăng trưởng của dịch treo tế bào..................................................................................... 22 3. KẾT QUẢ, THẢO LUẬN...................................................... 22 3.2. Ảnh hưởng của hàm lượng saccharose trong môi trường nuôi cấy trên sự tăng .................................................................. 24 4. KẾT LUẬN ............................................................................. 27 SVTH: Trần Minh Kiển Trang 3 Nguyễn Văn Huẩn Phùng Thị Mỹ Trinh
  4. Môn: CN nuôi cấy mô và chọn giống 4 GVHD: TS. Trần Thị Dung Đề tài: Hợp chất thứ cấp 1. Các hợp chất thứ cấp thực vật 1.1. Định nghĩa Sản phẩm trao đổi chất bậc 2 hay hợp chất thứ cấp là những sản phẩm được tạo ra trong tế bào nhờ các quá trình trao đổi chất xảy ra trong tế bào, sau đó chúng thoát ra khỏi tế bào và đi ra môi trường ngoài. Phần lớn các hợp chất thứ cấp thường không có ý nghĩa sinh lý đối với bản thân các tế bào. Quá trình tạo ra những sản phẩm bậc 2 chỉ thông qua những cơ chế chuyển hóa rất tự nhiên của tế bào, cũng có thể do sự sai lệch về thông tin di truyền trong tế bào dẫn đến hiện tượng sinh tổng hợp thừa. Thực vật là nguồn cung cấp các hợp chất dùng làm dược liệu hoặc phụ gia thực phẩm có giá trị. Những sản phẩm này được biết như là các chất trao đổi thứ cấp, thường được hình thành với một lượng rất nhỏ trong cây và chức năng trao đổi chất chưa được biết đầy đủ. Chúng dường như là sản phẩm của các phản ứng hóa học của thực vật với môi trường hoặc là sự bảo vệ hóa học chống lại vi sinh vật và động vật. Những nghiên cứu về các hợp chất thứ cấp có nguồn gốc thực vật đã phát triển từ cuối những năm 50 của thế kỷ 20 (Rao và cs 2002). 1.2. Phân loại Các chất trao đổi thứ cấp có thể xếp trong ba nhóm chính là alkaloid, tinh dầu và glycoside. Các alkaloid có dạng tinh thể là các hợp chất chứa nitrogen, có hoạt tính sinh lý trên tất cả động vật và được sử dụng trong công nghiệp dược. Họ alkaloid bao gồm: codein, nicotine, caffeine và morphine. Một số loài thực vật chứa nhiều alkaloid như: cây thuốc phiện (họ Papaveraceae), cây canh – ki – na (họ Rubiaceae), cây cà độc dược, thuốc lá và khoai tây (họ Solanaceae). Người ta thường gặp trong một cây tập hợp các alkaloid có cấu trúc hóa học gần giống nhau. Đôi khi toàn cây chứa alkaloid, đôi khi chỉ tập trung trong lá (thuốc lá, chè, SVTH: Trần Minh Kiển Trang 4 Nguyễn Văn Huẩn Phùng Thị Mỹ Trinh
  5. Môn: CN nuôi cấy mô và chọn giống 5 GVHD: TS. Trần Thị Dung Đề tài: Hợp chất thứ cấp cacao), trong quả (thuốc phiện), trong rễ (cà độc dược, cây phụ tử), trong vỏ (canh-ki-na). Trong cùng một cây có thể tùy theo bộ phận của cây mà tạo ra những alkaloid khác nhau (họ Taxaceae). Các alkaloid có hoạt tính sinh học rất khác biệt, một số có tác dụng lên hệ thần kinh (caffein, atropin, strychnin…), một số tác dụng lên các cơ (veratrin, atropin…), một số tác dụng lên mạch máu (hydrastin, ephedrin...), một số khác tác dụng lên bộ máy hô hấp (morphin…). Alkaloid thường độc ở liều lượng lớn nhưng với liều lượng nhỏ có tác dụng làm thuốc chữa bệnh (Misawa, 1994). Các tinh dầu chứa hỗn hợp terpenoid, được sử dụng như chất mùi, chất thơm và dung môi. Giống như những lipid khác, terpenoid không tan trong nước. terpene được xây dựng từ những đơn vị 5 carbon và được thiết lập từ nhiều đơn vị isoprene, ví dụ monoterpene chứa 2 đơn vị isoprene, sesquiterpene chứa 3 đơn vị isoprene, diterpene chứa 4 đơn vị isoprene (Lee 2001). Các glycoside bao gồm các hợp chất phenol và flavonoid, saponin và các cyanogenic glycoside, một số trong chúng được sử dụng làm thuốc nhuộm, chất mùi thực phẩm và dược phẩm (Lee 2001). 2. Nuôi cấy tế bào đơn để thu hợp chất thứ cấp SVTH: Trần Minh Kiển Trang 5 Nguyễn Văn Huẩn Phùng Thị Mỹ Trinh
  6. Môn: CN nuôi cấy mô và chọn giống 6 GVHD: TS. Trần Thị Dung Đề tài: Hợp chất thứ cấp Kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật tiêu biểu cho tiềm năng cải thiện các hợp chất có giá trị trong y dược, gia vị, hương liệu và màu nhuộm mà không thể sản xuất chúng từ các tế bào vi sinh vật hoặc tổng hợp bằng con đường hóa học. Những năm gần đây, sự phát triển của các hợp chất thứ cấp quan trọng trong thương mại là kết quả được mong đợi nhất trong lĩnh vực nghiên cứu này. Ưu thế về mặt nguyên lý của kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật là có thể cung cấp liên tục nguồn nguyên liệu để tách chiết một tỷ lệ lớn lượng hoạt chất từ tế bào thực vật nuôi cấy (Mulbagal and Tsay, 2004). Một trong những nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến việc sản xuất các hợp chất thứ cấp từ tế bào thực vật là sự phân hóa hình thái. Nhiều hợp chất thứ cấp được sản xuất trong suốt quá trình phân hóa tế bào, vì thế chúng được tìm thấy trong các mô có khả năng phân hóa cao như rễ, lá và hoa. Do sự phân hóa hình thái và sự trưởng thành không xuất hiện trong nuôi cấy tế bào nên các chất thứ cấp có khuynh hướng ngưng tạo thành trong quá trình nuôi cấy. Tuy nhiên, các tế bào không phân hóa trong nuôi cấy huyền phù thường tạo thành một khối vài trăm tế bào, các tế bào ở giữa khối có sự tiếp xúc với môi trường khác với các tế bào ở bên ngoài nên sự phân hóa sẽ xuất hiện tới một mức độ nào đó trong khối để tạo thành các chất thứ cấp (Lee 2001). Nuôi cấy tế bào huyền phù thường khởi đầu bằng cách đặt các khối callus dễ vỡ vụn trong môi trường lỏng chuyển động (lắc hoặc khuấy). Trong quá trình nuôi cấy, các tế bào sẽ dần dần tách ra khỏi mẫu do những chuyển động xoáy của môi trường. Sau một thời gian ngắn trong dịch huyền phù sẽ có các tế bào đơn, các cụm tế bào với kích thước khác nhau, các mẫu nuôi cấy còn thừa chưa phát triển và các tế bào chết. Tuy nhiên, cũng có những dịch huyền phù hoàn hảo, chứa tỷ lệ cao các tế bào đơn và tỷ lệ nhỏ các cụm tế bào. SVTH: Trần Minh Kiển Trang 6 Nguyễn Văn Huẩn Phùng Thị Mỹ Trinh
  7. Môn: CN nuôi cấy mô và chọn giống 7 GVHD: TS. Trần Thị Dung Đề tài: Hợp chất thứ cấp Mức độ tách rời của tế bào trong nuôi cấy phụ thuộc vào đặc tính của các khối tế bào xốp và có thể điều chỉnh bằng cách thay đổi thành phần môi trường (Misawa, 1994). Bên cạnh nuôi cấy tế bào huyền phù, nuôi cấy callus (trên môi trường rắn) có ưu điểm là thao tác thí nghiệm đơn giản, dễ vận chuyển mẫu nhưng nhược điểm là thể tích nuôi cấy bé nên khó phát triển ở quy mô công nghiệp, mẫu nuôi cấy chỉ tiếp xúc được một mặt với nguồn dinh dưỡng, những sản phẩm do mẫu nuôi cấy tạo ra trong quá trình trao đổi chất sẽ tích tụ xung quanh dẫn đến làm chậm sự sinh trưởng của tế bào. Vì thế, nuôi cấy tế bào huyền phù thích hợp hơn cho việc sản xuất sinh khối tế bào thực vật vì có thể duy trì và thao tác tương tự với các hệ thống lên men vi sinh vật ngập chìm trong môi trường lỏng. 2.1 Đặc điểm sinh lý của tế bào đơn trong nuôi cấy Nhiều nhà khoa học khi nghiên cứu sự phát triển của tế bào đơn trong môi trường nuôi cấy lỏng theo phương pháp gián đoạn cho thấy 1 số đặc điểm sau Tế bào đơn khi phát triển trong môi trường lỏng thường tạo ra dòng tế bào. Dòng tế bào là 1 huyền phù gồm nhiều tế bào tạo thành và có những đặc điểm sau: + Cho phép tách riêng từng tế bào rất dễ dàng, sự gắn kết các tế bào với nhau thường không chặt chẽ. SVTH: Trần Minh Kiển Trang 7 Nguyễn Văn Huẩn Phùng Thị Mỹ Trinh
  8. Môn: CN nuôi cấy mô và chọn giống 8 GVHD: TS. Trần Thị Dung Đề tài: Hợp chất thứ cấp + Trong quá trình nuôi cấy trong cùng một điều kiện, các tế bào được sinh ra có sự đồng nhất cao, cả về mặt di truyền, hình thái và sinh lý. Tính đồng nhất này có ý nghĩa trong điều hành kỹ thuật như tách chiết, tinh sạch. + Tế bào đơn thường có nhân to hơn, nguyên sinh chất đậm đặc hơn tế bào nguyên thủy trong mô thực vật. + Tế bào có khả năng phân chia trong khoảng thời gian 24 – 72 giờ. + Tế bào bị mất tính toàn năng. + Tế bào bị tăng mức bội thể. Trong quá trình phát triển, các tế bào đơn thường phát triển theo đúng chu kỳ sinh trưởng của nhiều tế bào sinh vật: + Giai đoạn thích nghi + Giai đoạn tăng trưởng + Giai đoạn cân bằng + Giai đoạn suy tàn Đường cong tăng trưởng trên cùng một môi trường có sự khác nhau rất lớn ở từng loại thực vật, thậm chí ở từng cơ quan của thực vật. Các tế bào thực vật thường tạo ra một quần thể dị biệt. Phổ biến dị của tế bào thực vật lớn và dễ nhận thấy trong khi nuôi. Do đó việc kiểm soát quá trình nuôi cấy phải được thực hiện rất nghiêm ngặt. Trong quá trình nuôi cấy sẽ xảy ra hệ thống phân chia đồng bộ, hệ thống này tạo ra những thế hệ tế bào có cùng tuổi sinh lý, phát triển, có cùng thời điểm trao đổi chất mạnh hay yếu. Do đó trong quá trình nuôi cấy cần phải lưu ý những điểm sau + Có sự thay đổi chất dinh dưỡng, nhất là thành phần khoáng cho thích hợp. + Có sự thay đổi chất điều hòa sinh trưởng cho phù hợp với từng thời kỳ phát triển. + Có sự thay đổi điều kiện chiếu sáng cho phù hợp với từng thời kỳ phát triển. Nguyên liệu để nuôi cấy tế bào đơn trong môi trường lỏng là những tế bào mô sẹo hoặc những tế bào lai hữu tính. Trong quá trình nuôi cấy có thể xảy ra những thay đổi về mặt di truyền do tác động của các yếu tố bên ngoài. Vì vậy, phải kiểm soát thường xuyên SVTH: Trần Minh Kiển Trang 8 Nguyễn Văn Huẩn Phùng Thị Mỹ Trinh
  9. Môn: CN nuôi cấy mô và chọn giống 9 GVHD: TS. Trần Thị Dung Đề tài: Hợp chất thứ cấp để loại những tính trạng xấu làm thoái hóa tế bào và giữ lại những tính trạng tốt để duy trì và làm tăng giá trị của tế bào. 2.2 Những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy tế bào đơn trong môi trường lỏng 2.2.1 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng Phần lớn các chất điều hòa sinh trưởng làm tăng quá trình phân bào. Các chất điều hòa sinh trưởng làm tăng quá trình biệt hóa tế bào để tạo ra những cơ quan riêng biệt của cây như rễ, thân, lá.. Các chất điều hòa sinh trưởng có ảnh hưởng đến việc tạo những hợp chất thứ cấp. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật thường được sử dụng với hàm lượng rất nhỏ từ 1 – 10 mg/l Hầu hết các tế bào thực vật đều cần những chất điều hòa sinh trưởng sau: + Nhóm auxin gồm IAA, NAA, IBA, 2,4 – D + Nhóm cytokinin gồm kinetin, zeatin, BA, IPA + Gibberellin Ở nhiều loại cây một lá mầm như lúa, không cần bổ sung cytokinin vì chúng có khả năng tự tổng hợp zeatin, riboside. Như vậy, cần chú ý vần đề quan trọng là khả năng tự tổng hợp các chất điều hòa sinh trưởng thực vật. Khi có nhu cầu cần thiết phải bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng từ bên ngoài. Việc bổ sung auxin vào môi trường nuôi cấy là hoàn toàn cần thiết. Chúng tar61 cần cho quá trình phân chia tế bào và quá trình biệt hóa tế bào. Auxin lại đặc biệt quan trọng đối với tế bào cây một lá mầm. Auxin làm tăng lượng DNA trong tế bào và làm tăng sinh khối tế bào khi nuôi cấy. 2.2.2 Ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng Nguồn đạm Nguồn đạm từ các muối nitrat thường được tế bào dễ hấp thu hơn cả. Đôi khi người ta sử dụng nguồn đạm từ hỗn hợp nitrat và ammonium. Cũng có nhiều trường hợp người ta sử SVTH: Trần Minh Kiển Trang 9 Nguyễn Văn Huẩn Phùng Thị Mỹ Trinh
  10. Môn: CN nuôi cấy mô và chọn giống 10 GVHD: TS. Trần Thị Dung Đề tài: Hợp chất thứ cấp dụng nguồn đạm hữu cơ. Nhưng về cơ bản, các nguồn đạm từ các muối vô cơ hòa tan thường thích hợp cho nuôi cấy tế bào hơn cả. Nguồn carbon Người ta thường sử dụng đường saccharose như nguồn carbon trong nuôi cấy tế bào đơn thực vật. đối với nhiều loại thực vật, tế bào lại cần mannose, galactose, glucose hơn. Các nghiên cứu cho thấy nguồn carbon có ảnh hưởng rất nhiều đến việc tạo thành các sản phẩm trao đổi chất bậc 2. Ánh sáng Tế bào thực vật là loại tế bào tự dưỡng. Trong quá trình phát triển chúng cần ánh sáng cho quá trình quang hợp. Chu kỳ tối, sáng có ảnh hưởng rất lớn đến thành phần và số lượng các sản phẩm trao đổi chất bậc 2. Do đó, trong nuôi cấy, việc điều khiển cường độ ánh sáng, thời gian chiếu sáng là điều đặc biệt quan trọng. Vi lượng và các chất khác Tùy theo loài thực vật mà nhu cầu về các nguyên tố vi lượng, vitamin và các chất khác có khác nhau. Do đó khi nuôi cấy phải chú ý đến nhu cầu sinh lý của chúng để tạo ra môi trường nuôi cấy thích hợp. 3. Sự tích lũy các hợp chất thứ cấp trong tế bào thực vật Sự tiến bộ vượt bậc của công nghệ sinh học trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật giúp nhân giống các cây trồng có giá trị và tách chiết các hóa chất quý hiếm mang lại nhiều ý nghĩa về mặt thương mại. Phương pháp này sẽ mở rộng và tăng khả năng thu hồi các hóa chất giá trị có nguồn gốc thực vật, một sự thay thế từ quy mô nông nghiệp truyền thống lên quy mô công nghiệp trong sản xuất các hợp chất thứ cấp (Dicosmo và Misawa 1995). Kỹ thuật nuôi cấy tế bào được khởi xướng từ cuối những năm 60 của thế kỷ 20 như là một công cụ hữu ích để nghiên cứu và sản xuất hợp chất thứ cấp thực vật. Kỹ thuật này được phát triển với mục tiêu cải thiện hiệu suất các sản phẩm có hoạt tính sinh học. Ưu SVTH: Trần Minh Kiển Trang 10 Nguyễn Văn Huẩn Phùng Thị Mỹ Trinh
  11. Môn: CN nuôi cấy mô và chọn giống 11 GVHD: TS. Trần Thị Dung Đề tài: Hợp chất thứ cấp điểm của chúng là có thể cung cấp sản phẩm một cách liên tục và đáng tin cậy dựa trên những lý do sau: (1) Tổng hợp các hợp chất thứ cấp có giá trị diễn ra dưới sự điều khiển các yếu tố môi trường nuôi cấy, độc lập với khí hậu và điều kiện đất trồng. (2) Phủ định ảnh hưởng sinh học đến các sản phẩm là hợp chất thứ cấp trong tự nhiên (vi sinh vật và côn trùng) (3) Có thể chọn lọc các giống cây trồng cho nhiều loại hợp chất thứ cấp khác nhau (4) Với việc tự động hóa điều khiển sự sinh trưởng của tế bào và điều hòa quá trình chuyển hóa, chi phí có thể giảm và lượng sản phẩm tăng lên. Bên cạnh đó, những kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy nuôi cấy tế bào huyền phù của thực vật cũng được sử dụng để sản xuất các sản phẩm protein tái tổ hợp (Fisher và cs 1999). 4. Phương pháp làm tăng sản lượng các hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy tế bào Trong nuôi cấy tế bào, việc chọn lựa cẩn thận các tế bào có khả năng phát triển và điều kiện nuôi cấy tối ưu sẽ giúp tăng khả năng tích lũy một vài sản phẩm ở mức cao hơn. Để thu được hiệu suất cao cho khai thác thương mại, người ta đã sử dụng nhiều phương pháp khác nhau trong nỗ lực tập trung vào việc kích thích hoạt động sinh tổng hợp của các tế bào nuôi cấy (Rao 2000, Dixon 1999). Tế bào nuôi cấy tích lũy một lượng lớn hợp chất thứ cấp chỉ khi ở những điều kiện đặc biệt như (1) chọn lựa thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp, (2) chọn lựa các dòng tế bào năng suất cao, (3) bổ sung tiền chất nuôi cấy và (4) các chất kích kháng bảo vệ thực vật (Mulbagal and Tsay 2004). 4.1. Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy. Các thông số hóa học và vật lý như thành phần và pH môi trường, chất điều hòa sinh trưởng, nhiệt độ nuôi cấy, sự thông khí, sự lắc hoặc khuấy, và ánh sáng ảnh hưởng đến hàm lượng các hợp chất thứ cấp đã được nghiên cứu nhiều (Goleniowski và Trippi 1999, Lee và Shuler 2000, Wang và cs 1999). Một vài sản phẩm tích lũy trong tế bào ở mức cao hơn so với ở trong cây trồng tự nhiên khi được nuôi cấy ở điều kiện tối ưu. Các thông số vật lý và SVTH: Trần Minh Kiển Trang 11 Nguyễn Văn Huẩn Phùng Thị Mỹ Trinh
  12. Môn: CN nuôi cấy mô và chọn giống 12 GVHD: TS. Trần Thị Dung Đề tài: Hợp chất thứ cấp yếu tố dinh dưỡng trong một mẻ có thể gần như là yếu tố cơ bản cho việc tối ưu hóa hiệu suất nuôi cấy. Môi trường nuôi cấy thường dùng là môi trường MS. Nhiệt độ trong khoảng 17-25oC thường được áp dụng để cảm ứng tạo mô sẹo và sự tăng trưởng của tế bào nuôi cấy. Độ pH của môi trường thường được chỉnh trong khoảng 5-6 trước khi hấp khử trùng, cần tránh chỉnh pH quá cao hoặc quá thấp. Mỗi loài thực vật có những điều kiện tối thích cho sự tăng trưởng của tế bào và sự sản xuất các hợp chất thứ cấp, vì vậy cần xác định rõ điều kiện nuôi cấy thích hợp trong mỗi trường hợp. 4.2. Chọn lọc các dòng tế bào cho năng suất cao. Các tế bào thực vật trong nuôi cấy là một tập hợp các đặc điểm sinh lý độc lập. Chọn lọc tế bào dựa vào khả năng tổng hợp một vài hợp chất có giá trị cao trong nuôi cấy đã được Berlin và Sasse công bố năm 1985, và sau đó phương thức này đã được ứng dụng rộng rãi. Chẳng hạn, một dòng tế bào của cây bát tiên (Euphorbia milli) sau 24 lần chọn lọc đã tích lũy gấp khoảng 7 lần lượng anthocyanin được sản xuất từ nuôi cấy tế bào bố mẹ (Yamamoto và cs 1982). Yamada và Sato (1981) đã chọn lọc được một dòng tế bào của Coptis japonica có khả năng sinh trưởng gấp 6 lần trước đây sau 3 tuần nuôi cấy và lượng berberin đạt tới 1,2 g/L. 4.3. Cung cấp tiền chất (precursor feeding). Bổ sung các tiền chất của quá trình sinh tổng hợp nội bào vào môi trường nuôi cấy cũng có thể tăng lượng sản phẩm mong muốn do một số hợp chất trung gian nhanh chóng bắt đầu sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp và vì thế làm tăng lượng sản phẩm cuối cùng. Phương pháp này hữu ích khi dùng các tiền chất có giá thành rẻ. Tăng cường kích thích hoặc bổ sung tiền chất hoặc các hợp chất tương tự mang lại hiệu quả trong nhiều trường hợp (Silvestrini và cs 2002; Moreno và cs 1993). Chẳng hạn, bổ sung phenylalanine khi nuôi cấy tế bào huyền phù cây Salvia officinalis đã kích thích tạo ra rosmarinic acid, cung cấp ferulic acid trong nuôi cấy tế bào cây Vanilla planifolia đã tăng tích lũy valnillin, hoặc SVTH: Trần Minh Kiển Trang 12 Nguyễn Văn Huẩn Phùng Thị Mỹ Trinh
  13. Môn: CN nuôi cấy mô và chọn giống 13 GVHD: TS. Trần Thị Dung Đề tài: Hợp chất thứ cấp bổ sung leucine dẫn đến việc tăng các monoterpen dễ bay hơi trong nuôi cấy Perilla frutiscens (Mulbagal and Tsay 2004). 4.4. Sự kích kháng bảo vệ thực vật (elicitation). Thực vật sản xuất các hợp chất thứ cấp trong tự nhiên như một bộ máy bảo vệ chống lại các yếu tố gây bệnh. Chất kích kháng bảo vệ thực vật (elicitor) báo hiệu việc hình thành các hợp chất thứ cấp. Sử dụng các elicitor của bộ máy bảo vệ cây, tức sự kích kháng bảo vệ thực vật, là phương thức để thu được các sản phẩm hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học một cách hiệu quả nhất. Sử dụng các elicitor sinh học và phi sinh học (được phân loại dựa trên nguồn gốc của chúng) để kích thích hình thành các hợp chất thứ cấp trong quá trình nuôi cấy tế bào, có thể giúp rút ngắn thời gian và đạt hiệu suất cao (DiCosmo và Tallevi, 1985). 5. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào đơn thu hợp chất thứ cấp Mẫu thực vật Xử lý mẫu thực vật Nuôi cấy tạo thành mô sẹo Nuôi cấy trong môi trường lỏng trong bình thủy tinh có dung tích nhỏ, lắc liên tục Nuôi cấy trong các thiết bị lên men có dung tích lớn, khuấy đảo liên tục Ly tâm hoặc lọc Dịch lọc được xử lý để Bã thu hợp chất thứ cấp Dùng cho chăn nuôi Tái sử dụng để hoặc làm phân bón sản xuất cây con Mẫu thực vật Mẫu tế bào dùng để nuôi cấy phải có những tính chất quan trọng sau: (1) Mẫu tế bào phải được lấy từ cây đã biết chắc chắn có khả năng sinh tổng hợp các chất cần quan tâm. SVTH: Trần Minh Kiển Trang 13 Nguyễn Văn Huẩn Phùng Thị Mỹ Trinh
  14. Môn: CN nuôi cấy mô và chọn giống 14 GVHD: TS. Trần Thị Dung Đề tài: Hợp chất thứ cấp (2) Mẫu tế bào phải được lấy từ cơ quan hay bộ phận trên cây nói trên và ở bộ phận này, hàm lượng các chất yêu cầu có khả năng được tổng hợp và chuyển hóa cao nhất. (3) Mẫu tế bào phải sạch bệnh và đang trong giai đoạn phát triển mạnh nhất. Xử lý mẫu thực vật Khi chọn được mẫu thực vật thì ta tiến hành khử trùng mẫu theo các bước sau: - Rửa mẫu dưới vòi nước chảy trong 30 đến 2 giờ - Rửa mẫu bằng xà phòng loãng, đôi lúc cần dùng thêm dung dịch thuốc trừ nấm loãng. - Rửa lại mẫu cho sạch xà phòng. - Ngâm mẫu trong dung dịch thuốc khử trùng hypochlorite sodium 0.5 – 5.25%, ngoài ra còn có thể sử dụng các loại chất khử trùng khác như hypochlorite canxi, cồn, chlorua thủy ngân, bạc nitrat. Có thể sử dụng thêm Tween để tăng hiệu quả khử trùng. - Chuyển mẫu vào tủ cấy và rửa lại nhiều lần bằng nước cất 2 lần. Nuôi cấy tạo thành mô sẹo Khi mẫu cấy tạo thành mô sẹo, người ta cấy mô sẹo này vào trong môi trường lỏng dùng để nuôi cấy tế bào đơn. Môi trường có thành phần như sau: - Khoáng MS - Nước dừa - 2.4 D hoặc các loại auxin khác - Bột chiết nấm mem - Saccharose … tùy loại thực vật và loại mô nuôi cấy. Đầu tiên mô sẹo được nuôi trong các bình tam giác 200ml có chứa 20ml môi trường và lắc với tốc độ 90 – 100 vòng/phút. Nuôi ở nhiệt độ 28-30oC, với ánh sáng 3000 lux. Khoảng 2-3 ngày lấy mẫu ra kiểm tra bằng cách đếm dưới kính hiển vi, xây dựng đường cong tăng trưởng của tế bào. Sau 1-2 tuần tùy theo lòai thực vật, trong bình nuôi cấy sẽ tạo huyền phù tế bào. Trong huyền phù tế bào có 2 loại tế bào: - Tế bào có khả năng sinh phôi - Tế bào không có khả năng sinh phôi SVTH: Trần Minh Kiển Trang 14 Nguyễn Văn Huẩn Phùng Thị Mỹ Trinh
  15. Môn: CN nuôi cấy mô và chọn giống 15 GVHD: TS. Trần Thị Dung Đề tài: Hợp chất thứ cấp Theo kinh nghiệm nuôi cấy của các nhà nghiên cứu cho thấy sinh khối thu được cao nhất ở ngày thứ 8. Ta chuyển toàn bộ sinh khối này sang quá trình nuôi kế tiếp. Dung tích mỗi lần nuôi sau nhiều hơn lần nuôi trước khoảng 10-15 lần. Cứ như vậy, ta nhân giống cho đến khi đủ lượng giống cho sản xuất lớn. Tỉ lệ tiếp giống trong sản xuất lớn khoảng 1- 5%. Hiện nay, người ta đã thiết kế những thiết bị nuôi cấy tế bào đơn với dung tích hàng chục m3. Trong thiết kế và chế tạo các bình nuôi cấy tế bào đơn thực vật cần lưu ý là có cánh khuấy để tăng lượng oxy hòa tan trong môi trường nuôi cấy. và phải có hệ thống chiếu sáng đảm bảo cho quá trình tự dưỡng của tế bào xảy ra. Huyền phù tế bào sau khi kết thúc quá trình nuôi cấy được đem đi ly tâm và sản phẩm thứ cấp nằm trong dung dịch ly tâm. Áp dụng những phương pháp hóa lý tương ứng để tách những sản phẩm thứ cấp này ra khỏi dung dịch và đem tinh chế sẽ thu được hợp chất thứ cấp. 6. Các ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật trong sản xuất các hoạt chất sinh học Những năm gần đây, thuốc truyền thống trở thành một đề tài quan trọng mang tính toàn cầu. Mặc dù ở các nước phát triển người ta thường sử dụng tân dược trong điều trị nhưng các loại thuốc có nguồn gốc thảo mộc vẫn được dùng phổ biến do yếu tố lịch sử và văn hóa. Theo các đánh giá về mặt khoa học, nhiều loài thảo mộc có thể ứng dụng trong y học. Vấn đề đặt ra là vùng sinh trưởng của cây thuốc đang biến mất nhanh chóng do sự không ổn định của điều kiện môi trường và các yếu tố khác. Như vậy, thật khó có một SVTH: Trần Minh Kiển Trang 15 Nguyễn Văn Huẩn Phùng Thị Mỹ Trinh
  16. Môn: CN nuôi cấy mô và chọn giống 16 GVHD: TS. Trần Thị Dung Đề tài: Hợp chất thứ cấp nguồn nguyên liệu đủ lớn để tách chiết các hợp chất thứ cấp dùng trong dược phẩm. Điều này cảnh báo cho ngành công nghiệp cũng như các nhà khoa học cần tính đến tiềm năng của kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật như một sự thay thế khác để cung cấp nguyên liệu cho nguồn dược phẩm này. Bảng 2 giới thiệu sản phẩm của một số cây dược liệu quan trọng đã được sản xuất từ nuôi cấy callus và tế bào huyền phù (Mulbagal and Tsay 2004). Ngay từ năm 1971, Wani và các cộng sự đã tìm ra một diterpene amide mới có khả năng chống ung thư gọi là “taxol” chiết từ cây thông đỏ Pacific (Taxus brevifolia). Đến năm 1983, taxol được Cục quản lý Dược phẩm và Thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) đồng ý đưa vào thử nghiệm ở giai đoạn I điều trị cho ung thư buồng trứng. Sau đó, FDA đã cho phép sử dụng taxol trong điều trị các trường hợp ung thư buồng trứng và ung thư vú. Ngoài ra, taxol cũng có tác dụng đối với các bệnh nhân có khối u ác tính, ung thư phổi và các dạng u bướu khác (Wickremesinhe và Arteca 1993 và 1994), và nó được xem như là chất đầu tiên của một nhóm mới trong hóa trị liệu ung thư (Cragg và cs 1993). Tuy nhiên, sử dụng taxol trong điều trị bị hạn chế do chỉ tách chiết được một lượng rất ít từ vỏ của cây thông đỏ tự nhiên. Lớp vỏ mỏng này chứa khoảng 0,001% taxol tính theo khối lượng khô. Ở cây 100 năm tuổi trung bình chỉ thu được 3 kg vỏ (khoảng 300 mg taxol), lượng này ứng với một liều trong toàn đợt điều trị ung thư. Sở dĩ nguồn taxol khan hiếm như vậy là do các cây tự nhiên sinh trưởng rất chậm (Cragg và cs 1993). Do đó, cần có những nguồn khác để thay thế mới đáp ứng được nhu cầu sử dụng ngày càng tăng trong y học. Nuôi cấy tế bào các loài Taxus được xem như là một phương pháp ưu thế để cung cấp ổn định nguồn taxol và dẫn xuất taxane của nó (Slichenmyer và Von Hoff 1991). Hiện nay, việc sản xuất taxol bằng nuôi cấy tế bào các loài Taxus đã trở thành một trong những ứng dụng rộng rãi của nuôi cấy tế bào thực vật và đang tạo ra các giá trị thương mại to lớn. Fett-Neto và cs (1994) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các chất dinh dưỡng và một số yếu tố khác lên sự tích lũy taxol trong nuôi cấy tế bào T. cuspidata. Srinivasan và cs (1995) nghiên cứu quá trình sản xuất taxol bằng nuôi cấy tế bào của T. baccata. Lee và cs (1995) đã nghiên cứu sản xuất taxol bằng nuôi cấy tế bào huyền phù của cây T. mairei, một loài được tìm thấy tại Đài Loan ở độ cao 2000 m so với mực nước biển. Các dòng tế bào thu SVTH: Trần Minh Kiển Trang 16 Nguyễn Văn Huẩn Phùng Thị Mỹ Trinh
  17. Môn: CN nuôi cấy mô và chọn giống 17 GVHD: TS. Trần Thị Dung Đề tài: Hợp chất thứ cấp được từ callus có nguồn gốc thân và lá, và một trong những dòng này sau khi được bổ sung các tiền chất vào môi trường nuôi cấy, thì sau 6 tuần cứ một lít dịch huyền phù tế bào sẽ có khoảng 200 mg taxol. Tsay và cs (1994) đã nghiên cứu sản xuất imperatorin từ nuôi cấy tế bào huyền phù của cây Angelica dahurica var. Formosana. Đây là một loài cây bản địa lâu năm ở Đài Loan, được sử dụng để chữa chứng đau đầu và bệnh vảy nến. Imperatorin được xem là thành phần hoạt động chính trong điều trị các bệnh về da. Nếu sản xuất cây Angelica dahurica var. formosana bằng phương pháp nhân giống truyền thống sẽ mất một thời gian dài mới có thể đáp ứng được nhu cầu. Vì vậy, phương pháp nuôi cấy tế bào huyền phù sản xuất imperatorin đã được chọn lựa sử dụng. Nghiên cứu đã cho thấy trong chu kỳ sinh trưởng của tế bào huyền phù, sản phẩm imperatorin đạt giá trị cực đại trong khoảng giữa 10 và 14 ngày. Benzylamino purine ở nồng độ từ 0,5-1,0 mg/L đã kích thích tổng hợp imperatorin, một tỷ lệ thích hợp ammonium nitrate và nitrate (2:1) cũng như tăng nồng độ phosphate từ 1-2 mM sẽ làm tăng lượng impertatorin. Glucose là nguồn carbon tốt hơn saccharose và fructose về hiệu quả sản xuất imperatorin. Vai trò của elicitor cũng đã được khảo sát, bổ sung thêm vanadyl sulphate trong môi trường sẽ tăng tích lũy imperatorin, quyết định nồng độ và thời gian sinh trưởng của tế bào. Bổ sung vanadyl sulphate ở nồng độ 30 mg/L vào môi trường đã cho hiệu quả tốt nhất sau 10 ngày nuôi cấy. Hoặc bổ sung 20 g/L chất hấp phụ amberlite XAD-7 vào môi trường, quá trình tổng hợp imperatorin cũng tăng mạnh ở ngày nuôi cấy thứ 10. Hàm lượng imperatorin sản xuất bởi phương thức này đạt 460 μg khối lượng tươi cao hơn đối chứng 140 lần. Berberine là một isoquinoline alkaloid có trong hệ rễ của cây Coptis japonica và vỏ của cây Phellondendron amurense. Berberine chloride được sử dụng để chữa bệnh rối loạn tiêu hóa. Để thu được nguyên liệu thô từ rễ cây Coptis phải mất 5-6 năm. Yamada và Sato (1981) đã chọn lọc dòng tế bào có khả năng sản xuất berberin cao của loài C. japonica. Sau đó, công ty hóa dầu Mitsui (Nhật Bản) đã cải thiện được năng suất bằng cách thêm 10- 8 M gibberellic acid vào môi trường, hiệu suất berberine đã tăng lên rất nhiều tới 1.66 g/L (Misawa 1994). SVTH: Trần Minh Kiển Trang 17 Nguyễn Văn Huẩn Phùng Thị Mỹ Trinh
  18. Môn: CN nuôi cấy mô và chọn giống 18 GVHD: TS. Trần Thị Dung Đề tài: Hợp chất thứ cấp Rễ của cây Panax ginseng, một loại thảo dược lâu năm còn gọi là nhân sâm được sử dụng rộng rãi như một vị thuốc bổ, một dược phẩm quý giá, có tác dụng chữa bệnh rối loạn tiêu hóa, bệnh đái đường, suy nhược cơ thể. Trong rễ của nó chứa nhiều loại saponin và sapogenin khác nhau. Trong đó, ginsenoside-Rb có hoạt tính an thần, còn Rg có hoạt tính kích thích. Từ 1973, Furuya và cs đã nuôi cấy mô callus P. ginseng để phân lập saponins và sapogenins. Năm 1994, Choi bắt đầu nghiên cứu nuôi cấy P. ginseng trên quy mô công nghiệp. Đến nay, đây là một trong các đối tượng được các nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu nhiều nhất. Yeh và cs (1994) nghiên cứu sản xuất diosgenin bằng nuôi cấy tế bào huyền phù của cây Dioscorea doryophora. Phương pháp này được sử dụng như một cách thay thế quá trình tổng hợp steroid. Nuôi cấy tế bào huyền phù được thiết lập bằng cách đưa callus vào môi trường có 0,2 mg/L 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D). Nồng độ saccharose tối thích cho tổng hợp diosgenin là 3%. Lượng diosgenin thu được trong trường hợp này đạt tới 3,2% khối lượng khô. Sản xuất diosgenin từ cây D. doryophora bằng nuôi cấy tế bào huyền phù hiện nay đã được ứng dụng trên quy mô công nghiệp. Gentiana davidii var. formosana là thảo mộc bản địa sống lâu năm ở Đài Loan. Từ xưa nó đã được sử dụng như một loại thuốc thô sơ trong y học cổ truyền Trung Quốc nhằm ngăn chặn béo phì và lão hóa, bảo vệ phổi khỏi các chất độc (Zheng và cs 1997). Secoiridoid glycoside là hợp chất chính với đặc tính y học ở trong rễ của chi Gentiana (Skrzypczak và cs 1993). Chueh và cs (2000) nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy tế bào huyền phù của G. davidii var. formosa để sản xuất gentipicroside và swertiamarin, hai dược chất quan trọng. Tế bào huyền phù sinh trưởng tối ưu khi nuôi cấy callus trong môi trường bổ sung 1,2 mg/L kinetin và 3% saccharose, pH 4,2-5,2, tốc độ lắc 80-100 vòng/phút. Sự tích lũy cao nhất 2 hợp chất swertiamarin và gentipicroside trong tế bào được xác định lần lượt sau 12 và 24 ngày nuôi cấy. Miyasaka và cs (1989) đã nghiên cứu sản xuất cryptotanshinone từ nuôi cấy callus cây Salvia miltiorrhiza. Salvia là một chi quan trọng của họ Lamiaceae và một vài loài của Salvia mọc hoang dại trên khắp thế giới dùng làm thuốc dân gian. Hiệu quả của BA đối với SVTH: Trần Minh Kiển Trang 18 Nguyễn Văn Huẩn Phùng Thị Mỹ Trinh
  19. Môn: CN nuôi cấy mô và chọn giống 19 GVHD: TS. Trần Thị Dung Đề tài: Hợp chất thứ cấp việc hình thành cryptotanshinone trong nuôi cấy callus S.miltiorrhiza đã được khảo sát. Callus sơ cấp được tạo ra từ nuôi cấy mảnh lá ở trong tối trên môi trường bổ sung 1,0 mg/L 2,4-D. Callus sau đó phát triển nhanh hơn trên môi trường có 1,0 mg/L 2,4-D và 0,5 mg/L BA. Kết quả phân tích HPLC cho thấy callus chứa một lượng nhỏ cryptotanshinone (0,26 mg/g khối lượng khô). Loại bỏ 2,4-D khỏi môi trường nuôi cấy cho kết quả là lượng cryptotanshinone trong callus tăng lên. Nồng độ cao nhất của cryptotanshione thu được trong callus nuôi cấy trên môi trường có 0,2 mg/L BA trong 6 ngày là 4,59 mg/g khối lượng khô (Wu và cs 2003). Scopolamine và hyoscyamine là 2 loại tropane alkaloid đang được sử dụng như những loại thuốc trị co thắt và gây mê. Các alkaloid này có trong lá của các chi thuộc họ Solanaceae như: Duboisia, Scopolia, Atropa, Hyoscyamus và Datura. Những nghiên cứu về sản xuất các tropane alkaloid bằng nuôi cấy mô thực vật đã được nhiều nhà khoa học thực hiện từ những năm 1960 (Misawa, 1994). Tuy nhiên, hàm lượng của scopolamine và hyoscyamine trong tế bào nuôi cấy thường rất thấp. Sau này, Tabata và cs (1971) đã bổ sung tropic acid vào dịch huyền phù nuôi cấy Scopolia japonicalên 15 lần. Shikonin, một loại sắc tố đỏ có khả năng diệt khuẩn, có trong rễ cây Lithospermum erythrorhizon. Tuy nhiên, người ta đã tạo được dòng tế bào rễ cây Lithospermum có khả năng tích lũy đến 15% shikonin và đã hoàn chỉnh công nghệ nuôi cấy tế bào sản xuất shikonin. Công nghệ này cho phép trong một chu kỳ nuôi cấy thu hoạch tới 5 kg hoạt chất và giúp giảm nhiều giá thành của shikonin. Podophyllotoxin là một aryltetralin lignan chống khối u được tìm thấy ở các cây Podophyllum peltatum và Podophyllum hexandrum. Nó cũng được dùng để tổng hợp các dẫn xuất etoposide và teniposide, sử dụng rộng rãi trong điều trị chống khối u (Issell và cs 1984). Tuy nhiên, trong tự nhiên những cây này sinh trưởng rất chậm và vì thế đã hạn chế việc cung cấp podophyllotoxin, bắt buộc chúng ta phải hướng tới một phương thức thay thế khác. Nuôi cấy tế bào để sản xuất podophyllotoxin đã được Kadkade và cs thực hiện lần đầu tiên vào năm 1981 và 1982. Woerdenberg và cs (1990) đã dùng một phức hợp precursor là coniferyl alcoholvà b-cyclodextrin bổ sung trong môi trường nuôi cấy tế bào huyền phù của P. hexandrum. Bổ sung phức hợp 3 mM coniferyl alcohol đã tăng hiệu suất SVTH: Trần Minh Kiển Trang 19 Nguyễn Văn Huẩn Phùng Thị Mỹ Trinh
  20. Môn: CN nuôi cấy mô và chọn giống 20 GVHD: TS. Trần Thị Dung Đề tài: Hợp chất thứ cấp podophyllotoxin lên 0.013% theo khối lương khô, trong khi các nuôi cấy không có precursor chỉ sản xuất được 0.0035% podophyllotoxin. Smollny và cs (1992) đã thông báo callus và tế bào huyền phù của Lilium album đã sản xuất được 0.3% podophyllotoxin. Kết luận Ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật để sản xuất các hợp chất thứ cấp đã tạo ra một bước tiến xa trong khoa học thực vật. Việc phát triển và sử dụng các công cụ di truyền cũng như sự hiểu biết ngày càng sâu sắc hơn về bản chất của tế bào và các phương thức điều hòa quá trình chuyển hóa trao đổi chất thứ cấp là cơ sở cho việc sản xuất chúng ở quy mô thương mại. Do nhu cầu sử dụng các sản phẩm tự nhiên trong y-dược ngày càng tăng nhưng sản lượng của chúng ở cây trồng tự nhiên lại rất thấp đã thúc đẩy sự phát triển không ngừng của công nghệ nuôi cấy tế bào ở quy mô lớn. Tuy nhiên, các con đường sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp mong muốn trong thực vật cũng như trong nuôi cấy tế bào ở quy mô lớn là rất phức tạp. Vì vậy, các thông tin ở mức độ tế bào và phân tử của các quá trình chuyển hóa là rất cần thiết cho sự phát triển của sản xuất công nghiệp. Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện ở các điều kiện khác nhau để giải thích các hiện tượng xuất hiện trong quá trình sản xuất các chất trao đổi thứ cấp từ các tế bào thực vật nuôi cấy in vitro. Các kết quả này cũng đã cho thấy các hệ thống nuôi cấy tế bào thực vật có tiềm năng rất lớn cho việc khai thác thương mại các chất trao đổi thứ cấp. SVTH: Trần Minh Kiển Trang 20 Nguyễn Văn Huẩn Phùng Thị Mỹ Trinh
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

LV.11: Bộ Luận Văn Tốt Nghiệp Chuyên Ngành Tài Chính Ngân Hàng
172 tài liệu
823 lượt tải
THÔNG TIN
TRỢ GIÚP
HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG
Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2