intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE

BÁO CÁO NGHIÊN CỨU KHOA HỌC KỸ THUẬT: ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH TRUNG HÒA ĐỘC TỐ VT2E CỦA PROTEIN TÁI TỔ HỢP MBP-VT2EB

Chia sẻ: Linh Ha | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:5

53
lượt xem
8
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Tóm tắt Escherichia coli tái tổ hợp expresssing protein phản ứng tổng hợp B-tiểu đơn vị của VT2e đã được sử dụng để sản xuất loại protein này.

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: BÁO CÁO NGHIÊN CỨU KHOA HỌC KỸ THUẬT: ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH TRUNG HÒA ĐỘC TỐ VT2E CỦA PROTEIN TÁI TỔ HỢP MBP-VT2EB

  1. ÑAÙP ÖÙNG MIEÃN DÒCH TRUNG HOØA ÑOÄC TOÁ VT2E CUÛA PROTEIN TAÙI TOÅ HÔÏP MBP-VT2EB IMMUNITY RESPONSE NEUTRALIZES VT2E TOXIN OF RECOMBINANT PROTEIN MBP- VT2EB Nguyeãn Ngoïc Haûi Boä moân Vi sinh - Truyeàn nhieãm, Khoa Chaên nuoâi - Thuù y , Ñaïi hoïc Noâng Laâm Tp. Hoà Chí Minh. E.mail: nnhai@hcmuaf.edu.vn, nguyenngochai62@yahoo.fr ABSTRACT Recombinant Escherichia coli expresssing the fusion protein B-subunit of VT2e was used for producing this protein. The fusion protein B-subunit of VT2e purified was used for an immunizing trial on rabbit. At the level of 50µg - 100µg of fusion protein B-subunit of VT2e, the titer at 1/64 to 1/128 of neutralisant antibody of 3TCID50 was obtained on vero cell culture. The results demonstrated that the fusion protein B-subunit of VT2e in the study could be used for the vaccination trials against oedema disease in pigs. Keywords: VT2e or SLT-II2e, fusion protein, neuralisant antibody. ÑAËT VAÁN ÑEÀ Beänh phuø do vi khuaån E. coli gaây ra treân heo sau cai söõa luoân laø vaán ñeà lo ngaïi cuûa caùc nhaø saûn xuaát heo. Beänh xaûy ra ñoät ngoät, thöôøng gaây töû vong cao, coù theå ñeán 90 -100% thuù coù trieäu chöùng beänh. Vieäc phoøng beänh chuû yeáu hieän nay vaãn laø duøng khaùng sinh troän vaøo thöùc aên, tuy nhieân, lieäu phaùp naøy ngaøy caøng giaûm taùc duïng, taïo theâm nguy cô ñeà khaùng ñoái vôùi khaùng sinh ôû caùc loaøi vi khuaån ñöôøng ruoät vaø toàn dö khaùng sinh trong thòt. Vieäc duøng vaêcxin ñeå ngöøa beänh cho heo coù leõ laø phöông phaùp toát nhaát. Nhieàu nhaø khoa hoïc ñaõ nghieân cöùu caùc loaïi vaêcxin ñoäc toá voâ hoaït nhöng vaãn chöa thu ñöôïc keát quaû mong muoán do söï voâ hoaït khoâng hoaøn toaøn veà ñoäc tính cuûa khaùng nguyeân. Ñoäc toá verotoxin do vi khuaån E. coli gaây phuø treân heo laø loaïi ñoäc toá thuoäc nhoùm Shiga- like toxin. Ñoäc toá VT2e cuõng nhö caùc loaïi ñoäc toá Shiga-like toxin ñöôïc caáu taïo bôûi 2 thaønh phaàn: 1 tieåu phaàn A (Active) coù taùc duïng ñoäc vaø 5 tieåu phaàn B (Binding) giuùp ñoäc toá gaén leân teá baøo maãn caûm, taïo ñieàu kieän cho tieåu phaàn A xaâm nhaäp vaøo trong teá baøo, gaây ñoäc vaø laøm cheát teá baøo. Neáu ñoäc toá khoâng gaén leân ñöôïc treân teá baøo thì ñoäc toá seõ khoâng coù taùc duïng gaây ñoäc treân teá baøo, nghóa laø neáu trong cô theå thuù coù khaùng theå choáng laïi tieåu phaàn B thì khaùng theå naøy seõ keát hôïp ñaëc hieäu vôùi tieåu phaàn B, ngaên caûn söï keát baùm cuûa ñoäc toá leân teá baøo vaät chuû vaø giuùp thuù choáng laïi beänh do vi khuaån E. coli saûn sinh ñoäc toá naøy gaây ra. Keát quaû cuûa thöû nghieäm seõ cho pheùp hieåu roõ hôn veà khaû naêng söû duïng vaø phaùt trieån vac-xin tieåu phaàn B ñoäc toá VT2e trong kieåm soaùt beänh phuø treân heo sau cai söõa. VAÄT LIEÄU VAØ PHÖÔNG PHAÙP Noäi dung
  2. - Ñònh tính khaùng theå trung hoøa protein taùi toå hôïp MBP-VT2eB baèng phöông phaùp keát tuûa treân thaïch (Agar Gel Precipitation) Ñònh löôïng khaùng theå trung hoøa ñoäc toá VT2e treân moâi tröôøng teá baøo vero - Phöông phaùp nghieân cöùu Nghieân cöùu ñaùp öùng mieãn dòch ñoái vôùi protein taùi toå hôïp MBP-VT2eB Thí nghieäm ñöôïc tieán haønh treân 3 con thoû, caùch 4 tuaàn thì tieâm vaø laáy maùu 1 laàn, tieâm 5 laàn vôùi lieàu protein taùi toå hôïp MBP-VT2eB giaûm daàn töø 100 µg ñeán 50 µg trong dung dòch Al(OH)3, ñöôøng tieâm döôùi da. Dòch tieâm ñöôïc pha saün vaø baûo quaûn ôû 40C. Ngaøy 0, laáy 1 ml maùu (ñoái chöùng), ngaøy 1: tieâm muõi ñaàu tieân vôùi lieàu 100 µg MBP-VT2eB/thoû, caùc laàn tieâm sau tieâm lieàu 50 µg MBP-VT2eB/thoû. Khaùng huyeát thanh ñöôïc baûo quaûn ôû -200C duøng cho xeùt nghieäm khaùng theå trung hoøa treân moâi tröôøng teá baøo vero. Ñaùnh giaù Ñònh tính: Phaûn öùng keát tuûa khueách taùn keùp treân thaïch (kyõ thuaät Ouchterlony) 1,5 g agarose ñöôïc laøm tan trong 100 ml ñeäm PBS 1X, ñun ñeán khi agarose tan hoaøn toaøn. Ñoå thaïch 6,5 cm x 6 cm, daøy 3 mm treân taám phim trong, taïo caùc gieáng treân thaïch. Xeùt nghieäm ñöôïc thöïc hieän vôùi maãu huyeát thanh ñoái chöùng thu tröôùc khi tieâm khaùng nguyeân, maãu khaùng huyeát thanh chöa pha loaõng, maãu protein taùi toå hôïp MBP-VT2eB noàng ñoä 1,588 mg/ml ñöôïc pha loaõng theo tæ leä 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, maãu khaùng huyeát thanh ñöôïc pha loaõng theo tæ leä 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32. Huùt khaùng nguyeân vaø khaùng theå vaøo caùc gieáng töông öùng, ñaët thaïch vaøo buoàng aåm ôû 40C. Khoaûng 24 – 48g sau quan saùt ñöôøng tuûa, eùp khoâ thaïch vaø nhuoäm vôùi thuoác nhuoäm ñoû Ponceau S 0,2%. Quan saùt vaø ñaùnh giaù. * Ñònh löôïng: Phaûn öùng trung hoaø ñoäc toá VT2e treân moâi tröôøng teá baøo vero * Xaùc ñònh lieàu TCID50 (Tissue Culture Infectious Dose 50) + Chuaån bò ñoäc toá VT2e Vi khuaån E. coli 0139 K82 (H28) coù gen quy ñònh ñoäc toá VT2e ñöôïc nuoâi caáy trong moâi tröôøng LB, ôû 370C, laéc 150 voøng/phuùt trong 24 giôø. Dòch nuoâi caáy ñöôïc ly taâm 10.000 voøng trong 30 phuùt. Thu dòch trong ñeå thöû ñoäc toá treân teá baøo vero. + Chuaån bò teá baøo vero Teá baøo vero (ATCC ref. CCL-81) ñöôïc nuoâi caáy trong moâi tröôøng DMEM coù boå sung 10% huyeát thanh baøo thai beâ (FBS), 2 mM gentamycin trong caùc chai nuoâi caáy 25 cm2, ôû 37oC, 5%CO2. Teá baøo ñöôïc chuyeån vaøo væ 96 gieáng ôû noàng ñoä teá baøo laø 300.000 teá baøo/ml, 100 µl teá baøo ñöôïc cho vaøo moãi gieáng, uû ôû 37oC, 5% CO2 trong 24 giôø. + Xaùc ñònh lieàu TCID50 Ñoái chöùng (-) 1: gieáng chæ chöùa moâi tröôøng nuoâi caáy teá baøo DMEM. Ñoái chöùng (-) 2: gieáng chöùa dòch loïc canh khuaån E. coli DH5α. Lieàu TCID50 laø noàng ñoä gaây cheát 50% teá baøo vero trong gieáng nuoâi caáy teá baøo ôû thôøi ñieåm 48 giôø nuoâi caáy döïa theo giaù trò OD620nm cuûa teá baøo vôùi thuoác nhoäm xanh methylen, so saùnh giöõa gieáng coù ñoäc toá vaø gieáng ñoái chöùng (-) 2. Giaù trò TCID50 ñöôïc xaùc ñònh baèng phöông phaùp Reed – Muench. + Xaùc ñònh hieäu giaù khaùng theå trung hoøa ñoäc toá VT2e treân moâi tröôøng teá baøo vero Khaùng huyeát thanh pha loaõng baäc hai ñöôïc uû vôùi lieàu 3TCID50 ñoäc toá VT2e ôû 370C trong moät giôø vaø ôû 40C qua ñeâm. Caáy hoãn hôïp khaùng huyeát thanh - ñoäc toá ñaõ uû vaøo phieán 96
  3. gieáng chöùa teá baøo vero ñaõ nuoâi caáy 24 giôø. Tieáp tuïc nuoâi teá baøo vero ôû 370C theâm 2 ngaøy. Quan saùt söï huyû hoaïi teá baøo do verotoxin khoâng bò trung hoaø vaø ñaùnh giaù keát quaû. Ñoái chöùng (+) laø nhöõng gieáng chæ coù teá baøo vero. Ñoái chöùng (-) laø nhöõng gieáng ñöôïc uû vôùi 100 µl dòch loïc vi khuaån coù noàng ñoä TCID50 ñaõ xaùc ñònh ôû treân. Ñoái chöùng teá baøo laø nhöõng gieáng ñöôïc uû vôùi 100 µl khaùng huyeát thanh chöa pha loaõng. Xaùc ñònh hieäu giaù khaùng theå baèng phöông phaùp Reed – Muench. Baûng 1. Keát quaû ñaù p öùng mieãn dòch ñoá i vôù i protein taù i toå hôïp MBP-VT2eB treân thoû (phöông phaùp keát tuûa khueách taùn treân thaïch) Thoû Ñoá i chöùng Muõ i nhaéc laïi 1 Muõ i nhaéc laïi 2 1 - - + 2 - + + 3 - + + Hình 1. Keát quaû phaûn öùng keát tuûa khueách taùn trong thaïch a, b, c: huyeát thanh thoû 1, 2, 3 töông öùng. Gieáng 1, 2, 3, 4, 5, 6 chöùa 10 µl protein MBP- VT2eB pha loaõng töø noàng ñoä ban ñaàu ñeán noàng ñoä 1/32. Gieáng giöõa chöùa 10 µl khaùng huyeát thanh. Vaïch keát tuûa khaùng theå khaùng protein taùi toå hôïp vaø protein taùi toå hôïp (muõi teân chæ ). KEÁT QUAÛ VAØ THAÛO LUAÄN Xaùc ñònh khaùng theå ñaëc hieäu vôùi protein taùi toå hôïp MBP-VT2eB baèng kyõ thuaät keát tuûa treân thaïch Ñeå ñaùnh giaù sô boä söï hieän dieän cuûa khaùng theå ñaëc hieäu khaùng protein taùi toå hôïp MBP- VT2eB, phaûn öùng keát tuûa treân thaïch ñaõ ñöôïc tieán haønh vôùi caùc maãu khaùng huyeát thanh thu ñöôïc töø thoû ngay töø laàn tieâm nhaéc thöù nhaát. Khaùng theå ñaëc hieäu khaùng protein taùi toå hôïp MBP-VT2eB ñaõ hieän dieän ôû 2/3 thoû sau muõi tieâm nhaéc thöù nhaát vaø ôû caû 3/3 thoû thí nghieäm sau muõi tieâm nhaéc thöù hai (baûng 1 vaø hình 1). Hieäu giaù khaùng theå trung hoøa Thöû nghieäm trung hoøa ñoäc toá VT2e ñaõ ñöôïc tieán haønh treân teá baøo vero vôùi lieàu 3TCID50. Hieäu giaù khaùng theå trung hoøa ñöôïc tính ôû möùc pha loaõng khaùng huyeát thanh cao nhaát coù theå ngaên caûn 100% taùc ñoäng huûy hoaïi teá baøo vero cuûa ñoäc toá VT2e. Töø nhöõng trò soá ño OD620 xaùc ñònh ñöôïc noàng ñoä khaùng huyeát thanh trung hoøa lieàu 3 TCID50 sau laàn tieâm nhaéc thöù tö laàn löôït laø 1/64, 1/64 vaø 1/128 ôû 3 thoû khaùc nhau. Thaûo luaän Vaêcxin söû duïng protein taùi toå hôïp laø moät trong nhöõng höôùng nghieân cöùu vaø phaùt trieån trong chieán löôïc kieåm soaùt caùc beänh truyeàn nhieãm. Tuy döïa treân nhöõng nguyeân taéc sinh hoïc töï nhieân, caùc loaïi protein ñöôïc saûn xuaát nhôø vaøo coâng ngheä di truyeàn ñoâi khi vaãn khoâng ñaûm baûo ñaày ñuû caùc tính chaát sinh hoïc caàn thieát. Ñoái vôùi caùc saûn phaåm duøng trong
  4. vaêcxin, vieäc kieåm tra khaû naêng gaây ñaùp öùng mieãn dòch cuûa khaùng nguyeân laø moät trong nhöõng khaâu ñaàu tieân vaø quan troïng nhaát. Trong phaûn öùng keát tuûa treân thaïch, keát quaû nghieân cöùu cuûa chuùng toâi ghi nhaän caùc vaïch keát tuûa döông tính hoaøn toaøn ôû taát caû caùc maãu khaùng huyeát thanh ñöôïc thöû. Ñieàu naøy coù nghóa laø protein taùi toå hôïp MBP-VT2eB ñaõ coù theå gaây kích öùng mieãn dòch ôû thoû vaø taïo ñöôïc khaùng theå ñaëc hieäu ñoái vôùi protein taùi toå hôïp MBP-VT2eB. Tuy nhieân do protein taùi toå hôïp ñöôïc caáu taïo bôûi 2 thaønh phaàn: protein dung hôïp MBP (Maltose Binding Protein) vaø protein tieåu phaàn B ñoäc toá VT2e neân khoâng loaïi tröø khaû naêng keát quaû döông tính thu ñöôïc trong phaûn öùng keát tuûa treân thaïch coù theå laø do söï keát hôïp ñaëc hieäu cuûa khaùng theå khaùng MBP vaø VT2eB. Trong tröôøng hôïp naøy khaùng theå ñöôïc taïo thaønh seõ khoâng coù khaû naêng ngaên chaën taùc ñoäng gaây ñoäc cuûa ñoäc toá VT2e treân teá baøo vaø keát quaû laø seõ khoâng baûo veä ñöôïc thuù khoûi taùc ñoäng cuûa ñoäc toá VT2e hay noùi khaùc ñi laø khoâng baûo veä ñöôïc thuù choáng laïi vi khuaån E. coli gaây phuø treân heo duø ñaõ ñöôïc tieâm vac-xin protein taùi toå hôïp MBP- VT2eB. Khaû naêng baûo veä thuù chæ coù theå coù ñöôïc neáu protein taùi toå hôïp coù khaû naêng taïo ñöôïc khaùng theå trung hoøa ñoäc toá VT2e, vì theá caàn tieán haønh caùc thöû nghieäm xaùc ñònh khaû naêng trung hoøa cuûa khaùng theå ñoái vôùi ñoäc toá VT2e. Trong ñieàu kieän in vitro, coù theå tieán haønh thöû nghieäm naøy treân moâi tröôøng nuoâi caáy teá baøo vero. Ñoäc toá VT2e coù khaû naêng gaây ñoäc maïnh ñoái vôùi teá baøo vero. Teá baøo vero vì vaäy ñöôïc xem nhö laø moät moâi tröôøng thöû nghieäm in vitro phuø hôïp nhaát ñeå xaùc ñònh ñoäc löïc cuûa ñoäc toá VT2e. Töø keát quaû thu ñöôïc trong thöû nghieäm trung hoøa ñoäc toá VT2e treân teá baøo vero, chuùng toâi ghi nhaän khaùng huyeát thanh thu nhaän töø thoû ñöôïc gaây mieãn dòch baèng protein taùi toå hôïp MBP-VT2eB coù theå trung hoøa hoaøn toaøn taùc ñoäng gaây ñoäc cuûa lieàu 3TCID 50 ñoäc toá VT2e treân teá baøo vero ôû möùc hieäu giaù trung bình töø 1/64 ñeán 1/128. Keát quaû naøy cho thaáy protein taùi toå hôïp MBP-VT2eB ñöôïc taïo ra trong nghieân cöùu cuûa chuùng toâi hoaøn toaøn coù khaû naêng taïo ra khaùng theå ñaëc hieäu trung hoøa ñöôïc ñoäc toá VT2e, yeáu toá gaây beänh phuø treân heo cuûa vi khuaån E. coli saûn xuaát ñoäc toá VT2e. Trong nhöõng nghieân cöùu cuûa Gordon vaø coäng söï (1992), hieäu giaù khaùng theå trung hoøa ñoäc toá VT2e laø töø 1/128 ñeán 1/152, tuy nhieân caùc taùc giaû treân chæ thöïc hieän trung hoøa ôû lieàu 2TCID50 ñoäc toá VT2e, thaáp hôn lieàu ñoäc toá söû duïng trong nghieân cöùu cuûa chuùng toâi (3TCID50). Hôn nöõa, khaùng nguyeân maø caùc taùc giaû naøy söû duïng (ñoäc toá VT2e voâ hoaït hoaëc ñoäc toá bieán dò nhöôïc ñoäc) vaãn coøn gaây neân caùc taùc duïng phuï treân heo ñöôïc gaây ñaùp öùng mieãn dòch (taêng troïng keùm hoaëc gaây nhöõng beänh tích treân moâ…). Protein taùi toå hôïp MBP-VT2eB theå hieän roõ khaû naêng gaây ñaùp öùng mieãn dòch toát, taïo khaùng theå trung hoøa ñoäc toá VT2e vôùi möùc hieäu giaù khaù cao. Ñieàu naøy cho thaáy protein taùi toå hôïp MBP-VT2eB coù theå ñöôïc söû duïng cho caùc thöû nghieäm phoøng beänh phuø do E. coli saûn sinh ñoäc toá VT2e treân heo. KEÁT LUAÄN - Protein taùi toå hôïp MBP-VT2eB coù khaû naêng kích thích mieãn dòch toát treân thoû, taïo khaùng theå trung hoøa ñoäc toá VT2e treân teá baøo vero ngay sau laàn tieâm nhaéc ñaàu tieân. - Hieäu giaù khaùng theå trung hoøa ñoäc toá VT2e vaøo khoaûng 1/64 ñeán 1/128 treân teá baøo vero vôùi lieàu 3TCID50. TAØI LIEÄU THAM KHAÛO
  5. Bosworth B.T., Samuel J.E., Moon H.W., O’brien A.D., Gordon V.M. and Whipp S.C., 1996. Vaccination with genetically modified shiga-like toxin IIe prevents edema disease in swine. Infect. Immun., 64: 55-60. Franke S., Gunzer F., Wieler L.H., Baljer G. and Karch H., 1995. Construction of recombinant shiga-like toxin-IIv (SLT-IIv) and its use in monitoring the SLT-IIv antibody status of pigs. Vet. Microbiol., 43: 41-52. Gordon V.M., Whipp S.C., Moon H.W., O’brien A.D. and Samuel J.E., 1992. An enzymatic mutant of shiga-like toxin II variant is a vaccine candidate for edema disease of swine. Infect. Immun., 60: 485-490. Gunzer F., and Karch H., 1993. Expression of A and B subunits of Shiga-like toxin II as fusions with glutathione S-transferase and their potentital for use in seroepidemiology. J. Clin. Microbiol., 31: 2604-2610. Imberechts H., De Greve H., Hernalsteens Schlicker C., Bouchet H., Pohl P., Charlier G., Bertschinger H., Wild P., Vandekerckhove J., Van Damme J., Van Montagu M. and Lintermans P., 1993. The role of adhesive F107 and of SLT-IIv toxin in the pathogenesis of edema disease in pigs. Zbl. Bakt., 278: 445-450. Johansen M., Andresen L.O., Thomsen L.K., Busch M.E., Wachmann H., Jorsal S.E. and Gyles C.L., 2000. Prevention of edema disease in pigs by passive immunization. Can. J. Vet. Res., 64: 9-14. Macleod D.L. and Gyles C.L., 1991. Immunization of pigs with a purified shiga-like toxin II variant toxoid. Vet. Microbiol., 29: 309-318. Makino S.I., Watara I M., Tabuchi H., Shirahata T., Furuoka H., Kobayashi Y. and Takeda Y., 2001. Genetically modified Shiga toxin 2e (Stx2e) producing Escherichia coli is a vaccine candidate for porcine edema disease. Microb. Pathog., 31: 1-8. Mukherjee J., Chios K., Fishwild D., Hudson D., O’donnell S., Rich M.S., Donohue-Rolfe A. and Tzipori S., 2002. Human Stx2-specific monoclonal antibodies prevent systemic complications of Escherichia coli O157:H7 infection. Infect. Immun., 70: 612-619. Nguyen Ngoc Hai, 2002. Maladie de l’oedeøme du porc au Vietnam: caracteùrisation des souches d’Escherichia coli responsables, facteurs de pathogeùniciteù et vaccination. Theøse du doctorat. INPT. Sarrazin E. and Bertschinger H.U., 1997. Role of fimbriae F18 for actively acquired immunity against porcine enterotoxigenic Escherichia coli. Vet. Microbiol., 54: 133-44.
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2