Báo cáo nghiên cứu nông nghiệp " Tăng cường năng lực giám sát và khống chế bệnh lở mồm long móng (LMLM) trên trâu bò và heo để góp phần tăng cường an toàn sinh học cho quốc gia - Milestone 3 "

Chia sẻ: Nguyen Nhi | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

85
lượt xem 15
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Sự tăng cường năng lực chẩn đoán cho phép xác định và định danh sớm virus LMLM giúp cho công tác khống chế dịch bệnh tốt hơn, làm giảm thiệt hại chăn nuôi và sản xuất. Mục đích của dự án là tăng cường gấp đôi khả năng giám sát và chẩn đoán bệnh lớ mồm long móng (LMLM) ( và những bệnh khác) ở cấp độ trong phòng thí nghiệm và ngoài hiện trường, điều tra sự lưu hành các type virus LMLM ở Việt Nam và vì sao việc sử dụng vaccin thất bại....

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Báo cáo nghiên cứu nông nghiệp " Tăng cường năng lực giám sát và khống chế bệnh lở mồm long móng (LMLM) trên trâu bò và heo để góp phần tăng cường an toàn sinh học cho quốc gia - Milestone 3 "

Ministry of Agriculture & Rural Development Báo cáo kỹ thuật Dự Án CARD 072/04 VIE “ Tăng cường năng lực giám sát và khống chế bệnh lở mồm long móng (LMLM) trên trâu bò và heo để góp phần tăng cường an toàn sinh học cho quốc gia” Milestone 3 Hoạt động và hiệu quả của phòng thí nghiệm tham chiếu quốc gia và các phòng thí nghiệm cấp Vùng By Chris Morrissy
Mục lục 1. Thông tin về đơn vị _____________________________________________ 3 2. lược dự án _____________________________________________________ 4 3. Báo cáo tóm tắt_________________________________________________ 4 4. Giới thiệu và bối cảnh ___________________________________________ 5 5. Hoạt động và hiệu quả của phòng thí nghiệm tham chiếu quốc gia và phòng thí nghiệm cấp vùng. __________________________________________________ 6 5.1 Những điểm đánh chú ý ______________________________________ 6 5.2 Xây dựng năng lực __________________________________________ 8 5.3 Quảng bá __________________________________________________ 8 6. Kết luận _______________________________________________________ 9 7. Phụ lục_______________________________________________10 7.1 Phụ lục 1: Phiếu quản lý xét nghiệm, phiếu kết quả, mẫu lưu trữ kết quả đối chứng nội thí dụ LMLM 3ABC ELISa__________________ 10 7.2 Phụ lục 2:Kết quả định serotype LMLM của Việt Nam 2005-2009_____ 14 7.3 Phụ lục 3 :Kết quả giải mã gen từ 2005-2009 của dự án ____ 15 7.4 Phụ lục 4:Kết quả giám sát huyết thanh ______________________ 24 3
Thông tin về các đơn vị 1. CARD 072/04 VIE Tên dự án : Trung Tâm Thú Y Vùng TP. Hồ Chí Minh ( Đơn vị Việt Nam nay là Cơ Quan Thú Y Vùng VI ) Bs. Đồng Mạnh Hòa Giám đốc dự án phía Việt Nam Australian Animal Health Laboratory Đơn vị Úc (AAHL), PMB 24, Geelong, 3213, Australia Mr Chris Morrissy Nhân sự Úc 01/06/2005 Ngày bắt đầu Ngày kết thúc ( theo dự kiến ban 01/06/2008 đầu) Ngày kết thúc ( đã thay đổi) Chu kỳ báo cáo Cán bộ liên lạc Ở Úc: Cố vấn trưởng Mr Chris Morrissy +61 3 5227 5000 Tên: Telephone: Diagnostic Virologist +61 3 5227 5555 Chức vụ Fax: Supervisor Mammalian Virology Australian Animal Health Email: chris.morrissy@csiro.au Tổ chức Laboratory (AAHL), PMB 24, Geelong, 3213, Australia Ở Úc: Đầu mối liên hệ hành chính Mr Chris Morrissy +61 3 5227 5000 Tên : Telephone: Patents Contracts Officer +61 3 5227 5555 Chức vụ : Fax: Australian Animal Health Email: christopher.morrissy@csiro.au Tổ chức Laboratory (AAHL), PMB 24, Geelong, 3213, Australia 4
Ở Việt Nam Bs. Đồng Mạnh Hòa + 84 8 8568220 Tên : Telephone: Giám đốc + 84 8 38569050 Chức vụ : Fax: Trung Tâm Thú Y Vùng TP. Hồ Email: rahchcmc@hcm.vnn.vn Tổ chức Chí Minh ( nay là Cơ Quan Thú Y Vùng VI ) 5
2. Trích lược dự án Sự tăng cường năng lực chẩn đoán cho phép xác định và định danh sớm virus LMLM giúp cho công tác khống chế dịch bệnh tốt hơn, làm giảm thiệt hại chăn nuôi và sản xuất. Mục đích của dự án là tăng cường gấp đôi khả năng giám sát và chẩn đoán bệnh lớ mồm long móng (LMLM) ( và những bệnh khác) ở cấp độ trong phòng thí nghiệm và ngoài hiện trường, điều tra sự lưu hành các type virus LMLM ở Việt Nam và vì sao việc sử dụng vaccin thất bại. Các phòng thí nghiệm cấp vùng đã được xây dựng với các nguyên vật liệu và phương pháp sẳn sàng để xác định các virus LMLM và thực hiện các xét nghiệm huyết thanh học. Chiến lược khống chế LMLM trên cơ sở nắm bắt dịch tễ được cải thiện qua các lớp tập huấn cán bộ của phòng thí nghiệm và thú y cơ sở. Dự án làm nổi bật tầm quan trọng phải có một hệ thống các phòng thí nghiệm để xác định điều gì đang xảy ở hiện trường và làm cách nào để ngăn chặn, kiểm soát các ổ dịch Những khu vực thí điểm được xây dựng ở các tỉnh có biên giới của Việt Nam với các nước để nghiên cứu serotype của virus thực địa và để xác định nguồn gốc của chúng. Số lượng và chất lượng mẫu ngày càng được cải thiện, cung cấp nhiều dữ liệu hơn về tình hình lưu hành bệnh LMLM ở Việt Nam. Các nghiên cứu phân lập virus và sinh học phân tử được tiến hành trên các mẫu thu thập từ hiện trường và các nghiên cứu dịch tễ học phân tử trên các mẫu virus phân lập được từ các tỉnh đã đưa ra một cái nhìn sâu hơn về hiệu quả kiểm soát và sự lưu hành virus LMLM ở vùng biên giới. Sự tăng cường năng lực chẩn đoán cho phép phát hiện và xác định sớm bệnh LMLM giúp cho công tác khống chế dịch bệnh tốt hơn, làm giảm thiệt hại chăn nuôi và nhờ đó tăng năng xuất sản xuất. 3. Báo cáo tóm tắt Trong suốt quá trình thực hiện dự án, các hoạt động ngoài hiện trường và trong phòng thí nghiệm ngày càng được cải thiện tốt hơn. Chất lượng của xét nghiệm chẩn đoán và dữ Trong suốt dự án, các chuyên viên từ AAHL đã làm việc với 4 phòng thí nghiệm chẩn đoán – Cơ Quan Thú y vùng VI ( Tp. Hồ Chí Minh) , Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương (Hà Nội) , Cơ Quan Thú y vùng VII (Cần Thơ) và Cơ Quan Thú y vùng IV (Đà Nẵng) nhằm tăng cường năng lực chẩn đoán LMLM và theo dõi tiến trình dự án. Phòng thí nghiệm của Cơ Quan Thú y vùng VI và Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương được thiết lập các kỹ thuật chẩn đoán bệnh LMLM bao gồm phân lập virus, trung hoà virus, ELISA, PCR và kỹ thuật giải mã gen. Dự án cũng hợp tác với phòng nghiên cứu NAVETCO để thiết lập năng lực chẩn đoán huyết thanh học bệnh LMLM bằng kỹ thuật ELISA. Hiện nay, Cơ quan Thú y vùng VI đã 6
thiết lập được các kỹ thuật này và cùng Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương ứng dụng kỹ thuật mới để chẩn đoán các bệnh khác tại Việt Nam. Ví dụ: Cơ quan Thú y vùng VI đã phân lập virus đậu dê, PRRS và CSF; Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương dùng kỹ thuật phân lập virus để phát hiện một chủng mới của virus PRRS tại Việt Nam. Phòng thí nghiệm tại Cần Thơ và Đà Nẵng có năng lực chẩn đoán định serotype và xét nghiệm huyết thanh học sau tiêm phòng LMLM bằng kỹ thuật LP-ELISA. Thêm vào đó, Cơ quan Thú y vùng VI đã được đào tạo kỹ thuật sản xuất kháng nguyên và đã sản xuất được kháng nguyên từ virus LMLM phân lập được tại Việt Nam để dùng trong các phản ứng ELISA để chẩn đoán bệnh LMLM. Sự phát triển các kỹ thuật như thế cũng cho thấy Cơ quan thú Y Vùng VI có khả năng khắc phục các khó khăn của các kỹ thuật ELISA và giải quyết được những khó khăn trong nuôi cấy virus LMLM. Nhân viên của Cơ Quan Thú y vùng VI và Trung tâm chẩn đoán Thú y Trung ương đã được tập huấn theo kế hoạch mỗi năm của dự án và theo các dự án hợp tác khác tại AAHL. Đối với các hoạt động hiện trường, số lượng và chất lượng mẫu giám sát và định type gởi đến phòng thí nghiệm đã có sự cải thiện rõ rệt về. Điều này giúp cho Cục Thú y hiểu rỏ hơn sự lưu hành của các serotype LMLM tại Việt Nam và tự tin để tổ chức các đợt giám sát huyết thanh trên diện rộng. Số lượng dữ liệu thu thập được qua mỗi giai đoạn của dự án cũng được cải thiện đáng kể. Hiện nay Cơ quan Thú y vùng VI đã có phòng dịch tễ và dự án này đang giúp các nhân viên phát triển các kỹ năng dịch tễ áp dụng trong giám sát huyết thanh, kiểm soát ổ dịch và điều tra tìm nguyên nhân thất bại của việc chủng ngừa. Kết quả giám sát huyết thanh của dự án đã được xem xét và đưa ra một chỉ báo cho thấy sự thành công của công tác tiêm phòng và tỷ lệ nhiễm LMLM. Dữ liệu này được trình bày tại các cuộc họp của OIE/SEA FMD thuộc vùng Đông Nam Á và Cục Thú y Dự án cũng được mời đến nhiều cuộc họp của vùng để trình bày các dữ liệu về kiểm soát LMLM ở Việt Nam. Với kết quả nêu trên, Việt Nam trở thành một ví dụ cho các quốc gia khác trong khu vực trong việc chỉ ra các loại thông tin có thể được thu thập trong quá trình giám sát huyết thanh và điều tra ổ dịch. Các hoạt động kết hợp với dự án xây dựng năng lực của AusAID giúp cả 2 dự án đều đạt được mục tiêu như kết hợp huấn luyện kỹ thuật PCR và giải mã gen virus LMLM song song cùng với giải mã gene virus cúm gia cầm, PRRS và dịch tả heo phân lập được từ Việt Nam Dịch cúm gia cầm và PRRS tác động mạnh đến các hoạt động phòng thí nghiệm cũng như các hoạt động hiện trường của dự án này và làm công việc của đội ngũ nhân viên của Cục Thú Y bị quá tải. 7
4. Giới thiệu và bối cảnh Mục tiêu của dự án 1. Thiết lập mạng lưới phòng thí nghiệm để chẩn đoán và kiểm soát bệnh LMLM thông qua việc đào tạo nhân viên về các phương pháp xét nghiệm theo quy định và quản lý chất lượng. 2. Cung cấp số liệu chính xác để lý giải được sự thất bại của vaccin trong chương trình khống chế LMLM và đề xuất chiến lược sử dụng vaccin mới có hiệu quả. Khi hoàn thành những mục tiêu này sẽ không chỉ nâng cao được năng lực chẩn đoán của các phòng thí nghiệm thú y ở Việt nam mà còn giúp huấn luyện về công tác điều tra khống chế bệnh cho cán bộ thú y của Cục thú y. Do đó sẽ tăng cường năng lực cho ngành thú y , cơ quan có vai trò quan trọng , giúp cho Việt Nam tăng khả năng cạnh tranh trong quá trình hội nhập kinh tế . Cải thiện sức khỏe vật nuôi sẽ làm phát triển sản xuất ở vùng nông thôn nhờ tăng sản phẩm chăn nuôi và gián tiếp tăng sản lượng cây trồng. Vật nuôi khỏe mạnh sẽ giúp người chăn nuôi nhỏ tăng khả năng cạnh tranh tại thị trường nội địa. Việc khống chế LMLM và các bệnh khác sẽ tạo điều kiện cho những hộ nghèo có thu nhập ổn định, giảm sự tác động bất lợi từ tự nhiên và kinh tế. Việc thiết lập một hệ thống chẩn đoán trải dài từ Bắc tới Nam Việt nam, từ phòng thí nghiệm đến trại chăn nuôi được củng cố qua sự huấn luyện và đào tạo thường xuyên về cơ bản sẽ giúp Việt Nam thiết lập được mô hình về kiểm soát dịch bệnh. Điều này sẽ trực tiếp làm tăng khả năng cạnh tranh, sản xuất chăn nuôi trong hệ thống ngành Nông nghiệp của Việt Nam tập trung chủ yếu ở những vùng trọng điểm thuộc đồng bằng sông Cửu long và duyên hải miền Trung. Mục tiêu cụ thể cho các phòng thí nghiệm • Tài liệu đào tạo cho phòng thí nghiệm bao gồm nhiều kỹ thuật chẩn đoán. • Thiết lập các kỹ thuật xét nghiệm tại Cơ quan thú y vùng VI ( TP. Hồ Chí Minh ) và Trung tâm chẩn đoán thú y trung ương ( Hà Nội) giúp các phòng thí nghiệm này hoạt động như phòng thí nghiệm tham chiếu cấp quốc gia. • Thiết lập các kỹ thuật ELISA tại Cơ quan thú y vùng IV ( Đà Nẳng), Cơ quan thú y vùng VII ( Cần Thơ) và phòng thí nghiệm của NAVETCO giúp các phòng thí nghiệm này hoạt động như phòng thí nghiệm cấp vùng. • Các quy trình hướng dẫn gửi mẫu, quản lý mẫu và phản hối kết quả xét nghiệm. 8
• Xây dựng và kiểm tra hồ sơ quản lý chất lượng . Xem xét hồ sơ quản lý các kết quả đối chứng nội của các xét nghiệm của từng phòng thí nghiệm. Hướng thực hiện và chiến lược Phương thức chuyển giao kỹ thuật được thiết lập tại AAHL rất thành công khi áp dụng cho các dự án trước đây ở Vietnam, Thailand và Indonesia Phương pháp tiếp cận của dự án được coi là thích hợp nhất cho việc phát triển sự hiểu biết về dịch tễ học của LMLM ở Vietnam. Các nghiên cứu thực địa và giám sát huyết thanh học đã được thiết kế, lên kế hoạch cùng với Cục thú y để có được những thông tin cần thiết và chính xác nhất thể hiện được tình hình LMLM ở Viet Nam và hiệu quả của vaccin LMLM . Các kỹ thuật chẩn đoán sẽ được sử dụng trong dự án này là những xét nghịêm tiêu chuẩn đã và đang được sử dụng rộng rãi trên thế giới khi nghiên cứu LMLM cũng như theo hướng dẫn của Tổ chức thú y thế giới OIE. Các chuyên viên AAHL có nhiều kinh nghiệm điều tra thực địa để xác định tỷ lệ lưu hành kháng thể như trong các dự án ACIAR ở Laos và Thailand về LMLM. Philippines là một ví dụ khác, nơi mà các xét nghiệm chẩn đoán tiêu chuẩn theo OIE đã sử dụng để khống chế và loại trừ bệnh LMLM. 5. Hoạt động và hiệu quả của các phòng thí nghiệm tham chiếu cấp quốc gia và các phòng thí nghiệm cấp vùng 5.1 Những điểm đáng chú ý Các thành tựu chính của dự án • Các kỹ thuật chẩn đoán sau đây được thiết lập tại các phòng thí nghiệm tham gia dự án: Cơ quan Thú Y Vùng VI và Trung Tâm Chẩn Đoán Thú Y Trung Ương đã thiết lập các kỹ thuật nuôi cấy tế bào, phân lập virus, trung hòa virus, xác định kháng thể và kháng nguyên bằng ELISA, PCR và giải mã gene. Cơ quan thú y vùng IV và vùng VII có khả năng chẩn đoán định serotype bằng kỹ thuật ELISA (phát hiện kháng nguyên) để xác định các ổ dịch và giám sát kháng thể bệnh LMLM để giám sát huyết thanh sau tiêm phòng bằng các phản ứng ELISA. 9
• Hệ thống chất lượng được áp dụng ở mỗi phòng thí nghiệm trong chẩn đoán FMD bao gồm các phương pháp được tiêu chuẩn hóa, xây dựng hệ thống đối chứng nội và lưu giữ các dữ liệu xet nghiệm tốt hơn Tiêu chuẩn hóa các phương pháp xét nghiệm đối với các phương pháp ELISA, nuôi cấy tế bào, PCR, giải mã gene và thu thập dữ liệu (ví dụ: các phương pháp ELISA được đính kèm trong email gởi cùng báo cáo này.) Các phiếu quản lý xét nghiệm, bảng kết quả và các báo cáo hệ thống đối chứng được lưu giữ theo mẫu ( thí dụ mẫu ELISA phụ lục 1) • Đã tăng cường sự cộng tác giữa các phòng thí nghiệm ngày càng tốt hơn từ khi dự án bắt đầu • Cải thiện chất lượng và số lượng mẫu gửi đến phòng thí nghiệm để định type LMLM ( tổng kết kết quả định serotype ở phụ lục 2). Điều này giúp cho Cục Thú Y hiểu rõ hơn về sự lưu hành của các serotype virus LMLM ở Việt Nam. Chất lượng mẫu thu thập được cải thiện giúp phân lập được virus từ các mẫu hiện trường, điều này chưa được thực hiện tốt trước khi có dự án, nhờ đó việc giải mã gene của virus LMLM đã phân lập được thực hiện tốt hơn. • Giải mã gene, phân loại kiểu gene và phân tích gần 100 mẫu virus FMD được phân lập tại Việt Nam từ năm 2006 cho đến nay. Sự giải mã và phân tích kiểu gene được thực hiện tại AAHL bởi các nhà khoa học AAHL và Cơ quan Thú y vùng VI. Dữ liệu về các mã gene được gửi đến phòng thí nghiệm tham chiếu về LMLM của thế giới để chứng thực và so sánh với các virus LMLM khác được phân lập. Thông tin này được chia sẽ với chương trình khống chế LMLM của vùng Đông Nam Á (SEAFMD) nhằm hỗ trợ dự án cấp vùng kiểm soát LMLM. • Giải mã gene/ định kiểu gene 2006/2008 Serotype O: 3 topotype Cathay (33%), ME-SA (PanAsia) (6%) & SEA (Myanmar 98) (41%) Heo: chủ yếu là Cathay & SEA Trâu bò: chủ yếu là SEA Serotype A: Thailand/Malaysia 97 Vaccine LMLM Serotype A đã dùng cần được chuyển từ từ A 22 sang A Malaysia 97 (kể cả kháng nguyên cho xét nghiệm huyết thanh học) Serotype Asia 1: Jiangsu-China-2005 (được phân lập từ miền Bắc và miền Trung) và Myanmar (được phân lập từ miền Trung) Đã khẳng định có 2 nguồn gốc virus LMLM serotype Asia 1 tồn tại ở Việt Nam 10
• Các phân tích trình tự gene virus LMLM phân lập từ Việt Nam đã được dùng để so sánh với trình tự gene virus LMLM khắp thế giới và được trình bày ở bảng phụ lục 3 • Chất lượng và số lượng mẫu huyết gởi đến phòng thí nghiệm để làm phản ứng huyết thanh học bằng ELISA được cải thiện giúp cục Thú Y có hiểu biết rõ hơn nguy cơ của đàn gia súc với LMLM và tình hình tiêm chủng vaccine ở Việt Nam. Giám sát huyết thanh: thực hiện hai lần một năm trong đó lấy mẫu lần đầu trước khi tiêm chủng và lần thứ hai là sau khi tiêm chủng Dữ liệu từ giám sát huyết thanh cho thấy tỷ lệ tiêm phòng và số lượng gia súc có nguy cơ bị nhiễm LMLM (Ví dụ: bảng tóm tắt ví dụ được đính kèm theo e-mail) Có thể đưa ra những khuyến cáo nhằm cải thiện tinh hình giám sát huyết thanh • Một số mẫu huyết thanh được xét nghiệm lại nhằm so sánh hiệu giá kháng thể của các mẫu từ các tỉnh để cho phép xác định bằng huyết thanh học các serotype đang lưu hành. Các kết quả khẳng định rằng sự xét nghiệm kết hợp giửa phát hiện kháng thể kháng kháng nguyên không cấu trúc 3ABC bằng 3ABC-ELISA và chuẩn độ kháng thể kháng kháng nguyên cấu trúc bằng LP-ELISA có thể được dùng để xác định serotype LMLM đang lưu hành ngoai hiện trường. (xem bảng phụ lục 4) • Trong suốt dự án, các chuyên gia AAHL đã thăm các phòng thí nghiệm để Thiết lập các kỹ thuật ELISA chẩn đoán bệnh LMLM và chuẩn hóa các kỹ thuật này. Đánh giá kháng nguyên do Cơ quan thú Y vùng VI sản xuất từ mẫu virus phân lập được tại Việt Nam để sử dụng cho phản ứng ELISA. Việc sản xuất kháng nguyên LMLM cho ELISA giúp cho các phòng thí nghiệm chủ động hơn và bắt đầu cho thấy có khả năng tự sản xuất các nguyện liệu phục chẩn đoán. Thiết lập và xem xét lại kỹ thuật nuôi tế bào và phân lập virus LMLM từ hiện trường. Nuôi tế bào là kỹ thuật quan trọng dùng để phân lập và nuôi cấy virus LMLM giúp thực hiện những phân tích sâu hơn các virus này bằng kỹ thuật PCR và giải mã gene. Kỹ thuật nuôi tế bào cũng được ứng dụng để thực hiện phản ứng huyết thanh như trung hòa virus và để phân lập các virus gây bệnh khác như đậu dê cừu, dịch tả heo, PRRS. Xem xét lại các kỹ thuật phân tử và thiết lập trình tự các bước thực hiện để xử lý mẫu và kiểm tra để đảm bảo chất lượng kết quả phản ứng.. Đánh giá hồ sơ đảm bảo chất lượng và thu thập dữ liệu để chắc rằng các kết quả được lưu trữ và các kết quả được hiểu đúng. 11
Đưa ra các khuyến cáo về việc thu thập thông tin hiện trường và xây dựng mẫu thu thập thông tin. Phân tích kết quả hiện trường và phòng thí nghiệm cung cấp để thông tin đầu vào cho dịch tễ Cung cấp thêm các vật tư và nguyên liệu để xét nghiệm bệnh LMLM bằng kỹ thuật ELISA, phân tử và tế bào. Huấn luyện về kỹ thuật an toàn sinh học và trợ giúp các nhân viên thực hiện. Đánh giá quy trình đảm bảo chất lượng và cung cấp thông tin đầu vào cho sổ tay quản lý chất lượng Đánh giá tính chính xác của các xét nghiệm bằng các mẫu thẩm định năng lực ( đánh giá sự thành thục ) . Các mẫu cung cấp cho phòng thí nghiệm đã cho kết quả chính xác. . 5.2 Xây dựng năng lực Dự án đã hỗ trợ về tập huấn và chuyển giao kỹ thuật chẩn đoán bệnh LMLM cho từng phòng thí nghiệm (PTN) nằm trong chương trình. Các nguyên vật liệu và các phương pháp tiêu chuẩn đã được cung cấp để cho từng PTN có được năng lực chẩn đoán bệnh LMLM. Các PTN hiện nay đang áp dụng thường quy kỹ thuật ELISA để phát hiện kháng thể và định serotype ( phát hiện kháng nguyên) bệnh LMLM, Cơ Quan Thú y Vùng VI và Trung Tâm Chẩn Đoán Thú y trung Ương đã áp dụng được các kỹ thuật phân lập virus, nuôi cấy tế bào, trung hòa huyết thanh , sinh học phân tử và kỹ thuật giải mã gen. Tập huấn và đào tạo cho thú y địa phương cách lấy mẫu và thu thập dữ liệu giúp tăng chất lượng và số lượng mẫu thu thập gởi về phòng thí nghiệm. Những kỹ năng nảy sẽ rất hữu ích cho chương trình kiểm soát LMLM quốc gia. 5.3 Quảng bá Dự án CARD AusAID đã được quảng bá Việt Nam, Úc và quốc tế qua các chương trình tập huấn và giúp hiểu được tình hình LMLM ở Việt Nam. LMLM là một bệnh quan trọng ở Việt Nam và khu vực , điều này cho thấy dự án đi đúng hướng. Dự án đã được quảng bá bằng đưa thông tin trên các báo ớ Úc, trang báo diện tử của chương trình SEAFMD và trên internet. Các kết quả của dự án cũng được trình bày tại: o Cuộc họp OIE/SEAFMD (Ví dụ: file được đính kèm theo email) o EU FMD 2008 (Ví dụ: file được đính kèm theo email) o WAVLD 2007, 2009 o Cuộc họp vùng của nhóm công tác Thượng lưu và Hạ lưu sông Mê-Kông. 12
Với năng lực phòng thí nghiệm và dịch tễ hiện nay của các phòng thí nghiệm hợp tác, đặc biệt là Cơ Quan Thú y Vùng VI , có khả năng thực hiện một nghiên cứu nhỏ hơn, tập trung tim hiểu về việc thất bại trong chủng ngừa. Nghiên cứu này tốt nhất là thực hiện giới hạn ở một số ít tỉnh phía nam Việt Nam với mục tiêu nghiên cứu cụ thể là điều tra hiệu quả của việc chủng ngừa. Các phòng thí nghiệm hợp tác hiện nay đang áp dụng được nhiều kỹ thuật chẩn đoán bệnh LMLM một cách bền vững và có khả năng chuyễn giao kỹ thuật cho các phòng thí nghiệm khác 6. Kết luận Dự án đã đạt được mục tiêu bằng cách giúp đỡ để nâng cao năng lực chẩn đoán bệnh nói chung và bệnh LMLM của mạng lưới các phòng thí nghiệm thú y. Phòng thí nghiệm thuộc ơ Quan Thú y Vùng VI và Trung Tâm Chẩn Đoán Thú y trung Ương đã và đang tiếp tục hỗ trợ và đào tạo cho các phòng thí nghiệm khác trong mạng lưới. Dự án cũng cho thấy sự cần thiết phải tiếp tục huấn luyện cho thú y cơ sở các phương pháp thu thập thông tin và cách để lấy được thông tin chính xác từ người chăn nuôi. Nhân viên của Cơ Quan Thú y Vùng VI sẽ tiếp tục làm việc trực tiếp với thú y cơ sở để đảm bảo tính chính xác của các thông tin thu thập được cho các chương trình giám sát trong tương lai. Thiết được kỹ thuật nuôi cấy tế bào đã cho phép phân lập được virus LMLM từ hiện trường, mà trước đây, phòng thí nghiệm Cơ Quan Thú Y Vùng VI và Trung Tâm Chẩn Đoán Thú y Trung Ương không thể xác định được. Sự nâng cao năng lực chẩn đoán bệnh LMLM, bằng sự kết hợp các kỹ thuật ELISA, PCR và phân lập virus bằng tế bào, đã giúp gia tăng số ổ dịch LMLM được xác định tại Việt Nam. Sữ dụng tế bào để phân lập virus LMLM đã cung cấp được mẫu virus với chất lượng tốt hơn cho việc giải mã gen Việc áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử tại Cơ Quan Thú y Vùng VI đã giúp có được kết quả giải mã gen nhanh hơn, giúp khẳng định được các serotype virus LMLM đang lưu hành tại Việt Nam và chọn chính xác loại vaccine phù hợp để kiểm soát bệnh LMLM cho từng vùng. AAHL, Cục Thú y và phòng thí nghiệm tham chiếu của thế giới về LMLM (WRL) đã hợp tác phân tích trình tự gene của virus phân lập được tại Việt Nam. Nuôi cấy tế bào cũng cho phép sản xuất kháng nguyên sữ dụng cho ELISA, là một nguyên liệu chủ yếu trong các xét nghiệm chẩn đoán bệnh LMLM. Cơ Quan Thú Y Vùng VI đang tự sản xuất kháng nguyên và chuyễn giao cho Trung Tâm Chẩn Đoán Thú y Trung Ương, Cơ Quan Thú Y Vùng IV và VII để thử nghiệm. Dự án này vẫn tiếp tục là quan trọng đối với Việt Nam vì các ổ dịch LMLM có tính lập lại theo chu kỳ. Chính phủ Việt Nam và Cơ quan Thú Y vùng VI đã mời các chuyên gia AAHL 13
cố vấn trong việc kiểm soát LMLM và dự án này được sữ dụng như một mô hình để bổ sung cho kế hoạch kiểm soát LMLM của họ. Mặc dù sự giám sát và khống chế cúm gia cầm và gần đây là bệnh PRRS là cấp thiết hơn nhưng chính phủ Việt Nam vẫn cam kết thực hiện kiểm soát bệnh LMLM. Điều này được chứng minh bằng các hoạt động của chương trình kiểm soát LMLM quốc gia hàng năm. Dự án đã cho thấy sự cần thiết phải có sự cộng tác giữa phòng thí nghiệm và thú y cơ sở trong kiểm soát LMLM, kết quả giám sát huyêt thanh sau tiêm phòng do phòng thí nghiệm cung cấp sẽ giúp hiểu được hiệu quả tiêm phòng và tình hình nhiễm bệnh của gia súc. Đối với phòng thí nghiệm, điều quan trọng là phải có nguyên liệu xét nghiệm thích hợp với các chủng virus đang lưu hành ở hiện trường (cũng cho thấy tầm quan trọng của việc tăng cường định danh virus LMLM) và đối với hiện trường, những thông tin từ hiện trường kết hợp với kết quả của phòng thí nghiệm sẽ giúp đánh giá được tình hình chính xác hơn . Điều quan trọng đối với hệ thống thú y là kiểm soát được dịch bệnh, vì thế cần phải có mối quan hệ bền vững giữa phòng thí nghiệm và hiện trường để đảm bảo các kết quả đánh giá thu được là chính xác. Dự án này đã thiết lập những tiêu chuẩn cần thiết để một hệ thống phòng thí nghiệm hoạt động có hiệu quả, những bài học từ dự án đã được áp dụng trong việc đối phó với các ổ dịch cúm gia cầm có độc lực cao và PRRS ở Việt Nam và cho những dự án cũng như các cuộc điều tra tiếp theo. 14
Phụ lục 1 Mẫu quản lý xét nghiệm, kết quả và lưu trữ kết quả đối chứng nội , lấy xét nghiệm FMD 3ABC ELISA làm thí dụ: 7.1.1 Phiếu quản lý xét nghiệm 3ABC C-ELISA Tên xét nghiệm : FMD 3ABC COMPETITION ELISA Số đăng ký Ký hiệu mẫu Tên xét nghiệm (3ABC c-ELISA): Người giám sát: Ngày phủ đĩa: Người thực hiện: Ngày thực hiện xét nghiệm: Người thực hiện: Phương pháp rữa đĩa: Tủ ấm: Máy lắc đĩa: Các pipettes: Số đĩa: Pha kháng nguyên 3ABC: Số lô kháng thể phát hiện : Số lô kháng thể phát hiện: Pha loãng huyết thanh đối chứng và huyết thanh mẫu: Ngày sản xuất dung dịch phủ đĩa: Ngày sản xuất dung dịch Block: Số lô Conjugate: Pha loãng conjugate: Thời gian ủ Substrate: Ngày báo cáo kết quả Ký tên 15
7.1.2 Kết quả và sơ đồ đĩa Sơ đồ đĩa ELISa 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 S1 S1 S9 S9 S17 S17 S25 S25 S33 S33 C++ C++ A S2 S2 S10 S10 S18 S18 S26 S26 S34 S34 C++ C++ B S3 S3 S11 S11 S19 S19 S27 S27 S35 S35 C+ C+ C S4 S4 S12 S12 S20 S20 S28 S28 S36 S36 C+ C+ D S5 S5 S13 S13 S21 S21 S29 S29 S37 S37 C- C- E S6 S6 S14 S14 S22 S22 S30 S30 S38 S38 OD OD F MAX MAX S7 S7 S15 S15 S23 S23 S31 S31 S39 S39 OD OD G MAX MAX S16 S16 S24 S24 S32 S32 S40 S40 CC CC H S8 S8 7.1.3 Phiếu quản lý chất lượng Ngày C++ C+ C- OD Max Mhân Ghi chú Số Đăng Kháng viên ký nguyên Chuẩn Chuẩn Chuẩn Serotype Tỷ lệ ức Tỷ lệ ức Tỷ lệ ức chế chế chế 80 – 100% 50 – 80% < 30% 0.8 – 1.5 16
7.1.4 Tóm tắt qui trình FMD – 3ABC C-ELISA 1. Phủ đĩa 50μl/giếng 3ABC(D) baculovirus-expressed antigen (protein thô hòa tan được) pha loãng 1:2000 trong Carbonate Bicarbonate Coating Buffer 2. Ủ và lắc đĩa trong 1 giờ tại 37OC. (Có thể để 4OC, ủ qua đêm) 3. Rửa đĩa 5 lần với dung dịch PBS 4. Block đĩa với 100uL/giếng Blocking buffer. 5. Ủ và lắc đĩa trong 30 phút tại 37OC. 6. Rửa đĩa 5 lần với dung dịch PBS 7. Thêm 40uL Blocking buffer vào mỗi giếng và sau đó thêm 10uL huyết thanh và trộn mẫu (dùng pipette trộn lên và xuống). ODmax and Background (Bkg) mỗi giếng chỉ nhận 50uL Blocking buffer 8. Ủ và lắc đĩa trong 30 phút ở 37OC. 9. KHÔNG RỬA ĐĨA Pha loãng chicken egg antibody pool 1:100 trong Blocking buffer và thêm 50uL vào tất cả các giếng, trực tiếp phía tên mẫu test. Mỗi giếng Bkg chỉ nhận 50uL buffer. 10. Ủ và lắc đĩa trong 30 phút ở 37OC 11. Trong thời gian ủ, chuẩn bị conjugate (ít nhất 30 phút trước khi dùng.) 12. Rửa đĩa 5 lần với dung dịch PBS. 13. Thêm vào 50μl/giếng conjugate 14. Ủ và lắc đĩa trong 1 giờ ở 37OC 15. Chuẩn bị substrate (KHÔNG ĐƯỢC HOẠT HÓA). 16. Rửa đĩa 5 lần với dung dịch PBS. 17. Thêm 100μl Substrate cho mỗi giếng 18. Ủ tại nhiệt độ phòng. 10 phút (KHÔNG lắc) 19. Dừng phản ứng với 100μl Stopping Solution. 20. Đọc đĩa với máy đọc có bước sóng 450nm 17
Phụ lục 2 7.2 Kết quả định serotype virus LMLM tại Việt Nam từ 2005-2009 Năm Tổng lượng mẫu Các m ẫu Các m ẫu Các m ẫu Âm tính/ Không (Cơ Quan Thú Y vùng VI dương tính dương tính dương tính phù hợp và Trung Tâm Chẩn Đoán Serotype O Serotype A Serotype Asia Thú y trung Ương) 1 2005 251 207 17 13 12/2 216 180 17 11 6/2 * RAHO - 6 2006 803 663 0 8 128/4 506 467 0 2 33/4 2007 224 177 1 8 7/0 123 115 1 0 7/0 2008 154 86 9 0 59 *poor quality sample was a 22 14 0 0 problem in north 8/0 2009 9 0 7 0 2/0 18
Phụ lục 3 Thí dụ thông tin giải mã gen của dự án 7.3 kết quả giải mã gen virus LMLM serotype O 2008-2009 48 FMDV/Type O/08-6415-E2 65 FMDV/Type O/08-6415 E3 FMDV/Type O/08-6924 E4 100 FMDV/Type O/08-5515-12 99 71 FMDV/Type O/08-5515-14 49 O/UKG/35/2001|AJ539141| ME-SA 56 O/India/53/79|AF292107| ME-SA O/O1 Manisa/87|AY593823| ME-SA 70 67 O/India/R2/75|AF204276| ME-SA O/MYA/7/98|DQ164925| SEA 56 94 O/CAM/3/98|AJ294910| SEA O/SUD/2/86|DQ165075| EA3 O/KEN/83/79|AJ303511| EA1 99 68 O/UGA/5/96|AJ296327| EA1 94 73 O/GHA/5/93|AJ303488| WA 100 O/CIV/8/99|AJ303485| WA O/MAL/1/98|DQ165074| EA2 O/UGA/3/2002|DQ165077| EA2 100 63 O/KEN/5/2002|DQ165073| EA2 O/ISA/9/74|AJ303502| ISA-1 92 100 O/ISA/8/83|AJ303503| ISA-1 O/ISA/1/62|AJ303500| ISA-1 O/ISA/1/74|AJ303501| ISA-2 100 61 O/JAV/5/72|AJ303509| ISA-2 O/Corrientes/Arg/06|DQ834727| EURO-SA 70 O/O3 Venezuela/51|AJ004645| EURO-SA 91 O/O2Brescia/ITL/47|M55287| EURO-SA 58 39 O/O1BFS 1860/UK/67|AY593815| EURO-SA O/HKN/21/70|AJ294911| Cathay O/HKN/6/83|AJ294919| Cathay 100 O/PHI/7/96|AJ294926| Cathay 100 O/Yunlin/TAW/97|AF308157| Cathay 84 FMDV/Type O/08-4856 44 100 FMDV/Type O/08-4923-4 64 FMDV/Type O/08-4923-3 FMDV/Type O/09-1045-KH2 100 FMDV/Type O/09-1045 KH3 100 FMDV/Type O/09-1045 KH5 FMDV/Type O/09-1045 KH6 0.01 19
1 04A A HL 0738K TPHCM 8 4A A HL 0748BG2 BaRiaV ungTau Report on 34 FMDV O VP1 sequences 8 6A A HL 0745 DongNai 1 07A A HL 0758T TPHCM 1 06A A HL 0751QM TPHCM 8 7A A HL 0750 PhuY en 8 5A A HL 0748PH1 BaRiaV ungTau 1 03A A HL 06467 Soc trang 9 0A A HL 0779DH1 LongA n from Vietnam received from AAHL 8 2A A HL 0708 LamDong 78 8 9A A HL 0762 DongNai 1 12A A HL 06466 TPHCM O/V IT/7/2006 80 O/V IT/5/2006 82 O/V IT/4/2006 93 O/V IT/6/2006 9 4 O/TA I/15/05* ( TRRL) O/TA I/14/05* (TRRL) 100 O/TA I/3/2003 ( DQ164981) Software: MEGA 4 74 O/MA Y /1/2005 O/MA Y /2/2005 100 O/V IT/6/2005 No. of Taxa : 173 O/MY A /4/2004 100 O/MY A /5/04* (TRRL) O/TA I/21/05* (TRRL) 85 Data File : n:\evd\meg\db\fmdv\o\VITaahl1.meg O/MA Y /9/2007 91 74 O/MA Y /7/2007 SE A 99 O/MA Y /4/2007 82 O/MA Y /5/2007 Data Title : Vietnam 99 O/MA Y /6/2007 6 6A A HL ThanhHoa O/MA Y /5/2006 Data Type : Nucleotide (Coding) O/TA I/8/2004 100 O/TA I/37/04* ( TRRL) O/MY A /3/04* (TRRL) 97 90 O/MY A /4/04* (TRRL) Analysis : Phylogeny reconstruction 84 O/TA I/5/99 O/MY A /2/2000 ( DQ164927) O/V IT/4/2005 Tree Inference : ============================== O/TA I/36/04* ( TRRL) 100 O/MY A /1/04* (TRRL) O/MY A /2/04* (TRRL) 89 ->Method : Neighbor-Joining O/TA I/189/87* ( TRRL) 96 O/TA I/2/2000 (DQ164979) O/MA Y /1/2002 (DQ164923) 100 72 O/TA I/44-2/02R2B3* (TRRL) ->Phylogeny Test and options : Bootstrap (500 replicates; seed=64238) O/TA I/8/99 (DQ164977) O/BUR/2/89 100 O/V IT/2/97 99 Include Sites : ============================== O/V IT/7/97 O/CA M/12/94 92 O/CA M/3/98 94 O/CA M/6/99 ->Gaps/Missing Data : Pairwise Deletion 100 O/CA M/1/98 O/CA M/2/98 O1/Manis a/TUR/69 ( A J251477) ->Codon Positions : 1st+2nd+3rd+Noncoding O/LA O/17/2003 (DQ164912) O/LA O/2/2006 100 O/LA O/19/2003 (DQ164913) Substitution Model : ============================== O/LA O/20/2003 O/MA Y /1/2006 O/MA Y /2/2006 73 O/MA Y /7/2005 ->Model : Nucleotide: Maximum Composite Likelihood O/MA Y /3/2005 100 O/MA Y /4/2005 O/MA Y /6/2005 ->Substitutions to Include : d: Transitions + Transversions O/MA Y /3/2006 99 O/MA Y /9/2005 O/LA O/3/2006 99 ->Pattern among Lineages : Same (Homogeneous) O/LA O/4/2006 O/LA O/31/2003 (DQ164918) O/LA O/28/2003 (DQ164916) O/LA O/23/2003 (DQ164915) ->Rates among sites : Uniform rates O/TA I/20/04R2* (TRRL) O/V IT/1/2004 (DQ165032) 71 O/LA O/21/2003 (DQ164914) 85 No. of Sites : 639 O/LA O/5/2006 O/LA O/30/2003 (DQ164917) O/LA O/12/2003 (DQ164910) O/LA O/11/2003 (DQ164909) No Of Bootstrap Reps = 500 100 M E -SA O/LA O/13/2003 ( DQ164911) O/LA O/3/2003 (DQ164908) 9 8A A HL 06452T TienGiang 98 Only bootstrap vales of 70% and above are shown 100 1 01A A HL 06459CT1 LongA n 99 O/CA M/4/2006 89 O/V IT/17/2005 O/V IT/14/2002 (DQ165026) O/V IT/1/2003 (DQ165030) 100 O/CA M/2/2000 (A J318828) 100 O/CA M/4/2000 (A J318829) O/TA I/2/2003 ( DQ164980) O/V IT/8/2004 99 99 O/V IT/7/2005 89 N.J. Knowles & J. Wadsworth, 2 March 2008 O/V IT/7/2004 99 O/V IT/16/2002 (DQ165027) O/V IT/12/2002 ( DQ165024) O/V IT/3/2005 O/TA I/1/2000 93 O/V IT/6/2002 ( DQ165020) O/V IT/20/2002 (DQ165029) O/V IT/7/2002 O/V IT/10/2002 ( DQ165023) O/TA W/2/99 O/SKR/1/2000 (A J318854) O/JPN/2000 (A B050978) O/SKR/2/2002 O/TA I/9/99 (DQ164978) O/HKN/6/83 1 09A A HL 06482T Soc Trang 1 13A A HL 06482 Soc Trang 9 9A A HL 06453V Soc Tr ang 1 00A A HL 06457H CaMau 1 14A A HL 06443 CanTho 1 10A A HL 06476 1 15A A HL 06457 CaMau 1 02A A HL 06463 V inhLong 1 05A A HL 0739 CanTho 9 2A A HL 0757 V inhLong 92 8 8A A HL 0753 CanTho 72 1 11A A HL 0716 75 CanTho 1 16A A HL 0715C V inhLong 71 O/V IT/3/2006 1 00 O/V IT/1/2006 O/V IT/2/2006 8 3A A HL 0716 CanTho 85 9 5A A HL 06430 HauGiang 9 6A A HL 06434B HauGiang 99 98 9 3A A HL 0779CD1 LongA n 9 7A A HL 06443T Bac Lieu 99 O/MA Y /8/2005 72 O/V IT/9/2005 99 O/V IT/1/2005 O/PHI/21/2003 ( DQ164953) 100 O/PHI/23/2003 ( DQ164954) O/TA I/54-1/05B1* (TRRL) O/TA I/54- 2/05B1* ( TRRL) 79 O/TA I/53-2/05* (TRRL) O/TA I/64- 1/05* ( TRRL) 100 O/TA I/64-2/05* (TRRL) CAT H AY O/TA I/35/05B2* ( TRRL) 100 1 08A A HL 0735 DongThap O/V IT/2/2004 (DQ165033) O/V IT/3/2004 (DQ165034) O/V IT/11/2005 99 O/TA W/81/97 100 O/TA W/4/99 O/TA W/83/97 79 O/HKN/16/96 O/PHI/5/95 ( DQ164946) O/PHI/7/96 73 O/V IT/3/97 O/V IT/13/2002 ( DQ165025) O/HKN/7/96 78 O/HKN/20/96 99 O/HKN/12/2005 O/HKN/15/2005 O/HKN/14/2005 O/HKN/9/2005 O/HKN/10/2005 99 O/HKN/17/2005 O/HKN/18/2005 O/HKN/19/2005 O/HKN/20/2005 100 O/HKN/25/2005 O/HKN/24/2005 O/HKN/3/2006 O/HKN/22/2005 84 4 9 O/HKN/23/2005 O/HKN/1/2006 O/HKN/5/2006 87 O/HKN/2/2006 Page 1 of 4 O/HKN/4/2006 E U R O -S A O1/BFS 1860/UK/67 (J02185) 0.02 20
SEA topotype 1 04A A HL 0738K TPHCM 8 4A A HL 0748BG2 BaRiaV ungTau 8 6A A HL 0745 DongNai 1 07A A HL 0758T TPHCM 1 06A A HL 0751QM TPHCM 8 7A A HL 0750 PhuY en 8 5A A HL 0748PH1 BaRiaV ungTau 1 03A A HL 06467 Soc trang 9 0A A HL 0779DH1 LongA n 8 2A A HL 0708 LamDong 80 8 9A A HL 0762 DongNai 1 12A A HL 06466 TPHCM O/V IT/7/2006 80 O/V IT/5/2006 82 O/V IT/4/2006 93 O/V IT/6/2006 9 5 O/TA I/15/05* ( TRRL) O/TA I/14/05* ( TRRL) 100 O/TA I/3/2003 (DQ164981) 73 O/MA Y /1/2005 O/MA Y /2/2005 99 O/V IT/6/2005 O/MY A /4/2004 100 O/MY A /5/04* (TRRL) O/TA I/21/05* (TRRL) 85 O/MA Y /9/2007 78 75 O/MA Y /7/2007 99 O/MA Y /4/2007 81 74 O/MA Y /5/2007 O/MA Y /6/2007 6 6A A HL ThanhHoa 99 6 7A A HL LangSon O/MA Y /5/2006 O/TA I/8/2004 100 O/TA I/37/04* (TRRL) O/MY A /3/04* (TRRL) 97 90 O/MY A /4/04* (TRRL) 83 O/TA I/5/99 O/MY A /2/2000 (DQ164927) O/V IT/4/2005 O/TA I/36/04* (TRRL) 100 O/MY A /1/04* (TRRL) O/MY A /2/04* (TRRL) 88 O/TA I/189/87* (TRRL) O/TA I/2/2000 (DQ164979) O/MA Y /1/2002 (DQ164923) 100 71 O/TA I/44-2/02R2B3* (TRRL) O/TA I/8/99 (DQ164977) O/BUR/2/89 100 O/V IT/2/97 99 O/V IT/7/97 O/CA M/12/94 90 O/CA M/3/98 O/CA M/6/99 100 O/CA M/1/98 O/CA M/2/98 0.02 21