Chương 2: Điện di gel

Chia sẻ: Phuong Nha | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:16

1
1.095
lượt xem
522
download

Chương 2: Điện di gel

Mô tả tài liệu
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Điện di là kỹ thuật được dùng để phân tách và một đôi khi để tinh sạch các đại phân tử-đặc biệt là các protein và các nucleic acid-trên cơ sở kích thước/khối lượng, điện tích và cấu hình của chúng. Khi các phân tử tích điện được đặt trong một điện trường, chúng sẽ dịch chuyển hướng đến cực dương (+) hoặc cực âm (-) tùy theo điện tích của chúng.

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Chương 2: Điện di gel

  1. Chương 2 Điện di gel I. Nguyên lý chung Điện di là kỹ thuật được dùng để phân tách và một đôi khi để tinh sạch các đại phân tử-đặc biệt là các protein và các nucleic acid-trên cơ sở kích thước/khối lượng, điện tích và cấu hình của chúng. Khi các phân tử tích điện được đặt trong một điện trường, chúng sẽ dịch chuyển hướng đến cực dương (+) hoặc cực âm (-) tùy theo điện tích của chúng. Ngược với protein, loại phân tử có điện tích thực hoặc dương hoặc âm, các nucleic acid có một điện tích âm không đổi nhờ khung phosphate của mình, và vì thế chỉ dịch chuyển hướng đến cực dương. Các phân tử protein và nucleic acid có thể được chạy điện di trên một khuôn đỡ (support matrix) như giấy, cellulose acetate, gel tinh bột, agarose hoặc polyacrylamide gel. Trong đó gel của agarose và polyacrylamide được sử dụng phổ biến nhất. Thông thường, gel là một khuôn đúc dạng phiến mỏng có các giếng để nạp (loading) mẫu. Gel được ngâm trong đệm điện di cung cấp các ion để dẫn truyền dòng điện và một vài loại đệm để duy trì pH ở một giá trị không đổi tương đối. II. Điện di agarose gel Agarose (polysaccharide) có khối lượng phân tử xấp xỉ 120.000 Da (Hình 2.1) là một trong hai thành phần chính của agar1 chiếm khoảng 70%, phần kia là agaropectin chiếm khoảng 30%. Agarose là một polymer mạch thẳng không bị sulphate hóa chứa hai gốc xen kẽ nhau là D-galactose và 3,6-anhydro- L-galactose. Agarose gel là một chất trong suốt (transparent) hoặc trong mờ (transluent) giống như agar, được tạo thành khi hỗn hợp agarose và nước (hoặc đệm điện di) được đun nóng tới >100oC và sau đó được làm lạnh; dạng gel xuất hiện ở khoảng 40-45oC. Agarose gel được ứng dụng rộng rãi để làm giá thể cho các nucleic acid trong kỹ thuật điện di ngang (horizontal electrophoresis) hoặc làm giá thể cho môi trường nuôi cấy bacteriophage (top agarose). Hình 2.1. Cấu trúc phân tử của agarose. Đơn vị agarobiose (ví dụ: hai phân tử đường) là một monomer trong agarose polymer. Có khoảng 400 monomer trên một chuỗi polymer. Các phân tử nucleic acid có khối lượng và điện tích khác nhau được tách ra khi di chuyển từ cực âm sang cực dương của hệ điện di trong một điện trường có điện thế và cường độ thích hợp. Kỹ thuật này đơn giản và thực hiện nhanh. Hơn nữa, vị trí của DNA trong gel được xác định trực tiếp: các băng DNA trong gel được nhuộm ở nồng độ thấp của thuốc nhuộm huỳnh quang ethidium bromide (EtBr) và có thể phát hiện dưới ánh sáng tử ngoại (ultraviolet-UV). Điện di agarose gel được sử dụng trong các trường hợp sau: - Ước lượng kích thước của các phân tử DNA sau khi thực hiện phản ứng cắt hạn chế (ví dụ: lập
  2. bản đồ hạn chế của DNA được tạo dòng…). - Phân tích các sản phẩm PCR (ví dụ: trong chẩn đoán di truyền phân tử hoặc in dấu di truyền…). - Phân tách DNA hệ gen đã được cắt hạn chế trước khi thẩm tích Southern, hoặc RNA trước khi thẩm tích Northern. Ưu điểm của phương pháp này là gel được rót dễ dàng, không gây biến tính mẫu, và bền vững vật lý hơn polyacrylamide. Mẫu cũng dễ thu hồi. Nhược điểm là agarose gel có thể bị nóng chảy trong quá trình điện di, đệm có thể bị tiêu hao, và các dạng khác nhau của nucleic acid có thể chạy không ổn định. 1. Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ dịch chuyển điện di trong agarose gel 1.1. Kích thước của phân tử Các phân tử DNA mạch thẳng sợi đôi đi qua bản gel ở các tốc độ tỷ lệ nghịch với hàm log10 của khối lượng phân tử của chúng (Hình 2.2). Do đó, các phân tử DNA có kích thước càng lớn (khối lượng phân tử lớn) thì tốc độ dịch chuyển càng chậm. Hình 2.2. Mối quan hệ giữa kích thước DNA và độ linh động điện di của nó 1.2. Nồng độ agarose Đoạn DNA mang kích thước nhất định sẽ dịch chuyển ở các tốc độ khác nhau qua các bản gel chứa các nồng độ agarose khác nhau. Mối quan hệ tuyến tính giữa hàm logarithm của độ linh động điện di của DNA (m) và nồng độ gel (t) được biểu diễn bằng biểu thức: Trong đó mo: độ linh động điện di tự do. Kr: hệ số trì hoãn điện di (retardation), được thiết lập thông qua mối liên quan giữa các tính chất của gel với hình dạng và kích thước của các phân tử dịch chuyển. Như vậy, dùng gel ở các nồng độ khác nhau có thể phân tách được các đoạn DNA có kích thước
  3. khác nhau (Bảng 2.1). Nồng độ agarose cao có khả năng phân tách các đoạn DNA nhỏ, trong khi đó nồng độ agarose thấp lại cho phép phân tách các đoạn DNA lớn hơn. Bảng 2.1. Các thông số điện di DNA bằng agarose gel Hình 2.3 minh họa sự dịch chuyển của tập hợp các đoạn DNA trong hai mẫu ở ba nồng độ khác nhau của agarose, tất cả chúng ở trong một khay gel và được điện di ở cùng một điện áp (voltage) trong một thời gian xác định. Kết quả cho thấy, các đoạn lớn được phân tách tốt hơn ở gel 1%, trong khi các đoạn nhỏ thích hợp với gel 2%. Hình 2.3. Điện di các mẫu DNA giống nhau ở các nồng độ agarose khác nhau. A: 1%, B: 1,5% và C: 2%. 1.3. Cấu hình của DNA Các DNA dạng vòng đóng (form-I), vòng đứt (form-II) và mạch thẳng (form-III) có cùng một khối lượng phân tử sẽ dịch chuyển trên agarose gel ở các tốc độ khác nhau. Nhìn chung, DNA của các plasmid mạch vòng dịch chuyển nhanh hơn DNA của plasmid cùng loại nhưng có dạng mạch thẳng. Hầu hết plasmid mạch vòng chứa ít nhất hai dạng DNA có cấu trúc không gian khác nhau là dạng vòng đóng (siêu xoắn) và vòng đứt. Hình 2.4 minh họa kết quả điện di với plasmid mạch vòng bên trái và plasmid cùng loại mạch thẳng ở bên phải.
  4. Hình 2.4. Điện di các plasmid có cấu hình khác nhau 1.4. Thành phần base và nhiệt độ Tập tính điện di của DNA trong agarose gel không bị ảnh hưởng rõ rệt bởi thành phần base của DNA hoặc nhiệt độ mà ở đó gel được chạy. Trong agarose gel, tính linh động điện di tương đối của các đoạn DNA có kích thước khác nhau không thay đổi trong khoảng từ 4oC đến 30oC. Nói chung, agarose gel thường được chạy ở nhiệt độ phòng. 2. Phương pháp điện di agarose gel 2.1. Đệm pH Một số đệm điện di thích hợp cho DNA sợi đôi thường được dùng là Tris-acetate-EDTA (TAE), Tris-borate-EDTA (TBE) và Tris-phosphate-EDTA (TPE) ở nồng độ khoảng 50 mM và pH 7,5-7,8 (Bảng 2.2). Thường do thói quen, TAE được sử dụng nhiều nhất, nhưng khả năng đệm của nó lại thấp. Đệm TBE và TPE đều có khả năng hòa tan tốt các đoạn DNA và có khả năng đệm cao hơn một cách rõ rệt. Các đoạn DNA sẽ dịch chuyển với các tốc độ hơi khác nhau một chút trong ba loại đệm trên do sự khác nhau về cường lực ion của đệm. Đệm không những thiết lập một giá trị pH, mà còn cung cấp các ion để hỗ trợ cho độ dẫn (conductivity). Nếu chúng ta dùng nước thay vì là đệm trong quá trình điện di, thì sẽ không có sự dịch chuyển cần thiết của DNA trong gel. Ngược lại, nếu sử dụng đệm nồng độ đậm đặc (ví dụ: dung dịch stock ×10), thì nhiệt độ trong gel có thể tăng cao và làm nóng chảy nó. 2.2. Chuẩn bị agarose gel Có nhiều loại agarose khác nhau thích hợp để chạy điện di, loại agarose dùng tốt nhất trong thí nghiệm là type-II-agarose có nội thẩm thấu thấp (low-endo-osmotic). Nó dễ dàng chảy ra và tạo thành một dung dịch trong suốt, kết quả là gel đàn hồi thậm chí ở các nồng độ thấp. Tuy nhiên, type-II-agarose dễ bị bẩn bởi sulphate polysaccharides (SP), hơn nữa SP còn ức chế các enzyme như ligase, polymerase và RE. Vì thế, các đoạn DNA dung ly từ những gel như thế phải được làm sạch cẩn thận trước khi chúng được dùng như là các khuôn mẫu hoặc cơ chất cho các enzyme này. Bảng 2.2. Các đệm sử dụng phổ biến trong điện di
  5. 2.3. Nhuộm DNA trong agarose gel Phương pháp quan sát DNA trong agarose gel thuận lợi nhất là dùng thuốc nhuộm huỳnh quang EtBr. EtBr được dùng để phát hiện DNA sợi đôi và RNA sợi đơn. Tuy nhiên, ái lực (affinity) của thuốc nhuộm đối với nucleic acid sợi đơn là tương đối thấp và có hiệu suất huỳnh quang không cao. Sau khi nhuộm, EtBr sẽ xen vào giữa các base của nucleic acid và cho phép phát hiện dễ dàng chúng ở trong gel. Thường EtBr (0,5 mg/mL) được đưa vào trong agarose gel để phản ứng nhuộm xảy ra trong suốt quá trình điện di. Mặc dù tính linh động điện di của DNA sợi đôi mạch thẳng giảm khi có mặt thuốc nhuộm (khoảng 15%), nhưng khả năng xác định gel trực tiếp dưới ánh sáng UV trong suốt quá trình điện di hoặc ở giai đoạn cuối có ưu thế rõ rệt. Tuy nhiên, nếu cần có thể chạy điện di gel không có EtBr và chỉ nhuộm DNA hoặc RNA sau khi điện di xong. Gel được ngâm trong đệm điện di hoặc H2O chứa EtBr (0,5 mg/mL)/45 phút ở nhiệt độ phòng. Chú ý Ethidium bromide là một tác nhân gây đột biến mạnh. Vì thế, luôn luôn đeo găng tay khi cầm gel hoặc dung dịch chứa thuốc nhuộm. 2.4. Thu hồi DNA từ agarose gel Nhiều phương pháp đã được xây dựng để thu hồi DNA từ agarose gel, nhưng không có phương pháp nào là hoàn toàn tối ưu. Có hai vấn đề chính: thứ nhất đa số các loại agarose đều bị nhiễm bẩn bởi sulphate polysaccharides, các sản phẩm sau đó được chiết từ gel cùng với DNA, chúng là nhân tố ức chế có hoạt tính của nhiều loại enzyme (RE, ligase, kinase, polymerase) dùng trong các bước tạo dòng tiếp theo sau; thứ hai hiệu suất chiết DNA từ agarose gel phụ thuộc vào khối lượng phân tử của nó, các đoạn DNA có chiều dài 20 kb được thu hồi kém (khoảng hơn 20% sản lượng). Có nhiều phương pháp thu hồi và tinh sạch DNA từ agarose gel, dưới đây là một vài phương pháp chính: 2.4.1. Dùng agarose có nhiệt độ nóng chảy thấp (low melting temperature)
  6. Mẫu agarose gel có nhiệt độ nóng chảy thấp chứa đoạn DNA quan tâm được cắt ra khỏi bản gel và cho vào trong đệm với tỷ lệ 1:1, bổ sung muối đến nồng độ 0,5 M, sau đó được nóng chảy ở 70oC để hòa tan hoàn toàn trong đệm. Dung dịch gel có DNA được chiết bằng phenol/chloroform và kết tủa. Lưu ý DNA được tách chiết bằng phương pháp này không thích hợp cho mọi phương thức thao tác tiếp theo, do sự hiện diện của các nhân tố ức chế trong agarose. 2.4.2. Ly tâm Mẫu agarose gel có chứa băng DNA quan tâm được cắt ra và cho vào đệm chiết, làm nóng để hòa tan hoàn toàn, sau đó cho dung dịch gel lên trên một lớp (màng) bông thủy tinh đã silicon hóa đặt trong một cột lọc nhỏ loại 0,5 mL (còn gọi là spin column). Cột này được cho vào một tube vi ly tâm loại 1,5 mL và được ly tâm ở tốc độ cao 10.000-15.000 rpm trong 10-15 phút. DNA sẽ liên kết với màng còn dung dịch đệm sẽ đi qua lớp bông thủy tinh vào tube vi ly tâm. Cho đệm rửa vào cột và rửa cột vài lần bằng cách ly tâm nhanh. Thay tube vi ly tâm mới, cho đệm hòa tan DNA vào cột và ly tâm để dung ly (elution) DNA ra khỏi màng vào tube. Dung dịch DNA thu được có thể được tinh sạch thêm nếu cần. Cũng có thể đông lạnh mẫu gel trước khi dùng phương pháp ly tâm để cải thiện hiệu suất thu hồi DNA. 2.4.3. Điện di vào bẫy Một cái rãnh nhỏ được cắt trong agarose gel ngay phía trước của băng DNA quan tâm. Rãnh này được làm đầy bằng glycerol và gel được điện di nhanh trở lại để chuyển DNA từ gel vào trong dung dịch glycerol (quá trình điện di có thể được kiểm soát bằng UV). Dung dịch glycerol-DNA sau đó được chiết bằng pipette. Hoặc sau khi điện di, một khe nhỏ được cắt trong gel ngay phía trước băng DNA quan tâm và đặt trong khe một mẫu giấy loại NA-45. Gel sau đó được điện di trở lại và băng DNA quan tâm sẽ dịch chuyển vào trong mẫu giấy. Mẫu giấy sau đó được rửa và DNA được dung ly trong đệm bằng cách đun nóng mẫu giấy tới 70oC. DNA sau đó có thể được tách chiết bằng phenol và kết tủa. 2.4.4. Dùng hạt thủy tinh Mẫu gel quan tâm được hòa tan trong dung dịch muối NaI (một loại chaotropic salt) ở nồng độ khoảng 4 M. Các hạt thủy tinh sau đó được bổ sung vào dung dịch để liên kết hiệu quả với các đoạn DNA được phóng thích ở nồng độ đã cho của NaI. RNA, protein và các tạp chất khác không liên kết với các hạt thủy tinh. Tiếp theo là các chu kỳ rửa và kết tủa tiểu thể, DNA tinh sạch được dung ly khỏi hạt thủy tinh trong đệm muối thấp. Tuy nhiên, phương pháp này mặc dù nhanh và hiệu quả nhưng lại có phạm vi tối ưu hẹp. Thu hồi các đoạn DNA nhỏ (500-800 bp) là không hiệu quả lắm và các đoạn lớn (>15 kb) có thể liên kết với các hạt thủy tinh khác nhau và các sợi DNA có thể bị phá vỡ trong suốt các chu kỳ rửa. 3. Quy trình điện di 3.1. Chuẩn bị agarose gel Cho 1% type-II-agarose vào 100 mL đệm 0,5× TAE (nếu khuôn đổ gel lớn thì tăng theo tỷ lệ trên). Đun trong nồi khử trùng hoặc lò vi sóng cho đến khi agarose tan hoàn toàn. Nếu quá trình đun mất nước quá nhiều thì phải thêm nước cho đủ 100 mL. Để nguội khoảng 60oC và đổ vào buồng điện di có cài sẵn lược. Chiều dày gel khoảng 5 mm là thích hợp. Sau 30-40 phút, khi gel đã đông cứng, có thể gỡ lược ra. 3.2. Đặt mẫu DNA vào giếng Tùy thuộc vào từng mục đích điện di khác nhau có thể sử dụng nồng độ DNA cao hoặc thấp. Chẳng
  7. hạn theo tỷ lệ sau: DNA (1 mg/1 mL) 1 mL Đệm màu bromophenol (×10 loading dye) 1 mL Nước cất 2 lần 9 mL Tổng số 11 mL Dùng micropipette hút 11 mL dung dịch trên cho vào giếng. Lưu ý mẫu chạy điện di phải có dung tích £ thể tích của giếng. Thường đặt mẫu sau khi đã đổ dịch đệm 0,5× TAE vào buồng điện di cho ngập gel, ít khi đặt mẫu trước rồi đổ đệm sau (nạp khô). Để dễ làm việc nên dùng micropipette loại 20-200 mL và đặt buồng điện di trên bàn có nền đen. Khi tăng điện áp của quá trình điện di, các đoạn DNA lớn thường dịch chuyển nhanh hơn so với các đoạn nhỏ. Tuy nhiên, để có độ phân giải (resolution) tốt nhất đối với các đoạn DNA có kích thước lớn hơn 2 kb thì điện áp được sử dụng phải nhỏ hơn 5 V/cm (giá trị cm được tính theo khoảng cách giữa hai điện cực chứ không phải là chiều dài của gel). DNA dịch chuyển từ cực âm đến cực dương. Quan sát sự dịch chuyển bằng màu bromophenol để biết lúc nào cần ngừng điện di (Hình 2.5). 3.3. Nhuộm DNA bằng EtBr Sau khi chạy điện di xong lấy nhẹ bản gel ra khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch EtBr nồng độ 0,5 mg/mL, trong thời gian 30-45 phút, tốt nhất trên một máy lắc nhẹ (độ 10 vòng/phút ). Đổ dịch nhuộm EtBr vào một bình riêng để xử lý và rửa bản gel bằng cách ngâm trong nước cất hai lần, mỗi lần 15-20 phút. EtBr thường pha sẵn ở dạng đậm đặc 5 mg/mL và giữ ở 4oC trong tối. Hình 2.5. Sơ đồ minh họa các bước trong quá trình điện di agarose gel
  8. 3.4. Quan sát và chụp ảnh Bản gel sau khi nhuộm EtBr được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại (l = 302 nm) (Hình 2.6). Dùng thiết bị chuyên dụng để phân tích và lưu trữ hình ảnh DNA (Gel Documentation System). Chú ý Không nhìn vào ánh sáng tử ngoại nếu không có kính lọc thích hợp. Hình 2.6. Hình ảnh điện di DNA chạy trên agarose gel 1%, 3 Volts/cm và nhuộm bằng EtBr. Các băng DNA có màu sáng. SM: Chuẩn kích thước của DNA (1 kb ladder). Các đường 1, 2 và 3: mẫu plasmid DNA được cắt bằng 3 enzyme hạn chế khác nhau. III. Điện di polyacrylamide gel Acrylamide là một monomer có cấu trúc như sau: Khi có mặt các gốc tự do, được cung cấp bởi ammonium persulphate và ổn định bởi TEMED (N,N,N’,N’-tetramethylethylene-diamine), phản ứng chuỗi được bắt đầu trong đó các acrylamide monomer được polymer hóa (trùng hợp) thành một chuỗi dài. Khi bisacrylamide (N,N’- methylenebisacrylamide) được bổ sung trong phản ứng polymer hóa, các chuỗi sẽ liên kết chéo (cross-linking) để tạo thành dạng gel. Độ xốp của gel được xác định bởi chiều dài của chuỗi và mức độ liên kết chéo. Chiều dài của chuỗi polyacrylamide được xác định bằng nồng độ acrylamide trong phản ứng polymer hóa (giữa 3,5% và 20%). Ngoài protein, polyacrylamide gel cũng được dùng để điện di DNA (kể cả RNA và DNA/RNA). Gel phải được rót vào giữa hai tấm kính (gel plates) được ngăn cách bởi các miếng đệm (gel spacers) (Hình 2.7). Hầu hết các dung dịch acrylamide được ngăn không tiếp xúc với không khí để hạn chế sự ức chế trùng hợp gây ra bởi oxygen. Gel có thể dài từ 10-100 cm tùy thuộc vào yêu cầu phân tích và chúng thường được chạy trong phương thẳng đứng.
  9. Hình 2.7. Sơ đồ và hình ảnh của buồng điện di polyacrylamide gel Phạm vi kích thước phân tử và độ phân giải của quá trình phân tách tùy thuộc vào nồng độ của acrylamide và bis-acrylamide (và tỷ lệ của chúng) do chúng tạo ra khuôn gel với các phần trăm khác nhau của acrylamide và bậc của liên kết chéo. Nồng độ thấp tạo ra các lỗ có kích thước lớn hơn và vì thế có thể phân tách các phân tử lớn hơn. Liên kết chéo của các monomer và các tác nhân liên kết có thể được điều chỉnh để kiểm soát mức độ xốp của khuôn gel. Điều này cho phép tối ưu hóa một khuôn gel để phân tách một phạm vi kích thước đặc biệt của các phân tử protein. 1. Điện di nucleic acid Điện di polyacrylamide gel được dùng để phân tách và thu hồi các đoạn DNA có chiều dài từ 5-2.000 bp. Nồng độ polyacrylamide gel được sử dụng trong khoảng từ 3,5-20% tùy thuộc vào kích thước của đoạn DNA quan tâm. Hai loại polyacrylamide gel thường được sử dụng là: - Polyacrylamide gel không biến tính dùng để phân tách và tinh sạch các đoạn DNA sợi đôi. - Polyacrylamide gel biến tính bằng urea và formamide (sequencing gel) dùng để phân tách và tinh sạch các đoạn DNA sợi đơn. Phần này chỉ giới thiệu polyacrylamide gel không biến tính là loại gel hay được sử dụng nhất. Hiệu quả của sự phân tách DNA trong loại gel này phụ thuộc vào nồng độ của acrylamide (Bảng 2.3), kích thước và điện tích của DNA. Bảng 2.3. Hiệu quả của sự phân tách DNA trong polyacrylamide gel không biến tính
  10. 1.1. Chuẩn bị polyacrylamide gel không biến tính Kích thước phổ biến của tấm kính đổ gel thường là 20 cm´40 cm. Miếng đệm dày khoảng 0,5 mm-2,0 mm. Các gel dày hơn thường nóng lên trong quá trình điện di nên sẽ làm nhòe các băng DNA, vì thế người ta thường sử dụng các gel mỏng. Tuy nhiên, khi khi chạy một lượng lớn DNA (>1 mg/băng) thì cần chuẩn bị gel dày. Dưới đây mô tả các bước chuẩn bị và sử dụng polyacrylamide gel không biến tính: 1.1.1. Chuẩn bị các dung dịch sau: - 30% acrylamide (bao gồm bis-acrylamide) - 1× TBE - 10% ammonium persulphate 1.1.2. Lau sạch hai tấm kính dùng làm khuôn gel và miếng đệm bằng KOH/methanol hoặc ethanol. Xử lý bề mặt của hai tấm kính bằng dung dịch silicon để ngăn gel dính chặt vào hai tấm kính gây rách gel lúc lấy nó ra khỏi khuôn sau khi điện di xong. 1.1.3. Tính toán thể tích của các dung dịch dùng để tạo polyacrylamide gel trên cơ sở kích thước tấm kính, độ dày của miếng đệm (xem bảng 2.4). 1.1.4. Bổ sung 35 mL TEMED vào mỗi 100 mL dung dịch tạo polyacrylamide gel, trộn hỗn hợp bằng cách vortex. Rót dung dịch tạo gel vào giữa hai tấm kính. Gắn nhanh lược vào, tránh bọt khí ở răng lược (giếng). Đỉnh của răng lược phải hơi cao hơn mép gel. Nếu cần, bổ sung thêm một ít dung dịch tạo gel để làm đầy mép gel. Bảng 2.4. Dung tích của các chất dùng cho polyacrylamide gel 1.1.5. Cho phép acrylamide polymer hóa trong khoảng 60 phút ở nhiệt độ phòng, bổ sung thêm dung dịch tạo gel nếu thấy gel co vào nhiều. 1.1.6. Sau khi polymer hóa hoàn toàn, rút lược cẩn thận, tháo băng dính ra khỏi đáy khuôn gel. Gắn khuôn gel vào buồng điện di và làm đầy buồng điện di bằng đệm 1× TBE, dùng Pasteur pipette để phá các bọt khí ra khỏi đáy gel và các giếng bằng đệm 1× TBE.
  11. 1.1.7. Trộn các mẫu DNA với một lượng thích hợp của đệm 6× gel-loading dye. Đặt mẫu vào trong giếng bằng micropipette hoặc Hamilton syringe. 1.8. Nối buồng điện di với bộ nguồn. Polyacrylamide gel không biến tính thường chạy điện di trong khoảng 1 V/cm đến 8 V/cm. Chạy gel cho đến khi thuốc nhuộm chỉ thị dịch chuyển đến vị trí mong muốn. Tắt nguồn, lấy khuôn gel ra và đặt lên bàn. Tháo tấm kính nhỏ ở mặt trước ra, tấm kính lớn ở phía sau được dùng làm giá đỡ, và chuẩn bị nhuộm gel. 1.2. Phát hiện DNA trong polyacrylamide gel 1.2.1. Nhuộm bằng ethidium bromide Polyacrylamide có thể làm mất huỳnh quang của EtBr, do đó không thể phát hiện các băng DNA bằng phương pháp này nếu hàm lượng của nó thấp hơn 10 ng. Ngâm nhẹ gel cùng với tấm kính đỡ vào trong dung dịch nhuộm (0,5 mg/mL EtBr trong 1× TBE). Cho vừa đủ dung dịch nhuộm phủ hoàn toàn lên bề mặt gel. Sau khi nhuộm 30-45 phút ở nhiệt độ phòng, lấy gel và tấm kính đỡ ra, cẩn thận thấm khô bề mặt gel bằng giấy thấm Kimwipe. Phủ lên bề mặt gel bằng giấy nylon (Saran wrap), tránh tạo ra bọt khí hoặc nếp gấp của Saran wrap. Sau đó lật ngược gel và đặt nó trên máy soi tử ngoại ultraviolet transilluminator (Gel Documentation System), lấy tấm kính đỡ ra để tiến hành chụp ảnh. 1.2.2. Nhuộm bằng thuốc nhuộm bạc Thuốc nhuộm bạc được sử dụng từ những năm 1980, cho phép phát hiện một lượng protein rất nhỏ ở dạng vết trong polyacrylamide gel. Sau đó, loại thuốc nhuộm này được hoàn thiện và mở rộng phạm vi ứng dụng cho các phân tử nucleic acid. Hai phương pháp nhuộm bạc thường được sử dụng là: 1) Dùng các dung dịch diamine silver hoặc ammonical silver cho thấm vào gel và pha loãng các dung dịch acid của formaldehyde để phát triển hình ảnh. 2) Thấm dung dịch silver nitrate vào gel trong môi trường acid yếu và dùng formaldehyde khử có chọn lọc các ion bạc thành bạc kim loại dưới điều kiện kiềm. Nhìn chung, phương pháp diamine kiềm kém nhạy hơn nhưng thích hợp đối với các gel dày, trong khi phương pháp acid nhanh và bắt màu tốt hơn đối với các gel mỏng. Thuốc nhuộm bạc được sử dụng hiệu quả để phát hiện một lượng nhỏ (picogram, pg) nucleic acid. Giới hạn phát hiện DNA sợi đôi khi quan sát bằng mắt thường là vào khoảng 1 pg/mm2 mặt cắt ngang của băng DNA, nhạy gấp 1.000-10.000 lần phương pháp nhuộm bằng EtBr. Mức độ phát hiện này có thể so sánh với phương pháp đánh dấu đồng vị phóng xạ hoặc huỳnh quang. Quá trình nhuộm bao gồm các bước sau: - Cố định nucleic acid trong acetic acid 7,5% tối thiểu 5 phút để ngăn cản sự khuếch tán của các phân tử nucleic acid đã được phân tách trong gel, loại bỏ và trung hòa các hóa chất không mong muốn (urea và đệm). - Rửa gel trong nước khử ion tối thiểu 2 phút để loại bỏ acetic acid, các chất bẩn dạng vết và phần thừa của các thành phần gel hòa tan sau khi cố định. - Nhuộm gel trong dung dịch bạc với sự có mặt của formaldehyde để cải thiện độ nhạy và độ tương phản. Thời gian nhuộm tối ưu khoảng 20 phút. Tuy nhiên, đối với loại gel có tấm đỡ polyester (8×10 cm) thì chỉ cần 10 phút là đủ để có chất lượng hình ảnh cao mà không làm giảm độ nhạy. - Rửa gel sau khi nhuộm bạc để loại bỏ thuốc nhuộm thừa có thể gây ra kết tủa màu nâu trong quá trình phát triển màu. Thông thường, có thể dùng dung dịch phát triển màu để rửa gel. - Phát triển màu của gel bằng hỗn hợp dung dịch sodium carbonate (4 g/L), sodium thiosulfate (4 mM) và formaldehyde (khoảng 0,028-0,111%) để giảm các background không đặc hiệu một cách hiệu
  12. quả. Nhiệt độ rửa thích hợp từ 8-10oC, thời gian rửa thay đổi tùy thuộc vào thành phần của dung dịch phát triển màu trong khoảng từ vài giây đến vài phút. - Dừng phản ứng phát triển màu khi thu được hình ảnh tối ưu càng nhanh càng tốt bằng cách dùng acetic acid lạnh (4oC) 7,5%. 1.2.3. Phóng xạ tự ghi + Không cố định, làm ẩm gel Nếu muốn thu hồi băng DNA có hoạt tính phóng xạ từ gel thì gel phải được cố định hoặc làm khô. Nếu chỉ muốn quan sát kết quả điện di thì có thể tiến hành nhanh như sau: - Gói bản gel cùng với tấm kính đỡ trong giấy nylon Saran wrap. Tránh tạo bọt khí hoặc nếp gấp của Saran wrap. Đánh dấu bằng mực phóng xạ lên bề mặt Saran wrap. - Lật ngược gel và ủ với phim X-quang (tiến hành trong phòng tối) ở -70oC trong khoảng thời gian thích hợp. + Cố định, làm khô gel Các polyacrylamide gel chứa DNA có hoạt tính phóng xạ có thể được cố định và làm khô trước khi phóng xạ tự ghi. - Ngâm gel cùng với tấm kính đỡ trong acetic acid 7% trong 5 phút. Lấy gel khỏi thuốc hãm màu một cách cẩn thận bằng cách cầm nhẹ tấm kính ra khỏi chất lỏng. - Rửa nhanh gel trong nước khử ion. Dùng giấy thấm Kimwipe để thấm khô bề mặt gel (không dùng giấy thấm thường). Bọc gel và tấm kính đỡ trong Saran wrap, thiết kế phóng xạ tự ghi như trên. Một cách khác là làm khô gel trên giấy Whatman 3MM bằng cách dùng máy làm khô gel (sấy ở 80oC trong điều kiện chân không từ 1-2 giờ). Làm khô gel cần thiết chỉ khi gel chứa DNA được đánh dấu đồng vị phát xạ b yếu như 35S hoặc một lượng nhỏ 32P (cần phải ủ phim 24 giờ hoặc lâu hơn) (Hình 2.8). 1.3. Phân lập các đoạn DNA từ polyacrylamide gel Phương pháp tốt nhất để phân lập DNA từ polyacrylamide gel là kỹ thuật “ép và ngâm” (crush and soak) của Maxam và Gilbert (1977). DNA thu được có độ tinh sạch cao và không chứa các chất nhiễm bẩn ức chế enzyme. Mặc dù phương pháp này phải tiến hành qua nhiều bước và không hiệu quả (ít hơn 30% sản lượng các đoạn DNA >3 kb), nhưng nó có thể được dùng để phân lập cả hai loại DNA sợi đôi và sợi đơn từ các polyacrylamide gel không biến tính và biến tính, tương ứng. Phương thức sau đây được cải tiến từ kỹ thuật của Maxam và Gilbert (1977): - Chạy điện di polyacrylamide gel. Xác định vị trí của DNA quan tâm bằng phóng xạ tự ghi hoặc bằng EtBr quan sát dưới ánh sáng UV. - Dùng dao cắt mảnh gel chứa băng DNA quan tâm. Không loại bỏ Saran wrap khỏi gel trước khi cắt, cắt cả gel lẫn Saran wrap, sau đó bóc mảnh gel nhỏ có chứa DNA quan tâm ra khỏi Saran wrap. - Chuyển mảnh gel vào trong E-tube (eppendorf tube), dùng tip của micropipette để ép mảnh gel theo thành của tube. - Tính toán thể tích thích hợp của mảnh gel và bổ sung 1-2 thể tích của đệm chiết (0,5 M ammonium acetate, 10 mM magnesium acetate, 1 mM EDTA pH 8 và 0,1% SDS) vào E-tube. - Đóng tube và ủ ở 37oC kèm theo lắc vòng nhẹ. Đoạn DNA nhỏ (
  13. - Ly tâm 12.000 g trong 1 phút ở 4oC. Chuyển thể nổi vào E-tube sạch. - Bổ sung thêm 0,5 thể tích đệm chiết vào E-tube cũ có mảnh polyacrylamide gel, vortex nhanh và ly tâm. Trộn hai thể nổi lại với nhau. - Bổ sung hai thể tích ethanol ở 4oC, bảo quản dung dịch trên đá tuyết 30 phút. Thu hồi DNA bằng cách ly tâm 12.000 g trong 10 phút ở 4oC. - Hòa tan trở lại DNA trong 200 mL đệm TE (pH 7,6) và bổ sung 25 mL của 3 M sodium acetate (pH 5,2) và kết tủa DNA với hai thể tích ethanol như bước trên. - Rửa cẩn thận tiểu thể với ethanol 70% và hòa tan trở lại DNA trong đệm TE (pH 7,6) tới thể tích cuối cùng là 10 mL. - Kiểm tra số lượng và chất lượng của đoạn DNA bằng điện di polyacrylamide gel. Lấy một thể tích nhỏ tối thiểu (được ước lượng khoảng 50 ng DNA) trộn với 10 mL TE (pH 7,6), bổ sung thêm 2 mL gel-loading dye. Nạp mẫu và chạy điện di polyacrylamide gel ở nồng độ thích hợp bằng cách dùng các DNA marker chuẩn đã biết số lượng. Các đoạn DNA phân lập sẽ cùng dịch chuyển với DNA marker trong quá trình điện di. 2. Điện di protein 2.1. Điện di SDS-PAGE 2.1.1. Phương thức Điện di trên polyacrylamide gel với sự có mặt của SDS (sodium dodecyl sulfate) là kỹ thuật dùng trong hóa sinh, di truyền và sinh học phân tử để phân tách các protein theo tính linh động điện di của chúng (phụ thuộc vào chiều dài của chuỗi polypeptide hoặc khối lượng phân tử, cấu hình (xoắn) của protein, các biến đổi hậu dịch mã và các nhân tố khác). Điện SDS cho phép phân ly các phân tử protein có khối lượng khác nhau. SDS có điện tích âm rất lớn và có khả năng liên kết với mạch peptide để biến tính các cấu trúc bậc hai và bậc ba (không liên kết bằng cầu disulfide) của protein bằng cách bọc xung quanh khung polypeptide. Như vậy, số lượng SDS tương tác với protein tỷ lệ với khối lượng/kích thước phân tử protein và điện tích của SDS bám vào có thể làm bất cứ phân tử protein nào cũng chuyển động trong điện trường từ cực âm (-) sang cực dương (+). Do
  14. đó, bằng phương pháp điện di, có thể phân tách riêng biệt các phân tử protein có khối lượng phân tử khác nhau. Không có SDS, các protein khác nhau có khối lượng phân tử tương tự sẽ dịch chuyển khác nhau do sự khác nhau về cuộn xoắn, bởi vì những khác nhau trong các kiểu cuộn xoắn sẽ làm cho một vài phân tử protein thích hợp tốt hơn với khuôn gel so với những phân tử protein khác. Bổ sung SDS giúp giải quyết vấn đề này, vì nó làm cho các phân tử protein trở thành mạch thẳng sao cho chúng có thể phân tách hoàn toàn theo khối lượng phân tử (cấu trúc sơ cấp, hoặc số lượng (và kích thước) của các amino acid). SDS liên kết với protein theo tỷ lệ khoảng 1,4 g SDS trên 1,0 g protein (mặc dù tỷ lệ liên kết có thể thay đổi từ 1,1-2,2 g/SDS/g protein) tạo ra một tỷ lệ khối lượng/điện tích thống nhất cho mọi phân tử protein để sự dịch chuyển qua gel chỉ liên quan đến kích thước của protein. Một loại thuốc nhuộm vết có thể được bổ sung vào dung dịch protein cho phép theo dõi tiến độ của dịch chuyển protein qua gel trong suốt quá trình điện di. Hình 2.9. Điện di protein bằng kỹ thuật SDS-PAGE và nhuộm bằng Coomassie blue. WM: Chuẩn khối lượng phân tử của protein. Các đường 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 và 8: Mẫu protein. 2.1.2. Khử SDS-PAGE Bên cạnh việc bổ sung SDS, protein có thể được đun nóng nhanh gần đến sôi với sự có mặt của một tác nhân khử, ví dụ như dithiothreitol (DTT) hoặc 2-mercaptoethanol (BME), để biến tính thêm protein bằng cách khử các liên kết disulfide, vì thế khắc phục được một vài dạng cuộn xoắn bậc ba của protein, và bẻ gãy cấu trúc bậc bốn của protein (các tiểu đơn vị oligomer). Phương thức này được xem như là khử SDS-PAGE, và được sử dụng phổ biến nhất. Trường hợp không khử SDS-PAGE (không đun sôi và không có tác nhân khử) có thể được dùng khi cấu trúc nguyên thể là quan trọng trong phân tích về sau (chẳng hạn như hoạt tính enzyme, được trình bày bằng việc sử dụng zymogram). Điện di polyacrylamide gel liên tục nguyên thể pha chế định lượng (quantitative preparative native continuous polyacrylamide gel electrophoresis, QPNC-PAGE) là một phương pháp mới để phân tách các metalloprotein nguyên thể trong các khuôn sinh học phức tạp. 2.1.3. Điện di và nhuộm Các protein biến tính sau đó được nạp vào một đầu của khuôn polyacrylamide gel đặt trong đệm thích hợp. Dòng điện được sử dụng từ đầu này đến đầu kia của gel, sẽ làm cho các protein tích điện âm dịch chuyển qua gel. Tùy thuộc vào kích thước của chúng, mỗi protein sẽ dịch chuyển với các tốc độ khác nhau qua khuôn gel: protein ngắn dễ dàng đi qua các lỗ của gel, trong khi protein lớn hơn sẽ gặp khó khăn hơn. Sau một vài giờ (tùy thuộc điện áp sử dụng trên gel, nếu điện áp cao protein chạy nhanh hơn nhưng sẽ cho độ phân giải kém hơn), các protein sẽ có sự dịch chuyển khác nhau dựa trên kích thước của chúng, các protein nhỏ hơn sẽ đi nhanh hơn xuống phía dưới của gel, trong khi các phân tử lớn vẫn còn ở vị trí
  15. gần với điểm xuất phát. Vì thế, protein có thể được phân tách theo kích thước (và vì thế, theo khối lượng phân tử). Sau điện di, gel được nhuộm (phổ biến nhất là Coomassie Brilliant Blue hoặc thuốc nhuộm bạc), cho phép quan sát các protein được phân tách, hoặc những tiến trình xa hơn (ví dụ: Western blot, xem chương 7). Sau khi nhuộm, các protein khác nhau sẽ xuất hiện ở các băng phân biệt trong gel. Quá trình điện di thường được chạy kèm với protein marker của các khối lượng phân tử đã biết ở một đường riêng biệt trong gel, để canh chỉnh gel và xác định khối lượng của protein chưa biết bằng cách so sánh với khoảng cách dịch chuyển liên quan với marker. Điện di polyacrylamide gel thường là chọn lựa đầu tiên khi thử nghiệm sự tinh sạch protein do tính đáng tin cậy và dễ dàng của nó. Sự có mặt của SDS và bước gây biến tính làm cho các protein được phân tách đơn độc dựa trên kích thước. Các tác nhân bẩn cũng có thể cùng dịch chuyển và xuất hiện một băng không mong muốn tương tự protein. Sự đồng dịch chuyển này cũng có thể làm cho một protein sẽ chạy ở một vị trí khác hoặc không thể xâm nhập vào gel. Đây là điều quan trọng để nhuộm gel hoàn toàn bao gồm phần stacking. Coomassie blue có ái lực liên kết yếu với glycoprotein và các protein dạng sợi, đã làm cản trở chất lượng điện di. 2.1.4. Hệ thống đệm Hầu hết điện di phân tách protein được thực hiện với một hệ thống đệm không liên tục tăng cường một cách ý nghĩa hình dạng của băng trong gel. Trong suốt quá trình điện di ở hệ thống gel không liên tục, một gradient ion được tạo thành trong giai đoạn sớm của điện di làm cho tất cả protein tập trung trong một băng dạng đơn. Nhiều người sử dụng liên tục đệm Tris-glycine hoặc Laemmli tập trung và phân giải ở pH 8,3-9,0. Các pH này khởi động sự tạo thành cầu nối disulfide giữa các gốc cysteine trong protein, đặc biệt khi chúng hiện diện ở nồng độ cao do pKa của cysteine nằm trong phạm vi từ 8-9 và bởi vì tác nhân khử hiện diện trong đệm nạp (loading buffer) không đồng dịch chuyển với các protein. Những tiến bộ gần đây trong công nghệ đệm đã làm nhẹ bớt vấn đề này bằng cách hòa tan protein ở pH tốt dưới pKa của cysteine (ví dụ: bis-Tris, pH 6,5) và bao gồm các tác nhân khử (ví dụ: sodium bisulfite) là yếu tố di chuyển vào gel phía trước các protein để duy trì một môi trường khử. Một lợi ích nữa của đệm được sử dụng với các pH thấp là acrylamide gel ổn định hơn vì thế gel có thể được bảo quản trong một thời gian dài trước khi sử dụng. 2.2. Điện di 2D-PAGE Ngoài điện di SDS, có thể điện di các protein tùy theo điểm đẳng điện (isoelectric point, IEP) của chúng. Phương pháp này được gọi là điện di tập trung đẳng điện (isoelectric focusing, IEF). Trong dung dịch đệm có pH biến thiên liên tục (gradient pH), các protein sẽ phân ly đến vị trí tương thích với điểm đẳng điện của mình. Một hỗn hợp protein phức tạp được nạp vào ở giữa của mặt trái, ở đó pH là trung tính và một điện áp được sử dụng trên khuôn gel. Các protein sau đó dịch chuyển thông qua gel cho đến khi chúng hướng tới điểm đẳng điện của mình, là điểm mà ở đó điện tích của chúng tương tự như pH ở vùng chung quanh. Gel sau đó được ngâm trong dung dịch biến tính (để làm cho các protein không cuộn xoắn) chứa chất tẩy là SDS. Phân tử này tích điện âm rất mạnh và liên kết với tất cả protein, làm cho tất cả chúng đều mang điện âm. Một điện áp sau đó được sử dụng trên khuôn gel từ đầu này đến đầu kia để tất cả protein sẽ chuyển động hướng tới anode, nhưng những protein nhỏ hơn sẽ chuyển động qua gel nhanh hơn, vì thế các protein được phân tách theo kích thước của chúng. Kỹ thuật điện di 2 chiều (2D-PAGE, 2 dimension polyacryamide gel electrophoesis) được dùng để phân tách hỗn hợp protein, và đặc biệt hữu ích cho việc so sánh các mẫu liên quan như mẫu mô bình thường và mẫu mô đột biến. Comparative 2D-PAGE cũng có thể được dùng để tìm kiếm các protein mà sự biểu hiện của chúng rất tương đồng dưới cùng một tập hợp các điều kiện (những yếu tố này có các
  16. chức năng liên quan) và nhận dạng các protein được sản xuất trong phản ứng với liệu pháp thuốc. Hình 2.10. Điện di protein hai chiều Có khoảng 10.000 protein khác nhau trong tế bào, tập trung trong hơn sáu loại quan trọng. Kỹ thuật 2D-PAGE không đủ nhạy để phát hiện các protein hiếm và nhiều protein sẽ không được phân giải. Vì thế, cần phải phân cắt mẫu trong các phần khác nhau để làm giảm sự phức tạp của hỗn hợp protein trước khi thực hiện 2D-PAGE. Hai phương pháp điện di theo khối lượng phân tử và điểm đẳng điện có thể kết hợp với nhau tạo nên kỹ thuật điện di 2 chiều. Điện di protein trên polyacrylamide gel cho phép phân đoạn, xác định khối lượng phân tử và phân lập protein. Ngoài ra, khối lượng protein còn được xác định chính xác bằng phương pháp sắc ký khối phổ. Tài liệu tham khảo/đọc thêm 1. Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA and Struhl K. 2002. Short Protocol in Molecular Biology. Vol 1 and 2. 5th ed. John Wiley & Sons, Inc. USA. 2. Maniatis T, Fritsch EF and Sambrook J. 2000. Molecular Cloning-A Laboratory Manual. Cold Spring Habor Laboratory Press, USA. 3. Rapley R and Walker JM. 1998. Molecular Biomethods Handbook. Humana Press Inc. New Jersey, USA. 4. Rickwood D and Hames BD. 1984. Gel Electrophoresis of Nucleic Acids. IRL Press Ltd. Oxford, UK. 5. Surzycki S. 2000. Basic Techniques in Molecular Biology. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, Germany. 6. Westermeier R. 2005. Electrophoresis in Practice. 4th ed. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KgaA. Weinheim, Germany. 1 Agar: một galactan phức hợp tách chiết từ một số loài tảo đỏ như Gelidium và Gracilaria spp., được sử dụng rộng rãi ở dạng gel làm giá thể rắn hoặc bán rắn cho môi trường nuôi cấy vi sinh vật và thực vật.

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

Đồng bộ tài khoản