Chương 4: Các thử nghiệm sinh hóa

Chia sẻ: ngovanquang12c3

Phân lập khuẩn lạc thuần khiết là cần thiết cho định danh VSV. Việc định danh dựa chủ yếu vào đặc điểm kiểu hình đặc biệt là các phản ứng sinh hóa. Có 3 cách sử dụng các thử nghiệm sinh hóa để định danh VSV: Cách truyền thống, Sử dụng các bộ KIT.

Bạn đang xem 20 trang mẫu tài liệu này, vui lòng download file gốc để xem toàn bộ.

Nội dung Text: Chương 4: Các thử nghiệm sinh hóa

Các thử nghiệm sinh 
Chương 4

hóa
GV: Nguyễn Văn Hạnh
Phân lập khuẩn lạc thuần 
khiết là cần thiết cho định 
danh VSV
Việc định danh dựa chủ yếu 
vào đặc điểm kiểu hình đặc 
biệt là các phản ứng sinh 
hóa.
Có 3 cách sử dụng các thử 
nghiệm sinh hóa để định danh 
VSV:
◦ Cách truyền thống
◦ Sử dụng các bộ KIT
Thử nghiệm khả năng lên 
men
Mục đích: thử nghiệm khả năng sữ dụng các
nguồn CH của các VSV
Nguyên tắc: VSV sử dụng CH  tao acid 
giảm pH môi trường
Các loại carbonhydrate
◦ Monocarbonhydrate: glucose, xylose, rhamnose …
◦ Dicarbonhydrate: sucrose, lactose …
◦ Polycarbonhydrate: tinh bột, cellulose
◦ Các loại đường khử: đường mono chứa chức –CHO
◦ Các loại đường rượu: chứa chức -OH
Phenol Red Carbohydrate 
Broth Trang 
104




Hấp ở 115oC trong 15 phút
Thử nghiệm khả năng lên 
men
 Môi trường: Phenolred broth
base bổ sung 0,5-1% đường
cần thử nghiệm
 VSV sử dụng được nguồn
đường trong môi trường sẽ
làm giảm pH  thay đổi
màu chất chỉ thị phenolred
 Phản ứng (+): môi trường
chuyển vàng
 Phản ứng (-): môi trường có
màu đỏ
Thử nghiệm Citrate
Mục đích: Xác định khả năng vi sinh vật sử
dụng nguồn citrat như là nguồn cacbon duy
nhất.
Cở sở sinh hóa:

◦VSV sử dụng citrate, sinh ra CO2 làm kiềm
hóa MT
◦VSV sử dụng muối ammonium là nguồn
đạm duy nhất tạo ra NH3 làm kiềm hóa MT
Thử nghiệm Citrate
Môi trường Simmon citrate agar (tr. 105)

Ammonium dihydrogen phosphate 1.0g
Dipotassium hydrogen phosphate 1.0g
NaCl 5g
Sodium citrate 2g
MgSO4 0,2g
Bromothymol blue 0,08g
Agar 13g
Thử nghiệm Citrate
Chú ý
- Cấy lượng sinh khối vừa đủ
- Có đối chứng trắng đi kèm




Đối chứng  Pứ âm tính Pứ dương tính
Thử nghiệm Urease
Mục đích: phát hiện VSV có mang enzym
urease
Cơ sở sinh hoá:
(NH2)2CO + H2O  2 NH3 + CO2
 tăng pH môi trường  đỏ phenol (vàng –
đỏ)
Môi trường sử dụng:
◦Urea Broth (Rustigian – Stuart)
◦Christensen Urea (môi trường thạch nghiêng)
Môi trường Urea Broth
Thử nghiệm Urease


Thực hiện
◦Chuẩn bị môi trường
◦Cấy VSV vào 5ml môi
trường
◦ủ 37oC/24 giờ
◦Quan sát
Mục đích: phát hiện khả năng sinh H2S
Cơ sở sinh hóa:


Acid amin chứa S H2S
desulfohydrase



thiosulfate 
Thiosulfate reductase H2S

 H2S sinh ra được nhận biết bởi ion sắt, chì  
tạo kết tủa màu đen (FeS, PbS)
Để phân biệt các loài thuộc họ 
Enterobacteriaceae và giống Proteus
Môi trường sử dụng:

◦ KIA, TSI (thạch nghiêng)

◦ SIM, PIA (thạch sâu)

◦ BSA (thạch đĩa)
Cấy vsv lên môi trường  Ủ (37oC, 24 – 48h)
Đọc kết quả:


(+) Xuất hiện màu đen 
trong môi trường
(­)
Không xuất hiện màu 
đen trong môi trường



ĐC (+)
Pancreatic digest  20.0 
of casein  g
(casitone)
Peptic digest of  6.1 g
animal tissue 
(beef extract)
Ferrous ammonium  0.2 g
sulfate

Sodium  0.2 g
thiosulfate
(­) (+) (+)
Agar 3.5 g
Thử nghiệm khả năng sinh Indol
Mục đích
Phát hiện các VSV có khả năng sinh indol 
 các VSV có hệ emzym tryptophanase



37oC / 24h
Thuốc thử
Kovac’s


Chủng VSV MT canh trypton Pứ dương tính Pứ âm tính
Thử nghiệm khả năng sinh Indol

Là phản ứng giúp phân biệt
◦ E. coli (+) với Klebsiella (­)
◦ Proteus mirabilis (­) với Proteus khác (+)
◦ Bacillus alvei (+) với Bacillus khác (­)

Đối chứng (+) Proteus rettgeri
    (­)  Serratia marcescens
Thử nghiệm KIA/TSI
 KIA: Kligler iron agar (trang 99)

Pepton  20g
Lactose 20g
Glucose  1g
NaCl 5g
Feric ammonium citrate 0,5g
Sodium thiosulphate 0,5g
Agar 15g
Phenol red  0,025g
Nước cất 1 lít
pH 7,4±0,2
Thử nghiệm KIA/TSI
 TSI: Triple sugar iron agar (trang 106)

Pepton  20g
Lactose 10g
Sucrose 10g
Glucose  1g
NaCl 5g
Feric ammonium sulphate o,2g
Sodium thiosulphate 0,2g
Agar 13g
Phenol red  0,025g
Nước cất 1 lít
pH 7,4±0,2
Thử nghiệm KIA/TSI
Mục đích: phát hiện khả năng
◦ sử dụng các nguồn cacbonhydrate
◦ sinh H2S
◦ tạo hơi (gas)




Ủ 37oC/24 giờ
Quan sát:
Phần nghiêng / phần sâu / hơi /
H2 S
Thử nghiệm KIA/TSI




ĐC
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 11
Thử nghiệm MR (Methyl 
red)
Mục đích: xác định vi sinh vật sản 
xuất và duy trì các acid bền trong 
quá trình lên men glucose.
Cơ sở sinh hóa:
◦ Chất chỉ thị pH: methyl red
dưới 4,4 5,0 – 5,8 trên 6,0

◦ MR (+) – càng kéo dài thời gian nuôi cấy 
– môi trường càng acid
◦ MR (­) – càng kéo dài thời gian nuôi cấy 
– các chất có tính acid bị chuyển hóa – 
môi trường dần trung tính
 Thời gian ủ 2 – 5 ngày ở 37oC
Thử nghiệm MR (Methyl 
red)
Môi trường: Glucose Phosphate (MR­VP 
broth)



ủ 2 – 5 
ngày
37oC




Chủng VSV
MR­VP broth Pứ âm tính Pứ dương tính ĐC
Thử nghiệm VP (Voges – 
Proskauer)
Mục đích: Phát hiện vsv tạo 
sản phẩm trung tính (acetoin) 
trong quá trình lên men glucose
Cở sở sinh hóa: Acetoin được 
tạo ra trong điều kiện yếm khí 
hoàn toàn.
2 pyruvate acetoin + 2 CO2
Thử nghiệm VP (Voges – 
Proskauer)
Môi trường sử dụng: MR­VP
Phương pháp tiến hành:
◦ Cấy vi sinh vật trong môi trường MR­
VP
◦ Ủ 24 – 48 giờ, nhiệt độ 37oC
◦ Bổ sung thuốc thử vào môi trường, 
lắc nhẹ
◦ Đọc kết quả sau 20 phút và chậm 
nhất là 4 giờ.
Thử nghiệm VP (Voges – 
Proskauer)
Kiểm tra thuốc thử 
bằng đối chứng
(+) : Enterobacter 
cloacea
(­)  : E. coli
Đọc kết quả:
(+): màu đỏ trên 
môi trường (­) (+)

(­): mặt môi trường 
Thử nghiệm Bile 
Esculin
Mục đích: xác định khả năng thủy giải
glucoside esculin thành esculetin và
glucose khi có sự hiện diện của muối
mật.
Cơ sở sinh hoá:
◦Esculin là hợp chất nhân tạo
◦Esculetine được phóng thích phản ứng
với Fe tạo thành phức hợp màu đen
Môi trường Bile 
Esculine Agar
Beef extract 3g
Pepton 5g
Esculin 1g
Mật bò (Oxgall) 40g
Ferric citrate 0,5g
Agar 15g
Nước cất 1 lít
Esculet
ine

Phân tử 
Esculine

Glucos
e
Sự phân giải Esculine thành Glucose và 
Esculetine




Thử nghiệm Bile Esculin
Khuẩn lạc Enterococcus faecalis cho kết quả 
BEA (+)
Thử nghiệm Malonate
Mục đích
Phát hiện các VSV có khả năng sử dụng
malonate như nguồn carbon duy nhất
Cơ sở sinh hoá
Malonate là chất cạnh tranh với succinate
Khi VSV phân hủy được malonate thì cũng
phân huỷ được các nguồn đạm vô cơ khác
 tạo thành sp kiềm  làm tăng pH môi
trường
Thử nghiệm Malonate
Môi trường sử dụng:
Malonate broth
(bromothymol blue)
pH 7,6

Dương tính: MT
chuyển màu xanh da
trời
Âm tính: MT không
ĐC (+ (­
đổi màu và không sinh ) )
khối
Thử nghiệm catalase
Mục đích: phát hiện các vi sinh vật có hệ
enzym catalase.
Cơ sở sinh hoá:
◦ Catalase hiện diện ở các VSV hiếu khí và kỵ khí
tùy ý

catalase
◦ H2O2 H2O + O2 (bọt khí)
(hydrogen peroxide)
Thử nghiệm catalase
Thực hiện
◦ VSV lấy từ môi trường nuôi cấy (lỏng, rắn)
◦ Đặt VSV lên lam kính sạch
◦ Nhỏ H2O2 30%
◦ Quan sát sau 1-2 giây
Phản ứng (+): có bọt khí xuất hiện
Phản ứng (-): không có bọt khí xuất hiện
Thử nghiệm catalase
Thử nghiệm catalase




Thử nghiệm catalase trên đĩa petri: sử 
dụng H2O2 30%
Thử nghiệm 
decarboxylase
Mục đích: xác định khả năng tạo enzyme
decarboxylase xúc tác phân cắt nhóm
carboxyl ở một số acid amin



Cấu trúc của phân tử 
Amino acid
3thử nghiệm quan trọng
◦Lysine decarboxylase (LDC)
◦Ornithine decarboxylase (ODC)
◦Arginine decarboxylase (ADC) /
Arginine dehydrolase (ADH)

Các enzyme trên là các enzyme cảm ứng,
chỉ được tạo ra khi trong môi trường
nuôi cấy có cơ chất tương ứng
Thử nghiệm 
decarboxylase
Cơ sở sinh hoá
◦ Các sp tạo ra làm tăng pH môi trường 
đổi màu chất chỉ thị
Môi trường sử dụng:
Decacboxylase Basal Medium
chỉ thị bromocresol purple (5,2 – 6,8)
pH 6,8
6,8
Thử nghiệm 
decarboxylase
Biểuhiện sinh hoá
Dương tính: pH môi trường tăng
Âm tính: pH giảm




MT trước khi  Pứ dương tính Pứ âm tính
THỬ NGHIỆM COAGULASE
Mục đích: Thử nghiệm khả năng làm đông
tụ huyết tương bởi enzyme coagulase
Là bước cuối trong định danh các giống
Staphylococcus
Chủng đối chứng (+): S. aureus

(-): S. epidermidis
Thử nghiệm tiến hành với huyết tương và
fibrinogen.
THỬ NGHIỆM COAGULASE
Thử nghiệm bằng 2 cách
Thử trên phiến kính
Đọc 
kết 
quả
Giọt nước + Sinh khối  + Huyết tương 
vsv người
Thử nghiệm trong ống
nghiệm:
0,5ml huyết tương
Ủ và đọc kết quả mỗi
0,5ml huyết dịch  30 phút
sinh khối
THỬ NGHIỆM COAGULASE




Kết quả thử nghiệm Coagulase
(+) khi xuất hiện khối đông tụ huyết 
tương
(­)  không xuất hiện khối đông tụ, dung 
Thử nghiệm gelatinase
Mục đích: thử nghiệm khả năng phân giải
gelatine bởi gelatinase.
Cơ sở sinh hóa:

gelatinase
Gelatine polypeptide + acid amin

Gelatine trong môi trường dinh dưỡng môi
trường đông đặc
VSV phân hủy gelatine môi trường lỏng
Thử nghiệm gelatinase
Đối chứng dương: Aeromonas
hydrophila
âm: E. coli
Môi trường sử dụng Nutrient Gelatine
Dạng ống nghiệm thạch sâu
Cấy vi sinh vật và ủ ở nhiệt độ phòng.
Thử nghiệm gelatinase
Đọc kết quả
(+) môi trường tan chảy
(-) môi trường không tan
chảy
TN KHẢ NĂNG LÊN MEN – ÔXI HÓA

Mục đích: thử nghiệm khả năng chuyển
hoá glucose theo các con đường khác
nhau
Cơ sở sinh hóa:
◦Lên men: là quá trình kỵ khí, tạo môi
trường acid cao
◦Ôxi hóa: là quá trình hiếu khí
TN KHẢ NĂNG LÊN MEN – ÔXI HÓA
Môi trường sử dụng:
Oxidation/Fermentation media (Hugh &
Leifson media)
Chỉ thị pH: bromocresol purple
pH 6,8
6,8
TN KHẢ NĂNG LÊN MEN – ÔXI 
HÓA
Trực khuẩn gram âm
O (oxidation) Pseudomonas aeruginosa
F (fermentation) Serratia marcescens


Cầu khuẩn gram dương
O (oxidation) Micrococcus luteus
F (fermentation) Staphylococcus aureus
TN KHẢ NĂNG LÊN MEN – ÔXI 
HÓA

Đọc kết quả:




A: đối chứng
B: phản ứng Ôxi hóa
C: phản ứng lên men
Thử nghiệm nitratase (khử 
nitrate)

Mục đích: Thử nghiệm khả năng 
khử nitrate
Cở sở sinh hóa:
NO3− → NO2 , NH 3 , N 2 , NH 2OH , NO

nitratase −




NO2 + sulphanilamine/N­
napthylethylenediamine hydrochloride  chất 
màu hồng
NO3 + bụi kẽm  màu hồng
Thử nghiệm nitratase (khử 
nitrate)

Phương pháp tiến hành:
◦ Nuôi cấy chủng vi sinh vật trong 
môi trường chứa nitrate
◦ Bổ sung chất thử để kiểm tra sự 
hiện diện của nitrite
◦ Phản ứng định tính nitrite (­) bổ 
sung lượng kẽm nhỏ để định tính 
nitrate
Thử nghiệm nitratase (khử 
nitrate)
Thử nghiệm oxydase
Mục tiêu: phát hiện VSV có hệ enzym 
oxydase (hệ cytochrom C)
Cơ sở sinh hoá
Cytochrom C khử + H+ + O2 Cytochrom C ôxi hoá + H2O
Cytochrom C ôxi hoá + TMPD khử  TMPD ôxi hoá (màu 
xanh) 
Thử nghiệm oxydase
 Thuốc thử

◦ TMPD (0,1%): N,N,N’,N’­tetramethyl­p­
phenylenediamine
◦ Bảo quản lạnh trong tối
◦ Thời hạn bảo quản: 2 tuần
Đối chứng (+): Serratia marcescens
  (­) : Proteus rettgeri
Thử nghiệm oxydase
Thực hiện:
◦ Lấy VSV từ Nitrient Agar đặt lên 
giấy thấm
◦ Nhỏ thuốc thử TMPD
◦ Quan sát sau 30 giây
Phản ứng (+): sinh khối chuyển 
màu xanh
Phản ứng (­): sinh khối vẫn màu 
trắng
Thử nghiệm oxydase
Thử nghiệm ONPG

Mục đích: phát hiện các vi 
sinh vật có hệ enzyme ß­
galactosidase – enzyme cảm 
ứng.
Cơ sở sinh hóa: 
ONPG 
Không màu o­nitrophenol
Màu vàng
Thử nghiệm ONPG




ủ qua đêm

37oC
Lactose agar
Màu vàng


Chủng VSV 2ml ONPG broth Pứ (+) Pứ (­)
Thử nghiệm khả năng tan 
huyết
Mục tiêu: phát hiện các vi 
sinh vật có khả năng làm tan 
hồng cầu
◦ Máu sử dụng: cừu, bê non, thỏ …
Cơ sở sinh hoá: 
◦ Các heamolysine là các tác nhân 
làm tan hồng cầu động vật
◦ Vi sinh vật khác nhau  
heamolysine khác nhau  cường 
độ và biểu hiện tan hồng cầu 
khác nhau
Thử nghiệm khả năng tan 
huyết
Phân loại: 3 kiểu tan huyết
◦ Tan huyết hoàn toàn (ß): vòng 
tan huyết trong, rõ
◦ Tan huyết không hoàn toàn 
(α):xung quanhvà dưới khuẩn lạc 
chuyển đục và có màu khác
◦ Không tan huyết (ɣ): hoàn toàn 
không tan huyết
Thử nghiệm CAMP
Mục tiêu: thử nghiệm khả năng cộng 
hưởng tan huyết giữa các VSV
Cơ sở sinh hóa:

◦ S. aureus tiết β­lysin gay tan 
hồng cầu
◦ VSV tiết CAMP gây tan huyết
◦ β­lysin + CAMP  gây tan huyết 
mạnh, hoàn toàn
Ý nghĩa: dùng phân biệt 
Streptococcus nhóm B (+) với 
Streptococcus nhóm khác (­)
Staphylococcus 
aureus

Streptococcus 
agalactiae
(+)




Streptococcus pyogenes
(­)
Thử nghiệm tính di 
động
Mục đích: Xác định khả năng di 
động của vi sinh vật.
Cở sở: Vi sinh vật di động nhờ 
tiêm mao
Các tiến hành: Cấy đâm sâu vi 
sinh vật vào môi trường thạch 
mềm (0,5% agar).
◦ Vi sinh vật di động sẽ làm môi 
trường đục, phát triển lan ra khỏi 
vết cấy.
Vi sinh vật không di động sẽ phát 
Thử nghiệm tính di 
động




(­) (+) (+)
Ứng dụng thử nghiệm sinh 
hóa để định danh VSV
Mỗi loài vsv có những đặc 
tính sinh hóa khác nhau
Thực hiện kiểm tra các thử 
nghiệm sinh hóa có thể giúp 
xác định tên loài (định danh) 
vi sinh vật đó.
Bảng sinh hóa dùng định danh 
các loài vi sinh vật đường 
ruột (trang 23)
Hệ thống xác định vi sinh vật API-20E
(bioMerieux, Inc)
Đề thi vào lớp 10 môn Toán |  Đáp án đề thi tốt nghiệp |  Đề thi Đại học |  Đề thi thử đại học môn Hóa |  Mẫu đơn xin việc |  Bài tiểu luận mẫu |  Ôn thi cao học 2014 |  Nghiên cứu khoa học |  Lập kế hoạch kinh doanh |  Bảng cân đối kế toán |  Đề thi chứng chỉ Tin học |  Tư tưởng Hồ Chí Minh |  Đề thi chứng chỉ Tiếng anh
Theo dõi chúng tôi
Đồng bộ tài khoản