Đồ án: "“Ứng dụng của enzyme protease trong sản xuất bia”

Chia sẻ: juti80

Sử dụng enzyme trong sản xuất và đời sống là một vấn đề được các nhà khoa học và kỹ thuật chú ý từ lâu. Ngày nay, việc sử dụng này đã trở thành phổ biến ở nhiều nước và đã mang lại lợi ích kinh tế khá lớn. Enzyme là chất xúc tác sinh học không chỉ có ý nghĩa cho quá trình sinh trưởng, sinh sản của thực vật mà nó còn đóng vai trò rất quan trọng trong chế biến thực phẩm, trong y học, trong kỹ thuật phân tích, trong công nghệ gen và bảo vệ...

Bạn đang xem 20 trang mẫu tài liệu này, vui lòng download file gốc để xem toàn bộ.

Nội dung Text: Đồ án: "“Ứng dụng của enzyme protease trong sản xuất bia”

ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai




Đồ án: “Ứng dụng của enzyme
protease trong sản xuất bia”




MỤC LỤC
SVTH: Lưu Thị Liên Trang 1 Lớp: 08s2
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai


Mở đầu .............................................................................................. Trang 1
Chương 1: Tổng quan về enzyme protease ......................................... Trang 2
1. Tổng quan về enzyme protease ......................................... Trang 2
1.1. Giới thiệu chung ....................................................... Trang 2
1.2. Đặc điểm và tính chất của protease vi sinh vật .......... Trang 3
1.3. Cấu trúc trung tâm hoạt động của protease................. Trang 5
2. Nguồn thu nhận protease .................................................. Trang 6
3. Phương pháp thu nhận enzyme protease từ vi sinh vật ...... Trang 7
3.1. Tuyển chọn giống vi sinh vật cho enzyme protease có hoạt lực
cao................................................................................................ ...... Trang 7
3.2. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp enzyme protease
........................................................................................................... Trang 8
3 .2.1. Nguồn cacbon ...................................................... Trang 8
3 .2.2. Nguồn Nitơ ................................ .......................... Trang 8
3 .2.3. Nguồn các nguyên tố khoáng và các yếu tố kích thích sinh
trưởng.....Trang 9
3.3. Nuôi cấy thu nhận phế phẩm enzyme protease bằng phương
pháp bề mặtTrang 9
3.4. Thu nhận enzyme ....................................................... Trang 11
sạch chế phẩm enzyme
3 .4.1. Tách và làm
...................................................Trang 11
4. Quy trình thu nhận enzyme protease từ chủng nấm mốc Asp.oryzae
.............Trang 14
nhận
4 .1. Quy trình thu
...................................................................................Trang 14
4 .2. Thuyết Minh Quy Trình và đ ề xuất thiết
bị..............................................Trang 15
4.2.1. Lý do chọn chủng nấm mốc Asp.oryzae ............ ..Trang 15
4.2.2. Kỹ thuật nuôi cấy .............................................. .. Trang 15
4.2.3. Thu nhận sản phẩm ........................................... .. Trang 16
4.2.4. Đề xuất thiết bị .................................................. .. Trang 18

SVTH: Lưu Thị Liên Trang 2 Lớp: 08s2
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
cứu enzyme
5. Tình hình nghiên
protease.............................................................Trang 20
5 .1. Tình hình nghiên cứu enzyme protease trong nước
.................................Trang 20
5 .2. Vấn đề sản xuất enzyme protease trên thế giới
.........................................Trang 22
Chương 2: Đối tượng nghiên cứu và thiết bị....................................... Trang 2




LỜI MỞ ĐẦU

SVTH: Lưu Thị Liên Trang 3 Lớp: 08s2
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai


Sử dụng enzyme trong sản x uất và đời sống là một vấn đề được các nhà
khoa học và kỹ thuật chú ý từ lâu. Ngày nay, việc sử dụng này đã trở thành phổ
biến ở nhiều nước và đ ã mang lại lợi ích kinh tế khá lớn.
Enzyme là chất xúc tác sinh học không chỉ có ý nghĩa cho quá trình sinh
trưởng, sinh sản của thực vật mà nó còn đóng vai trò rất quan trọng trong chế
biến thực phẩm, trong y học, trong kỹ thuật phân tích, trong công nghệ gen và
bảo vệ môi trường.
Enzyme p rotease là nhóm enzyme thủy phân protein được ứng dụng rộng
rãi trong quá trình sản xuất nước mắm ngắn ngày, trong công nghiệp thuộc da,
trong công nghiệp sữa và phomat. Đ ặc biệt trong quá trình sản xuất bia, protease
đóng vai trò rất quan trọng trong việc tăng nhanh quá trình sản xuất, tăng hiệu
suất trích ly, thủy phân hoàn toàn các chất protein, làm giảm độ nhớt và làm triệt
tiêu nguyên nhân làm đục bia.
Ngày nay, bia là loại đồ uống không thể thiếu đối với cuộc sống của con
người. Bia là loại nước giải khát, có độ cồn thấp, giàu dinh dưỡng. Ngoài việc
cung cấp một lượng calori khá lớn, trong bia còn chứa một hệ enzyme phong
phú, kích thích tiêu hoá cho cơ thể con người.
Hiện nay, các nhà máy bia ở nước ta chưa chú ý tới việc sử dụng enzyme
trong quá trình sản xuất. Xuất phát từ những lý do trên em chọn đề tài “Ứng
dụng của enzyme protease trong sản xuất bia” với mong muốn những ứng dụng
của enzyme này sẽ được sử dụng rộng rãi trong việc sản xuất bia nói riêng.




Chương I TỔNG QUAN VỀ ENZYME PROTEASE

SVTH: Lưu Thị Liên Trang 4 Lớp: 08s2
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
1. Tổng quan về enzyme Protease [2]
1.1. Giới thiệu chung
Protease là các enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptit (CO -NH)
trong phân tử protein và các cơ chất tương tự.




Hình 1.1. Phản ứng thủy phân liên kết peptide

Nhiều Protease có khả năng liên kết este và vận chuyển acid amin.
Theo phân loại quốc tế các enzyme thuộc nhóm này chia thành 4 phân
nhóm phụ:
- Aminopeptidase: xúc tác sự thủy phân liên kết peptit ở đầu nitơ của
mạch polypeptit.
- Cacboxypeptidase: xúc tác sự thủy phân liên kết peptit ở đầu cacbon của
mạch polypeptit. Cả hai phân nhóm enzyme trên đều là các exo – p eptidase.
- Dipeptidhydrolase: Xúc tác sự thủy phân các liên kết dipepit.
- Proteinase: Xúc tác sự thủy phân các liên kết peptid nội mạch.
Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức
độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng
từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đ ến thực vật (đu đủ, dứa...) và động vật
(gan, dạ d ày bê...) [10]. Trong cơ thể, các Protease đảm nhiệm nhiều chức nǎng
sinh lý như: hoạt hóa zymogen, đông máu và phân hủy sợi fibrin của cục máu
đông, giải phóng hormon và các peptid có hoạt tính sinh học từ các tiền chất,
vận chuyển protein qua màng...[3]. Ngoài ra, các Protease có thể hoạt động như
các yếu tố phát triển của cả tế bào ác tính và tế bào bình thường đó là tǎng sự
phân chia tế bào, sinh tổng hợp ADN...[2]. So với Protease động vật và thực vật,
Protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt. Trước hết hệ Protease vi sinh
vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu
trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra d ưới dạng tinh thể
đồng nhất.
Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên Protease vi sinh vật
thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phân triệt để và đa dạng.




SVTH: Lưu Thị Liên Trang 5 Lớp: 08s2
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai




1.2. Đặc điểm và tính chất của Protease vi sinh vật [5]
Các công trình nghiên cứu Protease vi sinh vật ngày càng nhiều. Các kết
quả nghiên cứu cho thấy ngay cả các Protease của cùng một loài vi sinh vật cũng
có thể khác nhau về nhiều tính chất. Căn cứ vào cơ chất phản ứng, pH hoạt động
thích hợp,… các nhà khoa học đã phân loại các Protease vi sinh vật thành bốn
nhóm như sau: P-xerin, P-thiol, P-kim lo ại, P-acid.
Một số tác giả khác chia
Protease ra ba nhóm, dựa vào ho ạt
động ph của chúng bao gồm:
Protease-acid, Protease trung tính,
Protease kiềm.
Trong b ốn Protease kể trên,
các Protease-xerin và Protease-thiol
có khả năng phân giải liên kết este
và liên kết amide của các dẫn xuất
acid của aa. Ngược lại các Protease
kim loại, Protease acid thường
Hình 1.3. Cấu trúc tinh thể của Tripsin
không có hoạt tính esterase của các
(1 Protease xerin tiêu biểu)
dẫn suất của aa. Nhiều Protease
ngo ại b ào của vi sinh vật đã được
nghiên cứu tương đối kỹ về cấu tạo phân tử, một số tính chất hóa lý và cơ chế
tác dụng. Kết quả nghiên cứu cho thấy trọng lượng phân tử của các enzyme này
tương đối bé, nhất là các P-xerin.
Có thể tóm tắt những đặc tính của các nhóm Proteinase này ở bảng 1.1




Bảng 1.1. Một số tính chất của Protease (P) vi sinh vật
N hóm Nguồn E Đặc điểm
C hất kìm pH tối

SVTH: Lưu Thị Liên Trang 6 Lớp: 08s2
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
hãm thích
TTHĐ
DFP+ K iềm
P -Xerin Bac.subtilis X erin
Bac.pumilus
Str.griseus
Str.fradiae
Art hrobacter B22
Asp.oryzae
Asp.flavus
Asp.sojae
E.coli
Streplococcus Indoaxeta-mit -SH 7 ,5
P -tiol
Clostridium histoly-ticum 7 ,0
Ps.cloromer-
curbenzoat
EDTA++ K im lo ại Trung
Bac.subtilus
P -kim
hóa trị hai tính
loại Bac.subtilus NRRL B3411 1,10octa-
fenantrolin
Bac. Subtilisamy
Losaccarilicis
Bac. Megaterium
Psuedomonasaeruginoa
Atreptomeces naraensis
Asp. Oryzae
Acremonium kiliense
Clostridiumhisttolytium
Asp.niger Dizoaxetil COOH Acid
P -Acid
Asp.Awamori Dlnorlox-
inmetil este
Sailoi,penicillium
Janthinellum
Rhizopus chinensis
Mucor pucillus
Endothia parasilica




1.3. Cấu trúc trung tâm hoạt động (TTHĐ) của Protease [5]

SVTH: Lưu Thị Liên Trang 7 Lớp: 08s2
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
Trong TTHĐ của Protease vi sinh vật ngoài gốc acid amin đặc trưng cho
từng nhóm còn có một số gốc acid amin khác. Các kết quả nghiên cứu chung về
TTHĐ của một số Protease vi sinh vật cho phép rút ra một số nhận xét chung
như sau:
- TTHĐ của Protease đủ lớn và bao gồm một số gốc aa và trong một số
trường hợp còn có cả cofactơ kim loại.
+ Các Protease kim loại có TTHĐ lớn hơn vào khoảng 210A, có thể phân
biệt thành sáu phần dưới TTHĐ (subsite), mỗi phần dưới TTHĐ tương ứng với
mỗi gốc aa trong phân tử cơ chất.
+ Đối với các Protease acid, theo nhiều nghiên cứu cấu trúc TTHĐ của
các tinh thể Protease acid của Phizopus chinenis và Endothia parasilica đã cho
thấy phân tử các Protease này gồm có hai hạt, giữa chúng có khe hở vào khoảng
200A. Khe hở này là phần xúc tác của các E, các gốc Asp-35 và Asp-215 xếp đối
diện nhau trong khe ấy.
- Đ ối với các Protease không chứa cysteine, TTHĐ của chúng có tính
mềm dẻo hơn vì cấu trúc không gian của chúng không được giữ vững bởi các
cầu disulphide.
Mặc dù TTHĐ của các Protease vi sinh vật có khác nhau nhưng các
enzyme này đều xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide theo cùng một
cơ chế chung như sau:



E+S enzyme – S enzyme – S + P1 enzyme + P2


Hình 1.4. Cơ chế xúc tác TTHĐ Enzyme
Trong đó: E: enzyme, S: cơ chất, enzyme - S: Phức chất enzym- cơ chất,
P1: Là sản phẩm đầu tiên của phản ứng, P2: Là sản phẩm thứ hai của phản ứng.
2. N guồn thu nhận Protease [3]
Enzyme là protein được sinh vật tổng hợp trong tế bào và là chất tham gia
xúc tác cho mọi phản ứng sinh học. Chính vì thế, mọi sinh vật đều được xem là
nguồn thu nhận để sản xuất enzyme. Nhưng vẫn chủ yếu là ba nguồn chính:
Động vật, thực vật và vi sinh vật.
Protease phân bố ở thực vật, động vật, vi sinh vật. Tuy nhiên nguồn
enzyme ở vi sinh vật phong phú nhất, có ở hầu hết các vi sinh vật như vi khuẩn,
nấm mốc và xạ khuẩn… có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp
nhất để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống [3].
Enzyme Protease từ nguồn động vật và thực vật đ ược loài người khai thác
và ứng dụng hàng ngàn năm để sản xuất và phục vụ trong cuộc sống. Nhưng
hiện nay lượng enzyme thu nhận từ thực vật và động vật đ ược thay thế dần bằng
enzyme vi sinh vật. enzyme thu nhận từ các nguồn này thường rất khó và hiệu
quả kinh tế không cao. Nguồn enzyme từ vi sinh vật dần dần thay thế enzyme từ

SVTH: Lưu Thị Liên Trang 8 Lớp: 08s2
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
động vật và thực vật do hàng loạt những ưu điểm về sinh lý vi sinh vật và về kỹ
thuật sản xuất được liệt kê như sau:
 Vi sinh vật có khả năng chuyển hóa một khối lượng cơ chất lớn hơn khối
lượng cơ thể chúng hàng ngàn lần sau một ngày đêm.
 Enzyme thu nhận từ vi sinh vật có hoạt tính cao.
 Tốc độ sinh sản của vi sinh vật mạnh, trong thời gian ngắn có thể thu
được lượng sinh khối vi sinh vật rất lớn, giúp trong một thời gian ngắn thu được
một lượng enzyme nhiều hoặc lượng các sản phẩm trao đổi chất cao.
 Một đặc điểm riêng có của vi sinh vật đó là cơ thể nhỏ bé nên việc vận
hành, kiểm soát thiết bị lên men trong quá trình sản xuất đơn giản hơn rất nhiều.
 Vi sinh vật là giới sinh vật thích hợp cho sản xuất theo quy mô công
nghiệp: Trong sản xuất, quá trình sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp
enzyme của vi sinh vật hoàn toàn không phụ thuộc vào khí hậu bên ngoài. Trong
khi đó, sản xuất enzyme từ nguồn thực vật và động vật không thể đưa vào quy
mô công nghiệp được.
 Nguồn nguyên liệu dùng sản xuất enzyme theo quy mô công nghiệp rẽ
tiền và dễ kiếm, không chỉ có ý nghĩa về mặt kinh tế mà còn có ý nghĩa rất lớn
về mặt môi trường sống. vi sinh vật không đòi hỏi quá khắt khe những yếu tố
dinh dưỡng của môi trường, nhất là những vi sinh vật tổng hợp enzyne. Chính vì
thế enzyme được sản xuất từ vi sinh vật thường rẻ tiền hơn enzyme từ các nguồn
khác.
 Vi sinh vật có thể sinh tổng hợp cùng m ột lúc nhiều loại enzyme khác
nhau [5].
 Nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh Protease, các enzyme này
có thể ở trong tế bào hoặc được tiết vào môi trường nuôi cấy. Một số Protease
ngo ại bào đã sản xuất quy mô công nghiệp và được sử dụng rộng rãi trong nhiều
ngành công nghiệp, trong nông nghiệp và trong y học.
 Nguồn vi sinh vật thu nhận enzyme Protease chủ yếu gồm: vi khuẩn, nấm
mốc, xạ khuẩn.
3. Phương pháp thu nhận enzyme protease từ vi sinh vật
3.1. Tuyển chọn giống vi sinh vật cho enzyme Protease có hoạt lực cao
Để chọn giống vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme cao, người
ta có thể phân lập từ môi trường tự nhiên hoặc có thể dùng các tác nhân gây đột
biến tác động lên bộ máy di truyền hoặc làm thay đổi đặc tính di truyền để tạo
thành các biến chủng có khẳ năng tổng hợp đặc biệt hữu hiệu một loại enzyme
nào đó, cao hơn hẳn chủng gốc ban đầu. Có thể thông qua các phương pháp sau:
- Phương pháp gây đột biến.
- Phương pháp biến nạp.
- Phương pháp tiếp hợp gene.
- Phương pháp tải.



SVTH: Lưu Thị Liên Trang 9 Lớp: 08s2
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
3.2. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp enzyme Protease
Để tổng hợp enzyme Protease cần phải chọn môi trường vì thành phần
môi trường dinh dưỡng có ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và tổng hợp
enzyme của vi sinh vật.
Trong thành phần môi trường phải có đủ các chất đảm bảo được sự sinh
trưởng bình thường của vi sinh vật và tổng hợp enzyme.
Đặc biệt lưu ý là để tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường dựa vào
hiện tượng cảm ứng. V ì nếu như trong thành phần môi trường có các chất cảm
ứng thì chất đó hay sản phẩm phân giải của nó sẽ kìm hãm hoặc làm yếu tác
dụng kìm toả của chất kìm hãm nhằm bảo đảm khả năng sinh tổng hợp enzyme
đã cho không b ị cản trở. Chất cảm ứng tổng hợp enzyme cho thêm vào môi
trường nuôi thường là cơ chất tương ứng của enzyme cần tổng hợp.
Thành phần chính của môi trường: C, N, H, O. Ngo ài ra các chất vô cơ:
Mn, Ca, P, S, Fe, K và các chất vi lượng khác.
3.2.1. Nguồn cacbon [1],[9]
Thường là hợp chất hữu cơ trong đó chủ yếu là gluxit, tùy thuộc vào đặc
tính của enzyme và nòi vi sinh vật mà người ta lựa chọn cho thích hợp.
Có nhiều hợp chất hydratcacbon và các hợp chất khác là nguồn cacbon
thích hợp đối với nấm mốc sinh ra enzyme Protease có hoạt lực cao. Các nguồn
cacbon có tác dụng đến sinh tổng hợp Protease của Asp. oryzae có thể theo thứ
tự:
fructoza→ sacaroza→ maltoza→ glucoza→ manit→ arabinoza→ galactoza.
Tinh b ột là nguồn cacbon của nhiều chủng vi khuẩn sinh tổng hợp
enzyme Protease.
3.2.2. Nguồn nitơ [1].
Nguồn nitơ sử dụng rất phong phú, bao gồm 2 nhóm: vô cơ và hữu cơ.
Đối với một số loài nấm mốc thuộc họ (A. oryzae, A. awamori, A. niger,
A. flavus) trên môi trường có các nguồn nitơ hữu cơ sinh tổng hợp Protease axit
cao. Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy sinh tổng hợp enzyme được nâng cao
khi trong môi trường có đồng thời cả nguồn nitơ hữu cơ và nitơ vô cơ. Cho thêm
vào môi trường có cám mì, bột đậu tương đã tách chất béo, các nguồn nitơ và
hữu cơ hoạt lực enzyme Protease tăng 22 - 74%. Còn trường hợp dùng các
nguồn nitơ vô cơ duy nhất trong môi trường sẽ dẫn đến ngừng sinh tổng hợp
Protease nói chung.
Ngoài ra, các bazơ purin như A (adenin), G (guanin) và các dẫn xuất của
chúng, ARN và các sản phẩm thuỷ phân cũng làm tăng đáng kể sinh tổng hợp
protease V SV.
3.2.3. Nguồn các nguyên tố khoáng và các yếu tố kích thích sinh trưởng [1]
- Muối khoáng rất cần thiết cho hoạt động vi sinh vật. Ion Mg2+ có tác
dụng sinh tổng hợp và ổn định các enzyme có hoạt tính ở nhiệt độ cao.
- Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đối với môi trường nuôi cấy.


SVTH: Lưu Thị Liên Trang 10 Lớp: 08s2
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
0
+Nhiệt độ nuôi cấy thông thường từ 25 - 30 C. Trị số pH ban đầu của môi
trường (chủ yếu ở môi trường nước) cũng có thể gây ảnh hưởng nào đó đến sự
tạo thành E, nhưng khi đó cũng cần tính đến khả năng biến đổi nhanh chóng chỉ
số đó bởi vi sinh vật.
+ Độ thông khí cũng rất cần thiết cho việc sinh tổng hợp enzyme. Vì vậy
ở môi trường bề mặt người ta thường thêm chất xốp như trấu vào, còn ở môi
trường bề sâu (môi trường dịch thể), thì người ta thường lắc (nếu enzyme cần lắc
thì việc này cực kỳ quan trọng). Độ ẩm cũng rất quan trọng (chỉ có tác dụng ở
nuôi cấy bề mặt), phụ thuộc vào thành phần môi trường bề mặt.
+ Khi lựa chọn môi trường cần chú ý đến cả thành phần định tính và định
lượng sao cho quá trình sinh tổng hợp enzyme mong muốn là cao nhất.
3.3. Nuôi cấy thu nhận chế phẩm enzyme Protease bằng phương pháp bề
mặt [3]
Là phương pháp tạo môi trường cho vi sinh vật phát triển trên b ề mặt môi
trường. Có thể là môi trường lỏng hoặc đặc. Phương pháp này rất thích hợp để
nuôi cấy các loại nấm mốc do khả năng phát triển nhanh, mạnh, nên ít bị tạp
nhiễm. Khi nuôi nấm mốc phát triển bao phủ bề mặt hạt chất dinh dưỡng rắn,
các khuẩn ty cũng phát triển đâm sâu vào lòng môi trường đã được tiệt trùng,
làm ẩm. Đối với một số mục đích đặc biệt, người ta nuôi vi sinh vật trực tiếp
trên bề mặt hạt gạo (sản xuất tương), hạt đậu tương đã được nấu chín trộn hạt
cốc còn sống (làm men thuốc bắc, men dân tộc, làm tương).
Người ta thường dùng cám mì, cám gạo, ngô mảnh… có chất phụ gia là
trấu. Cám, trấu, có b ề mặt tiếp xúc lớn, tạo được độ xốp nhiều, không có những
chất gây ảnh hưởng xấu đến sự phát triển của nấm mốc. Tỉ lệ các chất phụ gia
phải bảo đảm sao cho hàm lượng tinh bột trong khối nguyên liệu không được
thấp hơn 20%, có thể bổ sung thêm nguồn nitơ vô cơ ((NH4)2SO4, (NH 4)2CO),
photpho, nitơ hữu cơ và các chất kích thích sinh trưởng như malt, nước chiết
ngô, nước lọc bã rượu.
- Ưu, nhược điểm
+ Nồng độ enzyme tạo thành cao hơn nhiều lần so với dịch nuôi cấy chìm
sau khi đã tách tế b ào vi sinh vật. Chế phẩm dễ dàng sấy khô mà không làm
giảm đáng kể hoạt tính enzyme. Chế phẩm khô, dễ bảo quản, vận chuyển,
nghiền nhỏ hoặc sử dụng trực tiếp nếu không cần khâu tách và làm sạch
enzyme.
+ Tốn ít năng lượng, thiết bị, dụng cụ nuôi cấy đơn giản dễ thực hiện và
dễ dàng xử lý khi bị nhiễm vi sinh vật lạ, có thể thực hiện qui mô gia đình, trang
trại cũng như ở qui mô lớn đến 20 tấn/ngày.
+ Tuy nhiên phương pháp bề mặt có năng suất thấp, khó cơ khí hoá, tự
động hoá, cần diện tích nuôi lớn, chất lượng chế phẩm ở các mẻ không đồng
đều. Ngoài ra phương pháp nuôi cấy bề mặt có một nhược điểm rất lớn là tốn
nhiều diện tích. Do vậy mà phương pháp này d ần được thay thế bằng nuôi cấy
chìm để nuôi cấy vi khuẩn.


SVTH: Lưu Thị Liên Trang 11 Lớp: 08s2
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
3.4. Thu nhận enzyme (E)
3.4.1. Tách và làm sạch chế phẩm enzyme [3]
Enzyme thường chứa ở các tế bào sinh vật gọi là các enzyme nội bào
(intracellular enzyme), nhưng nó cũng có thể được các sinh vật tiết ra môi
trường sống. Đó là các enzyme ngoại bào (extracellular enzyme). Enzyme vi
sinh vật thường chiết là enzyme ngoại bào.
- Các phân tử enzyme nội bào không có khả năng đi qua màng của tế bào
và màng của các cấu tử của tế bào. Do đó để có thể chiết rút các enzyme này,
bước đầu tiên là phải phá vỡ cấu trúc của các tế bào có chứa enzyme và chuyển
chúng vào dung dịch.
Có thể phá vỡ cấu trúc của các tế bào bằng các biện pháp cơ học như
nghiền với bột thủy tinh hoặc cát thạch anh, làm đồng hóa bằng thiết bị đồng
hóa (homogenizator). Muốn tách được các enzyme trong các cấu tử của tế bào,
người ta còn phải dùng các yếu tố vật lý và hóa học khác nhau như sóng siêu
âm, dùng các dung môi hữu cơ như butanol, aceton, glycerin, ethyl acetate... và
chất detergent. Các hóa chất có tác dụng tốt cho việc phá vỡ các cấu tử của tế
bào vì trong các cơ quan này thường chứa mỡ.
Sau khi đã phá vỡ các cấu trúc của tế bào, enzyme được chiết bằng nước
cất, bằng các dung dịch đệm thích hợp hoặc các dung dịch muối trung tính.
+ Có một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết rút cần lưu ý. Trước hết
đó là nhiệt độ. Để tránh mất hoạt tính hoặc thậm chí vô hoạt, cần chiết rút và
tiến hành kết tủa enzyme ở nhiệt độ thấp (từ 3 đến 50C). Các thao tác phải
nhanh. Một số chất điện ly làm tăng quá trình chiết rút enzyme như NaCl,
ZnCl2, CaCl2. Tác dụng của chúng còn phụ thuộc vào phương pháp dùng khi
chiết rút.
- Để loại bỏ muối khoáng và các lo ại đường... là các tạp chất có phân tử
lượng thấp, người ta thường dùng phương pháp thẩm tích (dialysis) đối nước
hay đối các dung dịch đệm loãng hoặc bằng cách lọc qua gel sephadex.
- Để loại bỏ các protein tạp (protein cấu trúc, protein trơ) và các chất có
phân tử lượng cao khác người ta hay dùng kết hợp các phương pháp khác nhau:
phương pháp biến tích chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH của môi
trường, phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính hoặc các dung môi
hữu cơ, các phương pháp sắc ký (sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion), điện di,
phương pháp lọc gel.
- Mục đích yêu cầu: Các chế phẩm enzyme được sử dụng ở các dạng khác
nhau theo mức độ tinh khiết (hoạt độ riêng). Trong một số trường hợp, canh
trường nuôi cấy vi sinh vật có chứa enzyme được sử dụng trực tiếp dưới dạng
thô không cần tách tạp chất nếu chúng không gây ảnh hưởng đáng kể đến sản
phẩm và quy trình công nghệ sau này (Ví d ụ: sản xuất rượu, nước chấm thực
vật, da). Cũng có khi người ta cần sử dụng chế phẩm enzyme tinh khiết trong
công nghiệp dệt, công nghiệp mạch nha, y học, nghiên cứu khoa học.
Enzyme nói chung rất dễ bị giảm hoạt tính dưới tác dụng của các tác nhân
bên ngoài do đó khi tách và tinh chế enzyme để tránh sự biến hình protein ảnh
SVTH: Lưu Thị Liên Trang 12 Lớp: 08s2
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
hưởng lớn đến ho ạt tính enzyme cần tiến hành nhanh chóng ở nhiệt độ thấp, độ
pH thích hợp không có mặt các chất gây biến hình enzyme.
- Để trích ly enzyme ra khỏi tế bào trước hết cần phải phá vỡ thành tế b ào,
màng tế bào và những cấu trúc dưới tế bào bằng những phương pháp lý học
hoặc hóa học.
Đối với trường hợp enzyme còn nằm trong tế b ào (E nội bào nuôi bằng
phương pháp bề mặt) thì cần phải giải phóng enzyme bằng cách phá vỡ tế b ào
thu nhiều cách như:
+ Nghiền nhỏ, nghiền với cát, nghiền với vụn thủy tinh, nghiền bi.
+ Để tế bào tự phân hủy.
+ Dùng tác dụng của siêu âm hoặc tạo áp suất thẩm thấu cao, trích ly bằng
muối, dung dịch muối trung tính, dung môi hữu cơ.
+ Kết tủa enzyme bằng các chất điện ly thích hợp.
- Thẩm tích [8 ]
Trong quá trình tinh sạch các enzyme để loại bỏ các phân tử hòa tan nhỏ
không mong muốn khỏi dịch trích ly enzyme như amoni sulfat sau khi kết tủa,
dùng một muối để khử hấp thụ enzyme trong sắc ký trao đổi ion, hoặc một phối
tử cạnh tranh dùng trong sắc ký ái lực… người ta thường dùng phương pháp
thẩm tích. Túi thẩm tích được cấu tạo bằng một màng bán thấm, chứa dịch chiết
E, được đặt vào trong một dung dịch đệm không được chứa chất hòa tan cần
được loại bỏ. Chất hòa tan khuếch tán ra khỏi màng cho đến khi nồng độ chất
hòa tan trong túi và bên ngoài dịch đệm sẽ bằng nhau.
- Làm đ ặc [8]
Trong quá trình tinh sạch enzyme, có thể phải làm đặc dịch E, nhất là sau
khi qua giai đoạn sắc ký dịch chứa enzyme đã bị pha loãng ra nhiều.
Làm đ ặc dịch chứa enzyme bằng cách cho bốc hơi trong chân không, bằng cách
thẩm thấu ngược (tạo áp suất thẫm thấu làm cho dung dịch đi qua một màng bán
thấm và giữ lại các protein E) hoặc bằng siêu lọc (dung dịch enzyme được dẫn
qua một màng có lỗ nhỏ bằng áp suất hoặc bằng ly tâm).




SVTH: Lưu Thị Liên Trang 13 Lớp: 08s2
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
4. Quy trình thu nhận enzyme protease từ chủng nấm mốc Asp.oryzae
[8],[18]
4.1. Quy trình thu nhận
Khoáng hỗn hợp
Nước Nguyên liệu dinh dưỡng (bột
b ắp, cao nấm men, pepton)


Hấp thanh trùng

Làm nguội đến 300C

Đỗ lên khay

0,5 -2%
Giống Asp.oryzae
Nuôi cấy ở nhiệt độ
phòng
Thu nhận sinh khối
Chế phẩm ezyme
(enzyme thô)
thô đem sử dụng

Chế phẩm enzyme
thô đem tinh chế
Sấy
Nghiền mịn

Trích ly

Dùng trong

Lọc
chăn nuôi

Kết tủa enzyme

Thu nhận kết tủa

Ch ế phẩm ezyme
Sấy Kỹ thuật

Tinh ch ế Thu nhận chế phẩm
enzyme tinh khiết


Hình 1.5. Quy trình thu nhận enzyme protease


SVTH: Lưu Thị Liên Trang 14 Lớp: 08s2
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
4.2. Thuyết Minh Quy Trình và đề xuất thiết bị
4.2.1. Lý do chọn chủng nấm mốc Asp.oryzae
Asp. oryzae là một loại nấm vi thể thuộc bộ Plectascales, lớp
Ascomycetes. Cơ thể sinh trưởng của nó là một hệ sợi bao gồm những sợi rất
mảnh, chiều ngang 5 - 7µm, phân nhánh rất nhiều và có vách ngang , chia sợi
thành nhiều bao tế bào (nấm đa bào).
Đặc điểm của giống Asp.oryzae giàu các enzyme thủy phân nội bào và
ngo ại bào (amylase, protease, pectinasa,…), ta rất hay gặp chúng ở các kho
nguyên liệu, trong các thùng chứa đựng bột, gạo…đã hết nhưng không được rửa
sạch, ở cặn bã bia, bã rượu, ở lỏi ngô, ở bã sắn… Chúng mọc và phát triển có
khi thành lớp mốc, có m àu sắc đen, vàng… Màu do các bào tử già có màu sắc.
Các bào tử này, dễ bị gió cuốn bay xa và rơi vào đâu khi gặp điều kiện thuận lợi
sẽ mọc thành mốc mới.
4.2.2. K ỹ thuyật nuôi cấy
Sau khi đã trộn giống, môi trường được trải đều ra các khay với chiều dài
2 - 3cm, rồi được đưa vào phòng nuôi cấy, đặt trên những giá đỡ. Các giá đỡ này
được thiết kế sao cho lượng không khí được lưu thông thường xuyên. Phòng
nuôi cấy phải có hệ thống điều chỉnh nhiệt độ và độ ẩm không khí. Nhiệt độ
thích hợp cho nấm sợi phát triển là 28 - 32 0C. Nhiệt độ thấp quá hoặc cao quá
đều ảnh hưởng không tốt cho nấm sợi phát triển.
Trong quá trình nuôi cấy, ta hoàn toàn không cần điều chỉnh pH. Môi
trường bán rắn là môi trường tĩnh nên sự thay đổi pH ở một vùng nào đó ít khi
ảnh hưởng đến toàn bộ khối môi trường.
Thời gian nuôi nấm sợi thu nhận enzyme vào khoảng 36 - 60 giờ. Điều
này còn phụ thuộc vào chủng nấm mốc Asp.oryzae và điều kiện môi trường
cũng như phụ thuộc vào điệu kiện nuôi cấy.
Quá trình phát triển của nấm mốc trong môi trường bán rắn khi nuôi bằng
phương pháp b ề mặt này trải qua các giai đoạn sau:
 Giai đoạn 1: Giai đoạn này kéo dài 10 - 14 giờ kể từ thời gian bắt đầu
nuôi cấy. Enzyme mới bắt đầu đ ươc hình thành. Trong giai đoạn này phải đặc
biệt quan tâm đến chế độ nhiệt độ. Tuyệt đối không được đưa nhiệt độ cao quá
300C vì thời kỳ đầu này giống rất mẫn cảm với nhiệt độ.
 Giai đoạn 2: Giai đoạn này kéo dài 14 - 18 giờ. Enzym e protease được
tổng hợp mạnh. Lượng O 2 trong không khí giảm và CO 2 sẽ tăng dần, do đó
trong giai đoạn này cần phải đ ược thông khí mạnh và nhiệt độ cố gắng duy trì
trong khoảng 29 - 300C là tốt nhất.
 Giai đoạn 3 : Giai đoạn này kéo dài 10 - 20 giờ. Quá trình trao đổi chất
yếu dần, do đó mức độ giảm chất dinh dưỡng sẽ chậm lại. Nhiệt độ của khối môi
trường giảm, do đó làm giảm lượng không khí môi trường xuống 20 - 25 thể tích
không khí/thể tích phòng nuôi cấy/ 1giờ. Nhiệt dộ nuôi duy trì ở 300C, trong giai
đoạn này, bào tử được hình thành nhiều do đó lượng Enzyme protease tạo ra sẽ
giảm xuống. Chính vì thế việc xác định thời điểm cần thiết để thu nhận enzym
rất cần thiết.
SVTH: Lưu Thị Liên Trang 15 Lớp: 08s2
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
4.2.3. Thu nhận sản phẩm
Kết thúc quá trình nuôi cấy ta thu nhận đ ược chế phẩm enzyme protease,
chế phẩm này được gọi là chế phẩm enzyme thô.
Tùy theo mục đích sử dụng ta có thể dùng chế phầm thô này ngay không
cần phải quá trình tinh sạch. Trong những trường hợp cần thiết khác, ta phải tiến
hành làm sạch enzyme. Để sản xuất enzyme tinh khiết người ta phải tiến hành
như sau:
 Nghiền mịn
Toàn bộ khối lượng enzyme thô protease đ ược đem đi nghiền nhỏ. Mục
đích của qúa trình này là vừa phá vỡ thành tế bào vừa làm nhỏ các thành phần
của chế phẩm thô. Khi thành tế bào được phá vỡ, các enzyme nội bào chưa thoát
ra khỏi tế b ào sẽ dễ d àng thoát khỏi tế bào. Phần lớn enzyme protease ngoại b ào
khi được tổng hợp và thoát khỏi tế b ào ngay lập tức thấm vào thành phần môi
trường. Khi ta nghiền nhỏ, enzyme thoát ra khỏi các thành phần này dễ dàng
hơn.
Trong khi nghiền người ta thường sử dụng những chất trợ nghiền như cát
thạch anh và bột thủy tinh. Các chất này là những chất vô cơ không tham gia
vào phản ứng và khả năng tăng mức độ ma sát trước khi sử dụng cát thạch anh
và bột thủy tinh phải được rửa sạch, sấy khô ở nhiệt độ lớn hơn 1000C để loại bỏ
nước và tiêu diệt vi sinh vật.
 Trích ly
Sau khi nghiền mịn, người ta cho nước vào để trích ly enzyme protease.
Các loại enzyme thủy phân có khả năng tan trong nước nên người ta thường
dùng nước như một dung môi hòa tan. Cứ một phần chế phẩm enzyme thô,
người ta cho 4 - 5 phần nước, khuấy nhẹ và sau đó lọc lấy dịch, phần bã thu
riêng dùng làm thực phẩm gia súc (chú ý cần loại bỏ cát thạch anh và bột thủy
tinh ra khỏi hỗn hợp b ã rồi mới cho gia súc ăn).
Dịch thu nhận được vẫn ở dạng chế phẩm enzyme thô vì trong đó có chứa
nước, các chất hòa tan khác từ khối môi trường nuôi cấy. Việc tiếp theo là làm
sao tách enzyme ra khỏi vật chất này.
 Kết tủa enzyme protease
Để làm việc trên người ta tiến hành kết tủa enzyme nhờ những tác nhân
gây tủa. Trong công nghệ tinh chế enzyme, người ta thường dùng cồn và sunfat
amon. Hai tác nhân kết tủa này dễ tìm kiếm và giá rẻ so với những tác nhân gây
tủa khác.
Trong khi tiến hành kết tủa, người ta phải làm lạnh cả dung dịch enzyme
thô và cả những tác nhân kết tủa đ ể tránh làm mất hoạt tính enzyme. Khi đổ chất
làm kết tủa enzyme vào dung d ịch enzyme thô phải hết sức từ từ để tránh hiện
tượng biến tính.
Các enzyme sẽ đ ược tạo kết tủa và lắng xuống đáy, tiến hành gạn và lọc
thu nhận kết tủa ở dạng paste (độ ẩm lớn hơn 70% W).


SVTH: Lưu Thị Liên Trang 16 Lớp: 08s2
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
Ở trạng thái này enzyme rất dễ bị biến tính vì còn nhiều nước để dễ bảo
quản người ta sấy kết tủa enzyme protease ở 400C cho đến khi độ ẩm cuối cùng
đạt 5 - 8% W (thiết bị sấy thường dùng là máy sấy phun sương).
Trong nhiều trường hợp chế phẩm enzyme protease ở dạng kết tủa vẫn
hoàn toàn chưa sạch về mặt hóa học vì trong đó còn chứa một số enzyme ngoài
enzyme ta quan tâm.
4.2.4. Đề xuất thiết bị
 Nồi hấp khử trùng môi trùng
Mục đích của quá trình thanh trùng là tiêu
diệt hoàn toàn vi sinh vật tạp nhiểm còn tại trong
môi trường dinh dưỡng, ngoài quá trình gia nhiệt
sẽ làm cho môi trường dinh dưỡng chuyển hóa vi
sinh vật dễ d àng đồng hóa chất dinh dưỡng trong
môi trường nuôi cấy.
Ta tiến hành thanh trùng trong thời gian
45 - 60 phút, áp suất 1at, nhiệt độ 118 – 1250C.
 Máy nghiền búa Hình 1.6. Nồi hấp khử trùng.
Loại thiết bị này được dùng để nghiên cứu
các chủng nấm mốc.
Sản phẩm ban đầu có kích thước các tiểu phần nhỏ đến 50 mm qua đoạn
ống ở trên nắp của thiết bị, được cho vào tâm rôto một cách liên tục, dưới tác
động của lực ly tâm sản phẩm qua khoảng giữa các búa bị va đập nhiều lần và bị
vỡ ra.




H ình 1.7.Thiết bị nghiền búa




SVTH: Lưu Thị Liên Trang 17 Lớp: 08s2
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
 Máy trích ly
Để trích ly
enzyme, acid amin và
các chất khác từ vật liệu
rắn trong điều kiện sản
xuất lớn, người ta ứng
dụng trích ly tác động
liên tục.
Bộ nạp liệu kiểu vít tải
chuyển pha rắn của canh
trường nấm mốc vào
phần trên của cột
nạp liệu. Canh trường
nấm mốc từ cột nạp liệu
qua cột chuyển nằm
ngang vào cột nâng và
Hình 1.8. Máy trích ly kiểu
sau khi vắt thì thải ra
ngoài.
Nước dâng lên trong cột nạp liệu được bảo hòa liên tục và sau khi qua bộ
lọc thì đưa ra ngoài. Thời gian trích ly 40 - 60 phút ở 250C.
 Máy sấy phun sương




Hình 1.9. Máy sấy phun sương LPG Hình 1.10. Thiết bị sấy phun hình đáy b ằng


Không khí đi qua bộ lọc và bộ gia nhiệt đ ược đưa vào bộ phân phối không
khí ở trên đ ỉnh thiết bị; khí nóng được đưa vào buồng sấy đều theo hình xoáy
trôn ốc. Nguyên liệu dạng lỏng từ máng nguyên liệu đi qua bộ lọc được bơm lên
bộ phun sương ở trên đỉnh của buồng sấy làm nguyên liệu trở thành dạng hạt
sương cực nhỏ, khi tiếp xúc với khí nóng, lượng nước có trong nguyên liệu
nhanh chóng bay hơi, nguyên liệu dạng lỏng được sấy khô thành thành phẩm

SVTH: Lưu Thị Liên Trang 18 Lớp: 08s2
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
trong thời gian cực ngắn. Thành phẩm được phần đáy của buồng sấy và bộ phân
li gió xoáy đùn ra ngoài, phần khí thừa còn lại đ ược quạt gió hút và đẩy ra ngoài.
 Thiết bị lọc
Máy lọc chân không dạng thùng quay: Loại này được ứng dụng để tách
sinh khối vi sinh vật khỏi dung dịch canh trường.
Chất lỏng canh trường chảy vào nhánh trên của băng tải và khi chuyển dịch trên
các phòng chân không, phần chiết qua lỗ lọc vào các khoang, còn các tiểu phần
rắn của huyền phù bị giữ lại trên bề mặt của băng tải.




Hình 1.11. Sơ đồ thiết bị lọc chân không d ạng thùng quay tác động liên tục
5. Tình hình nghiên cứu enzyme protease
5.1 Tình hình nghiên cứu enzyme trong nước
Hầu như mọi phản ứng hoá học trong cơ thể sống đều cần phải có vai trò
xúc tác của enzyme - chất xúc tác sinh học. Chính vì vậy, các nghiên cứu về
enzyme đ ã thu hút sự quan tâm của các cán bộ hoá sinh học, sinh học thực
nghiệm và nhiều nhà nghiên cứu ở các lĩnh vực liên quan khác. Các nghiên cứu
nhằm theo hướng tách, tinh sạch enzyme, tạo các chế phẩm có độ sạch khác
nhau, nghiên cứu cấu trúc, mối liên quan giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của
enayme, khả năng ứng dụng enzyme trong thực tế [3]. Và gần đây nhất là những
sáng tạo mới mẽ, mang tính ứng dụng lớn được sử dụng rộng rãi như:
+ Trần Quốc Hiền, Lê Văn Việt Mẫn, Trung tâm Công nghệ sau thu
hoạch, Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II, Trường Đại học Bách Khoa, Đại
học Quốc gia Hồ Chí Minh đ ã “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm Protease từ ruột
cá Basa (pangasius bocourti)” thực hiện năm 2006. Nghiên cứu này khảo sát
quá trình trích ly và tinh sạch enzyme Protease từ ruột cá Basa (Pangasius
bocourti). Dịch chiết protease kiềm thu được từ ruột có tổng hoạt tính cao nhất
là 15,79UI/gCKNT (chất khô nội tạng) trong điều kiện chiết: tỷ lệ mẫu/dung
môi 1/1; pH 9,5; nhiệt độ 350C; thời gian chiết 10 phút. [12 ].
+ Tối ưu một số điều kiện nuôi cấy chủng vi sinh vật biển Acinetobacter
sp. QN6 sinh tổng hợp Protease được thực hiện của Quyền Đình Thi, Trần Thị
Quỳnh Anh, Nguyễn Thị Thảo (2007), viện CNSH đã chứng minh các điều kiện
thuận lợi nhằm nuôi cấy với hiệu suất cao nhất đối với chủng vi sinh vật biển
Acinetobacter sp. QN6 sinh tổng hợp Prơtease [13].

SVTH: Lưu Thị Liên Trang 19 Lớp: 08s2
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
+ Phan Thị Bích Trâm, Dương Thị Hương Giang, Hà Thanh Toàn, Phạm
Thị Ánh Hồng, Đại học Cần Thơ, Trường ĐHKH Tự nhiên, ĐH Quốc Gia TP
Hồ Chí Minh đã tiến hành “Tinh sạch và khảo sát đặc điểm của các Serine
Protease từ Trùn Quế” ( 2007). Bước đầu khảo sát hệ enzyme Protease từ trùn
quế (Perionyx excavatus) cho thấy phần lớn các protease trong dịch chiết
enzyme thô có thể tinh sạch sơ bộ bằng tủa phân đoạn với ammonium sulfat
nồng độ trong khoảng 30-80%. Nhiệt độ và pH tối ưu cho enzyme thô hoạt động
trên cơ chất casein là 550C và pH trong khoảng kiềm 10 -12. [14],[4].
+ “Nghiên cứu ứng dụng Protease bacillus subtilis trong sản xuất bột
đạm thủy phân từ cá Mối”, Vũ Ngọc Bội, trường Đại học thủy sản Nha Trang.
Qua nghiên cứu cho thấy protease B. subtilis có thể thủy phân mạnh mẽ cơ thịt
cá mối và hoàn toàn có thể sử dụng enzyme này trong sản xuất bột đạm thủy
phân. Khi bổ sung protease B. subtilis với nồng độ enzyme 0,3% vào hỗn hợp cơ
thịt cá mối và thủy phân ở 500C.
+ Nghiên cứu ứng dụng Protease trong sản xuất Bia, thực hiện trong các
năm 1993 - 1994, Thực hiện: TS.Trương Thị Hòa và các công tác viên Viện
Công nghiệp thực phẩm. Protease của Aps. oryzae được dùng để thủy phân
protein trong hạt ngũ cốc, tạo điều kiện xử lý bia tốt hơn. [5]
5.2. Vấn đề sản xuất enzyme Protea se trên thế giới
Trong các Protease, các enzyme của hệ tiêu hóa được nghiên cứu sớm
hơn cả. Năm 1857, Corvisart tách được tripxin từ dịch tụy, đó là Protease đ ầu
tiên nhận được ở dạng chế phẩm. Năm 1861 Brucke cũng đã tách được Pepxin
từ dịch dạ dày Chó ở dạng tương đối tinh khiết. Ngoài các enzyme của hệ tiêu
hóa, người ta cũng đã quan sát đầu tiên về các Protease trong máu [9].
Các Protease thực vật được phát hiện muộn hơn. Năm 1879 Wurtz được
xem là người đầu tiên tách được Protease thực vật. Đến nay người ta đã nghiên
cứu được khá đầy đủ về cấu trúc phân tử của nhiều Protease như: papain,
tripxin, kimotripxin, subtilizin… [9].
Các Protease của vi sinh vật mới được chú ý nghiên cứu nhiều từ năm
1950, mặc dù từ năm 1918 - 1919 Waksman đã phát hiện được khả năng phân
giải Protein của Xạ khuẩn. Trong hơn 10 năm nay số công trình nghiên cứu
Protease vi sinh vật tăng lên đáng kể nhiều hơn các Protease của động và thực
vật. Những kết quả đạt được trong lĩnh vực này đã góp phần mở rộng quy mô
sản xuất chế phẩm enzyme và ứng dụng enzyme trong thực tế [9].
Trong CNTP, người ta sử dụng Protease đ ể sản xuất phomat từ sữa
(Mohanty et al.,1999), x ản xuất bánh từ bột mì (Hozova et al., 2003) hay chế
biến các sản phẩm giàu protein từ đậu tương (Ghazi et al., 2003; Ma et al.,
2004); trong công nghiệp thuộc da, Protease được dùng để thủy phân một số
thành phần phi collagen của da và loại bỏ các protein phi fibrin như albumin,
globulin (Gupta, Rammani, 2006); trong chất tẩy rửa, Protease là một trong
những thành phần quan trọng của tất cả các loại chất tẩy rửa, từ các chất tẩy rửa
dùng trong gia đ ình đến những chất làm sạch kính hoặc răng giả, kem đánh răng
(Rao et al., 1998). Trong những năm gần đây, giá trị thương mại của các enzyme

SVTH: Lưu Thị Liên Trang 20 Lớp: 08s2
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
công nghiệp trên toàn thế giới đạt khoảng 1 tỷ USD, trong đó chủ yếu là các
enzyme thủy phân (75%), và Protease là một trong ba nhóm enzyme lớn nhất sử
dụng trong công nghiệp (60%) (Rao et al., 1998) [11].
Từ năm 1950 trở lại đây trên thế giới có hàng loạt Protease động vật, thực
vật và vi sinh vật được tách chiết nghiên cứu. Thời gian gần đây các nhà khoa
học trên thế giới tập trung nghiên cứu về Protease vi sinh vật và đã đạt nhiều
thành tựu to lớn về lĩnh vực này (Protease từ vi sinh vật chiếm tới 40% tổng
doanh thu của enzyme toàn thế giới (Godfrey west, 1996) [13]). Hiện nay, số
lượng các enzyme được sản xuất hàng năm trên thế giới, ở các nước phát triển
nhất là châu Âu, Mỹ và Nhật Bản vào khoảng 300.000 tấn với doanh thu từ sản
xuất enzyme ước tính vào khoảng 500 triệu USD. Trong đó khoảng 600 tấn
Protease tinh khiết được sản xuất từ vi sinh vật bao gồm khoảng 500 tấn từ vi
khuẩn và 100 tấn từ nấm mốc. Những nước có công nghệ sản xuất và ứng dụng
Protease tiên tiến trên thế giới là: Đan Mạch, Nhật Bản, Mỹ, Anh, Pháp, Hà Lan,
Trung Quốc, Đức, Áo. Các nước này đã đầu tư thích đáng cho công tác nghiên
cứu, sản xuất và ứng dụng Protease từ VSV. Chính vì thế nhịp độ sản xuất
Protease ở quy mô công nghiệp tại các nước phát triển hàng năm tăng vào
kho ảng 5% - 10%. Ngày nay người ta có thể sản xuất các enzyme cố định trên
các chất mang không tan cho phép có thể tái sử dụng enzyme nhiều lần. Vì vậy
mà việc ứng dụng Protease ngày càng gia tăng[4], [1].
Enzyme tinh khiết trong công nghiệp dệt, công nghiệp mạch nha, y học,
nghiên cứu khoa học.




SVTH: Lưu Thị Liên Trang 21 Lớp: 08s2
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU VÀ THIẾT BỊ
I. Đối tượng nghiên cứu
1.Giới thiệu nguyên liệu [6]
Nguyên liệu chính dùng để sản xuất bia là malt đ ại mạch, hoa houblon,
nước và sử dụng nguyên liệu thay thế là ngô, gạo.
1.1. Malt đại mạch
1.1.1. Vai trò của malt trong sản xuất bia
Trong công nghiệp sản xuất bia malt là nguồn nguyên liệu chủ yếu được
dùng để sản xuất bia vì vậy nó có vai trò rất quan trọng trong công nghiệp sản
xuất bia. Thành p hần của malt là những nhân tố quyết định đến chất lượng của
bia thành phẩm sau này, chúng giúp cho bia có hương vị đặc trưng, có vị đắng
dịu hài hòa tạo cảm giác thú vị cho người sử dụng.
Trong thành phần của malt có chứa một lượng Enzym e khá phong phú.
Trong những đ iều kiện thuận lợi về nhiệt độ, pH thì các Enzyme này hoạt động
mạnh phân cắt các hợp chất hữu cơ có phân tử lớn thành những hợp chất có
phân tử lượng thấp. Mặc khác trong thành phần của malt có chứa nhiều tinh bột,
các đường đơn, protein, các sắc tố tạo m àu, mùi, vị làm cho bia có hương vị đặc
trưng.
Malt đại mạch vừa là tác nhân đường hoá, vừa là nguyên liệu đặc trưng
dùng sản xuất bia, bia sản xuất từ malt đại mạch có mùi vị và tính chất công
nghệ hơn hẳn so với bia được sản xuất từ malt của các loại hạt hoà thảo khác.
Một số đặc tính của malt
Malt là một loại ngũ cốc được sản xuất từ lúa đại mạch. Malt đại mạch
gieo trồng là loại thực vật xếp vào họ hordeum gồm: hordeum sativum, hordeum
murium, hordeum jubatum…
Tùy theo mục đích sử dụng mà malt đại mạch được chia thành 2 nhóm:
đại mạch mùa đông (gieo hạt mùa đông, thu hoạch mùa hè) và đại mạch mùa
xuân (gieo hạt mùa xuân, thu hoạch mùa thu). Thường chu kỳ sinh trưởng của
đại mạch 100 – 120 ngày.
Trong công nghiệp thì người ta thường dùng dại mạch để chế biến bia là
giống đại mạch 2 hàng (hordeum distichum). Dấu hiệu đặc trưng của đại mạch
Trong nông nghiệp người ta dùng đại mạch làm thức ăn gia súc chăn nuôi
hoặc hai hàng là hình dáng rất cân đối tùy thuộc vào tư thế và đặc điểm của
bông.
Đại mạch hai hàng được chia thành ba nhóm nhỏ: đại mạch bông cúi,
bông đứng và bông xòe. Đại mạch bông cúi có đặc điểm là trục bông rất dẻo, gié
của hạt d ài, sau khi trổ hoa và làm đòng thì bông bắt đầu cúi xuống. Đại mạch
bông đứng có đặc điểm là cây to cứng, bông dày hạt. Loại này được trồng nhiều
ở một số nước Tây Âu. Đại mạch bông xòe thì có gié rất ngắn, có hạt dường như
được tính vuông góc với trục bông chủ yếu trồng nhiều ở Anh, Ailen và Bắc Mỹ
chế biến thức ăn cho gia súc, gia cầm,…thường dùng đại mạch đa hàng
(hordeum polystychum).

SVTH: Lưu Thị Liên Trang 22 Lớp: 08s2
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
Giống đại mạch đa hàng này được chia làm hai nhóm: đại mạch bốn hàng
(H.hexatichum) và đại mạch sáu hàng (H. tetratichum) thông thường giống đại
mạch bốn hàng cũng được dùng để sản xuất bia nhưng không được phổ biến.




Hình 1.12. Đại mạch hai hàng




Hình 1.13. Đại mạch nhiều hàng

1.1.2. Thành phần cấu tạo của malt
Hạt của malt đại mạch có ba bộ phận chính: vỏ, nội nhũ và phôi.
 Vỏ
Vỏ hạt chiếm tỉ lệ khá lớn nhưng không có giá trị dinh dưỡng. Đối với
công nghệ sản xuất bia vỏ hạt gây ảnh hưởng hai mặt: mặt bất lợi là trong vỏ có
chứa các chất màu,các chất đắng và các chất chát nếu các chất này hòa tan vào
dịch đường sẽ làm giảm chất lượng của sản phẩm. Mặt lợi của lớp vỏ là đóng
vai trò xây dựng màng lọc trong quá trình tách bả khỏi khối cháo.
SVTH: Lưu Thị Liên Trang 23 Lớp: 08s2
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
Vỏ hạt đại mạch từ ngo ài vào trong chia làm ba lớp: vỏ trấu, vỏ quả, vỏ
hạt. Phần này chiếm từ 8 - 15% trọng lượng hạt.
Vỏ trấu là cấu tử chiếm nhiều nhất trọng lượng của vỏ, nó được hình
thành từ đài hoa. Đài hoa dưới hình thành nên vỏ trấu phía ngoài (phía lưng) và
kết thúc bằng sợi râu, còn đài hoa hình thành nên vỏ trấu phía trong (phía bụng)
của hạt…Đ ài hoa là công cụ để bảo vệ các cơ quan bên trong của hạt trong quá
trình hình thành và chuyển hóa của nó.
Thành phần hóa học của vỏ trấu chủ yếu là xellulose kết chặt lại nhờ chất
khoáng và linhin. Dưới lớp vỏ trấu là lớp vỏ quả được cấu tạo từ lớp tế bào, cứ
một lớp xếp ngang thì tiếp đến là một lớp xếp dọc. Với cấu trúc như vậy lớp vỏ
quả sẽ rất dai và bền vững.
Dưới lớp vỏ quả là lớp vỏ hạt bai gồm hai lớp tế bào, tế b ào của lớp ngoài
có thành rất dày, lớp trong thì trong suốt. Lớp vỏ hạt có vai trò như một màng
bán thấm: chỉ cho nước thấm vào bên trong hạt đồng thời giữ các chất hòa tan
trong hạt không cho thấm ra ngoài.
Lớp vỏ quả và lớp vỏ hạt liên kết chặt với nhau, mối liên kết đó chắt hơn
rất nhiều so với sự liên kết giữa chúng với lớp vỏ trấu.
 Nội nhũ hạt:
Nội nhũ hạt là thành phần lớn nhất đồng thời là phần có giá trị nhất của
hạt, chiếm từ 45 – 68% trọng lượng hạt. Phần này của hạt đại mạch giữ vai trò
quyết định đến chất lượng của đại mạch trong sản xuất bia. Ngoài cùng của nội
nhũ tiếp giáp với lớp vỏ hạt là lớp aloron. Lớp aloron này rất giàu protein, chất
béo, đường xelluloza, pentoza, vitamin và chất tro. D ưới lớp aloran mới đ ến
phần nội nhũ thật của hạt.
Cấu trúc của nội nhũ gồm các tế bào lớn có thành mỏng chứa đầy các hạt
tinh b ột, một ít protein, xelluloza, chất béo, tro và đường. Các hạt tinh bột trong
nội nhũ malt có d ạng hình tròn có kích thước rất lớn 20 - 30 mm hoặc rất bé từ
2 – 10 mm có rất ít những hạt có kích thước trung bình, trọng lượng riêng của
hạt tinh bột khá cao 1,5 – 1,6 vì vậy chúng lắng xuống nhanh, tinh bột không tan
trong nước kể cả những dung môi hữu cơ trung tính, có nhiệt độ hồ hóa là . 75 –
800C.
Ngoài thành phần là tinh bột còn có chứa một số tạp chất khác như nito
0,5 – 1,5%; tro 0,2 – 0,7%; axit béo 0,6%.
Cấu tạo tinh bột gồm hai dạng polysacharide: amylo và amypectin.
- Amylo: chiếm từ 17 -24% trọng lượng tinh bột là một polyme ở dạng
xoắn – thẳng gồm 60 – 600 gốc glucoza được nối với nhau qua cầu oxy & - 1,4
glucozit.
- Amylopectin: chiếm từ 76 – 83% trọng lượng tinh bột, là một polyme ở
dạng xoắn –nhánh gồm khoảng 2000 gốc glucoza được nối với nhau qua cầu
oxy - 1,4 glucozit ở m ạch chính và - 1,6 glucozit ở mạch nhánh.
Tinh bột sẽ chịu tác động xúc tác của hệ enzyme amylaza, hiệu quả xúc
tác này sẽ tùy thuộc vào nhiệt độ và pH.

SVTH: Lưu Thị Liên Trang 24 Lớp: 08s2
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
 Phôi
Phôi là cơ quan sống, hô hấp của hạt. Phôi thường chiếm 2,5 – 5% trọng
lượng hạt. Trong phôi có từ 37 - 50% chất khô là thành phần nito, khoảng 7%
chất béo, 5 – 6% đ ường saccaroza, 7 – 7,5% pentoza, 6 – 6,5% chất tro và một ít
thành phần khác.
Vai trò của phôi có tầm quan trọng đặc biệt không những đối với sự sống
lưu truyền của cây mà ngay cả trong công nghiệp sản xuất bia. Quá trình chế
biến hạt đại mạch để trở thành hạt malt được đặt nền tảng trên sự nảy mầm của
hạt, tức là sự phát triển của phôi.
Trong giai đoạn này quá trình sinh học chủ yếu xảy ra là sự hoạt hóa và
tích lũy hoạt lực của enzym e trong hạt. Nhờ quá trình này mà một chất dinh
dưỡng cao phân tử bị p hân cắt thành sản phẩm thấp phân tử. Một phần các chất
thấp phân tử này được chuyển về phôi để nuôi cây non, phần còn lại tồn tại
trong hạt để sau này biến thành chất hòa tan của dịch đường.
Phôi nằm ở phía dưới gần đế của hạt bao gồm phôi lá , phôi rễ và nằm
giữa chúng là phôi thân. Tiếp giáp giữa phôi và nội nhũ là lớp ngù. Ngù là một
lớp màng bán thấm: nó chỉ cho phép các chất hòa tan từ nội nhũ thấm qua để
chuyển về phôi và nước từ phía phôi đi vào nội nhũ.
1.1.3. Thành phần hoá học của malt
Thành phần hóa học của malt đại mạch rất phức tạp. Nó phụ thuộc vào
giống đại mạch, điều kiện đất đai, khí hậu, kĩ thuật canh tác và điều kiện bảo
quản.Thành phần hóa học của malt là nhân tố quyết định chất lượng của đại
mạch để xem xét loại đại mạch đó có đủ tiêu chuẩn để sản xuất bia hay không.
 Nước
Thủy phần của đại mạch có ảnh hưởng lớn đến quá trình vận chuyển và
bảo quản hạt. H àm ẩm cao sẽ kích thích quá trình hô hấp và tự bốc nóng của hạt.
Hai quá trình này là nhân tố quan trọng làm hao tổn chất khô. Thủy phần cao
quá mức cho phép tạo điều kiện thuận lợi cho vi sinh vật phát triển.
Đặc biệt nguy hiểm là các lo ại vi khuẩn hoại sinh gây thối rữa cho hạt.
Đại mạch có thủy phần cao sẽ làm tăng chi phí vận tải một cách vô ích. Người ta
xác định được hàm ẩm của đại mạch tăng 1% thì hiệu suất thu hồi chiết giảm
0.76%, hàm ẩm tối đa cho phép của đại mạch khi đưa vào bảo quản là 13%.
 Gluxit
Gluxit được chia làm bốn nhóm: mono, disacharide, trisacharide và
polysacharide.
Monosaccharide trong đại mạch bao gồm glucoza, fructoza và xitaza.
Trong thành phần của disaccharide thì chủ yếu là saccharoza và maltoza
còn thành phần của trisaccharude là đường rasinoza.
Polysaccaride là hợp phần chiếm nhiều nhất trong thành phần gluxit của
hạt đại m ạch. Chúng bao gồm tinh bột, xelluloza, hemixelluloza, pentoza,
amylan và các hợp chất hợp kẹo. Ba cấu từ có ý nghĩa quan trọng nhất trong
công nghệ sản xuất bia.

SVTH: Lưu Thị Liên Trang 25 Lớp: 08s2
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
 Tinh bột
Tinh bột là cấu từ chiếm vị trí hơn một nửa khối lượng chất khối lượng
chất khô của đại mạch là chủng giống có chất lượng cao thì cao thì con số này
có thể lên đến 70%. Trong công nghệ sản xuất malt và bia thì tinh bột có hai
chức năng:
- Thứ nhất nó là nguồn thức ăn dự trữ cho phôi.
- Thứ hai nó là nguồn cung cấp hoà tan cho dịch đường trước lúc lên men.
Tinh bột được phân bố ở nội nhũ và một phần rất ít ở phôi. Chúng tồn tại
dưới dạng những khối lập thể, có kích thước khá bé ta gọi là hạt tinh bột.
Hạt tinh bột của đại mạch có hai kích cỡ: hạt to và hạt bé.
- H ạt to là hạt có kích thước đường kính khoảng 20 - 30 um, dạng hình
cầu hoặc hình o van.
- Hạt loại bé có dạng hình cầu hay hình que, kích thước khoảng 2 - 10um.
Tinh bột của hạt đại mạch có tỷ trọng 1.5 - 1.6, nhiệt lượng riêng là 0.27
kcal/kg, d ễ kết lắng trong nước, quay mặt phẳng của ánh sáng phân cực sang
bên phải có giới hạn góc quay là 201.5 - 204.30
Tinh b ột không tan trong nước lạnh và các dung môi hữu cơ trung tính,khi
tiếp xúc với nước thì tinh bột sẽ hút nước và trương nở.
Tính chất hồ hóa của tinh bột có ý nghĩa rất lớn trong công nghệ sản xuất
bia vì tinh bột đ ã qua hồ hóa sẽ được đường hóa nhanh hơn và triệt để hơn.
Tinh b ột gồm hai polysaccharide hợp thành: amyloza và amylopectin:
- Amyloza: chiếm từ 17 - 24% bao gồm từ 60 - 600 gốc glucoza liên kết
với nhau qua cầu oxi và đến 1.4 - glucozit và tạo mạch thẳng: phía đầu là cực
kín còn đầu kia là cực aldehit.
Mạch amylose được xoắn theo vòng và có cấu trúc không gian giống một
chiếc lò xo. Khi tiếp xúc với dung dịch ion thì chúng b ị hấp thu vào khoảng
không của chiếc lò xo này và tạo phức chức phản quang màu xanh. Khi cấu trúc
lò xo này bị phá vỡ thì tính chất này cũng không còn.
Amyloza có dạng tinh thể có phân tử lượng khoảng 10.000 - 100.000 đơn
vị, dễ hòa tan trong nước nóng để tạo thành dung dịch không bền vững với độ
nhớt khá thấp. D ưới tác dụng của enzyme amyloza m ạch amyloza này sẽ bị
phân cách thành các đường đơn giản maltoza và glucoza.
- Amylopectin: chiếm khoảng 76 - 83% được tạo nên bởi khoảng 2.000
gốc đường glucoza, xếp thành một trục chính, trên đó có nhiều mạch nhánh. Tại
những điểm phân nhánh các gốc đ ường glucoza liên kết với nhau qua cầu nối
oxi – 1.6 - glucozit, còn các điểm khác thì mối nối liên kết là oxi - 1 .4 glucozit.
Amylopectin là chất vô định hình với khối lượng phân tử từ 400.000 –
1.000.000 đơn vị. Nó không hòa tan trong nước nóng mà chỉ tạo thành hồ với
tác dụng của dung d ịch ion thì amylopectin chuyển thành màu tím.
Trong mối trương giàu nước tinh bột bị thủy phân bởi hệ enzim amylaza
để tạo thành đường dextrin, đường kép mantoza, một lượng ít glucoza và một số

SVTH: Lưu Thị Liên Trang 26 Lớp: 08s2
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
oligozaccharide này cùng với các dextrin bậc thấp hòa tan bền vững vào nước để
trở thành chất hòa tan của dung dịch đường trước lúc lên men.
 Xelluloza
Xenlluloza của hạt đại mạch được phân bố chủ yếu ở vỏ trấu và chiếm
khoảng 20% chất khô của vỏ.
Xenlluloza bao gồm khoảng 2.000 - 10.000 gốc glucoza, xấp xếp một
mạch dài, xoắn lại thành từng chùm nên cấu trúc của xenllucoza rất dai và rất
khó bị phân cắt trong môi trường thường. X enllucoza không tan trong nước, hầu
như không thay đổi gì về thành phần và cấu trúc trong suốt quá trình sản xuất
bia.
Xenllucoza đóng vai trò đặc biệt quan trọng trong quá trình lọc dịch
đường vì lớp vỏ trấu là vật liệu tạo màng lọc phụ rất hữu hiệu góp phần lọc
trong bia hơn.
 Hemixelluloza
Hemixelluloza là thành phần chủ yếu tạo nên thành tế bào, là một phức hệ
bao gồm pentozan, hexozan và acid uronic.
Dưới xúc tác của nhóm enzyme sitaza thì hemixelloza bị thủy phân thành
hexoza (galactoza và manoza) và pentoza (arabinoza và xiloza), chúng hòa tan
bền vững vào dung dịch đường và tạo thành chất chiết là nguồn cung cấp dinh
dưỡng quan trọng cho nấm men sử dụng.
Quá trình phá vỡ thành tế bào bởi enzyme sitaza đóng vai trò quan trọng ở
giai đoạn ươm mầm vì đây là bước đột phá để các enzyme khác xâm nhập vào
bên trong tế bào.
 Các hợp chất pectin và các hợp chất dạng keo
Các hợp chất dạng pectin được phân bố thành tế bào tạo ra màng trung
gian chủ yếu là protopectin.
Các chất dạng keo khi chúng hòa tan vào nước nóng thì tạo thành dung
dịch có độ nhớt cao vì b ản chất của nó là một hydratcacbon nên khi thủy phân
cho sản phẩm là đường đơn galactoza và xitoza.
Sự tồn tại của hợp chất pectin và các chất dạng keo trong dung dịch
đường mang tính chất hai mặt: Mặt bất lợi gây cho dung dịch có độ nhớt cao nên
khó lọc, mặt có lợi tạo cho bia có vị đậm đà, tăng khả năng tạo bọt và giữ bọt
của sản phẩm.
 Saccharide thấp phân tử
Saccharide chủ yếu là một số đ ường đơn và đường kép, cấu tử chiếm
nhiều nhất là saccharoza tới 1,8% chất khô của hạt. Loại đường này phân bố ở
phôi chiếm đến 5,5% trọng lượng của bộ phận này.
Lượng glucoza và fructoza trong hạt đại mạch là không đáng kể, tổng
lượng đường ngược khoảng 0,3 - 0,4% trong đó trọng lượng glucoza cao hơn
một ít so với fructoza.



SVTH: Lưu Thị Liên Trang 27 Lớp: 08s2
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
Các loại đường đơn trong hạt đại mạch không nhiều nhưng có vai trò
quan trọng đối với sự phát triển của phôi đặc biệt ở giai đoạn đầu của quá trình
ươm m ầm.
1.3.3. Các hợp chất chứa nitơ
Hàm lượng các hợp chất chứa nitơ tuy chiếm tỷ lệ thấp trong đại mạch
kho ảng 9 - 10% so với lượng chất khô của hạt nhưng nó có vai trò rất quan trọng
trong công nghệ sản xuất bia vì nó ở chừng mực nào đó chúng quyết định chất
lượng của sản phẩm cuối cùng.
Phần lớn các hợp chất này tồn tại dưới dạng cao phân tử chúng được gọi
là protit, còn một phần rất nhỏ tồn tại dưới dạng phân tử thấp, dễ hòa tan, có các
tính chất khác với nhóm cao phân tử.
 Protit
Protit là chỉ số quan trọng thứ hai sau tinh bột để đánh giá xem lô hạt đó
có đủ tiêu chuẩn để sản xuất bia hay không. Nếu hàm lượng cao quá bia dễ bị
đục, rất khó bảo quản, nếu quá thấp quá trình lên men sẽ không triệt để, bia kém
bọt, vị kém đậm đà và kéo theo nhiều chỉ số non yếu khác. Hàm lượng protit tốt
nhất cho sản xuất bia là 8 - 10%.
Protit phân bố chủ yếu ở lớp vỏ alơron và phôi, một phần nhỏ ở tế bào
xung q uanh nội nhũ. Sự thủy phân protit là một trong những quá trình quan
trọng nhất trong công nghệ sản xuất malt và bia vì các sản phẩm của quá trình
này đ ều đóng vai trò nhất định, đ ặc biệt là sản phẩm tạo thành do quá trình
tương tác giữa sản phẩm thủy phân của các hợp phần trong nội nhũ như
melanoid-một hỗn hợp vàng óng, có vị ngọt và thơm dịu, là nhân tố quyết định
hương và vị của bia đen.
Khả năng tạo bọt và giữ bọt cũng như độ bền keo của chúng phụ thuộc
vào mức độ thủy phân của protit và tỉ lệ các cấu tử sản phẩm tạo thành trong quá
trình thủy phân.
Protit trong đại mạch được chia thành hai nhóm: protit đơn giản hay gọi là
protein và protit phức tạp còn gọi là proteid. Các đại diện tiêu biểu của protein là
levkozin, edestin, hodein và glutein. Còn proteid là những hợp chất được tạo
thành từ một phân tử có bản chất prtein và một khác có bản chất phi protein đại
diện là nucleoproteid, lipoproteid, glucoproteid và phosphoproteid. Đặc điểm
của proteid là kém hòa tan không bền vững gây ảnh hưởng trực tiếp đến chất
lượng của sản phẩm do đó cần loại bỏ tối đa cấu tử này khỏi dịch đường là cần
thiết nhưng cũng rất khó khăn.
 Các hợp chất chứa nitơ và phi protit
Các đại diện tiêu biểu của nhóm này là albumoza, penton, pentid,
polypentid và acid amin.
- Albumoza và penton có vai trò rất lớn trong việc tạo và giử bọt, đồng
thời làm tăng thêm vị đậm đà của bia, nhưng ở hàm lượng cao sẽ làm giảm độ
bền của keo của bia gây đục bia.


SVTH: Lưu Thị Liên Trang 28 Lớp: 08s2
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
- Peptid là hỗn hợp nhiều hợp chất mà phân tử của chúng cũng được tạo
thành từ các gốc acid amin nhưng ít hơn nhiều so với albumoza và penton. Căn
cứ vào số gốc acid amin hợp thành, chúng được chia ra: di-, tri- và polypeptid
chúng dễ dàng hòa tan vào dịch đ ường tạo thành dung dịch bền vững tồn tại
trong bia như một thành phần dinh d ưỡng.
- Acid amin tự do tồn tại trong đại mạch với một lượng không nhiều
kho ảng 0.1% so với lượng chất khô của hạt. Tuy chiếm tỉ lệ nhỏ nhưng vai trò
của nó trong công nghệ sản xuất bia lại rất lớn: là nguồn cung cấp chất nitơ cho
nấm men, là tác nhân chính tạo melanoid, tham gia tạo bọt và tồn tại trong bia
như một thành phần dinh dưỡng quan trọng.
1.3.4. Các hợp chất không chứa nitơ
Bao gồm các hợp chất hữu cơ và vô cơ không chứa nitơ, chúng hòa tan
thành dung dịch khi chiết ly bằng nước các đại diện tiêu biểu polyphenol, chất
đắng, fitin, acid hữu cơ, vitamin và chất khoáng.
 Polyphenol và chất đắng
Polyphenol tập trung chủ yếu ở lớp vỏ hạt đại mạch, phần lớn là những
hợp chất hòa tan được và tồn tại trong bia đều là những dẫn xuất của catechin
thuộc nhóm flavonid. Những hợp chất này dễ dàng kết hợp protit cao phân tử để
tạo phức chất dễ kết lắng, làm tăng độ bền keo của sản phẩm. Tuy nhiên sự hòa
tan của polyphenol vào d ịch đ ường lại là nhân tố làm x ấu đi hương vị của bia.
Chất chát và chất đắng trong đại mạch thuộc nhóm lipoid là nhân tố chính
gây ra vị đắng khó chịu cho bia. Hầu hết các chất đắng, chất chát, p olyphenol và
các chất màu của hạt được phân bố chủ yếu ở lớp vỏ, muốn loại trừ chúng thì
ngâm hạt trong môi trường kiềm nhẹ.
 Fitin
Fitin là muối đồng thời là của canxi và magie với acid inozitphosphoric
C6H 6O6(H2PO 3)6. Chúng tập trung chủ yếu ở lớp vỏ và chiếm 0,9% chất khô của
vỏ. Khi bị thủy phân sẽ tạo thành inozit C6H6(OH)6 và acid phosphoric. Hợp
chất cuối cùng này là nguồn cung cấp phospho cho nấm men, đồng thời làm
tăng độ chua tác dụng của dịch cháo ở giai đoạn đường hóa.
 Vitamin
Trong đại mạch có nhiều loại Vitamin B1, B2, B6, C, tiền vitamin A, E,
acid pantotenic, biotin, acid pholievic và nhiều dẫn xuất vitamin khác. Mặc dù
chiếm tỷ lệ ít nhưng chúng có vai trò rất quan trọng trong công nghệ sản xuất
malt vì chúng là nhân tố điều hòa sinh trưởng của mầm.
 Chất khoáng
Các chất khoáng trong đại mạch đóng vai trò quan trọng trong quá trình
sản xuất malt và bia đặc biệt là phospho vì nó đóng vai trò chủ yếu trong việc
hình thành hệ thống đệm của dịch đường.
1.3.5. Ch ất béo và lipid
Hàm lượng chất béo và lipoid trong hạt đại mạch giao động trong khoảng
2,5 - 3% lượng chất khô của hạt. Chúng tập trung chủ yếu ở phôi và lớp alơron.
SVTH: Lưu Thị Liên Trang 29 Lớp: 08s2
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
Chúng là những dầu béo m àu vàng - cà phê nhạt, có mùi thơm rất nhẹ và dễ
chịu. Thành phần chủ yếu của các loại dầu béo.
Thành phần chủ yếu của các loại chất béo trong đại mạch là este của
glyxerin với các acid béo bậc cao. Ở giai đoạn ươm mầm một phần chất béo và
lipoid bị thủy phân bởi enzyme lipaza, m ột số sản phẩm thủy phân được chuyển
đến phôi để nuôi cây non, số còn lại tồn tại trong dịch đường hoặc bị thải ra
ngoài theo bã malt.
Chất béo và lipoid tồn tại trong bia sẽ làm giảm độ bền keo của sản phẩm.
1.3.6. Enzyme
Enzyme là những hợp chất hữu cơ có hoạt tính sinh học rất cao, có cấu
tạo phân tử rất phức tạp và giữ vai trò đặc biệt trong công nghệ sản xuất bia.
Trong hạt đại mạch có chứa một lượng enzyme khá phong phú, chúng được xếp
vào hai nhóm: nhóm enzym e thủy phân và nhóm enzyme oxi hóa khử.
 N hóm enzyme thủy phân (Hydrolaza)
 Cacbohydraza
Nhóm enzyme này thủy phân các glucoxit cao phân tử thành các sản
phẩm thấp phân tử hơn. Trong nhóm này có chia nhóm nhỏ là polyaza và
hexozidaza.
- H exozidaza là những enzyme tham gia xúc tác thủy phân disacharide,
trisacharide và một số glucozid khác thành các đường đơn.
- Polyaza là những enzym e thủy phân gluxit cao phân tử amylaza
(diastaza) và sitaza.
+Amylaza phân cắt tinh bột thành các sản phẩm dạng đường và dextrin.
Amylaza bao gồm hai enzyme là  - amylaza và β - amylaza.
* Enzim  - amylaza phân cắt các tinh bột thành glucoza và dextrin làm
cho độ nhớt của dịch cháo nhanh chóng giảm xuống, chúng chỉ được hoạt hóa
trong giai đoạn ngâm và ươm m ầm. Là enzyme chịu nhiệt tốt nhất, nhiệt độ tối
thích là 700C, pH=5,7.
* Enzim β - amylaza tác động trực tiếp lên mạch amyloza, mạch nhánh và
hai đầu mạch chính của amylopectin. Sản phẩm của quá trình phân cắt này là
đường maltoza và dextrin. Nhiệt độ thích hợp cho enzyme hoạt động là 630C,
pH = 4.7.
+ Sitaza gồm hai enzyme sitolactaza và sitolitaza. Enzyme đầu thủy phân
hemixelluloza thành các sản phẩm trung gian, còn enzyme sau thủy phân các sản
phẩm trung gian thành các sản phẩm cuối cùng là pentoza và hexoza. Nhờ có
quá trình phân cách này mà tế bào mới bị phá hủy tạo điều kiện thuận lợi cho
các enzyme khác xâm nhập vào và nâng cao hoạt lực.
 Proteaza
Thủy phân các sản phẩm trung gian và một số trong các chất này tiếp tục
bị phân cách đến các sản phẩm cuối cùng là acid amin và amoniac NH3.


SVTH: Lưu Thị Liên Trang 30 Lớp: 08s2
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
Proteinaza thúy phân thành albumoza và pepton, chúng tiếp tục bị phân cắt
thành peptit, polypeptid. Enzyme hoạt động tốt ở pH = 4.6 - 5.0 và nhiệt độ là
500C.
Peptidaza gồm hai enzyme d ipeptidaza và polypeptidaza, chúng tác động
lên dipeptid và polypeptid để phân cắt chúng thành acid amin. Enzyme này hoạt
động mạnh nhất ở pH = 7.5 và nhiệt độ là 50 - 520C. Nếu pH < 5 enzyme này
trở thành vô hoạt.
Amidaza cắt nhóm amin khỏi acid amin để tạo thành acid hữu cơ và giải
phóng NH 3. Chúng có thể phá vỡ liên kết peptid (- CO -NH-) của các amin để
phá hủy chúng.
 Esteraza
Enzyme này phân cắt mối liên kết este giữa các hợp chất hữu cơ khác
nhau hoặc các hợp chất hữu cơ và vô cơ. Chúng chia làm hai nhóm: lipaza và
pho spataza.
- Lipaza phá vỡ liên kết este giữa rượu đơn hoặc đa chức với các acid bậc
cao. Enzyme này được phân bố chủ yếu ở phôi và lớp alơron, nhiệt độ tối ưu cho
hoạt động là 350C, pH = 5.
- Amilophosphataza tham gia hỗ trợ thủy phân tinh bột, chúng cắt mối
liên kết este của acid phosphoric trong phân tử amylopectin nhờ vậy mà tinh bột
được hồ hóa một cách dễ dàng. Nhiệt độ tối ưu là 700C, pH = 5,6.
- Fitaza có chức năng phá vỡ liên kết este giữa acid phosphoric với inozit, tức là
chúng tham gia thủy phân fitin. Quá trình này đóng vai trò quan trọng vì H3PO4
được giải phóng sẽ làm tăng độ chua tác dụng và tăng cường lực đệm của dịch
đường.
 N hóm enzyme oxy hóa khử (Decmolaza)
Nhóm enzym e này xúc tác phản ứng oxy hóa khử của quá trình hô hấp và
phân giải yếm khí gluxit, nghĩa là chúng tham gia trực tiếp vào quá trình trao đổi
chất của tế bào.
Nhóm enzyme này đóng vai trò quyết định trong việc hoạt hóa và phát
triển của phôi ở giai đoạn ươm mầm.
Một số enzym e khác trong nhóm này còn tham gia vào phản ứng oxy hóa
khử các hợp chất poliphenol, protein và các hợp chất khác vì vậy chúng đã gây
ảnh hưởng gián tiếp đến các chỉ số chất lượng của dịch đường và bia thành
phẩm tiêu biểu là dehidraza, oxydaza và catalaza.
1.3.7. Yêu cầu về chất lượng
Malt dùng đ ể sản xuất bia phải đảm bảo các yêu cầu sau:
- Sạch, có mùi thơm đ ặc trưng, có vị ngọt, màu vàng sáng đồng đều.
Không được có mùi vị lạ, không mốc, không hôi khói.
- Kích thước hạt malt phải đồng đều: hạt trên sàng 2,8 mm và chiếm 94%,
hạt dưới sàng 2,2 mm không quá 0,5%.
- Khối lượng riêng của malt: 520 ÷ 600 g/l

SVTH: Lưu Thị Liên Trang 31 Lớp: 08s2
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
- Độ ẩm của malt không quá 6%
- Malt có thời gian đường hoá 10 ÷ 35 phút, hoạt lực amylaza là 100 ÷
300 đơn vị.
Malt sau khi nhập từ nước ngoài về đ ược bảo quản trong kho với thời
gian dự trử sản xuất khoảng một tháng.
1.2. Nguyên liệu thay thế đại mạch
1.2.1. Giới thiệu chung về nguyên liệu thay thế




Hình 1.14. Nguyên liệu thay thế

Ngoài đ ại mạch là nguyên liệu chủ yếu được dùng trong sản xuất thì trong
công nghiệp sản xuất bia người ta còn đưa ra m ột số nguyên liệu khác để thay
thế.
Mục đích:
- Giảm giá thành sản phẩm.
- Cải thiện một vài tính chất của sản phẩm.
- Tạo ra chủng loại bia có mức độ phẩm chất khác nhau.
- Đáp ứng yêu cầu đơn đặt hàng của người tiêu dùng.
Các lo ại nguyên liệu thay thế có thể được chia làm hai nhóm: nhóm dạng
hạt và nhóm dạng đường.
Nhóm dạng hạt thường là các hạt thường loại cốc dùng để thay thế malt
đại mạch chủ yếu là gạo, ngô, tiểu mạch…Các loại hạt này thường đưa vào chế
biến cùng với bột malt d ưới dang bột nghiền mịn.
Nhóm dạng đường thường là đường saccharoza và glucoza. Đường
saccharoza có nhiều trong mía và củ cải đường, lượng saccharoza đưa vào thay
thế không quá 20% so với lượng chất khô đã được trích ly từ malt vào d ịch
đường. Hai loại đường này đưa vào sử dụng ở dạng hạt tinh luyện. Còn đ ường
glucoza (đường thủy phân) thu nhận bằng cách thủy phân tinh bột khoai tây
hoặc tinh bột ngô bằng acid sau đó trung hòa ,lọc, cô chân không đến 77 - 84%
chất khô. Lượng đường thủy phân thường dùng là 10 - 15%.

SVTH: Lưu Thị Liên Trang 32 Lớp: 08s2
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
1.2.2. Vai trò của nguyên liệu thay thế
Thực tế hiện nay th ì có nhiều nhà máy bia sử dụng nguyên liệu thay thế là
gạo điển hình là nhà máy bia Tân Hiệp Phát với tỷ lệ malt/gạo là 8/2.G ạo được
coi là thế liệu hàng đầu trong sản xuất bia do hàm lượng gluxit và protein khá
cao, khả năng chuyển hóa thành chất hòa tan tốt (có thể đạt đến 90% chất khô).
1.2.3. Đặc tính của nguyên liệu thay thế
Cũng giống như malt đại mạch hạt khác bao gồm các bộ phận : Vỏ trấu,
vỏ hạt, vỏ quả, lớp alơron, nội nhủ và phôi. Trong thành phần chất khô của gạo
thì tinh bột chiếm 75% protein 8% , chất béo 1 - 1,5%, xenluloza 0,5- 0 ,8%, chất
khoáng 1- 1,2% .
Qua thành phần của gạo ta thấy hàm lượng tinh bột cao, protein ở mức
vừa phải còn chất béo và xenluloza ở giới hạn thấp vì vậy có thể nói gạo là một
loại nguyên liệu thay thế khá lý tưởng cho việc sản xuất bia với lượng gạo thay
thế đến 20% hoàn toàn có thể sản xuất được các loại bia có chất lượng hảo hạng.
1.2.4. Yêu cầu chất lượng của nguyên liệu thay thế
Màu sắc đồng nhất .
Không có hạt mốc,không có mùi lạ.
Tỉ lệ tạp chất < 2%.
Hàm lượng tinh bột > 65%.
Hàm lượng protein 8%.
Chất béo 1,9%.
Xenluloza 0,9%.
Độ hòa tan 79 - 80%.
1.3. Nước
1.3.1. Vai trò của nước trong công nghệ sản xuất bia
Nước có vai trò quan trọng nó ảnh
hưởng đến chất lượng của bia đặc biệt là
hương vị của thành phẩm. Với một tỷ lệ
lớn 77- 90% trong bia thành phẩm, nước
được xem là một trong những nguyên liệu
chính để sản xuất bia vì hàm lượng các
chất hòa tan trong dung dịch đường trước
lúc lên men là 10 – 13% trọng lượng đối
với bia vàng và 16 –22% ở bia đen.


Hình 1.15. Nước
1.3.2. Nước sử dụng trong nhà máy bia
 N ước dùng để ngâm đại mạch
Yêu cầu quan trọng nhất đối với nước dùng đ ể ngâm đại mạch là không
chứa nhiều tạp chất hữu cơ và vi sinh vật. Mặc dù khi đại mạch đưa vào thùng
SVTH: Lưu Thị Liên Trang 33 Lớp: 08s2
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
ngâm không được sạch lắm song vi sinh vật trong nước gây tác dụng xấu đối với
dại mạch nhanh hơn nhất là trong thời gian hạt bắt đầu trương nở.
Ảnh hưởng của thành phần các muối trong nước đối với quá trình ngâm
đại mạch qua hai chiều hướng: hòa tan các chất trong vỏ hạt và sau đó các muối
hòa tan ngấm vào bên trong hạt. Muối trong nước ảnh hưởng đến những quá
trình bên trong thời kì bắt đầu này mầm. Qua đó cho thấy ảnh hưởng của muối
đến quá trình ngâm hạt rất phức tạp. Do đó nước dùng đ ể ngâm đại mạch phải là
nước mềm với môi trường acid yếu (pH = 6 – 7) riêng trong bước rửa hạt nên
dùng nước có độ cứng tạm thời cao.
Nếu nước có nhiều sắt và mangan nên loại bỏ bớt trước khi ngâm vì nó
ảnh hưởng xấu trực tiếp đến hạt. Để rửa hạt tốt hơn và sát trùng nhiều trường
hợp người ta cho thêm Ca(OH)2 vào nước ngâm.
 N ước dùng để sản xuất dịch đ ường
Thành phần và tính chất của nước ảnh hưởng đến mùi vị và một vài tính
chất của bia. Các biacacbonat và cacbonat trong nước sẽ hòa tan những chất
đắng trong vỏ malt tạo vị đắng khó chịu cho dịch đường và bia đặc biệt là
NaCO 3 và NaHCO 3. Tất cả b icacbonat và cacbonat có trong nước dùng để chế
biến dịch đường đều làm kém chất lượng của thành phẩm vì chúng có ảnh
hưởng xấu đến các quá trình hồ hóa và đường hóa.
 N ước dùng để rửa men và thiết bị
Giống như nước d ùng để ngâm đại mạch, nước dùng để rửa men và thiết
bị đòi hỏi phải sạch không chứa nhiều tạp chất hữu cơ và vi sinh vật. Đặc biệt
các vi sinh vật và vi khuẩn có ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình sản xuất bia,
nên phải dùng thường xuyên kiểm tra bằng kính hiển vi, nếu lượng này nhiều
quá phải sát trùng nước.
Nước dùng để rửa thiết bị không được chứa NH3 các nitrit, nên dùng nước
có độ cứng thấp đến độ cứng trung bình. Các cơ sở làm bia thường d ùng hơi
nước trực tiếp để gia nhiệt phải đảm bảo hơi nước đạt chất lượng thực phẩm.
1.3.3. Yêu cầu chất lượng của nước đối với công nghệ sản xuất bia
Nước dùng trong lên men nói chung phải đạt tiêu chuẩn dùng cho nước
uống, không có mùi vị lạ, không màu, trong suốt, đặc biệt không cho phép có
mùi amoniac, vết của kim loại nặng (thủy ngân, bari…).




SVTH: Lưu Thị Liên Trang 34 Lớp: 08s2
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
Chỉ tiêu Yêu cầu
Mùi vị Tinh khiết, không mùi
Độ đục 1 – 9%
pH 6.8 – 7.2
Độ mặn 11.7 mg/l
Độ cứng tạm thời 0.72 mg/l
Độ cứng vĩnh cửu 0.26 – 0.72 mg/l
≤ 4.0 (0F)
Độ kiềm tổng
≤ 5.0 (0F)
Độ cứng tổng cộng
Hàm lượng muối CO32-
Đề thi vào lớp 10 môn Toán |  Đáp án đề thi tốt nghiệp |  Đề thi Đại học |  Đề thi thử đại học môn Hóa |  Mẫu đơn xin việc |  Bài tiểu luận mẫu |  Ôn thi cao học 2014 |  Nghiên cứu khoa học |  Lập kế hoạch kinh doanh |  Bảng cân đối kế toán |  Đề thi chứng chỉ Tin học |  Tư tưởng Hồ Chí Minh |  Đề thi chứng chỉ Tiếng anh
Theo dõi chúng tôi
Đồng bộ tài khoản