ENZYEME GIỚI HẠN

Chia sẻ: Tho Thi Vi Anh Tho | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:12

0
254
lượt xem
46
download

ENZYEME GIỚI HẠN

Mô tả tài liệu
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Sư sống đã xuât́ hiện trên trái đất hàng ngàn hàng triệu năm trươc và kèm theo là nhưng quá trình trao đổi chất diễn ra một cách liên tục tư đơn giản đến phưc tạp, tư mưc độ thấp đến mưc độ cao.để thưc hiện quá trình trao đổi chất hàng ngaǹ , haǹ g vaṇ cać phan̉ ưng hoá hoc̣ phưc tap̣ diêñ ra môṭ cać h liên tuc̣ , nhịp nhàng liên quan chặt chẽ đến nhau, điều chỉnh lẫn nhau ơ trong tưng tê ́ bào, tưng cơ thể sôń g. Cać quá hoá hoc̣ đó tiêń haǹ h vơi tôć...

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: ENZYEME GIỚI HẠN

  1. Enzyme giới han (Restriction Enzyme –RE) ̣ SV:Vi Thị Thơ 40cnsh 1. MỞ ĐÂU ̀ Sư sông đã xuât hiên trên trai đât hang ngan hang triêu năm trươc và kem ́ ́ ̣ ́ ́ ̀ ̀ ̀ ̣ ̀ theo là nhưng quá trinh trao đôi chât diên ra môt cach liên tuc tư đơn gian đên ̀ ̉ ́ ̃ ̣ ́ ̣ ̉ ́ phưc tap, tư mưc độ thâp đên mưc độ cao.để thưc hiên quá trinh trao đôi chât ̣ ́ ́ ̣ ̀ ̉ ́ hang ngan , hang van cac phan ưng hoa hoc phưc tap diên ra môt cach liên tuc, ̀ ̀ ̀ ̣ ́ ̉ ́ ̣ ̣ ̃ ̣ ́ ̣ nhip nhang liên quan chăt chẽ đên nhau, điêu chinh lân nhau ơ trong tưng tế ̣ ̀ ̣ ́ ̀ ̉ ̃ bao, tưng cơ thể sông. Cac quá hoa hoc đó tiên hanh vơi tôc độ mau lẹ phi ̀ ́ ́ ́ ̣ ́ ̀ ́ thương nhưng lai hai hoa,cân đôi vơi sư tham gia cua cac chât xuc tac tư nhiên ̣ ̀ ̀ ́ ̉ ́ ́ ́ ́ hay con goi là cac chât xuc tac sinh hoc. Là chât xuc tac sinh hoc vơi ban chât là ̀ ̣ ́ ́ ́ ́ ̣ ́ ́ ́ ̣ ̉ ́ protein enzyme có tinh xuc tac sinh hoc đăc hiêu rât cao và hiêu lưc xuc tac rât ́ ́ ́ ̣ ̣ ̣ ́ ̣ ́ ́ ́ lơn. Pavlov đã noi : “hoat đông cua enzyme là biêu hiên đâu tiên cua sư sông, ́ ̣ ̣ ̉ ̉ ̣ ̀ ̉ ́ không có sư sông nao lai không có quá trinh tac đông cua enzyme ’’. ́ ̀ ̣ ̀ ́ ̣ ̉ Và enzyme có nhiêu loai môi loai có môt biêu hiên và chưc năng hoat ̀ ̣ ̃ ̣ ̣ ̉ ̣ ̣ đông riêng cua no. Enzyme giơi han cung vây , là nhưng enzyme có măt trong ̣ ̉ ́ ̣ ̃ ̣ ̣ tế bao Enzyme giơi han là đai diên quan trong cua môt trong nhưng enzyme ̀ ̣ ̣ ̣ ̣ ̉ ̣ ̀ ́ dung trong thao tac DNA.
  2. Enzyme giới han (Restriction Enzyme –RE) ̣ SV:Vi Thị Thơ 40cnsh ̣ 2. NÔI DUNG 2.1. Lich sử ,Phân loai ̣ ̣ Enzyme han chế (Restriction Enzyme _RE) là Enzyme thuôc nhom ̣ ̣ ́ Enzyme endonuclease. Enzyme hạn chế được phát hiện vào năm 1970, chúng tồn tại trong tế bào vi khuẩn, có tác dụng cắt DNA ngoại lai (ví dụ: DNA của phage) tại nhưng điểm xác định, để tiêu diệt DNA này. Năm 1978, Arber (Thụy Sĩ), Nathans (Mỹ) và Smith (Mỹ) đã được nhận Giải Nobel nhơ phát hiện ra enzyme hạn chế và nhưng ưng dụng của chúng để giải quyết nhiều vấn đề quan trọng của sinh học phân tử. Các enzyme này là nhưng “chiếc kéo phân tử” có thể cắt DNA thành nhưng đoạn xác định, đã mơ ra một thơi kỳ phát triển mơi của sinh học hiện đại-Thơi kỳ thao tác gen. Chất xúc tác sinh học, là các phân tử sinh học có bản chất protein đóng vai trò chất xúc tác cho các phản ưng biến đổi hóa sinh. Hiện nay, ngươi ta đã tìm thấy hơn 900 enzyme hạn chế khác nhau tư khoảng 250 chủng vi sinh vật. Các enzyme hạn chế có ba loại (type): I, II và III. Loại I.Vị trí cắt năm ngoai trinh tư nhân biêt môt khoang không nhât đinh ̀ ̀ ̀ ̣ ́ ̣ ̉ ́ ̣ cách xa vị trí nhận biết khoảng 1000 – 5000 base. Do không có tinh đăc hiêú ̣ trong căt đoan nên san phâm cua nó không đông nhât và không phat hiên được ́ ̣ ̉ ̉ ̉ ̀ ́ ́ ̣ băng điên di trên gen. Điêu kiên cân để căt là có ATP,Mg++, S-AdolMet, ̀ ̣ ̀ ̣ ̀ ́ Loại II: enzym giơi hạn nhận biết vị trí giơi hạn và cắt ngay tại đó. Loại này được sử dụng phổ biến nhất trong nghiên cưu hiện nay.Điêu kiên cân để căt là ̀ ̣ ̀ ́ có Mn++, Mg++ Loại III: enzym giơi hạn nhận biết vị trí giơi hạn và cắt ơ vị trí cách đó khoảng 10-20 nucleotit về trươc. và tao ra môt số đâu căt khăc nhau. . Điêu ̣ ̣ ̀ ́ ́ ̀ kiên cân để căt là có Mg++, S-AdolMet, ̣ ̀ ́ Các enzyme được dùng phổ biến hiện nay thuộc type II, có cơ chế tác động đơn giản nhất. Đây là các nuclease cắt ơ một vị trí đặc hiệu nằm bên trong sợi DNA (chư không phân hủy DNA tư hai đầu), nên được gọi là endonuclease. Tên gọi đầy đủ của chúng là các restriction endonuclease type II, hay được gọi đơn giản là enzyme hạn chế (restriction enzyme, RE).
  3. Enzyme giới han (Restriction Enzyme –RE) ̣ SV:Vi Thị Thơ 40cnsh ̣ ̉ 2.2. Đăc điêm 2.2.1.Cách gọi tên Cách gọi tên các enzyme hạn chế dưa trên các qui ươc quốc tế : E Escherichia (giống) co coli (loài) R RY13 (chủng) I First identified Order ID'd in bacterium Enzym giơi hạn được gọi tên dưa vào vi khuẩn mà chúng được phân lập theo cách dươi đây Tên chi và tên loài của sinh vật, mà ơ đó tìm thấy enzyme, được dùng để đặt cho phần đầu của tên enzyme (viết nghiêng) bao gồm: chư thư nhất của tên chi và hai chư đầu của tên loài. Ví dụ: enzyme được tách chiết tư vi khuẩn Escherichia coli thì có tên là Eco, còn enzyme được tách chiết tư vi khuẩn Bacillus globigii thì viết là Bgl…Ngoài ra, tên gọi enzyme hạn chế còn được bổ sung thêm phần sau (viết thẳng), tùy thuộc vào chủng vi khuẩn liên quan và tùy thuộc vào sư có mặt hay không của các yếu tố ngoài nhiễm sắc thể. Ví dụ: RI trong enzyme Ecori có nghĩa như sau: R là viết tắt của chủng RY13, I là bậc xác định đầu tiên trong vi khuẩn (first identified order in bacterium). Giá trị của enzyme hạn chế là ơ tính đặc hiệu của chúng. Các enzyme này cắt DNA ơ các vị trí nhận biết riêng biệt bao gồm tư 4-6 cặp nucleotide có trình tư đối xưng đảo ngược nhau, các đoạn ngắn này gọi là palindrome (đoạn đối xưng: là đoạn DNA có hai sợi hoàn toàn đối xưng giống hệt nhau nếu lật ngược đầu đuôi).Ví dụ: enzyme ecori nhận biết chuỗi hexanucleotide (6 nucleotide): Giống như ecori, nhiều enzyme hạn chế đã tạo ra các đoạn DNA vơi đầu lồi (protruding) 5’. Một số enzyme hạn chế khác (ví dụ: psti) tạo ra các đoạn DNA có đầu lồi 5’. Trong khi đó, một số enzyme hạn chế (ví dụ: smai) lại cắt ơ trục đối xưng để tạo ra các đoạn DNA mang đầu bằng (DNA Mạch đôi có hai đầu sợi đơn bằng nhau)
  4. Enzyme giới han (Restriction Enzyme –RE) ̣ SV:Vi Thị Thơ 40cnsh ̣ ̣ 2.2.2,Hoat đông ̀ ̣ ̣ ̣ a, Điêu kiên hoat đông: Sư hoat đông cua cac Enzyme giơi han chiu anh hương cua cac yêu tố như: ̣ ̣ ̉ ́ ̣ ̣ ̉ ̉ ́ ́ • Anh hương của nhiệt độ: Đa số các chất enzym ơ động vật có hoạt độ ̉ cao nhất ơ điều kiện thân nhiệt (37 - 400C). sư tăng nhiệt độ ơ giơi hạn thích hợp (35 - 500C) Có tác dụng kích thích hoạt động của enzym tưc là kích thích quá trình trao đổi vật chất. Sốt là phản ưng bảo vệ cơ thể chống lại sư xâm nhập của vi trùng, thưc chất là tăng cương sư hoạt động của các loại Enzyme . • Anh hương của pH: Môi loai Enzyme giơi han khac nhau có độ pH thich ̉ ̃ ̣ ̣ ́ ́ hợp khac nhau. ́ • Anh hương của nồng độ Enzyme và cơ chất: Ngươi ta dùng hằng số ̉ Michaelis- Men ten để biểu diễn trạng thái phân ly của ES. • Anh hương cua cac chât kim ham :chât kim ham canh tranh và chât kim ̉ ̉ ́ ́ ̀ ̃ ́ ̀ ̃ ̣ ́ ̀ ̃ ̣ ham không canh tranh.
  5. Enzyme giới han (Restriction Enzyme –RE) ̣ SV:Vi Thị Thơ 40cnsh • Anh hương cua cac ion kim loai : Môi ion kim loai hoat hoa cho môt ̉ ̉ ́ ̣ ̃ ̣ ̣ ́ ̣ Enzyme xuc tac môt phan ưng nhât đinh. ́ ́ ̣ ̉ ́ ̣ • Phan ưng cua Enzyme giơi han thưc hiên trong môt thể tich cang nhỏ ̉ ̉ ̣ ̣ ̣ ́ ̀ cang đam bao cho Enzyme giơi han tiêp xuc vơi cơ chât cang tôt hiêu ̀ ̉ ̉ ̣ ́ ́ ́ ̀ ́ ̣ quả phan ưng cang cao. Enzyme giơi han không mang tinh đăc hiêu loai , ̉ ̀ ̣ ́ ̣ ̣ ̀ có thể nhân biêt và căt DNA cua tế bao đông vât, thưc vât hay vi sinh vât ̣ ́ ́ ̉ ̀ ̣ ̣ ̣ ̣ ơ trinh tư 6 căp nucleotide . ̀ ̣ • Số lượng, kich thươc đoan căt phụ thuôc vao số vị trí giơi han trên môi ́ ̣ ́ ̣ ̀ ̣ ̃ phân tử DNA và đăc điêm nhân biêt đăc trưng cua môi loai Enzyme giơi ̣ ̉ ̣ ́ ̣ ̉ ̃ ̣ ̣ han . b, Vị trí điêm căt Enzyme giơi hạn chỉ cắt các trình tư lặp đối xưng khi đọc ̉ ́ theo chiều 5´-3´ trên mạch DNA (palindrome) gọi là trình tư nhận biết. Vị trí điểm cắt của enzyme giơi hạn có thể nằm trong hoặc ngoài trình tư nhận biết này. *Enzyme căt DNA tai trinh tư đăc hiêu và chung căt câu nôi đông hoa trị ́ ̣ ̀ ̣ ̣ ́ ́ ̀ ́ ̀ ́ trong môt chuôi , câu nôi hydrogen giưa hai chuôi ̣ ̃ ̀ ́ ̃ *Vị trí nhân biêt cua Enzyme : Môi Enzyme nhân biêt và căt DNA tai môt ̣ ́ ̉ ̃ ̣ ́ ́ ̣ ̣ trinh tư đăc biêt là Restriction. Enzyme có thể nhân biêt 4-6 hoăc 8 căp base , ̀ ̣ ̣ ̣ ́ ̣ ̣ trinh tư lăp đao là palindromicsequece. ̀ ̣ ̉ Ví dụ: enzyme EcoRI nhân biêt chuôi 6 nuclease, enzyme HaeIII nhận ̣ ́ ̃ biết chuỗi 4 nucleotid : Restriction endonuclease EcoRI có trinh tư nhận biết : ̀ ê ----G--A--A--T--T--C----- → - -----G A--A--T--T--C ----- - ---C--T--T--A--A--G----- → - -----C--T--T--A--A G-----
  6. Enzyme giới han (Restriction Enzyme –RE) ̣ SV:Vi Thị Thơ 40cnsh - - MboI và Sau3AI cùng nhân biêt trình tư: ̣ ́ BamHI nhân biêt trình tư: ̣ ́
  7. Enzyme giới han (Restriction Enzyme –RE) ̣ SV:Vi Thị Thơ 40cnsh ́ ́ C,Cach căt :
  8. Enzyme giới han (Restriction Enzyme –RE) ̣ SV:Vi Thị Thơ 40cnsh Enzyme han chế có thể căt theo 2 cach: ̣ ́ ́ • Các đâu dinh (cohesive ends) , còn gọi là đầu lồi hay đầu so le. Cac ̀ ́ ́ Enzyme nay gôm 2 loai là Enzyme căt tao đâu sole 5’ cuôi có đâu 5 dai ̀ ̀ ̣ ́ ̣ ̀ ́ ̀ ̀ hơn mach đơn đâu 3’(Ví dụ : EcoRI, BamHI…) và Enzyme căt tao đâu 3’ ̣ ̀ ́ ̣ ̀ cuôi dai hơn mach đơn đâu 5’(Ví du: kpnI,PacI…). Cac Enzyme nay Có ́ ̀ ̣ ̀ ̣ ́ ̀ thể băt căp ngược trơ lai . Ví dụ: đầu dính được tạo ra nhơ PstI ́ ̣ ̣ • Các đâu băng (blunt ends) , còn gọi là đầu thô. Môt số Enzyme căt hai ̀ ̀ ̣ ́ mach DNA tai cung môt điêm. Sau khi căt đâu băng không có khả năng ̣ ̣ ̀ ̣ ̉ ́ ̀ ̀ kêt hợp lai. Ví dụ: đầu bằng được tạo ra nhơ HaeIII ́ ̣
  9. Enzyme giới han (Restriction Enzyme –RE) ̣ SV:Vi Thị Thơ 40cnsh Dung enzyme DNA ligase cua phage T4 có thể gắn lai cac đâu dinh hoăc ̀ ̉ ̣ ́ ̀ ́ ̣ đâu băng. Tuy nhiên, trương hợp đâu băng thương cho hiêu quả thâp vì thế ̀ ̀ ̀ ̀ ̣ ́ ngươi ta có thể dung cac biên phap khac như: Găn vào đầu bằng môt đoan bổ ̀ ́ ̣ ́ ́ ́ ̣ ̣ sung để tao ra đâu dinh hay dung terminal transferase. Enzyme nay sẽ tao ơ đầu ̣ ̀ ́ ̀ ̀ ̣ 3’ của DNA sợi đôi môt homopolymer.s ̣ Sơ đồ:Quá trinh nôi cac đâu căt bơi Enzyme giơi han ̀ ́ ́ ̀ ́ ̣
  10. Enzyme giới han (Restriction Enzyme –RE) ̣ SV:Vi Thị Thơ 40cnsh 2.4,Ứng dung: ̣ Ưng dung trong kỹ thuât gene : xuc tac tông hợp DNA ,RNA hay phân căt ̣ ̣ ́ ́ ̉ ́ acid nucleic có vai trò quan trong trong kỹ thuât tinh sach DNA , RNA trong kỹ ̣ ̣ ̣ thuât phiên mã ngược tao cDNA. ̣ ̣ Sử dung trong phương phap Northern blotting xác định các đoạn RNA ̣ ́ đặc biệt vơi nhiêm vụ căt phân tử DNA : ̣ ́         Ưng dung trong thiêt lâp ban đồ căt giơi han :cac Enzyme giơi han ̣ ́ ̣ ̉ ́ ̣ ́ ̣ căt khu vưc bên trong cua phân tử DNA tai môt trinh tư nucleotide nhât đinh ́ ̉ ̣ ̣ ̀ ́ ̣ và tao hôn hợp cac đoan DNA vơi kich thươc khac nhau. Chung nhân biêt ̣ ̃ ́ ̣ ́ ́ ́ ̣ ́ nhưng trinh tư ngăn cua DNA và căt dung vao vị trí phân chia , cac Enzyme ̀ ́ ̉ ́ ́ ̀ ́ giơi han khac nhau có đoan nhân biêt vơi nhưng trinh tư base đăc trưng khac ̣ ́ ̣ ̣ ́ ̀ ̣ ́ nhau . Sơ đồ mô tả cac vị trí căt khac nhau cua phân tử DNA là ban đồ căt giơi ́ ́ ́ ̉ ̉ ́ han. Ví dụ ta muôn lâp ban đồ căt giơi han cua cac Enzyme BamHI, EcoRI đôi ̣ ́ ̣ ̉ ́ ̣ ̉ ́ ́
  11. Enzyme giới han (Restriction Enzyme –RE) ̣ SV:Vi Thị Thơ 40cnsh vơi đoan DNA dai 15kb kêt quả thu được là nêu chỉ dung môt loai Enzyme thì ̣ ̀ ́ ́ ̀ ̣ ̣ DNA chỉ được căt lam 2 đoan vơi kich thươc 14-1 kb ơ BamHI, 12-3 kb ơ EcoRI, nhưng ́ ̀ ̣ ́ nêu căt băng cach phôi hợp 2 loai Enzyme thì DNA có thể bị căt thanh 3 đoan ́ ́ ̀ ́ ́ ̣ ́ ̀ ̣ khac nhau về kich thươc. ́ ́ Enzyme giơi han kêt hợp voi Enzyme nôi tao vector tai tổ hợp: Kêt quả ̣ ́ ́ ́ ̣ ́ ́ hoat đông cua enzyme han chế phụ thuôc rât nhiêu vao độ sach cua DNA. Cac ̣ ̣ ̉ ̣ ̣ ́ ̀ ̀ ̣ ̉ ́ chế phâm DNA con lân đêm chiêt, phenol hoăc EtOH sẽ lam giam chât lượng ̉ ̀ ̃ ̣ ́ ̣ ̀ ̉ ́ ̣ ̣ ̉ hoat đông cua enzyme 3.KẾT LUẬN Hầu hết các phân tử ADN trong tư nhiên đều lơn hơn nhiều so vơi kích thươc có thể thao tác và phân tích một cách thuận lợi trong phòng thí nghiệm. Trong các tế bào, phần lơn các nhiễm sắc thể thương là một phân tử ADN dài chưa hàng trăm thậm trí hàng nghìn gen khác nhau. Vì vậy, để có thể phân lập và phân tích tưng gen, ngươi ta phải cắt các phân tử ADN kích thươc lơn thành các phân đoạn nhỏ. Và Enzyne giơi hạn giư vai trò quan trọng trong công việc thao tác vơi gene. Quá trình nghiên cưu Enzyne giơi hạn ngày càng phát triển và có nhiều ưng dụng trong các công trình nghiên cưu khoa học cũng như trong thưc tế cuộc sống.
  12. Enzyme giới han (Restriction Enzyme –RE) ̣ SV:Vi Thị Thơ 40cnsh ̀ ̣ ̉ TAI LIÊU THAM KHAO 1. Chu Hoang Mâu -Cơ sơ và phương phap sinh hoc phân tử.NXB ĐAI ̀ ̣ ́ ̣ ̣ HOC SƯ PHAM,2005. ̣ ̣ 2. TS .Trân Thị Lê,Võ Văn Quang -Giao trinh hoa sinh thưc vât . NXB ̀ ̣ ́ ̀ ́ ̣ NÔNG NGHIÊP HÀ NÔI,2006. ̣ ̣ 3. Pham Thanh Hổ -Nhâp môn công nghệ sinh hoc. NXB GIAO DUC. ̣ ̀ ̣ ̣ ́ ̣ 4. Mai Xuân Lương -Giao trinh Enzyme .ĐAI HOC ĐÀ LAT. ́ ̀ ̣ ̣ ̣ 5. Mai Xuân Lương.-Kỹ thuât gen_nguyên lý và ưng dung. NXB KHOA ̣ ̣ HOC VÀ KỸ THUÂT. ̣ ̣ 6.Nguyên Hoang Lôc-Công nghệ DNA tai tổ hợp .Giao trinh điên tử. ̃ ̀ ̣ ́ ́ ̀ ̣ 7.Tài liệu trên mạng
Đồng bộ tài khoản