Giáo trình CƠ SƠ VÀ PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ - Chương 5

Chia sẻ: Doc Tai | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:17

Thêm vào BST

Báo xấu

225
lượt xem 70
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Chương 5: XÁC ĐỊNH MỐI LIÊN QUAN GIỮA PROTEIN VÀ ĐẶC TÍNH Ở SINH VẬT Tóm tắt: Protein lả sản phẩm biểu hiện gene, protein biểu hiện thành tính trạng và đặc tính ở sinh vật. Trong tế bào có nhiều loại protein chức năng quan trọng và những hiểu biết về đặc điểm của những protein này là cơ sở cho những ứng dụng vào công tác chọn giống và bảo vệ sức khoẻ con người. Những loại protein đề cập trong chương này là protein liên quan đến tính chống chịu của sinh vật và protein ức chế hoạt...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Giáo trình CƠ SƠ VÀ PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ - Chương 5

Chương 5: XÁC ĐỊNH MỐI LIÊN QUAN GIỮA PROTEIN VÀ ĐẶC TÍNH Ở SINH VẬT Tóm tắt: Protein lả sản phẩm biểu hiện gene, protein biểu hiện thành tính trạng và đặc tính ở sinh vật. Trong tế bào có nhiều loại protein chức năng quan trọng và những hiểu biết về đặc điểm của những protein này là cơ sở cho những ứng dụng vào công tác chọn giống và bảo vệ sức khoẻ con người. Những loại protein đề cập trong chương này là protein liên quan đến tính chống chịu của sinh vật và protein ức chế hoạt động ribosome. Xác định mốt liên quan giữa protein và tính trạng, đặc tính ở sinh vật lập thành các chỉ thị protein cho đặc tính và tính trạng. Các chỉ thị protein có thể là chỉ thị hàm lượng protein, enzyme, phân tử protein hay phổ isozyme và xác định các loại chỉ thị này được thực hiện theo quy trình kĩ thuật nhất định. Hàm lượng protem, đường và hoạt độ enzyme liên quan đến áp suất thẩm thấu trong tế bào và quan hệ với tính chống chịu của sinh vật. Có nhiều đặc tính và tính trạng của sinh vật được quan tâm nghiên cứu hiện nay là tính chống chịu của sinh vật và việc tìm ra các chỉ thị protein cho đặc tính này có ý nghĩa cao trong chọn tạo giống. Nội dung của chương gồm 6 vấn đề cơ bản: (1). Một số loại protein chức năng; (2). Quy trình xác định chỉ thị protein; (3). Kĩ thuật phân tích protein; (4). Kĩ thuật phân tích enzyme; (5). Kĩ thuật phân tích đường, (6). Nghiên cứu RIPs bằng Westem blot. §1. MỘT SỐ LOẠI PROTEIN CHỨC NĂNG 1.1. Protein liên quan đến tính chống chịu Khả năng chống chịu của sinh vật nói chung và của thực vật nói riêng liên quan đến cấu trúc và chức năng của các thành phần trong tế bào. Các vùng tế bào và các quá trình xảy ra trong mỗi vùng liên quan đến khả năng chịu hạn, nóng, mặn, phèn của thực vật (hình 5.1). 62
Hình 5.1. Chức năng của các vùng tế bào khi môi trường thiếu nước (theo Bohnert,Jensen, 1996 và Đinh Thị Phòng, 2001) Hình 5.2. Hoạt động của các gene liên quan đến sự mất nước và sự thay đổi áp suất thẩm thấu (theo Bray, 1993 và Trần Thị Phương Liên, 1999). 1.1.1. Protein sốc nhiệt (HSP) HSP có ở hầu hết các loài thực vật như: lúa mì, mạch, lúa gạo, ngô, đậu hành, tỏi.... chúng chiếm khoảng 1% protein tổng số trong lá của các loài thực vật này. HSP còn tìm thấy ở vi khuẩn và động vật bậc cao. HSP được tổng hợp khi tế bào gặp điều kiện cực đoan như hạn, nhiệt độ cao, độ muối cao. 63
HSP có thể chia làm 6 nhóm dựa trên cơ sở khối lượng phân tử khác nhau: MW 110, 90, 70, 60, 20, 8,5 kDa. Trong số đó có nhóm HSP70 và HSP60 có nhiều đại diện của chất môi giới phân tử (gọi là chaperonin). HSP8,5 hoa (ubiquytin) có chức năng bảo vệ cho tế bào nhưng không phải là môi giới phân tử. Ubiquytin có hoạt tính protease với chức năng phân giải các protein không có hoạt tính enzyme, ngăn chặn hiện tượng gây độc tế bào của những protein này. Ubiquytin có MW rất thấp, ít chịu ảnh hưởng của nhiệt độ nên ubiquytin có vai trò tự sửa chữa của tế bào khi gặp yếu tố cực đoan, đặc biệt là nhiệt độ. 1.1.2. Môi giới phân tử (MGPT) Theo Ellis (1997) MGPT là một nhóm gồm nhiều loại protein khác nhau, nhưng chúng đều có chức năng tham gia tạo cấu trúc không gian đúng cho protein trong tế bào. Chức năng của MGPT thể hiện ở những nội dung sau: - Giữ ổn định chuỗi polipeptit khi đang tổng hợp và tạo cấu trúc không gian đúng cho chúng. - Tạo lại cấu trúc không gian của protein sau khi vận chuyển qua màng tế bào. - Lắp giáp các chuỗi polipeptit vào phức để tạo cấu trúc bậc 4. - MGPT được tăng cường nhờ quá trình tổng hợp trong điều kiện cực đoan do nhu cầu cấp thiết của tế bào. Hoạt động của MGPT được thực hiện nhờ việc sử dụng năng lượng ATP. MGPT được nghiên cứu đầu tiên ở thực vật và liên quan đến enzyme Ribulose bisphotphat cacboxylase/oxygenelase (RUBISCO). RUBISCO xúc tác các phản ứng tổng hợp chất hữu cơ nhờ sử dụng CO2 tự do trong quang hợp. RUBISCO có cấu trúc bậc 4 gồm từ 4- 8 tiểu đơn vị lớn (MW52) và 8 tiểu đơn vị nhỏ (MW14 kDa). Một loại protein đặc hiệu gắn với những tiểu đơn vị chính tạo phức RUBISCO-binding protein (RBP) và RBP là MGPT. MGPT ở thực vật tham gia tạo cấu trúc không gian đúng cho những phân tử protein mới được tổng hợp, chuyển protein qua màng, duy trì cấu trúc đặc hiệu của protein, ngăn chặn sự huỷ hoại protein chưa tạo cấu trúc đúng, khởi đầu sự phân giải protein bị biến tính. MGPT có thể phân thành một số nhóm chủ yếu sau: • HSP70 là nhóm MGPT có hoạt tính ATP-ase và có tính bảo thủ cao. Trong điều kiện cực đoan HSP70 có thể ngăn chặn sự co cụm và kết tụ protein. • HSP60 (chaporonin) là loại protein cấu tạo từ các tiểu đơn vị có khối lượng 60 kDa và cũng có hoạt tính ATP-ase. Chúng có cấu tạo 2 vòng, 64
mỗi vòng có từ 7-8 tiểu đơn vị. Ở tế bào Prokaryot, chaperonin giống với protein tìm thấy ở ti thể, lục lạp và được gọi là GroEL, GroES. Trong tế bào Eukaryot tìm thấy một loại chaperonin trong tế bào chất là CCT. Nghiên cứu về CCT thực vật còn ít được đề cập. Tuy nhiên gần đây đã có những công bố đầu tiến của Nông Văn Hải và cộng sự (1998), Trần Thị Phương Liên và cộng sự (1999) về kết quả phân lập và tách được dòng gene CCT δ từ cây đậu tương. 1.1.3. HSP100, HSP90, SHSP Các nhóm HSP100, HSP90, sHSP có tính bảo thủ cao và có hoạt tính ATP-ase. Phần lớn các protein này được sinh ra khi.gặp nhiệt độ cao. Chức năng của HSP100, HSP90, SHSP là ngăn chặn hiện tượng co cụm của protein và tái hoạt hoá các phân tử protein đã biến tính. 1.1.4. LEA (Late embryogenesis abundant protein) LEA là loại protein được tổng hợp với số lượng lớn trong giai đoạn cuối của quá trình hình thành phôi. LEA có vai trò quan trọng đối với khả năng chịu khô hạn của hạt. Cấu trúc phân tử của LEA nổi bật là giàu axit amin ưa nước, không chứa xystein, tryptophan, có vùng xoắn α và có khả năng chịu nhiệt. Chúng thực hiện các chức năng cô lập ion, bảo vệ màng, huỷ protein biến tính và điều chỉnh áp suất thẩm thấu. LEA được chia làm 6 nhóm: nhóm 1-D19; nhóm 2-D11 (dehydrin); nhóm 3-D7; nhóm 4- D113; nhóm 5-D29; nhóm 6-D95. Nhiều gene LEA đã được nghiên cứu, phân lập và xác định chức năng. Khi gặp hiện tượng mất nước mARN của nó được tổng hợp và dần trở thành một lượng lớn gồm nhiều loại mARN khác nhau trong hạt chín, mARN bị phân giải hết khi hạt nảy mầm. Mức độ phiên mã của gene LEA được điều khiển bởi ABA và độ mất nước của tế bào. 1.2. Protein bất hoạt ribosome (Ribosome inactivating proteins - RIPs) Protein bất hoạt ribosome (ribosome inactivating proteins - RIPs) là những độc tố (toxin) có hoạt tính rRNA N-glicosidase và các đặc tính sinh - dược học rất đa dạng. Cơ chế tác động của RIPs là phân cắt cầu nối N- glicosidic của adenine đặc hiệu trên vùng Sarcin/Ricin Loop (còn được gọi là SRL hay R/S Domain) của rRNA (vị trí A4324 trên rRNA 28S ở gan chuột). Kết quả là ribosome không gắn kết được với EF-2 và GTP, làm ức chế quá trình sinh tổng hợp protein. RIPs được phân loại theo cấu trúc phân tử của chúng theo hai hoặc ba tipe khác nhau: (1) RIPs tipe I chỉ có một chuỗi polipeptit A (đôi khi ở dạng glicosyl hoá) với hoạt tính RIPs N-glicosidase; (2) RIPs tipe II có hai chuỗi: polipeptit A liên kết với chuỗi plipeptit B (là một phân tử có hoạt tính giống lectin) bằng một 65
hoặc hơn các cầu nối disulfide; (3) RIPs tipe III giống tipe I, bao gồm một chuỗi polipeptit, nhưng lại chỉ có hoạt tính sau khi được phân cắt đoạn tín hiệu bằng một loại protease đặc hiệu. Số lượng RIPs tipe I (khối lượng phân tử khoảng 30kDa) nhiều hơn RIPs tipe II và III. Tuy nhiên một số RIPs không thể phân loại theo các tipe kể trên. RIPs được phát hiện ở hơn 50 loài thuộc 13 họ thực vật, bao gồm cả cây một và hai lá mầm. RIPs không chỉ thấy ở họ Bầu bí (Cucurbitaceae) với rất nhiều loài là các cây thuốc quý như Trichosanthes, Luffa, mà còn thấy ở rất nhiều các họ thực vật khác như Cẩm chướng (Caryophylaceae), Thầu dầu (Euphorbiaceae), Hoà thảo (Poaceae), Họ đậu (Fabaceae), họ Hoa phấn (Nygtaginaceae)... RIPs không chỉ tìm thấy ở thực vật, mà còn thấy ở một số loại vi khuẩn đường ruột. Sự có mặt của RIPs ở rất nhiều cơ thể sinh vật khác nhau đã đưa đến một giả định về khả năng tồn tại của loại protein tương tự ở thế giới động vật. §2. QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH CHỈ THỊ PHÂN TỬ PROTEIN Protein là sản phẩm của sự biểu hiện gene. Protein biểu hiện tính trạng của cơ thể. Nghiên cứu xác định cơ sở protein của tính trạng hình thái, cấu tạo, sinh lí, hoá sinh của cơ thể sinh vật được quan tâm một số khía cạnh cụ thể như hàm lượng protein, các tiểu phần protein với kích thước phân tử khác nhau. Quy trình xác định chỉ thị protein cho một tính trạng nào đó có thể được thực hiện theo các bước sau: Bước 1. Nghiên cứu đặc tính hình thái, sinh lí Sàng lọc, phân lập các cá thể theo kết quả đánh giá dựa trên kiểu hình. Những cá thể mang tính trạng quan tâm có thể được tạo ra do lai giống hoặc đột biến thực nghiệm, sàng lọc trong quần thể tự nhiên và cũng có thể do xử lí, đánh giá trong điều kiện nhân tạo. Hiện nay người ta quan tâm chủ yếu các tính trạng chung chịu ở thực vật (khả năng chịu nhiệt: nóng, lạnh; mặn; hạn; phèn; khả năng chịu sâu, kháng bệnh), các bệnh do viêm hoặc ung thư ở động vật. Bước 2. Xác định chỉ thị protein • Chỉ thị hàm lượng protein - Chiết protein ở giai đoạn sinh trưởng, phát triển quan tâm của cá thể. - Phân tích hàm lượng protein. - Xác định mối liên quan đến tính trạng. 66
• Chỉ thị phân tử protein - Chiết protein dùng cho điện di, tách chiết phân đoạn protein. - Phân tích thành phần điện di. - Phân tích đa hình protein. - Giải trình tự axit amin của protein. • Western blot - Chiết protein dùng cho điện di. - Tách protein bằng điện di trên gel poliacrylamide. - Chuyển protein từ gel sang màng (PVDF) nhờ điện trường. • Chỉ thị enzyme - Chiết enzyme. - Phân tích định lượng và định tính hoạt độ enzyme. - Phân tích điện di entyme. Hình 5.3. Sơ đồ phân tích xác định chỉ thị protein §3. KĨ THUẬT PHÂN TÍCH PROTEIN 3.1. Tách chiết protein Protein có tính tan trong nước và muối, do vậy người ta chiết protein bằng một số loại dịch chiết có độ pH khác nhau kết hợp với phương pháp li tâm thu 67
dịch chiết. Sau đây trình bày cách chiết protein sử dựng cho định lượng và điện di protein. 3.1.1. Tách chiết protein dự trữ trong hạt thực vật Protein dự trữ trong hạt có thể được chiết bằng các loại dịch chiết như nước cất, NaCl, dung dịch đệm phosphat xitrat pH = 10... Đối với các loại hạt có dầu thì trước khi chiết protein cần phải loại lipit, ví dụ kĩ thuật loại loại lipit ở hạt đậu tương hoặc đậu xanh: Hạt đậu bóc vỏ, bỏ phần phôi mầm sau đó nghiền nhỏ. Bột nhận được giữ ở 40C. Loại lipit bằng petrolium ete qua đêm ở 40C. Li tâm 14.000 vòng/phút để loại dịch li tâm. Lặp lại một vài lần nữa. Bột đã loại lipit giữ ở 40C. 3.1.1.1. Chiết protein dùng để phân tích định lượng hoặc điện di Bột đã loại lipit được sử dụng chiết protein tổng số bằng dung dịch NaCl 1M pH = 7.0, chiết bằng nước cất pH = 7.0 hoặc chiết bằng đệm photphat pH=10. Bột đã loại lipit được chiết bằng dung dịch đệm qua đêm ở 40C, trong 24 giờ. Ngày hôm sau li tâm 14.000 vòng/phút trong 30 phút thu dịch phía trên. Dịch li tâm thu được chứa protein tổng số bao gồm albumin và globulin. Trong định lượng protein có thể tiến hành lặp lại nhiều lần; còn trong phân tích điện di thì có thể thực hiện một lần. Dung dịch protein được giữ ở -200C. 3.1.1.2. Chiết phân đoạn protein cho phân tích điện di Tách chiết và phân đoạn protein theo phương pháp Osborne và Klimenko. Có thể lấy ví dụ ở cây họ đậu: Hạt được nghiền nhỏ thành bột mịn, loại lipit bằng ete petroleum sau đó tiến hành phân đoạn. Protein được chiết bằng dung dịch NaCl 1M và nước cất. Theo cách thứ nhất, bột đã loại lipit được chiết bằng NaCl 1M sau đó li tâm 14000 vòng/phút trong 20 phút. Dịch li tâm chứa albumin và globulin tổng số (phân đoạn I). Cặn li tâm chứa tinh bột và tạp chất được loại bỏ. Tiếp theo albumin và globulin tổng số được phân đoạn bằng cách thẩm tích, sau đó li tâm. Dịch li tâm thu được chứa phần lớn albumin (phân đoạn II). Cặn li tâm là các protein không tan trong nước mà tan trong NaCl. Phần này được hoà vào NaCl 1M (phân đoạn III). Theo cách thứ hai, protein được chiết bằng nước cất sau đó li tâm. Dịch li tâm chứa phần lớn albumin và một phần globulin (phân đoạn IV).Cặn li tâm được chiết tiếp bằng NaCl 1M và li tâm lấy dịch (phân đoạn VII) Phân đoạn IV được xử lí tiếp bằng thẩm tích. Dịch li tâm chứa phần lớn albumin (phân đoạn V). Cặn li tâm chứa phần lớn globulin tan trong NaCl 1M (phân đoạn VI). 3.1.2. Tách chiết protein trong mô động vật Chiết protein từ mô động vật đơn giản hơn ở thực vật và được tiến hành 68
tương tự như ở thực vật. Protein trong mô động vật được chiết nhờ muối hoặc nước và bằng li tâm. 3.2. Định lượng protein 3.1.1. Phân tích hàm lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Keldjal Nguyên tắc : Tất cả các dạng nitơ có trong cơ thể hay trong các mô được gọi là nhờ nitơ tổng số. Nitơ có trong thành phần axit amin của protein là nitơ protein. Nitơ không có trong thành phần protein như muối vô cơ, axit nitric... là nitơ phi protein. Nitơ tổng số = nitơ protein + nitơ phi protein. Oxi hoá nguyên liệu bằng H2SO4 có mặt chất xúc tác và nhiệt độ cao, kết quả của việc công phá mẫu này là đạm trong thành phần chất hữu cơ chuyển thành (NH4)2SO4, dưới tác dụng kiềm mạnh, nóng NaOH, sục NH3 bay lên gặp nước tạo thành NH4OH, NH4OH được H2SO4 thụ, Sau đó chuẩn độ lượng NH3 được H2SO4 bằng NaOH. Kết quả phân tích sẽ thu được hàm lượng mía nitơg số bao gồm cả mùi nitơtein và nitơ phi protein. Do vậy cần tiến hành phân tích hàm lượng nitơ phi protein để xác định hàm lượng nitơ protein mà chúng ta quan tâm trong đánh giá chất lượng sản phẩm sinh học. Xác định hàm lượng nitơ phi protein có thể được xác định theo phương pháp của Barstein trên máy phân tích đạm tự động Vapodest của hãng Gerhardt và máy Kjeldahl. Hàm lượng nhơ pitotein = Hàm lượng nitơ tổng số - Hàm lượng nitow phi protein 3.1.2. Phân tích hàm lượng protein tan tổng số Nguyên tắc chung là sử dụng các thuốc thử như Folin, Bradford, Gordan... với sự hấp thụ ở những bước sóng khác nhau trên máy quang phổ Uvis Đồng thời với sự phân tích mẫu thí nghiệm là sử dụng protein chuẩn đã biết trước hàm lượng để tính hàm lượng protein của mẫu thí nghiệm. • Phương pháp định lượng protein tan tổng số theo phương pháp Lowry. Cơ sở của phương pháp là sự hình thành phức chất biurê. Phức này tham gia với thuốc khử Folin-ciocalteu để cho màu đặc trưng. Cường độ màu tỉ lệ với hàm lượng protein. Đo cường độ màu của hỗn hợp trong ống nghiệm trên máy so màu quang điện ở bước sóng λ = 750nm. Sau khi đo được mật độ quang thì đem đối chiếu với đồ thị chuẩn để tìm lượng protein tương ứng. Thí nghiệm để xây dựng đồ thị chuẩn thì dịch phân tích là dung dịch của một loại protein cụ thể (ở đây là Albumim) đã biết trước hàm lượng. • Phương pháp sử dụng thuốc thử Bradford Thuốc thử Bradford gồm: Coomasie Brilliant Blue G, ethanol, H3PO4, 69
nước cất; protein chuẩn. Các bước tiến hành: - Pha thuốc thử Bradford. - Sử dụng protein chuẩn và thuốc thử Bradford để xây dựng đường chuẩn và đo trên máy quang phổ ở bước sóng 595nm. - Căn cứ vào đường chuẩn xây dựng được sẽ xác định được hàm lượng protein của mẫu thí nghiệm. Ví dụ: Từ kết quả đo trên máy quang phổ, sử dụng máy vi tính theo chương trình excel lập đường hồi quy tuyến tính y = ax +b (y : mật độ quang; x : hàm lượng protein). Căn cứ vào đồ thị chuẩn y = 1,039. x + 0,0031 sẽ tính được hàm lượng protein của mẫu thí nghiệm. Giả sử khi đo mẫu thí nghiệm với thuốc khử Folin-Ciocalteu trên máy quang phổ ở bước sóng 750nm được trị số y = 0,234 thì thay vào phương trình y = 1,039. x + 0,0031 ta được hàm lượng protein : x = (0,234 - 0,0031)/1,039 = 0,22 mg/ml. Tuy nhiên, khi phân tích trên máy quang phổ bởi phương pháp Bradford hoặc Lowry thì căn cứ vào các số liệu lập đường chuẩn với albumin nguyên chất máy tự động lập phương trình và tính toán cho ta kết quả về hàm lượng protein. 3.3. Phân tích thành phần axit amin Xác định hàm lượng từng loại axit amin trong mẫu thí nghiệm bằng phương pháp sắc kí trên giấy hoặc hiện nay thường sử dụng máy phân tích axit amin tự động Biochrom 20 của hãng Pharmacia Biotech hoặc trên máy HP- Amino - Quant (Amino quant Series II - Operotor Handbook). Sử dụng OPA (ortho-phthaladehyde) tạo dẫn xuất đối với axit amin bậc I và FMOC (9- Fluoreryl methyl chlorofarmate) đối với các axit amin bậc II. Mẫu được xử lí theo phương pháp thủy phân ở 1050C trong 24 giờ. Tuỳ theo mục đích nghiên cứu mà có thể xác định hàm lượng axit amin tự do hoặc liên kết. Trong mục đích nghiên cứu tìm mối liên quan giữa hàm lượng của một loại axit amin nào đó với đặc tính chống chịu hoặc với tính trạng chất lượng (tính thơm của hạt thực vật chẳng hạn) thì có thể xác định hàm lượng axit amin tự do trong tế bào. Còn nếu mục đích nghiên cứu là đánh giá chất lượng protein của sản phẩm thì xác định hàm lượng axit amin liên kết. Căn cứ vào hàm lượng protein và hàm lượng từ loại axit amin xác định được thành phần axit amin trong protein. Thành phần axit amin trong protein được tính theo gam axit 70
amin/100g protein. 3.4. Kĩ thuật điện di protein Các loại protein có khối lượng phân tử khác nhau, do vậy chúng có tốc độ di chuyển khác nhau trong điện trường, vì thế có thể tách được các loại protein nhờ phương pháp điện di. Từ kết quả phân tích thành phần điện di mà người ta có thể đạt được những mục đích nghiên cứu khác nhau. Kĩ thuật điện di protein bao gồm phương pháp điện di một chiều và điện di hai chiều. Các kĩ thuật này cho phép phân tách hỗn hợp phức hệ protein thành những tiểu phần khác nhau dựa trên nguyên tắc tốc độ dịch chuyển khác nhau theo khối lượng phân tử của các tiểu phần đó. Nhờ kĩ thuật điện di một chiều người ta có thể tách được các tiểu phần protein trong protein tổng số tan trong dung dịch NaCl 1M và protein tan trong nước. Dựa vào các băng điện di có thể so sánh thành phần điện di giữa các mẫu nghiên cứu, xác định tính đa dạng sinh học trên cơ sở hiện tượng đa hình protein. Bằng phương pháp điện di protein SDS-PAGE người ta đã phát hiện những sai khác về các băng điện di ở kích thước phân tử 10-16kDa giữa các thể đột biến ở 5 giống lúa khác nhau, xác định được sự khác nhau về thành phần và hàm lượng protein chiết từ lá cây 10 ngày tuổi của 12 thể đột biến đậu tương. Các kết quả nghiên cứu về thành phần điện di protein dự trữ trong hạt đậu tương và trong hạt nảy mầm, nghiên cứu thành phần diện di enzym protease trong hạt nảy mầm của các giống dậu tương chịu hạn khác nhau cho thấy mối liên quan giữa sự thay đổi phổ điện di với khả năng chống chịu của giống đậu tương này. Kĩ thuật điện di protein hai chiều giúp cho các nhà sinh học phân tử phân tách các tiểu phần protein) định tính và định lượng các loại pohpeptide. Kỹ thuật điện di còn được ứng dụng để xác định các thể đột biến, xác định sự đa hình protein. Về mặt lí thuyết kĩ thuật điện di hai chiều có thể phát hiện hai loại đột biến: (1) đột biến do có sự thay thế một hay nhiều nucleotit, mất cặp nucleotit; (2) đột biến do sự biến đổi trình tự nucleotit. Ngoài ra: kĩ thuật điện di protein 2 chiều trên gel poliacrylamid còn được ứng dụng trong việc nghiên cứu biểu hiện gene ở giai đoạn phát triển sớm của cây. xác định được nhiều chỉ thị protein liên quan đến các tính trạng hình thái khác của cây trồng... Kĩ thuật điện di protein có thể theo các bước sau: Khi thực hiện phân tích điện di protein, trước hết người ta chế tạo bản gel 71
điện di protein (ví dụ gel poliacrylamid). Tra dịch chứa protein đã biến tính vào "giếng" trên bản gel poliacrylamid, đặt hai đầu mép gel lên diện trường, chạy điện di với hiệu điện thế khác nhau trong 1,5 - 2 giờ. Gel được cố định bằng tricloaxetic, ngâm vào dung dịch nhuộm màu coosmasie blue R-250. Sản phẩm điện di protein được chụp ảnh để phân tích. Thiết bị điện di bao gồm: máy điện di và bộ nguồn (hình 5.4). Máy điện di có thể là điện đi đứng hoặc điện di ngang. Gel sử dụng điện di protein hoặc phân tích điện di các enzyme có thể là poliacrylamid chứa SDS hay không có SDS. Ngoài ra có thể là gel thạch agar, gel agarose... Bảng 5.1. Thành phần của gel poliacrylamid Thành phần % gel H2O (ml) 30% Gel buffer SDS (ml) nhân bản gel Degassed (ml) acylamid/Bis (ml) Gel cô mẫu 4% 6,1 1,3 2,5 0,1 Gel phân tách 12% 3,4 4,0 2,5 0,1 protein Kĩ thuật chế gel điện di protein bao gồm các bước: (1) Lắp ráp khuôn gel; (2) tạo gel; (3) đổ gel. Hình 5.4. Thiết bị phân tích điện di protein Phân tích hình ảnh điện di protein cho kết quả thống kê các băng điện di của các đối tượng nghiên cứu, từ đó xác định được tính đa hình protein của các đối tượng nghiên cứu. Dựa vào thang protein chuẩn sẽ xác định được các băng 72
điện di protein đặc trưng và tìm được mối liên quan giữa tiểu phần protein với đặc tính quan tâm nghiên cứu. Công việc tiếp theo là phân tách tiểu phần protein từ bản gel và thu nhận tiểu phần protein bằng những thao tác khác nhau. Tiểu phần protein được đem phân tích khối phổ để xác định cấu trúc và tiểu phần protein cũng được xác định thành phần và trình tự axit amin của tiểu phần protein đó. Ngoài kĩ thuật điện di một chiều người ta có thể sử dụng phương pháp điện di hai chiều và thu nhân tiểu phần protein cũng theo nguyên tắc trên. Hình 5.5. Hình ảnh phổ điện di protein chiết bằng nước cất (M. marker. 1. Mỡ giống gốc; 2. MX10; 3. MXU21; 4. MXE01: 5. MX1608, 6. MX1103; 7. Tiêu giống gốc; 8. TXU21; 9. TX16012. ( : băng mất đi : băng xuất hiện mới ) Hình 5.6. Sơ đồ phân tích tiểu phần protein phân tách từ bản gel điện di (theo Phan Văn Chi, 2002) 73
§4. KĨ THUẬT PHÂN TÍCH ENZYME Phân tích enzyme nói chung theo hai cách tiếp cận, đó là xác định hoạt độ enzyme và phân tích phổ enzyme. Có thể tiến hành xác định hoạt độ của enzyme thông qua định lượng hoặc định tính. Đó là xác định lượng cơ chất bị phân giải trong một đơn vị thời gian, hoặc xác định thời gian phân giải trong cùng lượng cơ chất, đo vòng phân giải.... Kết quả xác định hoạt độ enzyme sẽ cho thấy mối quan hệ giữa hoạt độ của loại enzyme nào đó với đặc tính nghiên cứu. Dưới đây giới thiệu một vài phương pháp xác định hoạt độ của enzyme. Ở thực vật, khi hạt nảy mầm thì enzyme hoạt động mạnh. Hoạt độ của enzyme tăng dẫn đến sự biến đổi các chất dự trữ. Mức độ hoạt hoá các enzyme phụ thuộc vào tính chất và thành phần hoá học của hạt. Đối với các cây họ Đậu chất dự trừ chủ yếu là protein cho nên hoạt tính protease mạnh hơn các enzyme khác. Kết quả là protein bị phân giải thành các axit amin, các axit amin có thể được sử dụng tổng hợp nên các protein thứ cấp cấu trúc nên chất nguyên sinh của phôi hạt sinh trưởng và cây non, cũng có thể kết hợp với NH3 để tạo nên các amít, đặc biệt là sự nảy mầm của hạt trong tối. Ngoài protein, trong hạt đậu xanh còn có tinh bột, do đó hoạt tính α - amylase ở cây họ Đậu cũng khá cao. Sự tăng hoạt độ α - amylase sẽ làm tăng hàm lượng đường do đó làm tăng áp suất thẩm thấu và tăng khả năng giữ nước. Người ta đã nghiên cứu thấy α - amylase, hàm lượng đường và áp suất thẩm thấu có mối tương quan thuận. Người ta đã nghiên cứu thấy rằng đặc tính hoá sinh và sinh học phân tử của cây đậu tương có khả năng chịu hạn, chịu nóng có liên quan đến vai trò của a-amylase và protease. Hạt sau khi được ngâm nước với nhiệt độ thích hợp và đủ O2 thì các enzyme bắt đầu hoạt động phân giải các chất hữu cơ. Quá trình phân giải protein và tinh bột diễn ra rất phức tạp. Enzyme α -amylase thuộc nhóm hyđrolaza có trong nước bọt, hạt hoà thảo nảy mầm, tụy tạng, trong nấm mốc, vi khuẩn. Enzyme α -amylase phân giải các liên kết 1,4- glucozit ở giữa chuỗi mạch polisacarit, tạo thành các đextrin phân tử thấp. Do đó dưới tác dụng của enzyme này dung dịch tinh bột nhanh chóng bắt màu với dung dịch iot và bị giảm độ nhớt mạnh. Ion canxi có tác dụng làm bền cấu trúc không gian của phân tử enzyme. Enzyme α - amylase tương đối bền với nhiệt hơn các amylase khác nhưng lại kém bền với axit. Protease cũng thuộc nhóm hydrolaza phân giải các liên kết peptit ở giữa chuỗi mạch polipeptit nên còn gọi là endo peptit hydrolaza. Protease đóng vai trò quan trọng trong cơ thể sống. Chúng không chỉ tham gia vào phân giải protein dự trữ trong hạt nhằm cung cấp các axit amin cho thời kì phát triển đầu tiên của cây mà chúng còn tham gia vào quá trình xử lí phân tử protein và hoạt 74
hoá các enzyme khác. Ngoài ra, protease còn tham gia phân giải các protein lạ hoặc bị biến tính khi gặp điều kiện cực đoan như lạnh, hạn, mặn,... Protease trong hạt có thể được tổng hợp từ trước ở dạng tiền chất và tồn tại song song với protein dự trữ, cũng có thể được tổng hợp mới trong quá trình hạt nảy mầm. Sự có mặt của protease trong hạt dự trữ protein của hạt đang nảy mầm là bằng chứng về sự tham gia của chúng vào quá trình phân giải protein, các sản phẩm peptit trong các bào quan đó. Quá trình phân giải protein dự trữ của các cây họ Đậu đều giống nhau. Khi protein bị phân giải hết những không bào lớn được hình thành trong các tế bào dự trữ. Các axit amin được tạo ra trong quá trình này được sử dụng để sinh tổng hợp các protein mới trong mầm non. Quá trình biến đổi protein dưới xúc tác của protease diễn ra đầu tiên là : protein dự trữ ở dạng nguyên thuỷ bị endopeptidaza đặc hiệu cắt một số mối liên kết trên bề mặt của phân tử globulin theo cơ chế "khoá kéo". Sau đó có sự thay đổi cấu trúc không gian của globulin và làm cho chúng trở thành cơ chất dễ phân giải bởi endopeptidaza khác và các exopeptidaza có sẵn trong protein dự trữ trong hạt, tạo thành các polipeptit, oligopeptit ngắn hơn. Tiếp theo, các sản phẩm này bị aminopeptidaza phân giải đến axit amin. Định lượng hoạt độ enzyme α - amylase theo phương pháp Heinkel được thực hiện theo nguyên tắc là: xác định lượng tinh bột bị phân giải dựa trên cơ sở xác định mức giảm cường độ màu của hỗn hợp phản ứng với dung dịch iot. Đơn vị hoạt độ enzyme là lượng enzyme có khả năng phân giải 1 mg tinh bột sau 30 phút ở 300C. Dựa vào tính chất hoà tan trong dung môi hữu cơ, chiết enzyme a- amylase bằng dung dịch đệm photphat xitrat pH = 6,8. Đem cân mẫu và nghiền nhỏ tròng dung dịch đệm photphat xitrat, li tâm lạnh 12000 vòng/phút trong 15 phút thu dịch chứa enzyme α - amylase cho vào tube nhựa để làm thí nghiệm. Thí nghiệm được tiến hành ở ống thí nghiệm, ống kiểm tra, ống đối chứng. Trong ống thí nghiệm, cho 0,25ml tinh bột 1% vào 0,25ml NaCl 0,1% tiếp tục cho thêm 0,5ml dung dịch đệm photphat xitrat pH = 6,8 và 0,25ml dịch chứa enzyme, sau đó lắc đều và để trong tủ ấm 300C trong 30 phút. Sau khi để tủ ấm lấy ra cho thêm 1,25ml dung dịch axit sunfosalisihc 20%, lắc đều. Lấy 1ml từ hỗn hợp trên cho thêm 9ml iot loãng 150 lần lắc đều để 10 phút rồi đo trên máy quang phổ UV Visible Spectrophotometers ở bước sóng 560 nm. Ống kiểm tra: tương tự ống thí nghiệm chỉ khác là cho 1,25ml dung dịch axit sunfosalisilic 20% vào trước sau đó mới cho dịch chứa enzyme và để trong tủ ấm 30 phút. ống đối chứng: tương tự như ống thí nghiệm chỉ khác là thay dịch chứa enzyme bằng nước cất. 75
Kết quả: lấy kết quả ống kiểm tra trừ đi ống thí nghiệm nhân với độ pha loãng, tìm được số mg tinh bột bị thuỷ phân bởi dịch chiết chứa enzyme α - amylase trong 30 phút ở 300C. Cho hỗn dịch (thạch agar, tinh bột, nước) vào bình nón, đun cách thuỷ cho tan thạch, đổ vào đĩa petri dày 4mm, để nguội, đục lỗ đường kính (d-mm). Nhỏ 100 μ l dịch chiết chứa enzyme vào mỗi lỗ, để tủ lạnh qua đêm để enzyme khuếch tán, chuyển sang tủ ấm ở 300C trong 24 giờ. Nhuộm lugol trong 5 phút và tráng bằng NaCl 1N. Đo đường kính vòng phân giải (D-mm). Hoạt tính enzyme a-amylase được xác định bằng: D - d (mm). Xác định hoạt độ enzyme protease theo phương pháp anson cải tiến theo nguyên tắc: dùng cazein làm cơ chất; sau đó diệt enzyme và kết tủa protein chưa bị thuỷ phân bằng axit tricloaxetic. Xác định hoạt độ phân giải protein của enzyme trên cơ sở định lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin-ciocalteau. Cân mẫu và nghiền nhỏ trong dung dịch đệm photphat pH = 6,5. Li tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C. Dịch thu được sử dụng làm thí nghiệm như sau: Ống thí nghiệm: cho 1ml cơ chất đã đạt 300C trong 10 phút trộn với 0,5ml dịch chứa enzyme protease đã đạt 300C trong 10 phút, sau đó cho thêm 2,5ml tricloraxetic 5%, lắc đều để 30 phút ở 300C. Lọc lấy 0,5ml dịch lọc và cho thêm 2ml Na2CO3 6%, lắc đều rồi cho 0,5ml thuốc thử Foling- Ciocalteu. Để hỗn hợp trên 30 phút rồi đo trên máy quang phổ UV Visible Spectrophotometers ở bước sóng 720nm. Ống kiểm tra: sau khi cho 1ml dung dịch cơ chất, cho ngay 2,5ml dung dịch axit tricloaxetic 5%, lắc đều rồi mới cho 0,5ml dung dịch chứa enzyme protease. Các bước tiếp theo làm tương tự như ở ống thí nghiệm. ống đối chứng: làm tương tự như trên chỉ thay dung dịch chứa enzyme bằng nước cất. Cho hỗn dịch (thạch agar, cazein, nước) vào bình nón, đun cách thuỷ cho tan thạch, đổ vào đ a petri dày 4mm, để nguội, đục lỗ đường kính (d-mm). Nhỏ 100 μ l dịch chiết chứa enzyme vào mỗi lỗ, để tủ lạnh qua đêm để enzyme khuếch tán, chuyển sang tủ ấm ở 300C trong 24 giờ. Nhuộm lugol trong 5 phút và tráng bằng NaCl 1N. Đo đường kính vòng phân giải (D-mm). Hoạt tính protease được xác định bằng: D-d (mm). Phân tích isozyme với mục tiêu là phát hiện hoạt tính của một loại enzyme nào đó. Tuy nhiên trong phân tích di truyền, người ta căn cứ vào kết quả phân tích phổ isozyme mà đánh giá được sự đa dạng sinh học của các loài sinh vật nghiên cứu và xác định được mối quan hệ về di truyền mức độ sai khác giữa 76
các đối tượng nghiên cứu. Đại đa số các enzyme có bản chất là protein, cho nên thông thường người ta phân tích phổ isozyme bằng điện di trên gel acrylamid. Căn cứ vào hoạt động của loại enzyme đó mà người ta trộn thêm cơ chất của enzyme đó vào gel. Trong điều kiện nhiệt độ thích hợp sau khi chạy điện di mà enzyme cần phân tích sẽ hoạt động tương tác với cơ chất. Căn cứ vào kết quả nhuộm gel mà phát hiện ra phổ isozyme của loại enzyme đó. Cũng có thể sử dụng màng nitrocellulose để phát hiện hoạt động của enzyme. §5. NGHIÊN CỨU RIPS BẰNG WESTERN BLOT Western blot là kĩ thuật phát hiện các tiểu phần protein bằng kháng thể đánh dấu. Western blot bao gồm các bước cơ bản sau: Bước 1: Tách protein bằng điện di trên gel poliacrylamid. Bước 2: Chuyển protein từ gel sang màng (PVDF) nhờ điện trường. Bước 3: Nhuộm màng bằng kháng thể đặc hiệu. Bước 4: Nhuộm màng bằng cộng hợp (kháng thể kháng kháng thể gắn enzyme). Bước 5: Bổ sung cơ chất cho enzyme chuyển hóa để có thể nhìn thấy vệt protein phản ứng với kháng thể đặc hiệu trên màng. Enzyme sẽ chuyển hóa cơ chất thành hợp chất có màu có thể nhìn thấy trên màng. Như vậy chỉ vệt protein nào phản ứng với kháng thể thì mới hiển thị trên màng. Hình 5.7. Sơ đồ phân tích Western blot Nếu xét về cấu trúc bậc một và các tính chất hoá sinh thì các protein bất 77
hoạt ribosome (RIPs) tipe I là một họ protein tương đối đồng nhất, kiềm tính, khá bền vững. Tuy nhiên chúng vẫn rất khác nhau về đặc tính enzyme và hoạt tính sinh học. Do có các đặc tính sinh - dược học cũng như khả năng ứng dụng rất đa dạng, cho nên việc tìm kiếm những loại RIPs mới có những tính chất lí thú vẫn đang tiếp diễn ở rất nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới. Ở nước ta tuy chưa nhiều nhưng đã bắt đầu có những công bố về loại protein này từ nguồn thực vật. Dưới đây là kết quả khảo sát sự phân bố của RIPs tipe I bằng kĩ thuật Western blot trên một số đối tượng thực vật (thuộc họ Cucurbitaceae) như: cây Trichosanthes sp. Bac Kan 8-98 thu thập ở Bắc Kạn, cây Hồng qua (Mảnh bát - Coccinia cordifolia Cugn.), Gấc (Momordica conchinchinensis), Dưa chuột (Cucumis sativus L.), Mướp đắng (Momordica charantia), Thiên hoa phấn (rễ của Trichosanthes kirilowii Maxim). Để tiến hành việc khảo sát và xác định RIPs, protein tổng số từ các mẫu rễ, hạt được chiết rút, dịch chiết protein được lọc qua màng milipore 0,2 μ m. Protein được tủa lại bằng acetone lạnh theo tỉ lệ 1:1 (w/v) ở 40C. Các bước điện di protein bằng SDS-PAGE (12,5% acrylamide) được tiến hành theo các phương pháp của Laemmli, sau đó thực hiện phương pháp Western blot. Phản ứng chéo giữa kháng thể kháng Trichobakin tái tổ hợp với các mẫu protein trên là rất đặc hiệu và chỉ có ở vùng 23 - 30 kDa. THẢO LUẬN 1. Trình bày đặc điểm và vai trò của một số protein liên quan đến tính chịu nhiệt ở thực vật. 2. Protein bất hoạt ribosome RIPs, phương pháp khảo sát RIPs và ứng dụng của những nghiên cứu này. 3. Xác định mối liên quan giữa protein và tính trạng có thể tiến hành theo quy trình nào? 4. Phương pháp phân tích chỉ thị phân tử protein được phân tách bằng điện di. 78