intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE

Giáo trình Thực tập Vi sinh vật học: Phần 2

Chia sẻ: Lê Thị Na | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:70

265
lượt xem
80
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Phần 2 giáo trình "Thực tập Vi sinh vật học" gồm các bài thực hành: Đo sinh trưởng của vi sinh vật, nhu cầu về dinh dưỡng và điều kiện sinh trưởng của VSV, vi khuẩn chỉ thị độ nhiễm bẩn nước, vi sinh vật đất, vi khuẩn lactic và sữa, quan hệ giữa VSV với thực vật và người.

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Giáo trình Thực tập Vi sinh vật học: Phần 2

  1. BÀI 9. ĐO SINH TRƯỞNG CỦA Vi SÌNH VẬT Có thể định nghĩa sinh trưồng là sự tăng số lượng vật chất tế bào. Tuy nhiên cần phân biệt sự khác nhau giữa sinh trưỏng của quần thể (populatỉon grouĩth - sự tăng số lượng hoặc sinh khôi của quần thể) và sự sinh trưỏng của tế bào (cellular groivth - sự tăng kích thước hoặc sinh khôi của 1 tế bào). Sinh trưỏng của v s v thưòng được hiểu là sự sinh trưởng của 1 quần thể tế bào. Trong một hệ thống đóng (không có chất dinh dưdng thêm vào, không có sản phẩm trao đổi chất được rút ra, giống như bình nuôi VSV) sinh trưởng của v s v được đặc trưng bỏi đưòng cong sinh trưỏng bao gồm 4 pha: pha lag, pha log, pha ổn định (stationary phase) và pha tử vong (death phase). Khi đo sinh trưởng của một quần thể tế bào vi khuẩn, việc quan trọng nhất là xác định sự thay đổi về số lượng tế bào có trong môi trường nuôi cấy tại các thòi điểm khác nhau. Số lượng tế bào vi khuẩn được xác định trực tiếp trên phòng đếm vi khuẩn hoặc gián tiếp nhò phép đo độ đục và đếm số khuẩn lạc trên môi trường đặc. Dựa vào số liệu thu được, vẽ đường biểu diễn mổì tương quan giữa số lượng tế bào với thồi gian (đưòng cong sinh trưồng) để xác định sinh trưông của quần thể qua các pha, tính toán sô' thế hệ, thời gian thế hệ, tốc độ sinh trưỏng. Để đo sinh trưỏng cùa quần th ể tế bào cồ dạng sợi như nấm mốc, xạ khuẩn, ngưòi ta thưòng sử dụng một số phưđng pháp đặc biệt: xác định trọng ỉượng tưđi hoặc khô (bỉomass), định lượng protein, ADN, ARN hoặc một vài sản phẩm trao đổi chất đặc tnỉng. 78
  2. CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH s ố LƯỢNG TỂ BÀO v s v THÔNG DỤNG 9.1. ĐẾM TRỰC TIẾP DƯỚI KÍN H H IỂN V I Phòng đếm Petroff-Hausser được dùng để đếm tế bào vi khuẩn. Phòng đếm hồng cầu (Thoma, Goriaev) được dừng để đếm tế bào nấm men và phần lớn các eucariot đơn bào. Cách sử dụng các loại phòng dếin này là giống nhau. N^guyên tắc chung: đếm số lượng tế bào có trong một đơn vị thể tíc h của phòng đếm từ đó suy ra số lượng tế bào có trong 1 ml, nhán VỐI độ pha loăng dể biết số tế bào có trong dịch ban đầu. Phòng đ«ìm PetroíT-Hausser có 25 ô lớh, khoảng trống giữa phiến kmh và lá kính có chiều cao là 0,02 mm, tổng diện tích là Imm'*., tổng thể tích là 0 ,02mm^. 1 cm* (ml) ứng vói 1000 mm* ứng vđi 5.10' lần thể tích phòng đếm. Oách tiến hành: pha loãng và cho mẳu vào phòng đếm, không: để tràn ra ngoài. Đếm số lượng tế bào vi khuẩn có trong vài ô lớn, tính giá trị trung bình (a). Gọi K là độ pha.loãng. s
  3. ngữ "độ đục" {turbidity- tính đục) và sử dụng để đánh giá gián tiếp số lượng tế bào. Phép đo độ đục được tiến hành trên máy trực tiếp đọc độ đục (nephelometer) nhưng thông dụng hơn cà là xác định trên máy so màu (colorimeter) hoặc máy đo quang phổ (spectrophotometer) với bước sóng 600- 700 nanomet (nm). Ánh sáng ỏ phạm vi này ít bị hấp thu bỏi các thành phần của tế bào. Do vậy bất cứ sự ngắt quãng dòng ánh sáng đi qua đều là do sự phản chiếu (reflection), không phải là do sự hấp thu (absorption). Sử dụng các bưôc sóng khác sẽ gây sai lệch vì cả hai hiện tượng hấp thu và phản chiếu đều gây nên sự ngắt quãng ánh sáng. Các máy đo độ đục bao gồm nguồn ánh sáng và tế bào quang điện cách ròi nhau bỏi ô đựng mẫu. Dịch h u y ể n phù tế bào trong ô đựng mẫu sẽ cản trở dòng ánh sáng đi qua khiến ánh sang ít bị đập vào tế bào quang điện hđn so vối mẫu trăng (không có tế bào). Chỉ tiến hành đo độ đục khi từng tê bào riêng biệt tham gia vào việc cản trỏ ánh sáng. Lúc cụm lại, các tế bào bên ngoài che chắn một cách hữu hiệu các tế bào bên trong khỏi bị chiếu sáng làm cho phép đo độ đục trỏ nên không chính xác. Vì vậy chỉ tiến hành đo độ đục với các mẫu mà ỏ đó v s v sinh trưởng làm đxỊC đồng đểu môi trưòng nuôi cấy, không tạo thành váng, khuẩn ti hoặc các khôi. Có thể sử dụng phép đo độ đục đôì vối các mẫu có tế bào sinh trưỏng chìm dưổi đáy nhưng không dính vào nhau. Cần lác đều và đo nhanh tarước khi tế bào clùm xuống. Để đo độ đục cần chuẩn bị môi trưòng nuôi cấy trong suốt, không có cặn hoặc các hạt vẩn đục (ví dụ các hạt phosphat magiê được hình thành bỏi muôi phosphat kali và sulphat magiê có trong môi trưòng). Trưôc khi đo có thể hòa tan các hạt vẩn đục bằng cách thêm vài giọt HCỈ đậm đặc vào mẫu. Trong 80
  4. trường hợp môi trưòng nuôi cấy có màu sẫm, trưỏc khi đo độ đục nên li tâm loại bỏ môi trường, hòa sinh khôi tế bào (lớp tủa) trong dung dịch sinh lí hoặc môi trưòng thích hợp nhưng trong suốt và đưa về thể tích ban đầu. Đối vói 1 loại mẫu nên sử dụng 1 loại dung dịch hoặc môi trường nhất định để pha loãng. Thay đổi dịch pha loăng thưòng dẫn đến kết quả sai lệch. Không đưỢc dùng nước cất để pha loãng mẫu vì sự thay đổi áp suất thẩm thấu một cách đột ngột (từ dung dịch dinh dưdng chuyển sang nước cất) có thể làm cho tê bào bị vd, mất tính đục. Mẫu đối chứng (mẫu trắng - blank) phải có tính chất lí hóa giống như mẫu thí nghiệm nhưng không chứa tế bào vsv. Khi xác định số lượng tế bào v s v bằng phương pháp đo độ đục trước tiên phải lập đồ thị chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa các trị số đo trên máy (dộ hấp thụ hoặc OD - optical density) với SỐlượng tế bào: chuẩn bị dịch huyền phù tế bào có nồng độ khác nhau, xác định trị sô' của từng nồng độ ở bước sóng 600- 700 nm. Dùng phòng đếm đếm trực tiếp hoặc đếm số khuẩn lạc trên môi trưòng đặc để xác định số lựợng tế bàp v s v ỏ từng nồng độ. Trục tung biểu diễn các trị số đo trên máy, trục hòanh chỉ số tế bào (thường dùng đại lượng số tế bào / ml). Vẽ đưòng cong biểu diễn mối quan hệ giữa độ đục và sô' lượng tế bào. ở một chừng mực nhất định trị số đo trên máy tỉ lệ thuận với số lưỢng tế bào và đưòng biểu diễn mối quan hệ sẽ là đưòng thẳng đi qua gốc tọa độ. Muôn xác định số lượng tế bào v s v trong một mẫu chỉ cần đo chỉ SỐ của mẫu ỏ trên máy. Tìm điểm tương ứng với trị SỐ đó trên trục tung. Từ điểm này kẻ một đưòng thẳng song song vói trục hòanh cắt qua đưòng chuẩn. Tại điểm cắt dọi một đưòng vuông góc vổi trục hòanh để biết số lượng tế bào có trong mẫu. 81
  5. Phương pháp xác định số lượng tế bào bằng cách đo độ đục cho kết quả nhanh nhưng không phân biệt được số tế bào sống và chết. 9.3. ĐẾM SỐ TẾ BÀO SỐNG (Số KHUẨN l ạ c t r ê n đ ĩa THẠCH) Tế bào v s v sốhg là tế bào có khả năng sinh trưởng để tạo thành một quần thể. Trên bề mặt môi trường đặc, quần thể v s v này tạo những đám có hình dạng, màu sắc riêng biệt được gọi là khuẩn lạc (colony). Từ sô khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch suy ra số tế bào sống có trong mẫu đã gieo cấy trên mặt thạch. Theo lí thuyết 1 khuẩn lạc được hình thành từ một tê bào. Vì vậy đối với mẫu có chứa các tế bào xếp thành chuỗi hoặc cụm cần phải lắc kỹ và mạnh để các tê bào tách ròi nhau. Tuy nhiên trên thực tế khó có thể thu được kết quả hòan hảo do đó một khuẩn lạc có thể được hình thành từ một hay nhiều tế bào. Vì vậy để báo cáo tổng số tế bào có trong một đơn vị thể tích ngưòi ta thường dùng thuật ngữ “đơn vị hình thành khuẩn lạc trong 1 đơn vỊ thể tích” (CFU / V - colony forming unit í v). ưu điểm của phướng pháp này là chỉ các tế bào sống mới được phát hiện. Vật liệu - Chuẩn bị mẫu vật: dịch nuôi cấy tế bào từ các bình nuôi hoặc nồi lên men được rút ra và cho vào các ống nghiệm vô trùng một cách cẩn thận để không bị nhiễm thêm các v s v từ môi trưòng bên ngoài. Mâu là vật rắn (đất, bánh men...) phải đưỢc lấy và đựng trong các dụng cụ vô trùng. Trưỏc khi phân tích, mẫu cần được nghiền nhỏ trong các cốì chày sứ vô trùng. Mâu lấy xong cần được phân tích ngay. 82
  6. - Các đĩa thạch môi trưòng thích hỢp với nhóm vsv cần kiểm tra. - Pipet 1 và 5 ml có chia độ đã vô trùng. Nếu sử dụng micropipet, đầu nhựa của pipet phải đưỢc hấp tiệt trùng bằng hữi nước. - Các ống chứa 4,5 ; 9,0 và 9,9 ml, bình chứa 99 ml nưóc muôi sinh lí vô trùng. - Các que gạt bao gói kín, khử trùng sẵn. Cũng có thể chuẩn bị que gạt vô trùng bằng cách nhúng vào cổc cồn, đốt trên nịĩọn lửa dèn cồn, đợi nguội và sử dụng. - Máy trộn dung dịch trong ống nghiệm (vortex mixer). - Buồng thổi khí vô trùng (clean room technỉcs). - Đòi với một mẫu cần tính toán vật liệu sử dụng một cách cụ thể. Trinh tự Pha loãng mẫu Để tách rồi các tế bào, cần phà lòẳng mẫu kềm theo lắc mạnh dịch đã pha loãng. Kiểu cách pha loãng tùy thuộc vào mật độ tế bào dự đoán có trong mẫu. - Kiểu pha loãng với mỗi nồng độ kế tiếp giảm 10 lần: (Sứ dụng các ông chứa 4,5 mỉ nước muôi sinh lí vô trùng). Ghi sẵn kí hiệu độ pha loăng 10 ', 10 ^ 10'\ 10'\ 10'^.. lên thành Ống và xếp theo thứ tự. Lấy 0,5 ml (g) m ẫu cho vào ống nghiệm thứ n h ất (10‘‘) lắc đều trên máy hoặc bằng tay. Độ pha loăng của ống này là: 0,5/ (0,5 + 4,5) = 1/10 = 10*. Dùng pipet 1 ml khác hút 0,5 ml từ ống 10‘* sang ống 10*'^. Lắc đều. Độ pha loãng của ống thứ 2 là: 83
  7. 0,5 X lO V (0,5 + 4,5) = 101 Dùng pipet 1 ml khác tiếp tục làm như vậy vôi ống 10'^, 10'^, 10'®... Việc sử dụng các ống chứa 4,5 ml nước để pha loãng sè thuận tiện hơn khi lắc ống nghiệm trên máy hoặc bàng tay. - Kiểu pha loãng với mỗi nồng độ kể tiếp giầm 100 lần và 10 lần: Áp dụng để pha loãng dịch nuôi cấy v s v có nồng độ tế bào rất cao. Thao tác pha loăng giông như trên nhưng sử dụng các bình nón có chứa 99 ml và ống 9,9; 9,0 ral nước vô trùng. Lấy 1 ml (g) mẫu cho vào bình nón chứa 99 ml nưóc vô trùng hoặc 0,1 ml (g) mẫu cho vào ống chứa 9,9 ml nước vô trùng. Lắc đều, độ pha ỉoãng là; 1 / (1+99) = 1/100 =101 hoặc 0,1 / (0,1 + 9,9) = 0,1 /1 0 = 10-'^ Dùng pipet 1 ml khác hút 1 ml từ bình 10’^ cho sang bình nón thứ 2 (hoặc 0,1 ml từ ông 10 ‘* sang ống chứa 9,9 ml nước vỏ trùng) thứ 2 có độ pha loãng là: 1 X 10-2 ị (1 + 99) ^ y 000 =10 -' hoặc 0,1 X 10-* / (0,1 + 9,9) = lO-'’ /1 0 = 10“ Tiếp theo dừng pipet 1 ml khác hút 1 tnl từ bình hoặc ống 10“* cho sang ống chứa 9 ml nưôc vô trùng, ông này có độ pha loăng là: 1 X 10'V (1 + 9) = 10 ® Dùng pipet 1 ml khác tiếp tục làm như vậy để có các ống pha loăng 10 ®, 10 ^................................................... Câý trải (gạt đều) dỉch pha loỗng lên đĩa thạch môi trường - CSig vối mỗi độ pha loãng chuẩn bị 2 đĩa thạch môi trường thích hỢp, ghi kí hiệu độ pha loãng lên nắp đĩa. 84
  8. Sau khi lắc lại dịch pha loãng một iần nữa, bắt đầu từ ốhg loãng nhất, dùng pipet vô trùng nhỏ lên 2 đĩa có ghi kí hiệu tưdng ứng mỗi đĩa 0,1 mỉ hoặc 0,05ml (tay trái mỏ hé nắp đậy, tay phải cầm pipet nhỏ dịch vào đĩa môi trưòng). Dùng que gạt vô trùng gạt giọt dịch trải đểu khắp mặt thạch: tay trái mỏ hé nắp hộp, ngón út trái xoay nhẹ cho đĩa chuyển động tròn, tay J)hải liên tục gạt cho tới khi'mặt thạch khô ráo. Vối cùng độ pha loãng không cần thay que gạt. - Thay pipet, hút dịch pha loãng ỏ nồng độ kế cận nhỏ lên 2 (ỉĩa môi trường tưdng ứng, gạt đểu tối khi mặt thạch khô ráo. - Thay pipet và tiếp tục với các ống còn lại. Chú ý: đê các tế bào v s v tách ròi nhau và phân bố đều trôn mặt thạch, sau khi nhỏ dịch pha loãng cần tiến hành gạt ngay. Nếu để lâu giọt dịch sẽ bị khô. các tế bào gắn chặt vào thạch việc gạt dàn đều chúng sẽ rất khó khăn, dẫn đến kết quả sai lệch. ủ ở các điều kiện thích hợp Trưốc khi ủ, các đĩa được úp sấp và bao gói kín bằng giấy vô trùng. Sau đó đặt các gói vào tủ hoặc phòng có điều kiện thích hợp. Khi ủ ỏ nhiệt độ cao (40°c trỏ lên) lỏp môi trưòng trong đĩa dễ bị khô do nước bốc hơi. Trong trưòng hỢp này nên chuẩn bị các đĩa có lớp môi trứòng dày để giữ độ ẩm. Cũng có thể ủ các đĩa trong nồi cách thủy ổn nhiệt nhưng không để nưóc hoặc hơi nước làm ướt đĩa. Sau khoảng thòi gian nhất định (thưòng sau 24 - 72 giò) mở giấy bao gói nhưng không mỏ nắp đĩa, quan sát sự xuất hiện cùa các khuẩn lạc. Khi các khuẩn lạc phát triển tới mức cố thể phân biệt được bằng mắt thưòng thì ngừng ủ. Nếu ủ lâu hơn các khuẩn lạc phát triển mạnh dễ lan vào nhau. 85
  9. Đếm s ố khuẩn lạc • mọc • trên đĩa thạch • Đếm sô' khuẩn lạc bằng cách úp sấp đĩa, trên mặt đáy phía ngoài cùa đĩa dùng bút viết kính chấm lên khuẩn lạc đã đưỢc đếm. Nếu số lượng khuẩn lạc khá lớn, dùng bút chia mặt đáy thành các phần. Đếm số khuẩn lạc có trong từng phần sau đỏ cộng lại. Chú ý không bỏ sót khuẩn lạc bé hoặc khuẩn lạc mọc ở những chỗ khuất cũng như khuẩn lạc dính vào nhau. Đôi vớị những mẫu nuôi cấy v s v thuần khiết, cẳn phân biệt các khuẩn lạc lạ hình thành do tạp nhiễm và không tính chúng. Việc đếm khuẩn lạc cũng được thực hiện trên máy đếm khuẩn lạc bán tự động, trong đó các khuẩn lạc được đếm nhò việc đánh dấu bằng loại bút đặc biệt nôi vói máy. Tinh kết quả Trừ những đĩa khuẩn lạc dày đặc không đếm được chỉ lấy các đĩa có số khuẩn lạc trong khoảng 30-300. sắp xếp các số liệu thành một dãy ứng với các dộ pha loãng. Xem xét số khuẩn lạc
  10. hoặc bô sung các chất làm tế bào tách ròi nhau ra. Vói mẫu không được xử lí tốt đôi khi càng pha loâng số lượng khuẩn lạc xuất hiện càng lổn trái ngược vôi xu hướng trên. Như đã trình bày ỏ phần đầu 1 khuẩn lạc có thể được hình thành từ 1, vài hoặc nhiều tế bào. Từ số khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa thạch có thể suy ra số lượng tế bào (CFƯ) có trong mẫu vật một cách tưđng đối: CFU/ ml (g) = a X 1/K X lỉV a: sô khuẩn lạc trung bình xuất hiện trên các đĩa cấy có cùng độ pha loãng. V: thể tích dịch pha loãng được cấy gạt trên mặt đĩa thạch. K: độ pha loãng của dịch được cấy. Hình 15: Sơ đố pha loãng và cây mẩu 87
  11. CÂU HỎI (BÀI TẬP) 1. Thêm một ml mẫu vào ống chứa 9 ml nưốc vô trùng. Trộn đều, pha loãng thêm 4 lần liên tiếp theo thang pha loãng 1/ 10 (ống đứng sau có nồng độ tế bào kém 10 lần so với ống đứng trưốc). 0,1 ml dịch pha loãng từ các*ống được nhỏ lên mặt đĩa thạch (lặp lại 2 đĩa), gạt đều, ủ ở tủ ấm 3 ngày. Số khuẩn lạc trung bình xuất hiện trên 2 đĩa tương ứng vối các ống như sau: Ống K V a 1 ? 0.1 ml nhlểu 2 7 0.1 ml 730 3 ? 0,1 mỉ 67 4 7 0,1 ml 5 6 ọ 0.1 ml 0 Vậy kết quả thu được có đáng tin cậy không? Tại sao? Hãy tính CPU/ ml mẫu ban đầu. 2. Cho 3g đất vào bình nón chứa 27 ml nước vô trùng lắc mạnh trong 5-10 phút. Để yên cho hạt đất lắng xuốhg. Hút 0,1 ml dịch trong cho vào ống nghiệm chứa 9,9 ml nưóc vô trùng. Từ ống này pha ỉoãng tiếp 4 lần nữa theo thang pha loằng l/io . Lấy 1 ml từ ống pha loãng cuối cùng trộn với 25 ml thạch dinh dưõng (nguội đến 50°C) và đổ vào 1 đĩa petri. Sau khi ủ 3 ngày ở nhiệt độ thích hợp, có 289 khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa. Tính CFU/g đất. 3. Một mẫu dịch nuôi cấy vi khuẩn được pha loăng thành các nồng độ và cấy gạt trên 2 đĩa thạch. Kết quả được trình bày ở bẳng sau: 88
  12. K V Số khuẩn tạc trên tìAìg đĩa 10^ 0.1 ml nhiếu 10^ 0 ,1 tn! 3 2 1 -4 0 3 10 ‘ 0.1 ml 34 -4 2 10® 0 .1 ml 6- 1 10' 0.1 ml 0-0 10« 0.1 ml 0-0 Tính CPU / ml dịch nuôi cấy. 4. 10 gam thịt nguội Hambua đă nghiền nhỏ được thêm vào binh nón chứa 90 ml nưóc vô trùng lắc kĩ. Hút 0,1 ml dịch trong bình cho vào ống chứa 9,9 ml nước vô trùng trộn đều. Dịch trong ống tiếp tục pha loãng 1/ 100 và 1/ 10. Lấy 0,1 ml dịch pha loãng ỏ ống cuối cùng cấy gạt trên đĩa, ủ ỏ nhiệt độ thích hợp trong 3 ngày. Số khuẩn lạc trung bình xuất hiện trên đĩa là 52. Tính CFU có trong 10 gam thịt Hambua. 5. Sau khi đo sinh trưởng cua một quần thể Bacillus subtilis bằng phưđng pháp đo độ đục ỏ bưóc sóng 600 nm và đếm số khuẩn lạc trên đĩa thạch, các số liệu được trình bày d bảng dưới đây: Thời điểm OD N (số tế bào) LgN 9 :3 0 am 0 .0 5 1.0x10” 7 9:40 0 .0 5 1 .0 X 1 0 ' 7 9 :50 0.07 1 .0 X 1 0 ' 7 10 :0 0 0 .11 1.7 X 1 0 ' 7 .2 3 1 0 :1 0 0 .15 2 .5 X 1 0 ' 7 .3 9 89
  13. 10:20 0.25 4 .0 x 10 ' 7,602 1 0 :3 0 0 .40 6.2x10^ 7 ,7 9 2 10 :4 0 0 .6 1 1.0x10* 8 10 :5 0 0 .79 1.7 x 10 * 8 .2 3 11:00 0 .8 5 2.6x10* 8 ,4 14 11:10 0 .87 4 .1 X 10« 8 ,6 12 11:20 0.89 5 .5 X 10 * 8.74 11:3 0 0.89 6 .3 x 10 * 8.799 - Trên giấy kẻ ô vuông hãy vẽ đường cong sinh trưởng dựa trên OD và thòi gian, Ig số tế bào và thòi gian. Trục hòanh biểu thị thòi gian (phút), trục tung biểu thị OD, Ig sô' tế bào. Trên mỗi đường cong hãy đánh dấu các pha. - Hãy nhận xét về 2 đồ thị này. - Tính số thế hệ (n), thòi gian thế hệ (g), và tốc độ sinh trưỏng (K). LgN .-LgN , O.SOlt N q: số tế bào ỏ thòi điểm 0 giò (lúc bắt đầu cấy) N,: SỐtế bào ở thòi điểm lấy mẫu t: khoảng cách thòi gian từ No đến Nt, tính bằng giò Chú ý: hai đồ thị được vẽ trên cùng một diện tích để dễ so sánh. Nếu có điều kiện trên giấy semi - log 3 chu kỳ hãy vẽ đưòng c»ng sinh trưỏng biểu diễn môi tương quan giữa số tế bào và thòi gian. Trục hòanh biểu thị thời gian. Xác định các pha sinh trưỏng. 90
  14. BÀ110. NHU CẦU VỂ DINH DƯỠNG VÀ ĐIỂU KIỆN SINH TRƯỎNG CỦA VI SINH VẬT Sinh trưởng của v s v gán liền với sự có mặt của nưôc và các chất dinh dưỡng hòa tan trong nước. Các v s v khác nhau về kiểu dinh dưõng. Nhu cầu của v s v về thành phần các chất dinh dưõng cũng như điều kiện sinh trưởng là rất khác nhau. Với phần lớn v s v dị dưỡng (heterotrophic microorganism) các chất hữu cơ cung cấp khung cacbon cho sinh tổng hỢp các monome (axit amin, bazơ nitơ) và các polime (protein, peptidoglican). Để tạo ra các mono- và polime, v s v phải tổng hợp hàng loạt enzym, phần lớn enzym này cần các cofactơ và/ hoặc coenzym. Cofactđ thường là các cation K*, Mg^^ Ca'"*. Co(mzym thưòng là các phân tử hữu cơ có trọng lượng phân tử thấp, ví dụ như các vitamin. Cofactơ có thể nhận từ môi trưòng, còn coenzym thường được tổng hợp bỏi cơ thể. Tuy nhiên một số v s v thiếu thông tin di truyền để tổng hỢp các coenzym cần thiết. Đôì vối loại v s v này cần thiết phải bổ sung cắc chất hữu cđ đặc biệt nói trên vào môi trường nuôi cấy chúng. Các chất hữu cơ có trọng lượng phân tử thấp cần thiết cho tê bào với một lượng nhỏ gọi là các yếu tố sinh trưởng (groìvth factor). Yếu tố sinh trưỏng bao gồm các axit amin, purin, pirimidin và các vitamin. Dịch tự phân nấm men (cao nấm men), nước mạch nha, cao ngô giàu các yếu tố sinh trưồng. Vi sinh vật cần các yếu tố sinh trưỏng gọi là các v s v trợ dưâng (auxotroph). Ngược lại vi sinh vật không cần các yếu tô" sinh trưởng gọi là các v s v nguyên dưõng (prototroph). Vi sinh vật cần các nguyên tố như N, p, s, Fe... để cấu trúc nên toàn bộ tế bào. Tuy nhiên dạng hợp chất của các nguyên tố 91
  15. này cần phải phù hợp vói từng kiểu dinh dưõng của vsv. Ví dụ nitơ ồ dạng khí N 2 chiếm tới 80% khí quyển nhưng ngoại trừ một sô' ít vi khuẩn, v s v không có khả năng sử dụng nitơ ỏ dạng này, do đó cần bổ sung vào môi trưòng nuôi cấy các ion NH 4* hoặc NO 3 dưới dạng muối thích hợp hoặc pepton. Để nghiên cứu nhu cầu về các chất dinh dưỡng, ngưòi ta thưòng cấy v s v lên các đĩa thạch chứa các chất dinh dưõng khác nhau. Nghiên cứu nhu cầu của v s v về các nguyên tố vi lượng rất khó bồi vi phần lốn các hóa chất dùng để pha chế môi trưòng đểu không tinh khiết, ít nhiều đã nhiễm các nguyên tố vi lượng. Do vậy ngưòi ta thưdng đặt thí nghiệm với các yếu tô' đa lượng. Sinh trưỏng của v s v chịu ảnh hưỏng của các chất dinh dưõng có thể sử dụng trong môi trường. Tuy nhiên điều đó cũng chưa đù bỏi lẽ các yếu tố như nồng độ oxi, nhiệt độ, pH, áp suất thẩm thấu... của môi trưòng có ảnh hưỏng lớn tói tốc độ sinh trưỏng của vsv. Hơn nữa các đặc tính hình thái, sự hình thành các chất trao đổi thứ cấp, hàm lượng sắc tố cũng chịu ảnh hưỏng của các yếu tố này. Bất kỳ một thông số nào chệch khỏi phạm vi thích hỢp (optimum) đểu có thể dẫn tới sự thay đổi tốc độ sinh trưdng, hình thái tế bào vsv... Vật iiệu Vỉ sinh vật - Azotobacter sp. sống trong đất - có khả năng cố định nitơ - BaciUus subtilis - sống trong đất - Clostrỉdium butyricum ~ sốhg kị khí trong đất • E. colỉ - vi k h u ẩn sống trong đường ru ộ t ngưòi - Lactobacillus bulgaricus - sống trên bề mặt thực vật, trong sữa, thưòng được sử dụng ỉàm sữa chua - Streptomyces griseus - xạ khuẩn sống trong đất 92
  16. - Saccharomyces cereưisiae - nấm men làm nỏ bột mì, lên men rượu, bia, vang... - Sarcina lutea - sống trong đất. Mỏi trường - Các ống thạch bán lỏng thioglicolat đặt trong nồi cách thủy 50"C. Các đĩa môi trưòng đã làm khô mặt thạch: - Các đĩa mỗi trưòng thạch thường NA (nutrient agar). - Các đĩa môi trưòng NA có bổ sung 5%, 10%, 20% đưòng kính, đối chứng không bổ sung đường. - Các đĩa môi trường thạch glucoza - cao nấm men YEG (yeast extract - glucose agar) đã điểu chỉnh pH 4, 5, 6, 7 và 9. - Các đĩa môi trưòng vói các nguồn cacbon, nitơ riêng biệt (xem các công thức sau). Công thức môi trường nuôi cấy v s v ỏ thí nghiệm 10.1 (g/1 nước cất 2 lần). Thảnh phần mỏi tarờng MT 1 M T2 M T3 M T4 K 2 HPO 4 0 ,8 0 .8 0 .8 0 .8 KH,PƠ 4 0 ,2 0 .2 0 .2 0 ,2 MgS04.7Hj,0 0,5 0 .5 0 ,5 0 .5 PeCla.eHp 0 .1 0 .1 0 .1 0 .1 CaCOa 5.0 5 .0 5 ,0 5 .0 Na2Mo0^.2H20 0 .0 5 0 .0 5 0 .0 5 0 ,0 5 G lucoza 1 0 .0 - - - Xeniuloza - 10 .0 - - Pepton - - 10 - (NH,)jSO, - - - 5 .0 93
  17. PhưoTng p h á p 10.1. NHU CẦU VỀ NGUỔN CACBON VÀ NITƠ - Nhận các đĩa môi trưòng MT 1 - 4, đã làm khô mặt thạch và có kí hiệu từng loại môi trưòng. Không được mỏ nắp hộp petri khi chưa cấy v s v . - Úp sấp hộp petri, dùng bút viết kính chia mặt đáy phía ngoài của đĩa môi trường làm 2 phần đều nhau. Ghi kí hiệu 1, 2 vào từng ô. - Khử trùng que cấy, đợi nguội, lấy một ít tế bào AzotobojCter sp. hé mỏ nắp hộp petri cấy vào phần môi trưồng số 1. Có thể cấy tế bào v s v thành hình dấu chấm hoặc đưòng thẳng sao cho các vết cấy cách xa nhau. Sở dĩ như vậy là vì sau 2 - 7 ngày nuôi cấy số lượng tế bào v s v có thể tăng lên nhiều lần lan trên mặt thạch khiến cho các loại v s v phát triển ìẫn lộn rất khó đánh giá kết quả. - Khử trùng que cấy, lấy tế bào B. subtilis cấy vào ô thứ 2. - Các môi trưòng được cấy lần lượt theo thứ tự M T l, MT2, MT3, MT4. - Úp sấp và bao gói các hộp petri đã cấỵ vi sinh vật bằng giấy sạch. Ghi tên nhóm làm thí nghiệm và ngày cấy. Đặt cáo gói trong tủ ấm 30°c / 2-7 ngày. - Quan sát sự phát triển cùa các loại vsv trên các môi trưòng thí nghiệm. Tưòng trình kết quả. 10.2. N H U C Ầ U V Ề O X I - Ngâm các ống thạch thiogỉicoỉat vào nước sôi nhằm làm lỏng thạch. Sau đó cắm các ống vào giá ống nghiệm làm nguội 94
  18. trong không khí tới 45°c (áp ống nghiệm vào má thấy nóng ấm là được). - Sao chép tên ống giống lên thành ông môi trưdng. Có thể dùng chữ số 1, 2, 3... để kí hiệu ống giống (cần ghi mã số vào vở (lể tiện cho việc tường trình kết quả). - Lần lượt cấy riêng rẽ các chủng vi khuẩn sau vào từng ống thạch đứng: B. suhtilis E.coli, L.buỉgarỉcus, Sarcina lutea, C.hutyricum. - Cách cấy: khử trùng que cấy, đợi nguội, lấy một ít tế bào vi khuẩn từ ống giống đưa vào tận phần đáy của ống môi trường, lắc nhẹ que cấy để vi khuẩn hòa đều vào thạch, rút que cấy ra, đậy nút bông, khử trùng lại que cấy trưóc khi cắm vào giá. Ống đối chứng không cấy bất kì loại v s v nào cả. - Sau khi cấy đặt ống vào lòng 2 bàn tay, xoay nhẹ để vi khuẩn đưi.k; phân bố rộng hơn trong ống thạch. Làm nguội nhanh ống t.lư nghiệm bằng cách cám vào các cốc nưâc lạnh và sạch để vi khuẩn không bị tổn thưdng do giữ lâu ởnhiệt độ 45“c. - Nếu chưa cấy kịp mà ống thạch đã nguội và đông đặc, cần ngâm trỏ lại vào nồi nước sôi khoảng 5- 10 phút và làm nguội tới 45*^C trưôc khi cấy. - Nuôi cấy ở nhiệt độ 3(fC/2 ngày. Quan sát vị trí sinh trưởng của vi khuẩn trong ống nghiệm. So sánh với hình chuẩn để xác định nhu cầu của vi khuẩn đôi vói oxi. 10.3. PHẠM VI NH IỆT ĐỘ - Nhận 4 đĩa môi trưòng NA đă làm khô mặt thạch. Dùng bút viết kính chia mặt đáy phía ngoài của đĩa petri thành 3 phần đều nhau. Ghi kí hiệu và lần lượt cấy các vi khuẩn: E.coli, 95
  19. B. subtilis s. cerevisỉae theo hình dấu chấm hoặc vạch thảng vào các ô tương ứng, các vết cấy cần cách xa nhau. - Ghi kí hiệu nhiệt độ thí nghiệm lên nắp hộp petri. úp pấp và bao gói riêng rẽ từng hộp petri đâ cấy vi khuẩn bằng giấy sạch. ♦ - Một lần nữa ghi kí hiệu nhiệt độ thí nghiệm và tên nhóm làm thí nghiệm lên giấy bao gói. - Đặt các hộp petri vào tủ có nhiệt độ: lO^C, 24^c, 37“c 45°C/2 ngày. - Quan sát sự phát triển của v s v trên các vết cấy, ghi kết quả. 10.4. PHẠM VI pH THÍCH HỢP - Nhận các đĩa thạch YEG có kí hiệu các giá trị pH 4. 5, 6, T và 9. Dùng bút viết kính chia mặt đáy của cRa petri làm 4 phầìi bằng nhau. Ghi kí hiệu và lần lượt cấy các chủng vi sinh vật: B. subtilis, L. bulgaricus, s. griseus, s. cerevỉsỉae theo hình dấu chấm hoặc vạch thẩng. úp sấp hộp, bao gói bằng giấy sạch, đật trong tủ ấm 30°C/2 ngày. Quan sát sự sinh trưởng của các chủng vi sinh vật trên đĩa thạch và ghi kết quả. 10.5. THẨM ÁP - Nhận cẩc đĩa thạch NA, NA + 5%, NA + 10%, NA + 20% đường kính. Chia mặt đáy phía ngoài của đĩa thạch làm 2 phẩn, cấy B. subtiỉỉs và S.cerevisiae vào các ô tương ứng. úp sấp và bao gói các đĩa thạch. Để trong tủ ấm 30°C/2 ngày. Quan sát sinh trưởng của các chủng vi sinh vật và ghi kết quả. 96
  20. ĩ^ - • ^ « » •'V * * \-• ##1' (a) (b) (C) (d) (c) H ìn h 16: N hu cẩ u v ề o x i đ uợ c b iể u th ị qua s ự s in h tru ở n g củ a v i k h u ẩ n trong ố n g thạch th io g ìỉc o ía t (íi) hiếu khi (aerohe) - sinh trưởng chỉ ở bề mặt thạch nơi tiếp xúc vỏi không khi. (b) kị khí bắt b u ộ : (obligate anaerobe) - sinh trưởng chì ở phần đáy ống nghiệm . (c) kị khi - chịu khi (aerotolerant anaerobe) - sinh truởng đều khắp ừong ống nghiệm. (d) kị khí tùy tiện (tacultative anaerobe) - sinh trưởng tốt nhất ở vùng thạch tiếp x iiC VỚI không khi nhưng cũng sinh trưởng khắp ống, (tì) vi hiếu khi (microaerophile) - sinh trưởng ở vùng gần m ặt thạch nhưng không phải ỏ trên mặt thạch chỗ tiếp xúc với không khi. CÂU HỎI 1- Hây chỉ rõ chất nào được sử dụng làm nguồn cacbon, mtd trong các môi trưàng M T l, MT2. MT3, MT4? 2- Giải thích vì sao trong ống nghiệm thạch đứng thioglicolat vi khuẩn kị khí tùy tiện sinh trưởng mạnh hơn ỏ phần thạch tiếp xúc không khí so với ỏ phần khác? (Xem lại phần hô hấp và lên men trong giáo trình lí thuyết) 3- Điều gì cản trỏ v s v kị khí nghiêm ngặt sinh trưởng ở phần đỉnh của thỏi thạch? 4- ở thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thẩm áp, kết quả sẽ như thế nào nếu dùng glucoza thay thế sacaroza? 97
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2