Giáo trình Vi sinh vật học part 9

Chia sẻ: Afasg Agq | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:26

0
163
lượt xem
53
download

Giáo trình Vi sinh vật học part 9

Mô tả tài liệu
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Tham khảo tài liệu 'giáo trình vi sinh vật học part 9', khoa học tự nhiên, nông - lâm phục vụ nhu cầu học tập, nghiên cứu và làm việc hiệu quả

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Giáo trình Vi sinh vật học part 9

  1. 213 Bảng 10.3: Một số enzyme hạn chế, dạng vết cắt và nguồn gốc của chúng Enzyme Trình tự điểm nhận biết Nguồn gốc Eco RI 5'-G↓AA*TTC Escherichia coli RY 13 Hha I 5'-GC*G↓C Haemophilus haemolyticus Ba I I 5'-TGG↓C*CA Brevibacterium albidum Hae III 5'-GG*↓CC Haemophilus aegypticus Bam HI 5'-G↓GATCC Bacilus amyloliquefaciens H Hind III 5'-A↓AGCTT Hemophilus influenzae Rd Kpn I 5'-GGTAC↓C Klebsiella pneumoniae Mbo I 5'-↓GATC Moraxella bovis Hình 10.3 : Hai dạng đầu cắt của enzyme hạn chế loại II: a) cắt hình thành đầu tầy và b) cắt hình thành đầu dính. V. Biến dị 1. Biến dị kiểu hình Biến dị kiểu hình còn gọi là thường biến, là hiện tượng có sự khác biệt về cấu trúc cũng như đặc điểm phát triển giữa thế hệ con cái so với thế hệ bố mẹ cũng như giữa chúng với nhau dưới tác động của môi trường và không liên quan đến sự thay đổi vật chất di truyền. Đây là những biến dị tạm thời, thuận nghịch và không ổn định của toàn bộ quần thể sinh vật. Những biến dị này xuất hiện chậm và mất đi khi các yếu tố làm xuất hiện chúng mất đi. Bản chất của biến dị kiểu hình là hiện tượng trội - lặn của gen sẵn có trong tế bào dưới tác động cảm ứng của môi trường. Khi môi trường mất đi yếu tố cảm ứng thì tính trạng đã từng hình thành cũng trở nên không biểu hiện nữa (gen trở nên lặn). Biến dị kiểu hình, như vậy, có những tính chất sau: tính tạm thời (không ổn định), tính thuận nghịch và tính toàn bộ. Ở vi khuẩn, biến dị kiểu hình có thể biểu hiện dưới một số hình thức. Biến dị hình thái trong quá trình sinh sản thường xảy ra biến dị về kích thước của tế bào. Tế bào vi khuẩn E. coli nuôi cấy được 5 - 6 giờ trong môi trường và điều kiện thích hợp sẽ dài ra trước khi phân bào. Trái
  2. 214 lại chúng sẽ trở nên nhỏ hơn khi vào trong giai đoạn phát triển tối đa, và có kích thước tối thiểu khi mất khả năng sinh sản. Hoặc biến dị hình thái dưới ảnh hưởng của ngoại cảnh như cấu trúc hóa học của môi trường làm cho vi khuẩn có những hình thái khác nhau, vi khuẩn trở nên mập hơn nếu được nuôi cấy trong môi trường giàu chất dinh dưỡng, trái lại hình thành những dạng tế bào mảnh hoặc dạng cầu bất thường khi nuôi cấy trong môi trường nghèo chất dinh dưỡng. Sức căng bề mặt của môi trường cũng như độ Acid (pH) môi trường tăng làm hình thành những vi khuẩn mập hơn, ngắn hơn. Ở nhiệt độ 37 °C Brucella, chẳng hạn, có dạng rất ngắn, hình thoi hoặc dạng cầu khuẩn nhỏ trong khi nuôi cấy ở nhiệt độ thấp hơn tế bào thường dài, mảnh. Những chất ức chế ở nồng độ thấp có khả năng biến đổi hình thái của vi khuẩn. Tương tự, nhiều nấm gây bệnh thường biểu hiện hai dạng hình thái khác nhau, thường gọi là nấm nhị hình. Chúng có dạng hình cầu (dạng nấm men) khi ở trong nội quan động vật mắc bệnh nhưng có dạng sợi khi nuôi cấy trên môi trường nuôi cấy nhân tạo hay ở môi trường ngoài, ví dụ, Aspergillus fumigatus, Coccidoides immitis, Histoplasma farsimosa,... Biến đổi hình thái do thường biến còn biểu hiện ở dạng khuẩn lạc. Những vi khuẩn cùng loài khi phát triển trên môi trường đặc có thể hình thành khuẩn lạc láng (dạng S) hoặc nhám (dạng R) hoặc những dạng trung gian. Biến dị kiểu hình còn thể hiện ở hiện tượng dung nạp thuốc và khả năng hình thành enzyme để sử dụng các yếu tố môi trường. Tiếp xúc lâu ngày với nồng độ thấp chất kháng sinh có thể dẫn đến việc hình thành những chủng vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh do gen lặn được cảm ứng trở nên trội (mặc dù trong đa số trường hợp sự xuất hiện tính đề kháng với thuốc kháng sinh là do đột biến hoặc vận chuyển và tái tổ hợp thông tin di truyền). Trong trường hợp thường biến kháng thuốc các gen tổng hợp yếu tố đề kháng (thường là enzyme phân giải thuốc kháng sinh hoặc các hợp chất làm thay đổi các lỗ khổng trên màng tế bào chất) từ trạng thái bị ức chế được cảm ứng mà chuyển thành dạng hoạt động tức trở thành khuôn tổng hợp các protein tương ứng. 2. Biến dị kiểu gen Khái niệm biến dị kiểu gen ở sinh vật đa bào thường được coi là đồng nhất với khái niệm đột biến (mutation). Tuy vậy, ở vi sinh vật, thường là đơn bào, thì khái niệm biến dị kiểu gen phải được hiểu rộng hơn và như là sự hình thành các biến chủng có thể là kết quả của đột biến (biến đổi cấu trúc genome sẵn có) hoặc của quá trình tiếp nhận vật chất di truyền từ bên ngoài (thường tiếp theo sau là quá trình tái tổ hợp thông tin di truyền vào genome nhiễm sắc thể).
  3. 215 2.1. Đột biến Đột biến là sự hình thành các cá thể có những chi tiết (cấu trúc, phát triển) khác biệt so với thế hệ cha mẹ liên quan đến sự biến đổi vật chất di truyền. Biến dị này là những biến đổi đột ngột, xuất hiện một cách ngẫu nhiên, không dự tính trước được và không liên tục ở một số cá thể hiếm hoi (tần suất xuất hiện ở vi khuẩn: 10-8 - 10-6) của một quần thể vi sinh vật. Chúng tương đối độc lập với môi trường chung quanh, có tính cố định, tính bền vững và tính di truyền. Tính gián đoạn của đột biến là sự thay đổi xảy ra một cách hoàn chỉnh trong một thời hạn, thường là một lần phân bào. Tính hiếm của đột biến là hiện tượng tất cả các đột biến đều xảy ra với tần suất hết sức thấp và xảy ra không đều. Trong những điều kiện nhất định xác suất xuất hiện đột biến nào đó được biểu diễn như là tỷ số tế bào hình thành đột biến trong tập đoàn vi khuẩn giữa hai lần phân chia tế bào. Tần suất này ở vi khuẩn khoảng 10-7 (10-8- 10-5). Tính vững bền của đột biến là sự xuất hiện một biến chủng nếu tồn tại được trong điều kiện ngoại cảnh xác định thì tính trạng mới được duy trì và truyền sang thế hệ tiếp theo. Mặc dù vậy, trong nhiều trường hợp có thể xuất hiện những đột biến biến đảo (conversion). Biến đảo không nhất thiết có cùng tần suất xuất hiện của đột biến ban đầu nhưng chúng cũng hiếm, gián đoạn và di truyền. Tính ngẫu nhiên của đột biến có nghĩa là sự hình thành biến chủng đột biến trước khi có những yếu tố chọn lọc tác động đến, mặc dù cũng có những đột biến do cảm ứng với các yếu tố chọn lọc. Trong nghiên cứu vi khuẩn, để kiểm tra sự hình thành một biến chủng nào đó người ta phải sử dụng yếu tố chọn lọc để tuyển chọn những dòng vi khuẩn có thuộc tính khác biệt nhờ kìm hãm những vi khuẩn không có thuộc tính đề kháng chất chọn lọc. Thí nghiệm của Lederberg (1952) với một chủng E. coli pha loãng phân nhỏ ra ống nghiệm và pha loãng mà không phân nhỏ (vẫn để trong bình lớn) để nuôi cấy chuẩn bị trước khi cấy lên đĩa thạch môi trường có chất cảm ứng chọn lọc (streptomycin) chứng minh rằng đột biến xảy ra ngay cả khi không tiếp xúc với yếu tố chọn lọc (chất kháng sinh). Tính đặc hiệu của đột biến còn hiểu là tính độc lập của đột biến. Một tính trạng mới xuất hiện thường không ảnh hưởng đến sự hình thành tính trạng đột biến khác. Tần suất xuất hiện một đột biến kép (ví dụ, đột biến đề kháng cả penicillin và streptomycin) là tích số các tần suất tương ứng. Ví dụ, tần suất xuất hiện biến chủng đề kháng một chất kháng sinh là 10-7 và tần suất xuất hiện biến chủng đề kháng chất kháng sinh khác là 10-
  4. 216 8 thì tần suất xuất hiện một biến chủng đề kháng cả hai thuốc trên là 10-15. Như vậy, phối hợp hai thuốc trên có thể làm giảm khả năng chọn lọc những biến chủng kháng thuốc hơn là sử dụng các thuốc kháng sinh riêng rẽ. Nguyên nhân đột biến có thể là do các yếu tố hóa học và vật lý ion hóa hoặc gắn kết hóa trị với cầu nối giữa hai chuỗi monomer của DNA xoắn kép (tia tử ngoại tạo dimer thymine, actinomycin D, ethidium bromide, bromouracine, 2-aminopurine, ethyl- hoặc methyl- metasulfonate, dimethyl- hoặc diethylmetasulfonate, N-methyl-N-nitro- N-nitroso-guanidine, ethyleneimine, acid nitrơ,...). Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp khó có thể phát hiện và kiểm soát được các nguyên nhân gây nên nhiều đột biến. Người ta gọi chúng là đột biến do ngẫu nhiên. Bản chất của đột biến: Bộ nucleotide của DNA thuộc một gen là một mật mã thông tin, nó tương ứng với cấu trúc một protein đặc hiệu. Mọi thay đổi của bộ này dẫn đến sự thay đổi cấu trúc và chức năng của protein đó, hình thành một tính trạng đột biến. Đột biến là những thay đổi ở tầm phân tử. Mọi đột biến dù là ngẫu nhiên hay do cảm ứng thì sự thay đổi của bộ nucleotide có thể xảy ra hai kiểu: thêm, bớt hoặc thay thế một đôi bazơ bằng một đôi bazơ khác (đột biến điểm) hoặc thêm, bớt hoặc thay thế một đoạn DNA bằng một đoạn DNA khác (đột biến đoạn). Mặc dù đột biến đoạn thường khá gặp, như hiện tượng khuyếch đại gen, nhưng do tính phổ biến của đột biến điểm nên người ta thường đồng nhất khái niệm đột biến điểm với đột biến. Đột biến này thường không biến đảo. Đột biến điểm tuy nhỏ nhưng thường góp phần quan trọng trong quá trình tiến hóa. Khi một bazơ bị mất hoặc được chèn thêm vào trình tự của gen cấu trúc sẽ xuất hiện sự thay đổi mạnh mẽ trong cấu trúc protein do thay đổi toàn bộ trình tự Acid amin trong thành phần chuỗi polypeptide kể từ vị trí thêm điểm hay mất điểm (đọc theo hướng 5'→3' của RNA thông tin). Biến đổi này được gọi là sự chuyển dịch khung (frame shift). Trong đa số trường hợp, đặc biệt đột biến điểm ở vị trí đầu 5' của sợi dương của gen cấu trúc, cũng là đầu 5' của RNA thông tin, những biến chủng này thường mất khả năng sống nếu biến dị xảy ra trên gen thiết yếu (house-keeping genes) của sinh vật do cấu trúc (hóa học cũng như không gian) protein thay đổi dẫn đến mất chức năng vốn có (cấu trúc, enzyme, kích thích, thụ thể,...) của nó. Đột biến thế điểm (GC→AT và ngược lại) ngược lại là đột biến thường gặp nhưng ít biểu hiện ra bên ngoài và thường khó phát hiện. Khi DNA gen được phiên thành RNA thông tin, điểm đột biến thế điểm không làm thay đổi khung đọc của phần lớn chiều dài của chuỗi RNA thông tin. Vì vậy thành phần của chuỗi polypeptide chỉ thay đổi tại một vị trí tương ứng với điểm đột biến trên gen. Khi đó, nếu Acid amin mới đó khác nhiều
  5. 217 so với Acid amin nguyên thủy về thuộc tính phân cực, tính ái thủy và tính phản ứng thì tính chất nguyên thủy của protein bị thay đổi dẫn đến chức năng cũ của protein bị mất. Hiện tượng này biểu hiện trầm trọng nếu acid amin thay thế nằm ở trung tâm hoạt động của một enzyme thiết yếu, kết quả có thể là biến chủng không thể tồn tại. Trong trường hợp Acid amin thay thế không có sự khác biệt nhiều so với acid amin nguyên thủy hoặc đột biến tạo mật mã thoái hóa (nhiều mã bộ ba nucleotide cho một acid amin) thì đột biến không biểu hiện tính trạng và tích lũy lặn trong quần thể. Đây thường là nguyên nhân của sự hình thành loài mới trong quá trình tiến hóa. Chủng loại đột biến thường gặp khá phong phú. Có thể gặp đột biến hình thái như đột biến dạng khuẩn lạc, thay đổi khả năng sinh sắc tố hoặc khả năng hình thành nha bào. Đặc biệt có thể gặp các đột biến khuyết dưỡng hay tự dưỡng (auxotrophic mutants): các chủng đột biến này mất khả năng phát dục nếu trong môi trường thiếu một yếu tố nào đó. Ngược lại, một số đột biến dẫn đến việc tăng khả năng tổng hợp các yếu tố sinh trưởng hay các hợp chất khác như Acid amin,... (đồng nghĩa với việc mất khả năng điều tiết sản xuất thừa). Các đột biến khác cũng thường gặp ở vi khuẩn là đột biến thay đổi khả năng lên men, khả năng sử dụng các đường, đột biến gây vững bền đối với các nhân tố ức chế dẫn đến thay đổi độc lực, thay đổi tính kháng nguyên hoặc sự mẫn cảm đối với kháng sinh hoặc tia tử ngoại, v.v... 2.2. Sự vận chuyển và tái tổ hợp thông tin di truyền Có ba cơ chế vận chuyển di truyền khác nhau ở vi khuẩn: Biến nạp (còn gọi là chuyển thể - transformation), tải nạp (transduction, còn gọi là chuyển nạp) và tiếp hợp (conjugation, còn gọi là tiếp nạp hay giao phối). Những cơ chế đều có đặc điểm là vận chuyển di truyền theo một chiều từ tế bào này sang tế bào khác mà không có chiều ngược lại, và tế bào cho (donor) chỉ vận chuyển một phần di truyền, trừ một vài ngoại lệ ít gặp trong những trường hợp vận chuyển nhiễm sắc thể do sự tiếp hợp. Mỗi cơ chế vận chuyển này đều có đặc tính riêng quyết định sự truyền những yếu tố di truyền từ tế bào cho sang tế bào nhận. Trong quá trình biến nạp chất liệu di truyền là những mảnh DNA tự do. Hiện tượng chuyển nạp là do các phage đưa mảnh nhiễm sắc thể từ một tế bào phage đã ký sinh và dung giải trước đây cho một tế bào khác. Khác với sự vận chuyển di truyền trong biến nạp và tải nạp, hiện tượng giao phối là sự phối hợp giữa hai vi khuẩn có giới tính khác nhau, hay là sự vận chuyển từ vi khuẩn đực sang vi khuẩn cái. 2.2.1. Biến nạp (Transformation)
  6. 218 Biến nạp (hay chuyển thể) là sự vận chuyển thông tin di truyền nhờ sự xâm nhập của các phân tử DNA tự do (có nguồn gốc từ tế bào cho đã phân giải) vào tế bào nhận làm cho genome của tế bào nhận thay đổi. Kết quả của biến nạp phụ thuộc vào mức độ tương đồng trong cấu trúc phân tử DNA của tế bào cho và tế bào nhận. Vì vậy sự biến nạp thường có kết quả hơn trong giới hạn một loài có các cá thể có những tính trạng khác nhau. Điều kiện biến nạp: Quá trình biến nạp chỉ xảy ra trong khi các vi khuẩn nhận ở một tình trạng sinh lý đặc biệt (ở khoảng 1 - 15% tế bào ở quần thể, thông thường ở giai đoạn phát triển giảm). Tình trạng này đã làm thay đổi các tính chất bề mặt tế bào nhận có các yếu tố cảm ứng enzyme đặc biệt trên đó các đoạn phân tử DNA có thể xâm nhập được. Trên bề mặt tế bào nhận có các yếu tố cảm ứng để cho đoạn DNA có thể cố định. Có chừng 30 - 70 vùng cảm ứng như thế. Đoạn DNA đã nhập vào tế bào được tách đôi, và một mạch đơn được ghép vào nhiễm sắc thể của tế bào nhận. Quá trình này được gọi là sự tái tổ hợp (recombination). Tần suất tái tổ hợp phụ thuộc vào đặc tính các đoạn nhiễm sắc thể khác nhau, vào sự tương đồng các phân tử DNA. Biến nạp tự nhiên thường diễn ra ở họ Enterobacteriaceae. Trong điều kiện thí nghiệm tần suất biến nạp tăng cao nhờ tế bào được xử lý làm thay đổi màng tế bào chất (như xử lý polyethylene glycol) và gây sốc nhiệt (chuyển tế bào từ nhiệt độ 0°C sang nhiệt độ 40 - 50°C trong vòng 50 - 60 giây). Griffith là người đầu tiên đã phát hiện sự biến nạp ở phế cầu khuẩn (Streptococcus pneumoniae, tên cũ là Diplococcus pneumoniae hay pneumococcus) vào năm 1928. Vi khuẩn này có hai dạng khác nhau. Dạng gây bệnh cho động vật hình thành khuẩn lạc láng ký hiệu là S. Dạng không gây bệnh hình thành khuẩn lạc nhám ký hiệu R. Nếu tiêm vi khuẩn sống chủng S thì làm chuột nhắt chết, tiêm S chết do qua xử lý nhiệt (hơ nóng) thì chuột vẫn sống, còn tiêm vi khuẩn chủng R sống cho chuột thì chuột vẫn sống, nhưng tiêm R sống đồng thời với tiêm S chết lại làm chuột chết và sau đó trong máu chuột chết phân lập được chủng S đặc trưng. Các thí nghiệm sau đó (Avery, MacLeod và McCarty, 1944) cho thấy nếu xử lý dịch S chết được tinh chế vẫn có năng lực biến nạp in vitro và nếu xử lý bằng DNase thì làm mất hoạt tính biến nạp của dịch này trong khi xử lý bằng protease vẫn giữ nguyên tính biến nạp. Điều đó chứng minh rằng DNA, chứ không phải protein, là vật chất mang thông tin di truyền. Cho đến nay, những tính trạng được biến nạp được biết là khả năng tổng hợp yếu tố sinh trưởng, khả năng sử dụng đường để sinh trưởng, khả năng kháng thuốc, khả năng sinh độc tính,... Hiện tượng này được vận dụng rộng rãi trong kỹ thuật di truyền.
  7. 219 2.2.2. Sự tải nạp (chuyển nạp - transduction) Tải nạp là sự vận chuyển vật chất di truyền nhờ phage (bacteriophage hay thực khuẩn thể) là các virus ký sinh vi khuẩn. Có hai loại phage. Các phage độc làm tan vi khuẩn ký chủ đặc hiệu trong khi các phage ôn hòa không làm tan vi khuẩn. Tuy vậy, các phage ôn hòa có hai giai đoạn thay thế nhau trong chu trình phát triển, chúng có thể trở thành phage độc khi môi trường có tác nhân (hóa, lý) gây đột biến. Khi phage hấp bám lên màng tế bào vi khuẩn đặc hiệu bằng thụ thể ở lông đuôi, ATP-ase ống đuôi của phage được hoạt hóa phân giải ATP giải phóng năng lượng làm co rút vỏ đuôi, kết quả là ống đuôi chọc thủng màng tế bào chất vi khuẩn và làm DNA phage theo ống đuôi này xâm nhập vào tế bào chất vi khuẩn. Sau khi xâm nhập DNA, phage độc tồn tại độc lập trong tế bào chất, điều khiển quá trình tổng hợp protein phage, DNA phage và làm phân hủy DNA của vi khuẩn. Trong quá trình lắp ráp vỏ protein phage thường bao bọc DNA phage nhưng trong nhiều trường hợp vỏ protein phage lại chứa mảnh DNA vi khuẩn (và tạo thành phage khuyết tổn hay phage thui: abortive phage). Khi giải phóng ra ngoài cùng các phage khác do dung giải tế bào, phage khuyết tổn này lại tiếp tục hấp bám lên tế bào mới và đưa đoạn DNA của tế bào cũ vào tế bào mới. Ở một số phage được gọi là phage ôn hòa, sau khi xâm nhập vào tế bào chất vi khuẩn, DNA ấn nhập vào cấu trúc phân tử DNA nhiễm sắc thể của vi khuẩn ở dạng tiền phage (prophage). Ở trạng thái episome này bộ gen của phage ôn hòa được truyền cho các thế hệ sau của vi khuẩn tương tự các gen khác của nhiễm sắc thể. Các vi khuẩn mang prophage được gọi là vi khuẩn dung nguyên (lysogenic bacteria) do những vi khuẩn này mang mầm mống của quá trình dung khuẩn sau này, khi chuyển sang trạng thái độc. Vi khuẩn dung nguyên tiếp tục sinh trưởng bình thường, tuy nhiên khi gặp điều kiện môi trường có các yếu tố gây đột biến thì phage chuyển sang trạng thái độc làm vi khuẩn dung giải. Khi đó prophage tự sao chép thành những phiên bản ở trạng thái độc lập trong tế bào chất và bắt đầu chu trình dung giải vi khuẩn. Trong quá trình sao chép đó các phage mới hình thành có thể mang theo DNA của phage và đoạn DNA (nằm kề bên) của nhiễm sắc thể vi khuẩn. Khi xâm nhập vào tế bào mới, các phage mang gen nhiễm sắc thể thực hiện chức năng vật mang chất di truyền từ tế bào cho (ký chủ trước) sang tế bào nhận (ký chủ sau). Sự tải nạp phổ biến rộng rãi và được nghiên cứu kỹ ở vi khuẩn họ Enterobacteriaceae. Ở E. coli đó là các phage T và P-1, ở Shigella P-1, ở Salmonella typhimurum P-22. Các phage tải nạp ở Staphylococcus, Pseudomonas và Proteus cũng biết đến. Quá trình tải nạp có thể vận chuyển một hoặc một số gen bất kỳ như nêu trên được gọi là tải nạp
  8. 220 chung hay tải nạp không đặc hiệu (như tải nạp do phage P-1 và P-22 ở E. coli, Shigella và Salmonella. Nhiều phage chỉ có thể tái tổ hợp vào một vị trí (locus) nhất định trong genome ký chủ. Chính vì vậy chúng chỉ có thể vận chuyển những gen phân bố gần locus này mà thôi. Hiện tượng này gọi là tải nạp đặc hiệu. Phage lambda (λ) ở E. coli, ví dụ, chỉ vận chuyển những gen nằm kề locus galactosidase (Gal) là vị trí phage này tái tổ hợp vào genome ký chủ. Tương tự, phage Φ-80 cũng ở E. coli có thể tái tổ hợp vào gần locus điều khiển tổng hợp tryptophan và sau đó tải nạp yếu tố này một cách đặc hiệu. Khi nghiên cứu sự tải nạp ở Salmonella người ta còn phát hiện được sự tải nạp khuyết (abortive transduction). Chẳng hạn, trường hợp một đoạn nhiễm sắc thể điều khiển tổng hợp các purine được phage tải nạp sang tế bào nhận không tái tổ hợp với nhiễm sắc thể mà tồn tại tự do trong tế bào chất ở dạng gen ngoài (extragene) và không tự sao chép. Khi đó vi khuẩn trở nên có khả năng phát triển trên môi trường không có hợp chất này và thể hiện kiểu hình là các khuẩn lạc nhỏ mọc trên môi trường tổng hợp không chứa purine. Lý do của quá trình này là gen tổng hợp purine không sao chép được trong mỗi lần vi khuẩn phân bào nên chỉ một tế bào vi khuẩn duy nhất mang tính trạng tổng hợp purine trong quần thể (để phát triển và có thể hỗ trợ tế bào bên cạnh). Một số phage ôn hòa khi làm dung nguyên hóa vi khuẩn có khả năng làm thay đổi các kháng nguyên vi khuẩn nhận. Khi tải nạp, một đoạn nhiễm sắc thể điều khiển tổng hợp kháng nguyên thân được truyền theo điều khiển tổng hợp kháng nguyên thân ở tế bào nhận, sau khi được ấn nhập vào tế bào nhận (vốn không có kháng nguyên này). Hiện tượng tải nạp đoạn gen điều khiển độc tố được phát hiện ở Corynebacterium diphtheriae. Ở loài vi khuẩn này chỉ có những tế bào dung nguyên có khả năng tổng hợp ngoại độc tố biểu hiện độc tính: gây sốt và các hiện tượng bệnh lý khác ở người (bệnh bạch hầu). Nói chung, ở vi khuẩn chuyển nạp đóng vai trò trong lan truyền độc tính, lan truyền kháng nguyên thân (gây phản ứng chéo miễn dịch) và nâng cao khả năng tổng hợp các chất yếu tố sinh trưởng. 2.2.3. Tiếp hợp (hay tải nạp, giao phối - conjugation) Tiếp hợp là quá trình vận chuyển thông tin di truyền bằng cách tiếp xúc trực tiếp các tế bào cho và nhận nguyên vẹn về mặt sinh lý. Quá trình truyền vật chất di truyền chỉ diễn ra một chiều từ tế bào đực (F+) sang tế bào cái (F-). Điều này được Lederberg và Tatum chứng minh lần đầu tiên vào năm 1964 trên các biến chủng E. coli K-12. Khả năng cho của tế bào đực quyết định bởi sự có mặt của yếu tố di truyền ngoài nhiễm sắc thể là
  9. 221 F (fertility factor, sex-factor, yếu tố giới tính). Các thuật ngữ "tế bào đực" và "tế bào cái" được dùng theo hệ thống định danh hiện đại từ năm 1976. Trên bề mặt của tế bào F+ có các nhung mao đặc biệt - pili giới tính, có thể hấp thụ các phage đặc biệt. Số lượng pili giới tính rất ít (khoảng 2 - 3). Đường kính trong khoảng 25Åcó thể cho phép sợi DNA của tế bào đi qua khi nó tiếp xúc với tế bào nhận. Yếu tố ngoài nhiễm sắc thể điều khiển quá trình tiếp hợp gọi là các plasmid tiếp hợp (conjugative plasmid). Những plasmid này có thể điều khiển sự vận chuyển DNA của chính nó hoặc định hướng vận chuyển nhiễm sắc thể khi nó nằm ở trạng thái liên kết với nhiễm sắc thể đó. Ngoài yếu tố giới tính F còn có các plasmid tiếp hợp khác như plasmid điều khiển sự đề kháng của vi khuẩn đối với một số thuốc (plasmid R). Plasmid điều khiển tổng hợp colicin (col j, col v2, colv 3), plasmid điều khiển tổng hợp enterotoxin ở E. coli, plasmid Hly điều khiển sự tổng hợp hemolysin, hemotoxin, có plasmid độc tố vir, cũng như plasmid điều khiển tổng hợp kháng nguyên K-88 (tức F4), K-99 (tức F5) và một vài plasmid khác. Quá trình tiếp hợp của plasmid F tái tổ hợp trong DNA mạch vòng của nhiễm sắc thể bắt đầu từ khi hai tế bào đực và cái tiếp xúc nhau. Khi đó, một mạch của đoạn nhiễm sắc thể ở kề bên yếu tố F bị cắt và duỗi ra mà trở nên có cấu trúc thẳng. Đầu nhiễm sắc thể tự do này tách ra và tự sao thành hai sợi, hướng về phía pili giới tính và được chuyển theo pili này sang tế bào F-. Bởi vì plasmid F nằm ở cuối chuỗi thẳng nhiễm sắc thể nên nó không được truyền qua tế bào F- vì trong quá trình tiếp hợp ngắn ngủi DNA nhiễm sắc thể thường bị đứt đoạn, và nhờ đó chỉ một phần nhiễm sắc thể của tế bào F+ được chuyển sang tế bào F-. Những chủng có tần suất biến nạp gen nhiễm sắc thể cao được gọi là chủng Hfr (chủng có tần suất biến nạp cao). Trong trường hợp pili giới tính tự do trong tế bào chất, hai hiện tượng có thể gặp là biến nạp một phần genome plasmid F hoặc biến nạp toàn bộ genome plasmid. Trong trường hợp đầu chỉ một số gen của plasmid F được chuyển sang và có thể tái tổ hợp vào nhiễm sắc thể tế bào nhận. Trong trường sau, tế bào nhận trở thành tế bào F+. Hiện tượng này được gọi là sự hùng hóa ("đực hóa") tế bào cái. 2.3. Tương tác các virus Tương tác các virus là hiện tượng thường gặp và góp phần thay đổi tính trạng cũng như khả năng phát triển của virus khi trong một tế bào đồng thời cảm nhiễm một số virus. Hiện tượng này có thể liên quan đến kiểu gen nhưng trong nhiều trường hợp ở các virus chỉ xảy ra liên quan đến kiểu hình. Tương tác kiểu gen có thể là: 1) tái tổ hợp, hoạt hóa đồng
  10. 222 loạt, dị hợp hóa, chuyển vỏ và tái hoạt hóa chéo. Tương tác kiểu hình có thể là pha trộn kiểu hình, tái hoạt hóa phi kiểu gen, tương bổ, kích thích và cản nhiễm (hay can thiệp cảm nhiễm). Tái tổ hợp là sự trao đổi vật chất di truyền giữa các thể virus khác biệt nhau về một số tính trạng cùng phát triển trong một tế bào. Kết quả là hình thành những thể lai mang một phần tính trạng của chủng gốc này và một phần tính trạng của chủng gốc khác. Ở virus động vật xương sống hiện tượng tái tổ hợp chỉ diễn ra khi các chủng virus gần gũi cùng cảm nhiễm một tế bào và tần suất xuất hiện phụ thuộc vào chủng loại hệ thống tế bào ký chủ. Tái tổ hợp là đặc tính chung của mọi virus nhưng việc phát hiện được thể lai là khó khăn và phụ thuộc vào nhiều điều kiện. Tần suất lai cao diễn ra ở một số virus RNA (orthomyxovirus, reovirus, oncornavirus) và ở tất cả các virus DNA hai sợi. Tái tổ hợp có thể truyền hàng loạt tính trạng: hoạt tính ngưng kết hồng cầu, tính đề kháng nhiệt và chất ức chế, độc tính đối với động vật, hoạt tính sinh sản trong phôi gà, hoạt tính enzyme và miễn dịch. Có thể xảy ra, chẳng hạn quá trình tái tổ hợp giữa các virus động vật và người trong thí nghiệm in vitro cũng như in vivo, điều này giải thích sự xuất hiện dịch cúm ở người cũng như khả năng người mắc bệnh cúm động vật do cúm động vật có thể tiếp nhận một số tính trạng (như mang thụ thể đối với tế bào người) bảo đảm tiếp tục xâm nhập và phát triển trong tế bào người. Bản chất của quá trình tái tổ hợp gen virus có thể là sự trao đổi từng đoạn và trao đổi trong đoạn kết quả là thể lai mang thông tin di truyền của cả hai chủng gốc. Hoạt hóa đồng loạt là quá trình thường diễn ra trong một tế bào cảm nhiễm đồng thời nhiều thể virus đã bị vô hoạt bởi bức xạ tử ngoại. Do tử ngoại chỉ gây đột biến một số phần của genome virus nên, trong một tế bào, các phần gen còn nguyên vẹn của các genome có thể trao đổi (tái tổ hợp) dẫn đến hình thành thể có đầy đủ những gen nguyên vẹn. Dị hợp hóa là hiện tượng khi một số thể virus có tính trạng khác nhau tái sản đồng thời trong một tế bào có thể hình thành những virion mang toàn bộ genome của một virus và một phần hoặc toàn bộ genome của virus thứ hai. Mặc dù sự kết hợp genome trên không di truyền nhưng nó cho phép các virus sản sinh thế hệ mới, trong đó một số virion mang tính trạng của một virus khởi nguyên loại này còn một số khác mang tính trạng của virus khởi nguyên loại khác. Những virus trên được gọi là dị hợp thể và khác với các virus đồng thể ở chỗ các virion thế hệ con không đồng nhất. Hiện tượng dị hợp hóa có thể quan sát trong các thí nghiệm với virus cúm và virus bệnh Newcastle. Thí nghiệm cũng đã chỉ ra rằng có thể đun nóng làm biến tính DNA virus làm mạch đôi chuyển thành mạch đơn và khi để nguội thì mạch đôi lại tự phục hồi. Nếu trong dung
  11. 223 dịch tồn tại hai loại virus thì có thể hình thành những thể dị hợp mang genome hỗn hợp của hai virus khởi đầu. Chuyển vỏ (transcapsidation) là hiện tượng genome của một virus được ấn nhập vào vỏ của virus khác có khả năng bảo tồn ở trạng thái ổn định trong tế bào mẫn cảm với virus khởi nguồn. Hiện tượng này có thể gặp khi nuôi cấy vào tế bào đồng thời adenovirus và virus SV-40 của khỉ. Hoạt hóa chéo là hiện tượng genome tương tự tái tổ hợp nhưng một trong hai virus tham gia ở dạng nguyên vẹn còn virus kia đã bị vô hoạt do hư tổn một phần genome (đun nóng hoặc chiếu tử ngoại). Trong trường hợp này phần genome của virus bị vô hoạt có thể tham gia tái tổ hợp với genome virus bình thường. Kết quả là hình thành những virion có tính trạng hỗn hợp của hai virus khởi nguyên. Dạng tái tổ hợp thường dễ hình thành hơn trong trường hợp hoạt hóa chéo so với việc kết hợp hai virus nguyên vẹn. Hoạt hóa chéo thường diễn ra trong tế bào nếu tiêm virus vô hoạt (bằng nhiệt hoặc tia tử ngoại) vào hệ thống mẫn cảm khoảng 24 - 48 giờ trước khi tiêm virus có hoạt tính. Có đến 70% genome virus cúm gia cầm vô hoạt A1 được hoạt hóa nhờ virus cúm A2. Virus đậu thỏ cũng đã được chứng minh có hoạt hóa chéo. Pha trộn kiểu hình là hiện tượng hai virus khác nhau khi tái sản đồng thời trong một tế bào làm xuất hiện những virion mang genome của chỉ một virus khởi nguyên nhưng lại mang kháng nguyên của cả hai virus khởi nguyên đó. Trong trường hợp này không diễn ra quá trình tương tác kiểu gen mà các virion chỉ thừa hưởng chung các protein cấu trúc đã được tổng hợp đồng thời trong một tế bào. Hiện tượng pha trộn kiểu hình thường gặp ở phage T2 và T4 và cũng như ở một số virus người và động vật (như virus cúm, virus bệnh Newcastle, bại liệt, và các "arbovirus" typ A). Tái hoạt hóa phi kiểu gen là hiện tượng một virus bị vô hoạt protein cấu trúc nhưng có thể phát triển nhờ hoạt tính của protein-enzyme có nguồn gốc từ virus khác, ví dụ nhờ enzyme "cởi vỏ" của virus đậu. Hiện tượng tái hoạt hóa phi kiểu gen có thể diễn ra nhờ một virus đậu nguyên vẹn nhưng cũng có thể nhờ một virus đậu genome khuyết tổn. Tương bổ là hiện tượng khi nhiễm đồng thời hai virus có genome tổn thương do biến dị ở hai miền gen khác nhau và đều mất khả năng tái sản, thì chúng cùng sử dụng chung sản phẩm (các protein) của hai genome mà cùng có khả năng thực hiện chu trình tái sản. Chẳng hạn, gen khuyết tổn do biến dị ở một virus có thể là protein dịch sớm (RNA- polymerase) còn virus khác khuyết tổn ở gen protein cấu trúc. Khi tách biệt hai virus này đều không thể tái sản nhưng nếu cảm nhiễm hỗn hợp thì
  12. 224 quá trình tái sản của cả hai đều xảy ra. Do không có sự tái tổ hợp di truyền nên các virion thế hệ con cháu cũng có genome khuyết tổn. Kích thích là hiện tượng một virus nguyên vẹn khi cảm nhiễm đồng thời với virus khuyết tổn thì cung cấp một hoặc một số nguyên liệu cần thiết cho virus khuyết tổn thực hiện chu trình tái sản. Ví dụ virus u thịt Raus không thể cảm ứng tổng hợp protein cấu trúc, mà sử dụng protein của virus bạch cầu gà trong thành phần áo ngoài. Khi trong môi trường có mặt của virus bạch cầu gà, từ các tế bào gà biến nạp (có gen đã tái tổ hợp) virus u thịt Raus xuất hiện các virion virus u thịt Raus. Virus bạch cầu gà trong trường hợp này gọi là virus trợ giúp. Virus á cúm typ 3 có thể là virus trợ giúp đối với virus Newcastle trong lứa cấy tế bào thận khỉ, virus Sendai đối với virus bại liệt trong lứa cấy tế bào sơ phôi chuột vàng, adenovirus đối với các virus tùy thuộc adeno (hay AAV, hay adenosatelite). Cản nhiễm (hay can thiệp cảm nhiễm, can nhiễm - interfering) là hiện tượng một tế bào đã bị cảm nhiễm một loại (typ) virus có khả năng đề kháng lại sự xâm nhập sau đó của virus khác. Hiện tượng này liên quan đến sự hình thành protein đặc biệt gọi là interferon do genome tế bào động vật chi phối, giúp tế bào bị nhiễm cũng như các tế bào bên cạnh trở nên đề kháng tái cảm nhiễm virus. Phụ thuộc vào chủng loại virus bị cản nhiễm mà chia thành ba loại cản nhiễm: tự cản nhiễm, cản nhiễm đồng loại, cản nhiễm dị loại. Điểm đặc biệt của interferon là chỉ bảo vệ được các tế bào cùng loài với tế bào đã tổng hợp nên nó (tính đặc hiệu ký chủ) và chống lại sự xâm nhập của các loại virus khác nhau (tính không đặc hiệu vật ký sinh). Do khả năng hình thành nhanh chóng (khoảng 24 - 48 giờ) và tạo sự đề kháng đối với nhiều loại virus một cách nhanh chóng nên interferon được coi chú ý ứng dụng. Tác dụng của các vaccine virus nhược độc (attenuated vaccine) trong giai đoạn sớm là do hiện tượng cản nhiễm. Ngày nay, hợp chất này đã được sản xuất bằng công nghệ di truyền và áp dụng trong điều trị bệnh nhiễm virus ở người. VI. Kỹ thuật di truyền Kỹ thuật di truyền bắt đầu như một khoa học từ 7/1972 khi nhóm nghiên cứu của Paul Berg (Viện hàn lâm khoa học quốc gia Mỹ) hoàn thành việc chế tạo bộ gen lai giữa virus SV40 của khỉ với phage lambda. Lần đầu tiên kết nối hai virus khác nhau hoàn toàn về mặt di truyền thành một chỉnh thể và được nhân lên dưới dạng plasmid trong tế bào vi khuẩn. Phân tử DNA lai chứa các thông tin di truyền của virus SV40, thông tin điều khiển quá trình tự sao của DNA phage lambda cũng như toàn bộ chức năng của operon galactosidase của vi khuẩn E. coli. Ban đầu khái niệm kỹ thuật di truyền chỉ các kỹ thuật tái tổ hợp DNA nhưng
  13. 225 dần dần nội dung của thuật ngữ này mở rộng tới các kỹ thuật liên quan như PCR với các biến tướng PCR, kỹ thuật lai phân tử (Northern hybridization, Southern hybridization, microarray,... Nguyên tắc chung của công nghệ DNA tái tổ hợp gồm một số bước. Trước hết DNA genome mục tiêu và DNA chuyển tải (vector) được tinh chế và cắt thành đoạn nhờ một loại enzyme hạn chế. Trong nhiều trường hợp (đặc biệt đối với sinh vật bậc cao) DNA genome mục tiêu được thay thế bằng DNA tương bù (cDNA) của RNA thông tin thành thục. DNA này được tổng hợp từ khuôn RNA thông tin nhờ sự xúc tác của enzyme sao chép ngược (reverse transcriptase, RNA-dependent DNA-polymerase). DNA vector có thể là của một plasmid hoặc phage (nếu vật mang, dòng hóa gen là vi khuẩn), plasmid Ti của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (nếu vật mang dòng hóa gen là tế bào thực vật), là virus (retrovirus hoặc adenovirus không gây bệnh, nếu vật mang dòng hóa gen mục tiêu trong tế bào động vật). Bước thứ hai là chuyển vận DNA tái tổ hợp vào cơ thể vật mang, dòng hóa và bước tiếp sau đó là sau đó nuôi cấy vật mang, sản xuất (chiết xuất và tinh chế) sản phẩm mục tiêu. Nhờ được cắt cùng một loại enzyme hạn chế (thường là enzyme đầu dính) các đoạn DNA mục tiêu và các DNA vector (chỉ cắt tại một điểm của mạch vòng xoắn kép) có thể ngẫu nhiên hình thành mối liên kết hyđrô tương bù ở các đầu dính, rồi được enzyme ligase hàn gắn các đầu khấc. Kết quả là trong hỗn hợp hình thành thể tái tổ hợp vector với một hoặc một số mảnh DNA của genome mục tiêu (bên cạnh các sản phẩm không mong muốn như vector tự khép vòng, các vector tự tái tổ hợp với nhau và các mảnh DNA không tái tổ hợp hoặc tự tái tổ hợp). Tất cả các sản phẩm trong hỗn hợp đều được trộn với các vật mang tạo dòng, sau đó các vật mang được nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng có chứa yếu tố chọn lọc (chất kháng sinh đối với vi khuẩn, hóa chất gây chết đối với tế bào động vật và thực vật). Trong điều kiện đó, chỉ các tế bào vật mang mang vector sống sót. Hơn nữa, do plasmid bị enzyme hạn chế cắt tháo vòng tại một vị trí xác định trong một gen điều khiển một thuộc tính nhận biết khác, những plasmid đã tái tổ hợp mất khả năng tạo tính trạng đó ở vật mang (chẳng hạn, mất khả năng tổng hợp beta-galactosidase), nên chỉ những vật mang sống sót và không biểu hiện tính trạng đó được chọn nuôi cấy tạo dòng. Bước tiếp theo là chọn những dòng biểu hiện tính trạng của gen mục tiêu hoặc những dòng mang gen mục tiêu (nhờ lai phân tử: các phương pháp thử nghiệm miễn dịch như ELISA, Western blot analysis hoặc với các dò DNA hoặc RNA - Southern blot analysis, Northern blot analysis), hoặc PCR. Nuôi cấy tạo dòng những cá thể vật
  14. 226 mang thỏa mãn các bước thử nghiệm trên giúp tạo ra dòng thuần các sinh vật mang có thể sản xuất các sản phẩm mục tiêu. Cho đến nay, kỹ thuật di truyền đã đạt được những bước tiến vượt bậc. Nhiều sản phẩm có ích đã được sản xuất từ các sinh vật tái tổ hợp hay sinh vật biến đổi gen (genetically modified organisms - GMO) như giống ngũ cốc, đậu tương, hạt có dầu, bông,... mang gen chống sâu bệnh hoặc kháng thuốc chống cỏ dại hoặc có chất lượng sản phẩm nâng cao như khoai tây chứa nhiều protein, lúa giàu vitamin A và sắt,... tạo ra được những vaccine tái tổ hợp có thể dễ sản xuất (dễ nuôi cấy trên lứa cấy tế bào hay phôi gà) và dễ sử dụng (cho ăn, cho uống), hoặc các động vật tái tổ hợp sản sinh những sản phẩm hữu ích như thuốc chữa bệnh, thậm chí tạo ra những đàn lợn mang kháng nguyên người hy vọng có thể là vật cho tim hoặc nội quan khác để điều trị những trường hợp người bệnh cần phải thay thế nội quan,... Tuy nhiên, kỹ thuật di truyền cũng đặt loài người vào tình trạng có thể phải đương đầu với những đe dọa mới liên quan đến sức khỏe của người và sinh thái - môi trường. Chưa thể chứng minh được tính vô hại của GMO thực phẩm đối với con người, cũng như chưa thể phủ nhận khả năng lan truyền gen kháng thuốc (của plasmid vector) trong tập đoàn các vi khuẩn tự nhiên của cơ thể (ví dụ, trong đường ruột) người và động vật. Chăm sóc những loại cây trồng đề kháng thuốc diệt cỏ và thuốc diệt sâu bệnh có thể dẫn đến lạm dụng nông dược và nếu thoái hóa trở thành cỏ dại thì thực vật kháng thuốc và kháng sâu bệnh sẽ là một nguy cơ mới đối với nông nghiệp. Tương tự, nguy cơ những sinh vật GMO lấn át sinh vật tự nhiên là rất cao và có thể dẫn đến sự tuyệt diệt của nhiều loài sinh vật hiện có, ảnh hưởng xấu đến môi trường sinh thái,... PCR (phản ứng chuỗi trùng hợp: polymerase chain reaction) là một kỹ thuật riêng biệt được sáng tạo để khuyếch đại DNA in vitro dựa trên cơ sở phản ứng tự sao của DNA nhờ DNA-polymerase từ các deoxyribonucleoside triphosphate luôn cần mồi (primer) là đoạn oligonucleotide (trong tế bào là đoạn RNA do primase xúc tác tổng hợp) gắn kết sẵn một cách tương bù trên khuôn sợi đơn của phân tử DNA. Hiện thực hóa nguyên lý trên để áp dụng trong ống nghiệm được xúc tiến nhờ những tiến bộ trong kỹ thuật như: tổng hợp được các mạch oligonucleotide có trình tự đặc hiệu biết trước từ các deoxyribonucleoside triphosphate, thành công trong việc chế tạo máy chu kỳ nhiệt hay máy luân nhiệt (thermocycler) và tinh chế được enzyme DNA-polymerase chịu nhiệt (từ vi khuẩn ưu nóng Thermus aquaticus - Taq polymerase, sau đó từ E. coli tái tổ hợp gen này của Thermus aquaticus - rTaq polymerase). Trong máy luân nhiệt, hỗn hợp gồm DNA, dNTP, DNA-polymerase, cặp oligonucleotide mồi và dung dịch đệm được gia nhiệt (94 - 96 °C), khi đó các DNA mạch đôi biến tính thành chuỗi đơn, sau đó khi máy hạ nhiệt
  15. 227 xuống khoảng 40 - 60 °C thì các oligonucleotide mồi sẽ gắn vào các vị trí đặc hiệu (có trình tự nucleotide tương bù) và cung cấp đầu 3'-OH cho DNA polimerase gắn vào, khi gia nhiệt lên khoảng 60 - 75 °C polymerase hoạt động gắn kết các dNTP tương bù kéo dài sợi mới theo hướng 5'→3' làm cho sợi đơn trở thành sợi đôi bắt đầu từ điểm gắn mồi. Tiếp tục các chu kỳ gia nhiệt gây biến tính (denaturation), hạ nhiệt gây gắn mồi (annealling) rồi nâng nhiệt gây kéo dài (elongation) ta có thể tổng hợp được lượng lớn sợi đơn mới. Do hai mồi trong hỗn hợp được thiết kế có thể gắn đặc hiệu với hai sợi đơn khác nhau sao cho mạch mới tổng hợp của mồi này cung cấp chỗ gắn cho mồi kia nên sau một số khá lớn (25 - 40) chu kỳ tổng hợp đoạn DNA nằm giữa hai mồi được tổng hợp với số lượng lớn áp đảo. Nếu cho sản phẩm phản ứng di động trong gel nhờ dòng điện một chiều bên cạnh các đoạn DNA có phân tử lượng (DNA molecular weight marker) biết trước và nhuộm ethidium bromide rồi soi dưới tia tử ngoại, ta có thể nhận ra các băng DNA và xác định được phân tử lượng của sản phẩm (cũng như sự thuần khiết của sản phẩm). Do hai mồi được thiết kế một cách đặc hiệu với trình tự DNA biết trước hay do mỗi sinh vật có trình tự DNA đặc hiệu nên sản phẩm được PCR tổng hợp có phân tử lượng đặc hiệu (do tính đặc hiệu của trình tự nucleotide). Nhờ đó có thể dùng phản ứng này để nhận biết sự hiện diện của một đoạn gen cho trước hoặc để chẩn đoán bệnh (đồng định: nhận biết sự hiện diện của mầm bệnh) hoặc nhận diện (đồng định) cá thể. Để tăng hiệu quả của PCR, mở rộng phạm vi sử dụng của nó hoặc áp dụng để nhân DNA từ khuôn RNA, hàng loạt biến tướng của kỹ thuật này được thiết lập (nested PCR, LA PCR, hot start PCR, RAGE, panhandle PCR, inverse PCR,...). Ngoài kỹ thuật PCR thông thường (conventional PCR) nêu trên còn có PCR thực thời (real-time PCR) được phát triển trên cơ sở phản ứng PCR thông thường với cặp mồi đặc hiệu và một dò chỉ hấp thụ và phát xạ (bức xạ bước sóng đặc hiệu) khi gắn với DNA đoạn giữa hai mồi tổ hợp với thiết bị đặc biệt trắc định cường độ phát xạ của dò ngay trong quá trình phản ứng. PCR còn được sử dụng trong việc xác định trình tự nucleotide (sequencing) của DNA. Khi đó, có thể sử dụng trực tiếp sản phẩm khuếch đại nhờ PCR hoặc các đoạn DNA đã được dòng hóa. Nguyên tắc chung là khuyếch đại một đoạn DNA nhờ một mồi với hỗn hợp gồm DNA khuôn, một mồi duy nhất bắt cặp với đầu 5' của đoạn DNA cần đọc trình tự, Taq DNA-polymerase, các dNTP cùng với một trong bốn loại ddNTP (dideoxyribonucleotide) đã được đánh dấu huỳnh quang (hoặc phóng xạ,...) trong mỗi lọ trong bốn lọ phản ứng (hoặc bốn loại đánh dấu khác nhau trong một lọ phản ứng chung). Phản ứng xảy nối dài bắt đầu từ mồi và kết thúc khi gắn kết với một ddNTP đánh dấu (do ddNTP thiếu gốc 3'-
  16. 228 OH cần thiết cho phản ứng tiếp tục). Do việc gắn kết với các phân tử ddNTP là tương bù đặc hiệu và ngẫu nhiên giữa một ddNTP với dNTP cùng loại nên sau khi biến tính kết quả phản ứng (bằng nhiệt, có thêm formamide) ta có hỗn hợp chứa các đoạn DNA sợi đơn dài ngắn khác nhau. Khi điện di (trong polyacrylamide gel bão hòa urea) trong bốn làn (lane) cạnh nhau (với trường hợp đánh dấu cùng loại) hoặc trong một làn (với trường hợp đánh dấu khác loại) các đoạn dài ngắn khác nhau sẽ di động với tốc độ khác nhau. Kết quả là ta có các băng (band) phân bố liên tiếp (lần lượt, đọc từ băng di động nhanh nhất) phụ thuộc vào độ dài của mạch đơn nucleotide tức phụ thuộc vào vị trí gắn kết của một loại ddNTP. Trình tự đọc được chính là trình tự nucleotide của đoạn DNA bắt đầu từ mồi. Lai phân tử (hybridization) có thể giúp nhận biết sự hiện diện của một phân tử đặc hiệu nào đó, gồm lai Southern (phân tích DNA) hoặc Northern (phân tích RNA) và các kỹ thuật miễn dịch học như Western blot analysis và ELISA. Một trình tự mạch đơn (DNA hoặc RNA) biết trước gọi là dò (probe) được đánh dấu (bằng chất phóng xạ) được chuẩn bị sẵn và cho tiếp xúc với sản phẩm RNA hoặc DNA sợi đơn đã cố định trên giá thể (màng nylon hoặc màng nitrocellulose), nếu có trình tự tương bù dò sẽ gắn kết một cách đặc hiệu. Sau khi rửa kỹ màng giá thể, nếu phát hiện được dò (nhờ kỹ thuật phóng xạ tự ký) trên màng chứng tỏ trong sản phẩm có chứa trình tự nucleotide tương bù. Western blot analysis là phương pháp lai kháng thể gắn kết với một enzyme có khả năng chuyển màu cơ chất thích hợp (đánh dấu bằng peroxidase hoặc phosphotase kiềm) với sản phẩm đã cố định trên màng, trong khi ELISA là phương pháp lai kháng thể đánh dấu với sản phẩm đã cố định trên bề mặt lỗ khay. Nếu trong sản phẩm có kháng nguyên đặc hiệu thì kháng thể đánh dấu sẽ kết hợp đặc hiệu và không bị rửa trôi. Kết quả là nếu phát hiện được yếu tố đánh dấu (nhờ kỹ thuật chuyển màu cơ chất enzyme) thì chứng tỏ trong sản phẩm có kháng nguyên hay protein đặc hiệu. Câu hỏi ôn tập chương 10 1. Vật chất di truyền ở sinh vật nhân chuẩn, sinh vật nhân sơ và virus? 2. Sự tự sao DNA? 3. Quá trình phiên mã? 4. Quá trình dịch mã? 5. Sự điều tiết phiên mã và điều tiết dịch mã? 6. Cải biến và hạn chế? 7. Biến dị kiểu hình? 8. Đột biến? 9. Biến nạp (chuyển thể) ở vi khuẩn?
  17. 229 10. Tải nạp ở vi khuẩn? 11. Tiếp hợp ở vi khuẩn? 12. Tương tác di truyền ở virus" 13. Kỹ thuật di truyền và công nghệ DNA tái tổ hợp? 14. PCR cần những yếu tố hóa học gì, những điều kiện phản ứng như thế nào? 15. Các kỹ thuật lai phân tử dựa trên tính chất cơ bản gì của các yếu tố tham gia phản ứng?
  18. 230 Chương 11 MIỄN DỊCH Miễn dịch (MD-immunity) là trạng thái bảo vệ đặc biệt của cơ thể chống lại các tác nhân gây bệnh (vi sinh vật và các độc tố của chúng, các phân tử lạ...) khi chúng xâm nhập vào cơ thể. Sự bảo vệ cơ thể do rất nhiều các phân tử và tế bào nằm rải rác khắp cơ thể tham gia theo cơ chế bảo vệ không đặc hiệu và bảo vệ đặc hiệu. MD không đặc hiệu được hình thành từ khi mới lọt lòng và trước khi có sự xuất hiện của kháng nguyên. MD đặc hiệu bao gồm MD thể dịch do hình thành kháng thể trong thể dịch của cơ thể và MD tế bào (tạo Protein độc tiêu diệt các tế bào mang kháng nguyên lạ) I.Cơ chế bảo vệ không đặc hiệu Là miễn dịch tự nhiên mang tính chất bẩm sinh, bao gồm các tuyến phòng thủ từ ngoài vào trong để ngăn chặn không cho vi sinh vật (VSV) xâm nhập vào cơ thể. - Hàng rào vật lý: Da và niêm mạc ngăn cách nội môi của cơ thể với ngoại môi xung quanh. Trên mặt biểu bì chứa keratin không tan trong nước, không bị VSV phân giải, do đó không cho VSV thấm qua. Phía ngoài, biểu bì chủ yếu gồm tế bào chết nên virus không nhân lên được. Niêm mạc bao phủ bề mặt trong cơ thể như đường hô hấp, tiêu hoá và sinh dục. Chất nhầy của niêm mạc là cái bẫy bắt giữ VSV, hệ thống nhu mao chuyển động hất VSV ra bên ngoài qua đường mũi hoặc miệng. Lông mũi, phản xạ ho, hắt hơi, nôn cũng giúp ngăn chặn VSV xâm nhập vào cơ thể. * Dịch cơ thể như nước mắt, nước bọt, nước tiểu...cũng giúp rửa trôi VSV khi chúng bám trên bề mặt các mô, y hệt như ta tắm rửa để làm trôi bụi bặm. - Hàng rào VSV bao gồm các vi khuẩn bao phủ bề mặt hoặc khu trú bên trong cơ thể, tạo nên khu hệ VSV bình thường. Đây là một khu hệ VSV phức tạp, có số lượng gấp 9 lần tổng số tế bào của cơ thể. Chúng chiếm trước các vị trí mà VSV gây bệnh đã đến, cạnh tranh thức ăn và tiết ra chất hoá học tiêu diệt VSV gây bệnh. Ngoài ra nhiều vi khuẩn sống trong đường tiêu hoá còn tiết ra biotin, riboflavin và các vitamin khác cung cấp cho cơ thể. Khi phá vỡ sự cân bằng trong khu hệ, một số sẽ có thể trở thành VSV gây bệnh cơ hội.
  19. 231 - Hàng rào hoá học: trong dịch tiết của các mô trong máu, trong dịch lympho đều chứa các nhân tố ức chế hoặc tiêu diệt VSV gây bệnh. * pH acid ức chế sự sinh trưởng của VSV. VSV phân giải lipid thành acid béo làm tăng độ acid của da. Vi khuẩn lactic lên men glycogen tạo acid lactic trong âm đạo. Dịch vị do tuyến trong dạ dày tiết ra chứa acid clohydric có pH 1-2. Sản phẩm lên men của các vi khuẩn thường trú trong đường tiêu hoá là acid lactic và axetic. Ngoài ra VSV còn tiết ra bacterioxin là chất diệt khuẩn mạnh. * Lysozym là enzyme có trong nước mắt, nước mũi, nước bọt, dáy tai, mồ hôi, sữa, dịch âm đạo...v.v.., có khả năng diệt vi khuẩn Gram dương nhờ cơ chế phân giải thành tế bào, do đó được coi là một loại chất kháng sinh. Protein liên kết với sắt như lactoferrin có trong tinh dịch, nước mắt, sữa mẹ, mật, nước mũi, dịch nhầy ruột...v.v.., transferrin có trong gian bao các mô, trong huyết thanh làm giảm trọng lượng sắt tự do gây tình trạng thiếu sắt cần thiết cho VSV sinh trưởng, do đó ngăn cản được nhiễm trùng. Inteferon (IFN) là glycoprotein do các tế bào mô đã nhiễm virus hoặc vi khuẩn (IFN-α và IFN-β) hoặc do các tế bào lympho T sinh ra (IFN-γ). IFN ức chế sự nhân lên của virus trong tế bào bằng cách hình thành protein cảm ứng ngăn cản quá trình dịch mã và phân huỷ RNA thông tin của virus. Ngoài vai trò bảo vệ, IFN còn làm nhiệm vụ điều hoà mạng lưới bảo vệ chống nhiễm trùng và sự nhân lên của các tế bào ung thư. Bổ thể (Complement) là glycoprotein có khả năng làm tan tế bào và tăng cường hiện tượng thực bào. - Hiện tượng thực bào: Các bạch cầu tham gia vào cơ chế bảo vệ không đặc hiệu bao gồm: Bạch cầu trung tính chứa các hạt không bắt màu thuốc nhuộm, có tính hoá ứng động bắt giữ và tiêu diệt các vật lạ, kể cả VSV và các mảnh tế bào phân huỷ, do vậy đóng vai trò quan trọng trong chống nhiễm trùng. Bạch cầu ưa kiềm chứa các hạt bắt màu xanh methylen, chứa các hoạt chất nhu histamin, heparin, serotonin. Bạch cầu ưa acid chứa các hạt bắt màu eosin, chứa enzyme phân giải histamin và heparin, do vậy điều hoà hoạt động của bạch cầu kiềm. Bạch cầu này có khả năng gây độc các ấu trùng giun. Đại thực bào đóng vai trò quan trọng trong chống nhiễm trùng, nhất là virus. Đại thực bào thâu tóm VSV nhờ giả túc, tạo không bào
  20. 232 (phagosom). Các không bào dung hợp với lysosom tạo phagolysosom. Các VSV trong phagolysosom bị tiêu diệt do nhiều nguyên nhân. - Các enzyme phụ thuộc oxy chuyển hoá oxy phân tử thành peoxit gây độc cho VSV. - Sự thay đổi kiểu hô hấp, tạo acid lactic làm giảm pH, pH thấp làm tăng hoạt tính nhiều enzyme trong lysosom. - Cơ chế thực bào không phụ thuộc oxy bao gồm hoạt động của các enzyme phân giải của lysosom như lyzozim, photpholipase, ribonuclease, deoxyribonuclease..v.v.. Sốt là cơ chế bảo vệ tự nhiên, làm tăng phản ứng enzyme phân huỷ VSV, làm tăng hoạt động của IFN và làm giảm nồng độ sắt tự do trong máu, do đó góp phần tiêu diệt VSV. Viêm không đặc hiệu có tác dụng khu trú VSV vào một nơi không cho chúng lan rộng thêm, 4 tính chất của viêm là: đỏ, đau, sưng, nóng là do giãn mạch, tăng dòng máu, làm thoát bradykinin và prostaglandin, bạch cầu trung tính, đại thực bào vào ổ viêm. II.Chất sinh miễn dịch và kháng nguyên 1. Chất sinh miễn dịch (immunogen) là những chất khi đưa vào cơ thể ở điều kiện thích hợp có khả năng gây một đáp ứng miễn dịch (ĐUMD), còn kháng nguyên (KN-antigen) là những chất có khả năng liên kết với kháng thể hoặc thụ thể đặc hiệu của tế bào limpho T (TCR). Tất cả các chất sinh miễn dịch đều là kháng nguyên, nhưng không phải tất cả kháng nguyên đều là chất sinh miễn dịch. Ví dụ: Hapten là kháng nguyên không trọn vẹn, có thể gắn với kháng thể những không kích thích tạo kháng thể. Ba điều kiện cần của một chất sinh miễn dịch là: - Tính lạ: Cơ thể không đáp ứng bảo vệ với kháng nguyên bản thân, do vậy chất càng lạ với cơ thể, khả năng gây đáp ứng miễn dịch càng cao. - Trọng lượng phân tử đủ lớn: Kháng nguyên thường có trọng lượng phân tử trên 10.000 dalton. Nếu thấp hơn, khả năng sinh miễn dịch yếu hoặc không có vì khó bị đại thực bào bắt giữ và xử lý. - Cấu trúc phân tử phức tạp: nhiều chất có trọng lượng phân tử lớn như polylisin, polisaccharid không gây hoặc gây đáp ứng miễn dịch yếu vì cấu trúc đơn giản do lặp đi lặp lại, trong khi hapten có trọng lượng phân tử thấp nhưng gắn với protein thì lại trở thành chất gây đáp ứng miễn dịch.
Đồng bộ tài khoản