intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE

Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật

Chia sẻ: Nguyen AAA | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:5

512
lượt xem
83
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Phương pháp chính trong nuôi cấy tế bào động vật có vú để sản xuất các sản phẩm sinh-dược là dựa trên cơ sở nuôi cấy dịch huyền phù trong hệ lên men. Từ lâu, hệ lên men đã được sử dụng trong nuôi cấy vi khuẩn và nấm men. Đầu tiên, sự lên men là thuật ngữ dùng cho sản xuất cồn. Sau đó, các nhà vi sinh vật học ứng dụng các nguyên tắc trên để tách chiết các vitamin, các acid hữu cơ và các kháng sinh… ...

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật

  1. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật Phương pháp chính trong nuôi cấy tế bào động vật có vú để sản xuất các sản phẩm sinh-dược là dựa trên cơ sở nuôi cấy dịch huyền phù trong hệ lên men. Từ lâu, hệ lên men đã được sử dụng trong nuôi cấy vi khuẩn và nấm men. Đầu tiên, sự lên men là thuật ngữ dùng cho sản xuất cồn. Sau đó, các nhà vi sinh vật học ứng dụng các nguyên tắc trên để tách chiết các vitamin, các acid hữu cơ và các kháng sinh… Kết quả dẫn đến sự phát triển nhanh chóng các phương pháp và các hệ thống lên men khác nhau. Các nguyên lý tương tự sau đó được ứng dụng cho nuôi cấy sinh khối tế bào động vật và thực vật. Tuy nhiên, nuôi cấy các tế bào động vật và thực vật khó khăn hơn nhiều so với vi sinh vật, cái chính là do quá trình trao đổi chất trong các loại tế bào này diễn ra chậm, điều này cũng phản ánh tốc độ sinh trưởng chậm của tế bào. Các tế bào động vật có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp hơn so với vi khuẩn và nấm men, chúng không có thành tế bào như vi khuẩn vì thế rất dễ biến dạng và vỡ. Do đó, các hệ thống khuấy và sục khí được thiết kế khác với nuôi cấy vi khuẩn. Mặc dù có một số điểm không thuận lợi, nhưng hệ thống lên men đã được sử dụng để nuôi cấy tế bào động vật ít nhất cũng vài chục năm trước đây. Các dòng tế bào khác nhau như BHK-21, LS, các tế bào Namalwa… đã được sinh trưởng trong hệ lên men theo phương thức nuôi cấy chìm ngập trong môi trường để sản xuất các viral vaccine và các sản phẩm khác.
  2. Đặc điểm dễ biến dạng và dễ vỡ của tế bào động vật đã được khắc phục bằng cách đưa vào các cánh khuấy có dạng hình mái chèo. Việc cung cấp khí trực tiếp có thể tạo ra bọt khí dễ làm vỡ tế bào, vì thế cần cung cấp khí bằng cách khuếch tán thông qua ống silicone. Môi trường chứa nhiều protein huyết thanh có khả năng gây ra hiện tượng tạo bọt nên cần khuấy chậm và nhẹ. Đối với nuôi cấy mật độ cao, cần cung cấp thêm oxygen. Phương pháp dùng ống silicone để sục khí có nhiều ưu điểm do không tạo ra bọt khí và tốc độ truyền oxygen là thỏa đáng. Như vậy, các hệ lên men vi sinh vật được cải tiến thích hợp có thể dùng để nuôi cấy sinh khối các tế bào động vật sinh trưởng trong dịch huyền phù. Nếu muốn nuôi cấy một dòng tế bào dính bám thì nên dùng một hệ thống chất mang như là microcarrier. Các dòng tế bào động vật có vú thường được sử dụng trong nuôi cấy là CHO4, NS05, BHK6, HEK-2937 và tế bào võng mạc của người. 1. Hệ thống sản xuất Phát triển một quá trình sản xuất công nghiệp cho protein tái tổ hợp của tế bào động vật có vú thường dựa theo hệ thống được trình bày ở hình 1. Đầu tiên, gen quan tâm được tái tổ hợp với các nhân tố điều hòa phiên mã (promoter) cần thiết trong plasmid vector để chuyển vào tế bào. Đồng thời, gen thứ hai (gen chọn lọc-selector, hay còn gọi là gen chỉ thị chọn lọc- selectable marker) cũng được chuyển cho tế bào nhận để phân biệt tế bào được biến nạp và không biến nạp. Sự hiện diện của tác nhân chọn lọc trên
  3. môi trường nuôi cấy sau khi chuyển gen một vài ngày đã cho phép phân lập các tế bào tái tổ hợp sống sót. Các gen chỉ thị chọn lọc được dùng phổ biến nhất là dihydrofolate reductase (DHFR), một enzyme tham gia trong quá trình chuyển hóa nucleotide, và glutamine synthetase (GS). Trong cả hai trường hợp, sự chọn lọc xảy ra khi thiếu chất chuyển hóa thích hợp trong môi trường (hypoxantine và thymidine, trong trường hợp của DHFR hoặc glutamine trong trường hợp GS), do đó đã ngăn cản sự sinh trưởng của các tế bào không biến nạp. Sinh sản và phát triển dòng tế bào cho các quá trình nuôi cấy để sản xuất protein tái tổ hợp mong muốn (protein o.i.). Các đường gợn sóng chỉ ra số lần cấy chuyển của các dòng tế bào riêng biệt để sàng lọc tế bào đưa vào sản xuất. Các lọ nhỏ là ngân hàng tế bào được đông lạnh trong nitrogen lỏng. Các bình nuôi xoay (spinner flask) mô tả các hệ thống nuôi cấy quy mô nhỏ để tối ưu hóa quy trình, và các hệ lên men mô tả các quá trình sản xuất ở quy mô lớn. Sau khi chọn lọc, các tế bào sống sót (xem như là các tế bào đơn) được chuyển vào bình nuôi cấy thứ hai, và quá trình nuôi cấy được phát triển để
  4. sản xuất các quần thể vô tính (clonal populations). Cuối cùng, các dòng riêng biệt được đánh giá khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp để chọn ra dòng có khả năng sản xuất cao nhất. Từ những dòng này, một dòng tế bào có tốc độ sinh trưởng thích hợp và các sản lượng cao được sử dụng để sản xuất protein tái tổ hợp. Quá trình nuôi cấy sau đó sẽ được thiết lập và tối ưu hóa cho sản xuất. 2. Tối ưu hóa môi trường dinh dưỡng và tế bào vật chủ Hiện nay, môi trường thương mại dùng cho nuôi cấy tế bào có chất lượng cao đã được một số nhà cung cấp hàng đầu sản xuất. Tuy nhiên, việc sản xuất protein tái tổ hợp cũng cần phải được tối ưu hóa bằng cách khảo sát trên nhiều công thức môi trường dinh dưỡng. Thông thường, một quá trình sản xuất riêng biệt đòi hỏi một vài công thức môi trường khác nhau, trong đó mỗi công thức được thiết kế cho một phase đặc trưng của sự sinh trưởng. Các môi trường cho tốc độ sinh trưởng nhanh đòi hỏi cấy chuyển 3-5 ngày/lần. Quá trình sản xuất mẻ (6-8 ngày) hoặc mẻ mở rộng (10-21 ngày) dài hơn nhiều so với thời gian cấy chuyển đặc trưng. Phát triển môi trường thích hợp là vô cùng quan trọng và phải được thiết kế trên một cơ sở riêng biệt, đối với mỗi quá trình và mỗi dòng tế bào. Tương tự môi trường, các tế bào vật chủ cũng phải được cải thiện để chống lại các ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy làm giảm khả năng sống sót và/hoặc tiến hành các bước chuyển gen để kích thích sinh trưởng. Kết quả nghiên cứu của nhiều phòng thí nghiệm cho thấy, các tế bào vật chủ có thể được cải thiện sinh trưởng, khả năng sống sót và sản lượng nhờ công nghệ
  5. DNA tái tổ hợp. Các proto-oncogene8, các gen điều chỉnh chu kỳ tế bào (cyclins), các gen yếu tố sinh trưởng (ví dụ yếu tố sinh trưởng giống insulin) và các gen antiapoptosis đã được đưa vào trong tế bào để tạo ra các vật chủ siêu sản xuất (superior production hosts). Cải thiện sự biến đổi và sản xuất protein hậu dịch mã là một phát triển đầy hứa hẹn khác. Chẳng hạn, người ta thấy hiệu lực của các kháng thể có thể được cải thiện bằng cách tăng cường hiệu lực của cơ quan phản ứng miễn dịch tự nhiên của chúng. Sự biểu hiện dư thừa (over expression) được ổn định của N-acetylglucosaminyl-transferase-III, một enzyme không được biểu hiện tự nhiên trong các tế bào CHO và NS0, trong các tế bào sản xuất kháng thể tái tổ hợp đã kích thích tạo các IgG ở nồng độ cao và các oligosaccharide không fucosyl hóa (fucosylation) trong vùng Fc. Những biến đổi của dạng glyco (glycoform) đã làm tăng từ 5-10 lần các độc tố tế bào phụ thuộc kháng thể.
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2