Liệu pháp gen sử dụng Adenovirus

Chia sẻ: dinhky

Tham khảo luận văn - đề án 'liệu pháp gen sử dụng adenovirus', luận văn - báo cáo, khoa học tự nhiên phục vụ nhu cầu học tập, nghiên cứu và làm việc hiệu quả

Bạn đang xem 10 trang mẫu tài liệu này, vui lòng download file gốc để xem toàn bộ.

Nội dung Text: Liệu pháp gen sử dụng Adenovirus

Nhóm 10:
Sử dụng kháng thể đầy đủ kháng HER-2 đối với sự biểu
hiện vượt mức của HER-2 trong tế bào ung thư trung
gian qua liệu pháp gen sử dụng Adenovirus.

Giáo Viên hướng dẩn:
Ths.Trần Hoàng Minh Tú Thành viên nhóm:
Cô Bùi Hoàng Bảo Ngọc Phan Thị Phương Thanh: 0615114
Phan Thị Hồng Thanh: 0615113
Phan Thanh Hùng: 0515073
Vũ Đình Kỳ: 0615056
Lê Duy Lung: 0615239
Nguyễn Thị Thìn: 0615135
Nguyễn Đình Phú: 0615288
Lâm Hồng Tú: 0615343
Nội Dung Bài Báo

Giới thiệu

Sơ lược về HER-2 và
Adenovirus
Thí nghiệm

Kết quả thí nghiệm

Thảo luận
Mục Đích


Sử dụng Adenovirus la gián tiếp để đưa gene kháng ung
thư buồng trứng


So sánh liệu pháp dùng Adenovirus với một số liệu pháp
khác
HER-2 Là Gi?

HER-2 là thụ thể trên màng tế bào.

Thuộc nhóm thụ thể của yếu tố tăng trưởng.

Thụ thể của yếu tố tăng trưởng thượng bì – gọi là EGFR.

Bản chất là một glycoprotein xuyên màng.

Gen quy định thụ thể này nằm trên nhánh q của nhiễm sắc thể số
17.
Thúc đẩy tăng sinh, sinh mạch tế bào.
Tế Bào Thượng Bì Và Thụ Thể HER-2


Thụ Thể HER-2 trên
màng tể bào




Mô hình tế bào và thụ thể HER-2
Adenovirus
Adenovirus gây ra bệnh cảm cúm


tất cả các Adenovirus đều không có vỏ, đường
kính 60-90nm.

genome của adenovirus là phân tử DNA sợi kép
không phân đoạn

Bộ gene của adenovirus có thể mang gene
mục tiêu >30kb

Không gắn vào bộ gene tế bào vật chủ nhưg
có thể biểu hiện gene
Mô hình sâm nhập của Adenovirus vào tế bào chủ

Bơm vật liệu di truyền




Xuyên màng




Tạo vỏ bọc bằng vật chất tế bào vật chủ




Gắn lên thụ thể màng nhân
Xây dựng Ad5-Tab Adenovirus tái
tổ hợp.




Nhóm 10: shptyd
Fig. 1. Full-length trastuzumab antibody expression cassette using IRES.
Schematic illustration of adenoviral vector pDC315 with expression cassette
inserteda t E1 region. Antibody light andheavy chains, with separate signal peptide,
are linkedb y IRES. VL, variable region of light chain; CL, constant region of light
chain;VH, variable region of heavy chain; CH, constant region of heavy chain;
SP, signal peptide.
Nhóm 10: shptyd
Nguyên liệu
 Trastuzumab thương mại: một loại kháng thể đơn dòng đã
được thương mại hóa.

 Vector pDC315, pBGHE3.

 Protein tái tổ hợp Erb-2/Fc Chimera.

 Các loại kháng thể.
Các dòng tế bào

 HEK293: dòng tế bào thận phôi người.
 SKOV-3: tế bào ung thư buồng trứng người (HER-2+).
 BT549: tế bào bình thường (HER-2-).
 L-02: tế bào gan người bình thường.
Phương pháp và kết quả
Nội dung thí nghiệm

 Xem xét sự biểu hiện của kháng thể tạo bởi Ad5-Tab.

 Kiểm tra kích thước kháng thể tạo bởi Ad5-Tab.

 Kiểm tra sự kết hợp đặc hiệu của kháng thể.

 Kiểm tra ái lực của Ad5-Tab.

 Xét sự biểu hiện của kháng thể trong cơ thể chuột.

 Khả năng ức chế sự phát triển khối u của kháng thể.
Xét sự biểu hiện của kháng thể tạo bởi Ad5-Tab
Tế bào L-02 có chứa vector Ad5-Tab


 Tế bào L-02 cho vào môi trường 10%huyết thanh thai bò.


 Ủ trong lò ủ ẩm (t=24h, t0=370C, CO2=5%).


 Chuyển tế bào vào môi trường không huyết thanh.

 Tế bào được làm nhiễm với Ad5-Tab có nồng độ cao.
Tế bào L-02 có chứa vector Ad5-Tab
 Sau 2h, chuyển tế bào vào môi trường 5% huyết thanh thai bò.

 Thu hoạch các tế bào nổi (vào ngày thứ 3 và thứ 7).
ELISA

 Kháng thể đơn dòng mAb anti-human IgG1 chuột làm bất động
kháng thể tạo ra do Ad5-Tab.

 mAb tiếp hợp với horseradish-peroxidase.

 Đọc bằng Microplate reader với bước sóng 450nm.
Sơ đồ

horseradish-peroxidase




mAb




Kháng thể tạo ra từ Ad5-Tab
(trong tế bào L-02).
Kết Quả




Fig. 2. In vitro antibody expression in Ad5-TAb -infected L-02 cells.The L-
02 cells were infectedw ith Ad5-TAb at a multiplicity of infection of 10. Cell
culture supernatants were harvestedat different time points after infection for
protein analysis. A, ELISA analysis of supernatants of Ad-TAb - infected L-
02 cells.


Nhóm 10: shptyd
Kiểm tra kích thước kháng thể tạo bởi Ad5-Tab
Western Blot
 Các tế bào: dịch nổi, huyết thanh chuột, trastuzumab thương
mại điện di trên SDS-PAGE 12%.

 Ở điều kiện khử và không.

 Chuyển protein trên gel polyacrylamid lên màng nitrocellulose.

 Dò với goat anti-human IgG1 (H+L) polyclonal (gắn với
horseradish peroxidase).
Sơ đồ
Huyết thanh chuột, Trastuzumab, Ad5-Tab

Điện di
Các bản sao kháng
KhửMàng dò thể dê kháng IgG1
SDS-PAGE 12% người.
Không khử
nitrocelluse

Kháng thể thỏ kháng IgG dê



Horseradish peroxidase
chemiluminescent
X-RAY
Fig. 3. Columns, mean; bars, SD.Western blot analysis of
commercial trastuzumab and supernatants from Ad5-TAb – or
Ad5-LacZ - infected L-02 cells under nonreducing (B) and
reducing (C) conditions
Nhóm 10: shptyd
Kiểm tra sự kết hợp đặc hiệu của kháng thể.

 Rửa SKOV-3 và BT549 bằng PBS ba lần.
 Cố định bằng paraformaldehid 4% (5 phút).
 ủ với dịch nổi hoặc trastuzumab (40C, 2h).
 Kháng thể thỏ kháng IgG người tiếp hợp với FITC.
 Quan sát tế bào được đánh dấu dưới kính hiển vi huỳnh
quang.




Nhóm 10: shptyd
Fig. 4. Specific binding of anti-
HER-2 antibody expressed
byAd5-TAb.Two cell
lines SKOV-3 and BT549 are
chosen for this binding specificity
determination. Cell
culture supernatant from Ad5-
TAb - infectedL-02 cells was
used, and commercial
trastuzumab was usedas
control. Immunofluorescent
microscopy analysis for the
specific binding of anti-
HER-2 antibody to HER-2. A to
B, BT549 incubatedw ith
supernatant and trastuzumab,
respectively. C to D, SKOV-3
incubatedw ith trastuzumab and
culture supernatant, respectively.


Nhóm 10: shptyd
Kiểm tra ái lực của Ad5-Tab

 Cho 100 µl HER-2 vào các đĩa ELISA.
 Ủ 15h ở 40C, cố định bằng sữa khô không béo 5%.
 Trộn với protein HER-2 trong albumin huyết thanh bò 1%. Ủ trong 1h ở
200C.
 Chuyển vào đĩa ELISA.
 Cho Horseradish peroxidase vào.
 3,3’-diaminobenzidine nhận màu của peroxidase.
 Đọc bằng Microplate reader ở bước sóng 450nm.
 A0/(A0-A)= 1+ (KD/a0).
Fig. 5. Affinity constant of anti-HER-2 antibody. Indirect ELISA was applied for
estimation of the antibody binding capacity.The proper working concentration of
anti-HER-2 antibody were shown to be in the range of 1 ×10-5 to 5.0 ×10-5 mg/
mL, andt hen 2.5 × 10-5 mg/mL was appliedf or the determination of affinity
constant. Straight slope is the affinity constant of the antibody.
Nhóm 10: shptyd
Xét sự biểu hiện của kháng thể trong cơ thể
chuột.
 Tiêm tế bào SKOV-3 vào chuột.

 Chuột đã được tiêm Ad5-Tab thông qua đường tĩnh mạch.

 10 con chuột được lấy máu ở các thời điểm khác nhau.
Fig. 6. Anti-HER-2 antibody expression level in the serum of SKOV-3-inoculated
nudemice. Ad5-TAbwas given through the tail vein at the dose of 2 × 109
plaque-forming units per mouse at early stage.Mice were bleda t days 3, 7, 10, 14,
21, 28, and3 5, and then serum antibody concentrations were determined by
indirect ELISA on HER2-coated 96-well plates and detected with horseradish
peroxidase - conjugated mouse anti-human IgGmonoclonal antibody. Points,
mean (ng/mL); bars, SD.Ten mice were analyzeda t each time point.
Nhóm 10: shptyd
Khả năng ức chế sự phát triển khối u của kháng
thể.

 Thí nghiệm 1: điều trị sau khi tiêm SKOV-3 ba ngày.

 Thí nghiệm 2: điều trị sau khi tiêm SKOV-3 16 ngày

 Có 2 nhóm: Nhóm 1 được tiêm Ad5-Tab
Nhóm 2 (đối chứng)được tiêm Ad5-LacZ.

 So sánh thể tích khối u chữa trị bời 2 phương pháp và giữa 2 thí
nghiệm.



Nhóm 10: shptyd
Fig. 7 Antitumor activity of Ad5-TAb
-generated anti-HER-2 antibody via gene
transfer in tumor-burdened nude mice. A, early
stage with smaller size (˜20mm3). B, late stage
with large size (˜200 mm3).




Nhóm 10: shptyd
Tổng kết


Trastuzumab
 Là một kháng thể đơn dòng có tác dụng chữa bệnh ung thư đã được
kiểm chúng và công nhận bởi FDA.

 Phương pháp này sử dụng còn hạn chế do chi phí cao và khó thực hiện.




Nhóm 10: shptyd
Ad5-Tab

 Đơn giản và có hiệu quả hơn phương pháp protein kháng thể
truyền thống.

 Mở ra hướng mới để điều trị ung thư và các bệnh khác.

 Tuy nhiên đây chỉ mới là thử nghiệm ban đầu, cần phải nghiên
cứu thêm.

 Hiệu quả chữa trị tốt nhất ở giai đoạn còn sớm.



Nhóm 10: shptyd
Nhóm 10: shptyd
Đề thi vào lớp 10 môn Toán |  Đáp án đề thi tốt nghiệp |  Đề thi Đại học |  Đề thi thử đại học môn Hóa |  Mẫu đơn xin việc |  Bài tiểu luận mẫu |  Ôn thi cao học 2014 |  Nghiên cứu khoa học |  Lập kế hoạch kinh doanh |  Bảng cân đối kế toán |  Đề thi chứng chỉ Tin học |  Tư tưởng Hồ Chí Minh |  Đề thi chứng chỉ Tiếng anh
Theo dõi chúng tôi
Đồng bộ tài khoản