Luận văn : NGHIÊN CỨU MỘT SỐ VIRUS TRÊN KHOAI TÂY (PVX, PVY, PLRV) TẠI ĐÀ LẠT BẰNG KỸ THUẬT ELISA, RT-PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ part 4

Chia sẻ: zues02

Các bƣớc tiến hành ly trích RNA 1. Cân khoảng 80 mg mẫu lá, cắt ra từng miếng nhỏ (

Bạn đang xem 7 trang mẫu tài liệu này, vui lòng download file gốc để xem toàn bộ.

Nội dung Text: Luận văn : NGHIÊN CỨU MỘT SỐ VIRUS TRÊN KHOAI TÂY (PVX, PVY, PLRV) TẠI ĐÀ LẠT BẰNG KỸ THUẬT ELISA, RT-PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ part 4

 

  1. 22 Các bƣớc tiến hành ly trích RNA 1. Cân khoảng 80 mg mẫu lá, cắt ra từng miếng nhỏ (< 5 mm). Nghiền mị n trong nitơ lỏng. Chú ý không để cho mẫu bị chảy nƣớc trong lúc nghiền. 2. Cho 60 mg mẫu đã nghiền vào tube 2 ml có nắp đậy (có sẵn trong kit). Cho 14 µl PVP 2% vào mỗi 700 µl dịch ly trích mẫu (lysis solution). 3. Cho 700 µl dịch ly trích mẫu (lysis solution) đã bỗ sung PVP 2% vào tube chứa mẫu và trộn đều bằng pipet từ 12 - 15 lần. 4. Ly tâm với tốc độ 12000 vòng trong 3 phút ở 4oC. Sau đó hút dịch nổi sang tube 2 ml (có trong kit). 5. Cho 700 µl ethanol 70% vào tube chứa dịch nổi, trộn đều bằng pipet cho đến khi dịch không còn phân lớp. 6. Cho dịch hòa tan RNA (elution solution) vào bể điều nhiệt ở 70oC. Cho RNA binding column vào tube 2 ml không có nắp đậy. 7. Hút 700 µl dịch mẫu cho vào RNA binding column. Ly tâm ở tốc độ 12000 vòng trong 1 phút ở 4oC. Loại phần dịch bên dƣới ra khỏi tube (thực hiện nhiều lần cho đến khi hết mẫu thì thôi). 8. Cho 80 µl ethanol 100% vào 20 ml dịch rửa nhẹ (low stringency). 9. Cho 700 µl dịch rửa nhẹ (low stringency) đã bổ sung ethanol 100% vào RNA binding column. Ly tâm 12000 vòng trong 30 giây ở 4oC. Loại phần dịch bên dƣới. 10. Pha DNase I với 250 µl Tris base pH = 7,5, trộn đều. 11. Pha 5 µl DNase I với 75 µl dịch pha loãng DNase (DNase delution solution) cho một mẫu ly trích trong tube 1,5 ml. Cho 80 µl dung dịch DNase vào RNA binding column. Ủ 15 phút ở nhiệt độ phòng. Ly tâm 12000 vòng trong 30 giây ở 4oC. Loại phần dịch bên dƣới. 12. Thêm 700 µl dịch rửa mạnh (high stringency wash solution) vào RNA binding column. Ly tâm 12000 vòng trong 30 giây ở 4oC Loại phần dịch bên dƣới 13. Thêm 700 µl dịch rửa nhẹ (low stringency wash solution) vào RNA binding column.
  2. 23 Ly tâm 12000 vòng trong 30 giây ở 4oC Loại phần dịch bên dƣới. Ly tâm tiếp 60 giây với tốc độ 12000 vòng ở 4oC để loại hoàn toàn dịch rửa. 14. Cho RNA binding column vào tube 1,5 ml (có trong kit) có nắp đậy. Cho 80 µl dịch hòa tan RNA (elution solution) đã ủ ở 70oC vào RNA binding column, giữ ở nhiệt độ phòng trong 60 giây. Ly tâm 12000 vòng trong 2 phút ở 4oC để thu RNA tổng số. RNA đem ủ ở 4oC để dùng sau. *Những lƣu ý khi ly trích - Phải có khu vực làm việc riêng - Trong quá trình ly trích, phải thao tác càng nhanh càng tốt - Thay bao tay thƣờng xuyên khi thấy cần thiết Giai đoạn 2: Tổng hợp cDNA Mẫu RNA đƣợc ly trích ở trên sẽ đƣợc dùng để chạy RT-PCR. Mục đích để khuếch đại 1 đoạn gen mã hóa cho phân tử protein vỏ của virus PLRV. Quy trình này gồm hai bƣớc (two steps). Bƣớc 1: Tổng hợp cDNA Tổng hợp cDNA theo hƣớng dẫn của bộ kit tổng hợp cDNA (iScript cDNA kit). Thành phần các loại hóa chất cho 1 phản ứng tổng hợp cDNA đƣợc cho the o bảng dƣới đây. Đối với lƣợng RNA cho vào ta thay đổi thể tích từ 2 - 5 µl trong một phản ứng. Bảng 3.5 Thành phần hóa chất cho một phản ứng tổng hợp cDNA Thành phần Thể tích 4 µl 5X iScript reaction Mix 1 µl Enzyme 5 µl (1 - 5 µg) RNA Nƣớc Cho vào để đủ 20 µl Tổng thể tích 20 µl
  3. 24 Chu kỳ nhiệt của phản ứng tổng hợp cDNA 25oC trong 5 phút 42oC trong 30 phút 85oC trong 5 phút Giữ ở 4oC cDNA đƣợc tổng hợp (20 µl) có thể đem sử dụng ngay trong phản ứng PCR hoặc cất ở 4oC để chạy PCR sau. Bƣớc 2: Thực hiện phản ứng PCR khuếch đại cDNA Bƣớc này ta không sử dụng kit mà thực hiện theo nghiên cứu của Fattouma DJILANI và Hatem FAKHFAKH ở đại học Tuynidi vào năm 2002. Thành phần hóa chất cho một phản ứng 25 µl đƣợc cho theo bảng dƣới đây Bảng 3.6 Thành phần hóa chất trong một phản ứng khuếch đại cDNA Thành phần Nồng độ cuối Dung dịch đệm PCR 10X 1X MgCl2 1 mM Hỗn hợp dNTP (dNTP Mix) 0,2 mM Mồi xuôi (sens primer) 0,3 µM Mồi ngƣợc (antisens primer) 0,3 µM 1 U/µl iTaq polymerase 2,5 - 5 µl cDNA Nƣớc Cho vào để đủ 25 µl Tổng thể tích 25 µl Chu trình nhiệt của phản ứng PCR - 94oC trong 5 phút - 94oC trong 1 phút - 50oC trong 1 phút 35 chu kỳ - 72oC trong 1 phút - 72oC trong 10 phút Lƣợng cDNA cho vào mỗi phản ứng thay đổi từ 2,5 – 5 µl. Sau khi thực hiện phản ứng PCR, ta sẽ thu đƣợc 25 µl sản phẩm (cDNA sợi đôi). Ta có thể thực hiện điện di ngay để xem kết quả hoặc cũng có thể trữ ở -20oC để chạy điện di sau. *Điện di đọc kết quả
  4. 25 Để kiểm tra sản phẩm RT-PCR có phải là đoạn gen mong muốn không ta thực hiện điện di trên gel agarose. Nồng độ gel: 1,5% Hiệu điện thế: 50 V Cƣờng độ dòng điện: 250 mA Thời gian điện di: 45 phút (có thể canh vạch loading dye) Tỷ lệ mẫu : loading dye là 4 µl : 2 µl Nhuộm ethidium bromide trong 20 phút Đọc kết quả trên máy chiếu tia UV. 3.3.3.3 Giải trình tự trực tiếp đoạn gen của virus PLRV Sau khi kiểm tra kết quả bằng điện di nếu thấy có đoạn gen mong muốn (kích thƣớc 336 bp), chúng tôi thực hiện tiếp bƣớc giải trình tự nhằm xác định chính xác đoạn gen của PLRV và khẳng định có sản phẩm phụ hay không. Việc giải trình tự tiến hành trực tiếp từ sản phẩm RT-PCR, theo nguyên tắc của Sanger. Phƣơng pháp này sử dụng một primer (hoặc sense hoặc antisense) cho một lần giải trình tự. Trong đề tài này, ta sẽ tiến hành giải trình tự bằng cả primer sense lẫn antisense. Bƣớc 1: Chạy cycle sequencing - Thành phần hóa chất cho 1 phản ứng 2 µl Bigdye 2,5X 1 µl Bigdye buffer 5X Sản phẩm PCR 3 - 10 ng Primer 3,2 pmol Nƣớc cho vào để đƣợc thể tích 10 µl Bigdye 2,5X bao gồm: enzyme kéo dài mẫu, buffer, dNTP và ddNTP. -Mỗi phản ứng chỉ sử dụng hoặc là primer xuôi hoặc là primer ngƣợc Quy trình nhiệt 96oC trong 1 phút 96oC trong 10 giây 50oC trong 5giây 25 chu kỳ 60oC trong 4 phút
  5. 26 Bƣớc 2: Làm sạch sản phẩm cycle sequencing - Cho 2,5 µl / tube EDTA 125 mM vào. - Cho 30 µl / tube ethanol 100% vào, đảo nhẹ. - Để ở nhiệt độ phòng 15 phút - Ly tâm 12000 vòng trong 30 phút ở 4oC - Loại dịch trong - Cho 30 µl / tube ethanol 70% vào - Ly tâm 12000 vòng trong 20 phút ở 4oC - Hút bỏ dịch trong và để khô. Bƣớc 3: Biến tính - Cho vào mỗi tube 10 µl Hidi formamide. - Biến tính ở 95oC trong 2 phút - Đƣa nhanh vào đá Sau đó cho 10 µl mẫu này vào máy giải trình tự. Bƣớc 4: Đọc kết quả Kết quả giải trình tự sẽ ở dạng peak (mỗi peak đại diện cho 1 nucleotide) và dạng ký tự (A, T, G, C). Sau khi có trình tự ta tiến hành kiểm tra bằng cách so sánh trình tự giải đƣợc với trình tự có sẵn trên ngân hàng gen (NCBI). Qua đây ta sẽ biết đƣợc trình tự giải đƣợc có phải là virus PLRV không và biết đƣợc mức độ tƣơng đồng giữa trình tự ta có với trình tự trên ngân hàng gene.
  6. 27 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Tình hình canh tác khoai tây tại Thành phố Đà Lạt Thời gian điều tra từ ngày 21 tháng 3 đến ngày 23 tháng 3 năm 2005. Tại thời điểm điều tra đang là mùa nắng - mùa chính để trồng khoai tây. Địa điểm điều tra gồm các phƣờng 5, 8, 9, 11 và 12. Diện tích điều tra tại phƣờng 5 là 1 hecta, phƣờng 8 là 1 hecta, phƣờng 9 là 1,6 hecta, phƣờng 11 là 0,6 hecta và phƣờng 12 là 1 hecta. Hai giống khoai tây đƣợc trồng chủ yếu tại các phƣờng trên là 06 và 07 nuôi cấy mô, giống 07 đƣợc trồng trên nền đất thịt còn giống 06 đƣợc trồng ít hơn trên nền đất xốp. Vào khoảng thời gian này, khoai tây đang ở các độ tuổi từ 1 đến 3 tháng tuổi, phần lớn các ruộng khoai tây đang ở giai đoạn sắp thu hoạch (tháng thứ 3). Điều kiện khí hậu lúc này là nắng nóng và khô hạn kéo dài. 100% ruộng khảo sát đều hiện diện ruồi đục lá và các loại rệp. 100% các ruộng đều canh tác theo cách lên luống và trồng hàng một, không trồng xen với các loại cây trồng khác. Đa số các ruộng khoai tây ở giai đoạn chuẩn bị thu hoạch nên việc quan sát triệu chứng của các bệnh là rất khó khăn. Tuy nhiên các bệnh thƣờng gặp là héo xanh, bã trầu, cuốn lá. Sự quan tâm cũng nhƣ nhận thức về bệnh virus và sự nguy hại do bệnh virus của nông dân là rất hạn chế. Do điều kiện thời tiết bất lợi nên năng suất dự kiến sẽ bị giảm và ƣớc tính khoảng 1,5 – 2,5 tấn / hecta. 4.2 Kết quả phát hiện virus PVX, PVY và PLRV bằng kỹ thuật ELISA 4.2.1 Tỷ lệ nhiễm virus PVX, PVY và PLRV tại các phƣờng Với khí hậu mát lạnh, khu vực Đà Lạt có điều kiện đặc biệt thuận lợi trồng khoai tây hầu nhƣ quanh năm. Theo thống kê của phòng nông nghiệp, tổng diện tích trồng khoai tây tại Đà Lạt là 856 ha với năng suất 98 tạ / ha đạt sản lƣợng 8425 tấn (năm 2004). Đà Lạt đƣợc xem là địa phƣơng có kỹ thuật canh tác rất cao, ngƣời dân đã biết áp dụng các kỹ thuật hiện đại, các loại chế phẩm sinh học, công nghệ nuôi cấy mô, sử dụng nhà kính từ nhiều năm nay. Trong đó các phƣờng 8, phƣờng 9 và phƣờng 12 đƣợc xem là những khu vực có kỹ thuật canh tác tƣơng đối vƣợt trội. Tuy nhiên kết quả thực tế về tình hình nhiễm các loại virus PVX, PVY và PLRV rất bất ngờ và đáng lo ngại. Dƣới đây là kết quả kiểm tra tỷ lệ nhiễm các loại virus PVX, PVY và PLRV tại các phƣờng đƣợc điều tra.
  7. 28 Bảng 4.1 Tỷ lệ nhiễm PVX ,PVY, PLRV tại các phƣờng Địa PVX PVY PLRV phƣơng Tổn Số Tổng Số Tổng Số Tỷ lệ Tỷ lệ Tỷ lệ lấy mẫu g số mẫu số mẫu số mẫu (%) (%) (%) mẫu nhiễm mẫu nhiễm mẫu nhiễm P5 32 18 56,25 33 30 90,91 33 32 96,97 P8 23 4 17,39 23 23 100 23 23 100 P9 33 7 21,21 33 32 96,97 33 32 96,97 P11 17 7 41,18 18 18 100 17 17 100 P12 22 16 72,73 21 21 100 22 22 100 Trung 41,75 97,58 98,79 bình -Từ số liệu trên ta có biểu đồ dƣới đây 100 80 P5 Tỷ lệ (%) P8 60 P9 40 P11 20 P12 0 PVX PVY PLRV Virus Biểu đồ 4.1 So sánh tỷ lệ nhiễm PVX, PVY và PLRV theo từng phƣờng - Qua kết quả này ta thấy tất cả các phƣờng đƣợc điều tra tại thành phố Đà Lạt đã bị nhiễm PVX, PVY, PLRV. Trong đó, mức độ nhiễm trung bình PVX (41,75%) là thấp nhất còn PVY (97,58%) và PLRV (98,79%) là rất cao. - Tại Việt Nam virus PVY đƣợc xem là loại virus gây hại nghiêm trọng nhất tiếp đến là PVX (Lê Lƣơng Tề - Vũ Triệu Mân, 1999). Trong kết quả này tỷ lệ nhiễm PVY là rất cao, nhiễm PVX cũng khá cao. Chính vì vậy ta cần phải đƣa ra các biện pháp phòng trừ thích hợp nhằm ngăn chặn sự lây lan và tác hại của các loại virus trên. - Tại phƣờng 12, đa số các mẫu lấy tại đây đều chỉ ở F1 hoặc F2 nhƣng lại có tỷ lệ nhiễm các loại virus là cao nhất. Nguyên nhân có thể là nguồn gốc giống không đảm bảo (giống không sạch bệnh). - Các mẫu không biểu hiện triệu chứng của bệnh cũng cho kết quả dƣơng tính. Điều này chứng tỏ một điều là ta không thể dựa hoàn toàn vào triệu chứng mà định bệnh.
  8. 29 4.2.2 Tỷ lệ nhiễm virus PVX, PVY và PLRV theo từng giống Bảng 4.2 Tỷ lệ nhiễm PVX, PVY và PLRV theo giống PVX PVY PLRV Giốn Tổn Số Tổn Số Tổn Số Tỷ lệ Tỷ lệ Tỷ lệ g số mẫu g số mẫu g số mẫu g (%) (%) (%) mẫu nhiễm mẫu nhiễm mẫu nhiễm 07 104 39 37,50 103 103 100 104 102 98,08 06 22 12 54,54 23 20 86,96 23 16 69,57 Từ bảng ta có biểu đồ dƣới đây 100 80 Tỷ lệ (%) 60 07 06 40 20 0 PVX PVY PLRV Virus Biểu đồ 4.2 So sánh tỷ lệ nhiễm bệnh giữa hai giống 06 và 07 - Qua bảng và biểu đồ ta thấy có sự khác biệt về mức độ nhiễm bệnh của hai giống khoai tây 06 và 07. Giống 06 cho tỷ lệ nhiễm với PVX cao hơn so với giống 07. Còn đối với PVY và PLRV thì giống 07 lại cho kết quả nhiễm cao hơn giống 06. Hai giống 06 và 07 là giống nhập nội nên có tỷ lệ nhiễm PLRV ở mức độ cao (Lê Lƣơng Tề - Vũ Triệu Mân, 1999). - Giống 07 đƣợc cho là có khả năng kháng bệnh cao. Tuy nhiên qua kết quả trên ta thấy giống 07 không tỏ ra ƣu thế trong việc kháng lại các loại virus trên so với giống 06. Vấn đề ở đây là yếu tố môi trƣờng và cách chăm sóc cũng tác động rất lớn đến khả năng nhiễm virus của các giống khoai tây. Tuy nhiên cũng có thể do lƣợng mẫu kiểm tra không đủ để phản ánh tỷ lệ nhiễm thực sự của giống 06. Do đó tùy từng điều kiện cụ thể mà ta nên trồng giống 06 hay 07 tuy nhiên dù trồng giống 06 hay 07 thì khâu sản xuất giống sạch bệnh hay kháng bệnh là quan trọng nhất. Giống 06 và 07 đƣợc trồng bằng cây nuôi cấy mô. Theo Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mân (1999), những cây con giống có thể bị nhiễm bệnh từ 90 đến 100% ở các mức độ khác nhau nếu nhƣ tế bào ban đầu đem nuôi cấy đã bị nhiễm virus.
  9. 30 4.2.3 Tỷ lệ nhiễm virus PVX, PVY và PLRV theo từng thế hệ Bảng 4.3 Tỷ lệ nhiễm virus PVX, PVY và PLRV theo từng thế hệ của giống 07 PVX PVY PLRV Thế Tổn Số Tỷ Tổn Số Tỷ Tổn Số Tỷ hệ g số mẫu lệ g số mẫu lệ g số mẫu lệ mẫu nhiễm mẫu nhiễm mẫu nhiễm (%) (%) (%) F1 53 22 41,5 51 50 98,0 54 53 98,1 F2 45 12 1 44 44 4 44 44 5 F3 6 5 26,6 28 28 100 6 6 100 7 100 100 83,3 3 Từ bảng ta có biểu đồ 100 90 80 70 F1 Tỷ lệ (%) 60 50 F2 40 F3 30 20 10 0 PVX PVY PLRV Virus Biểu đồ 4.3 So sánh tỷ lệ nhiễm bệnh giữa các thế hệ của giống 07 Kết quả cho thấy, ở thế hệ sau tỷ lệ nhiễm virus cao hơn ở thế hệ trƣớc. Điều này hoàn toàn chính xác, đặc biệt với virus PLRV sự tái nhiễm ở vụ thứ hai hoặc thứ ba từ 69 – 90% (Vander Zang, 1983). Riêng đối với PVX thì thế hệ sau nhiễm ít hơn thế hệ trƣớc, có thể lý giải dựa vào điều kiện canh tác tốt đồng thời khí hậu khắc nghiệt của mùa nắng không thuận lợi cho sự phát triển và lây truyền của virus PVX. - Đối với PVY – virus gây hại quan trọng ở Việt Nam và PLRV cho tỷ lệ nhiễm rất cao ngay ở thế hệ F1. Điều này chứng tỏ nguồn cây giống (nuôi cấy mô) đã bị nhiễm bệnh từ đầu chứ không phải sạch bệnh nhƣ lời công bố của các nhà cung cấp giống. Qua đây ta rút ra kinh nghiệm là không nên để giống quá dài, bởi vì giống dễ bị thoái hóa và khả năng nhiễm các loại virus trên là rất cao ảnh hƣởng đến năng suất và chất lƣợng khoai tây.
  10. 31 4.2.4 Tỷ lệ nhiễm virus PVX, PVY và PLRV theo tháng tuổi Bảng 4.4 Tỷ lệ nhiễm virus PVX, PVY và PLRV theo từng tháng tuổi PVX PVY PLRV Tổng Số Tổng Số Tổng Số Tuổi Tỷ lệ Tỷ lệ Tỷ lệ Số mẫu Số mẫu Số mẫu (%) (%) (%) mẫu nhiễm mẫu nhiễm mẫu nhiễm 1T 5 1 20 5 5 100 5 5 100 1,5T 10 9 90 10 10 100 9 9 100 2T 19 8 42,11 18 17 94,44 7 7 100 2,5T 5 3 60 5 5 100 5 5 100 3T 65 18 27,69 65 65 100 66 66 100 Từ bảng ta có biểu đồ 100 80 1T Tỷ lệ (%) 1,5T 60 2T 40 2,5T 20 3T 0 PVX PVY PLRV Virus Biểu đồ 4.4 So sánh tỷ lệ nhiễm giữa các lứa tuổi Nhận xét - Không có sự khác biệt giữa các độ tuổi về tỷ lệ nhiễm PVY và PLRV. Từ 1 tháng đến 3 tháng tỷ lệ nhiễm luôn ở mức cao. Điều này chứng tỏ các giống đƣợc trồng có thể đã bị thoái hóa và nguồn cung cấp giống đã bị nhiễm từ ban đầu. - Đối với PVX, có sự thay đổi bất thƣờng, thời điểm 1,5 tháng cho tỷ lệ nhiễm cao nhất (90%), thấp nhất là lúc 1 tháng. - Sự hiện diện tƣơng đối nhiều các loại côn trùng nhƣ ruồi, rệp ở các ruộng khoai tây đƣợc khảo sát cũng là một nguyên nhân dẫn đến sự nhiễm các loại virus ở mức độ cao. 4.3 Kết quả RT-PCR - Dùng kit ly trích RNA do Bio - Rad cung cấp ta thu đƣợc 80 µl RNA tổng số. - Ta sẽ thu đƣợc 20 µl cDNA sau khi thực hiện phản ứng tổng hợp cDNA. Thành phần và quy trình nhiệt của phản ứng tổng hợp cDNA (theo hƣớng dẫn của kit tổng hợp
Theo dõi chúng tôi
Đồng bộ tài khoản