LUẬN VĂN: NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT KHÁNG THỂ THỎ KHÁNG OVALBUMIN DÙNG PHÁT HIỆN OVALBUMIN TRONG VACXIN CÚM A/H5N1

Chia sẻ: Truong Van Phuong Phuong | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:75

0
115
lượt xem
60
download

LUẬN VĂN: NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT KHÁNG THỂ THỎ KHÁNG OVALBUMIN DÙNG PHÁT HIỆN OVALBUMIN TRONG VACXIN CÚM A/H5N1

Mô tả tài liệu
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bệnh cúm A/H5N1 được xem là bệnh truyền nhiễm đặc biệt nguy hiểm với sự lây lan nhanh và tỷ lệ tử vong rất cao. Mới chỉ xuất hiện từ cuối năm 2003 tại một số nước châu Á, đến nay dịch cúm A/H5N1 đã lan rộng ra nhiều quốc gia trên thế giới với 229 người nhiễm bệnh, trong đó 131 người tử vong chiếm tỷ lệ 58% [6]. Các trường hợp nhiễm virus cúm được phát hiện mặc dù chỉ xảy ra do lây nhiễm giữa người với các loài gia cầm. Thế nhưng, các chuyên gia trên thế giới đã khẳng định, việc...

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: LUẬN VĂN: NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT KHÁNG THỂ THỎ KHÁNG OVALBUMIN DÙNG PHÁT HIỆN OVALBUMIN TRONG VACXIN CÚM A/H5N1

  1. tài "“ NGHIÊN C U S N XU T KHÁNG TH TH KHÁNG OVALBUMIN DÙNG PHÁT HI N OVALBUMIN TRONG VACXIN CÚM A/H5N1”
  2. L I C M ƠN T lòng bi t ơn sâu s c c a mình, em xin dành trang u tiên c a khóa lu n bày t lòng c m ơn chân thành n: Ban Giám hi u trư ng i h c Nha Trang, Phòng ào t o, Ban ch nhi m khoa Ch Bi n cùng toàn th quý th y cô ã gi ng d y t n tình và giúp em trong quá trình h c t p t i trư ng. PGS.TS. Lê Văn Hi p - Vi n trư ng Vi n V c xin và Sinh ph m Y t Nha Trang, ngư i th y ã luôn quan tâm hư ng d n, t o i u ki n thu n l i cho em trong quá trình th c t p t i Vi n. CN. Nguy n Th Minh Hi n - trư ng phòng, TS. Nguy n Th Lan Phương - phó phòng Ki m nh, CN. Tr n Ng c Nhơn, TS. Minh Sĩ ã tr c ti p hư ng d n, ch b o nhi t tình, chu áo và luôn t o m i i u ki n thu n l i nh t giúp em hoàn thành lu n văn này. Qua ây em xin bày t lòng bi t ơn sâu s c n toàn th các cô, các anh ch phòng Ki m nh, phòng Nghiên c u và phát tri n ã nhi t tình giúp , góp ý và ng viên em trong th i gian th c t p t i phòng. Em xin chân thành c m ơn Ban Giám c Vi n V c xin Nha Trang ã t o i u ki n thu n l i cho em th c t p t i Vi n. Xin bày t lòng bi t ơn n gia ình, t t c b n bè, anh ch và các em ã quan tâm, giúp , chia s , ng viên em trong su t th i gian qua. Nha Trang, tháng 11 năm 2007 Sinh viên ào Th Thanh Vân.
  3. CH VI T T T TRONG KHÓA LU N  APS : Amonium persulfat CV : H s bi n thiên D : Dư c i n D VN : Dư c i n Vi t Nam ELISA : Enzyme - linked immuno sorbent assay (Th nghi m mi n d ch g n men) FCA : Tá ch t Freund Complete FIA : Tá ch t Freund Incomplete HA : Haemagglutin IgG : Immuno globulin G IU : International Unit ( ơn v qu c t ) KN : Kháng nguyên KT : Kháng th LOD : Limit of detection (Gi i h n phát hi n) LOQ : Limit of quantification (Gi i h n nh lư ng) NA : Neuraminidase OD : Optical density (M t quang) PBS : Photphat buffer saline (Dung d ch m c a mu i Photphat) SD : Standard Deviation ( l ch chu n) SDS-PAGE : Sodium dodecyl sulphate – Poly acrylamide gel Electrophoresis ( i n di gel Poly acrylamide có Sodium dodecyl sulphate) Streptavidine – PO : Streptavidine – Peroxydase RIA : Radial immuno assay (Th nghi m mi n d ch phóng x ) RNA : Ribonucleic Acide (Axit Ribonucleic) TMB : 3,3’,5,5’ – TetraMethyl Benzidine TEMED : N,N,N’,N’- TetraMethylethylendiamin WHO : World Health Organization (T ch c Y t th gi i -TCYTTG)
  4. M CL C  TRANG BÌA PH L I C M ƠN DANH M C CH VI T T T M CL C DANH M C CÁC B NG DANH M C CÁC HÌNH L I NÓI U ................................................................................................................ 1 1.1. TÌNH HÌNH B NH CÚM A/H5N1 ............................................................. 4 1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN C U S N XU T VACXIN CÚM A/H5N1 HI N NAY ......................................................................................................... 5 1.3. GI I THI U VACXIN CÚM A/H5N1 S N XU T TRÊN TR NG GÀ CÓ PHÔI ............................................................................................................ 6 1.3.1. Nguyên li u s n xu t .............................................................................. 6 1.3.2. Ch ng s n xu t ....................................................................................... 6 1.3.3. Quy trình s n xu t và ki m nh vacxin cúm A/H5N1 trên tr ng gà có phôi ............................................................................................................. 7 1.3.4. Tiêu chu n ch t lư ng c a vacxin cúm A/H5N1 .................................... 7 1.4. OVALBUMIN .............................................................................................. 8 1.4.1. c tính ................................................................................................. 8 1.4.2. C u t o .................................................................................................. 9 1.4.3. Tính sinh mi n d ch ............................................................................... 9 1.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HI N OVALBUMIN VÀ KHUY N CÁO V CÁCH PHÁT TRI N VÀ TH M NH PHƯƠNG PHÁP .............. 10 1.5.1. Các phương pháp phát hi n ovalbumin ................................................ 10 1.5.1.1. Phương pháp Ouchterlony (khuy ch tán mi n d ch kép) ................. 11 1.5.1.2. Phương pháp i n di mi n d ch i lưu ............................................ 11 1.5.1.3. Phương pháp mi n d ch phóng x (Radioimmunoassay- RIA) ....... 12 1.5.1.4. Phương pháp ELISA – K thu t ch t h p ph mi n d ch g n enzyme (Enzyme – Linked immunosorbent Assay) ......................... 12 1.5.2. Các khuy n cáo v cách phát tri n và th m nh phương pháp ............. 14 1.6 S N XU T KHÁNG TH VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP TINH CH .......... 15
  5. 1.6.1. Tá ch t ................................................................................................. 15 1.6.2. Quy trình gây mi n d ch cơ b n t o kháng th a dòng ........................ 16 1.6.3. Tinh ch kháng th IgG ....................................................................... 17 1.6.3.1. K t t a IgG t huy t thanh ho c d ch sinh v t khác b ng (NH4)2SO4............................................................................................ 18 1.6.3.2. Tinh ch IgG nh s c kí trao i ion .................................................. 18 1.6.3.3. Tinh ch IgG nh c t ái l c protein A- ho c protein G-sepharose 4B ......................................................................................................... 19 1.6.4. Ki m tra n ng và s ch c a huy t thanh sau tinh ch ................... 20 2.1. TH I GIAN VÀ A I M NGHIÊN C U ............................................. 22 2.2. V T LI U .................................................................................................. 22 2.2.1. Sinh ph m............................................................................................. 22 2.2.2. Súc v t thí nghi m ................................................................................ 22 2.2.3. Hoá ch t và dung d ch chu n ................................................................ 22 2.2.4. Thi t b ................................................................................................. 23 2.2.5. D ng c ................................................................................................ 24 2.3. PHƯƠNG PHÁP ........................................................................................ 24 2.3.1. Mi n d ch th thu huy t thanh kháng ovalbumin .................................. 24 2.3.2. Xác nh hi u giá kháng th th kháng ovalbumin b ng phương pháp khuy ch tán mi n d ch kép (Ouchterlony) ...................................................... 26 2.3.2.1. Nguyên t c............................................................................................ 26 2.3.2.2. Ti n hành .............................................................................................. 26 2.3.3. Tinh ch kháng th kháng ovalbumin b ng c t HiTrap protein G HP.... 27 2.3.3.1. Tinh ch ............................................................................................... 27 2.3.3.2. Phương pháp i n di SDS-PAGE ki m tra s ch c a huy t thanh sau tinh ch ................................................................................ 28 2.3.4. Phương pháp i n di mi n d ch i lưu................................................. 30 2.3.5. Xây d ng phương pháp ELISA nh lư ng ovalbumin trong vacxin cúm A/H5N1. ................................................................................................. 31 2.3.5.1. Nguyên lý ............................................................................................. 31 2.3.5.2. Các bư c ti n hành .............................................................................. 31 2.3.6. Th m nh phương pháp ....................................................................... 33 2.3.6.1. Xây d ng ư ng chu n và nh y c a ph n ng............................. 33 2.3.6.2. Xác nh chính xác c a phương pháp ........................................... 33
  6. CHƯƠNG III: K T QU VÀ BÀN LU N.............................................................. 36 3.1. ÁNH GIÁ QUY TRÌNH MI N D CH VÀ S N XU T KHÁNG TH TH KHÁNG OVALBUMIN ........................................................................... 37 3.2. TINH CH KHÁNG TH TH (IgG) KHÁNG OVALBUMIN ................ 40 3.3. XÂY D NG H ELISA NH LƯ NG OVALBUMIN. ......................... 43 3.3.1. Ch n h m khóa phi n ...................................................................... 43 3.3.2. Xác nh n ng kháng th phù h p cho ph phi n ............................. 44 3.4. TH M NH PHƯƠNG PHÁP ................................................................. 46 3.4.1. Xây d ng ư ng chu n ......................................................................... 46 3.4.2. K t qu xác nh nh y c a ph n ng ................................................ 47 3.4.3. K t qu xác nh chính xác và úng c a phương pháp ............... 49 3.4.4. So sánh v i phương pháp i n di mi n d ch i lưu .............................. 55 3.5. NG D NG H ELISA NH LƯ NG OVALBUMIN TRONG TRONG VACXIN CÚM A/H5N1 ..................................................................... 56 4.1. K T LU N ................................................................................................ 59 4.1.1. S n xu t kháng th th kháng ovabumin ............................................... 59 4.1.2. ã s d ng c t HiTrap protein G HP tinh ch thành công kháng th (IgG) kháng ovalbumin t huy t thanh th thô ............................................... 59 4.1.3. Xây d ng và th m nh ư c h ELISA gián ti p nh lư ng ovalbumin trong vacxin cúm A/H5N1 ............................................................ 59 4.2. KI N NGH ................................................................................................ 60 TÀI LI U THAM KH O .............................................................................................. 1 PH L C
  7. DANH M C CÁC B NG  B ng 3.1. K t qu áp ng kháng th c a th sau mũi tiêm th nh t. .................... 37 B ng 3.2. K t qu hi u giá kháng th sau các mũi tiêm ......................................... 38 B ng 3.3. K t qu kháng th sau khi tinh ch ........................................................ 41 B ng 3.4. nh y c a ph n ng (LOD và LOQ) .................................................. 48 B ng 3.5. M t quang n n c a 6 l n th nghi m ................................................ 51 B ng 3.6. l p l i c a ph n ng ........................................................................ 52 B ng 3.7. chính xác và úng c a ph n ng................................................. 54 B ng 3.8. K t qu ELISA nh lư ng các m u ovalbumin .................................... 56
  8. DANH M C CÁC HÌNH  Hình 2.1. Sơ mi n d ch ..................................................................................... 25 Hình 2.2. Sơ l y máu ........................................................................................ 25 Hình 2.3. K thu t ELISA gián ti p nh lư ng kháng nguyên ovalbumin............. 35 Hình 3.1. Tiêu b n nhu m Coomassie phương pháp Ouchterlony phát hi n kháng th kháng ovalbumin ................................................................................... 39 Hình 3.2 th bi u di n các phân o n thu ư c khi tinh ch huy t thanh kháng ovalbumin. .................................................................................................. 40 Hình 3.3. Tiêu b n nhu m Coomassie b n i n di SDS-PAGE (10% SDS) các m u huy t thanh. ................................................................................................... 42 Hình 3.4. th bi u di n s phù h p gi a các m khóa phi n trong ph n ng ELISA nh lư ng ovalbumin. ............................................................................... 43 Hình 3.5. th bi u di n s phù h p gi a các n ng kháng th th kháng ovalbumin trong ph n ng ELISA nh lư ng ovalbumin...................................... 44 Hình 3.6. th ư ng chu n ............................................................................... 46 Hình 3.7. Tiêu b n nhu m Coomassie phương pháp i n di i lưu nh lư ng ovalbumin ............................................................................................................. 55
  9. -1- L I NÓI U B nh cúm A/H5N1 ư c xem là b nh truy n nhi m c bi t nguy hi m v i s lây lan nhanh và t l t vong r t cao. M i ch xu t hi n t cu i năm 2003 t i m t s nư c châu Á, n nay d ch cúm A/H5N1 ã lan r ng ra nhi u qu c gia trên th gi i v i 229 ngư i nhi m b nh, trong ó 131 ngư i t vong chi m t l 58% [6]. Các trư ng h p nhi m virus cúm ư c phát hi n m c dù ch x y ra do lây nhi m gi a ngư i v i các loài gia c m. Th nhưng, các chuyên gia trên th gi i ã kh ng nh, vi c virus cúm A lây nhi m t ngư i sang ngư i ch còn là v n th i gian. Trư c nguy cơ bùng phát c a i d ch, các nư c, các t ch c trên th gi i ã ph i vào cu c nhanh chóng tìm ra phương th c phòng b nh hi u qu . Vacxin luôn ư c coi là phương th c h u hi u nh t trong vi c phòng ch ng, gi m t l m c b nh và t l ch t do các i d ch gây ra. Công ngh s n xu t vacxin cúm “thông thư ng” ã có t 60 năm trư c các nư c châu Âu và B c M nhưng s lư ng ít và m c giá cao [3] nên không th áp ng cho th gi i khi có i d ch x y ra, c bi t v i các nư c nghèo, nư c ang phát tri n l i càng khó khăn hơn. T ch c Y t th gi i (TCYTTG) ã khuy n cáo các nư c nên t nghiên c u s n xu t vacxin cúm A/H5N1 có th ch ng trong công tác phòng ch ng d ch, b o v s c kho c ng ng [3]. Cùng v i vi c t o ra các ch ng s n xu t vacxin cúm A/H5N1 thích h p b ng k thu t di truy n ngư c, các trung tâm nghiên c u b nh cúm qu c t cũng ưa ra nh ng hư ng s n xu t vacxin cúm khác nhau (s n xu t trên tr ng gà có phôi, t bào ng v t…). Trên cơ s ó, tuỳ thu c vào i u ki n c a t ng qu c gia mà l a ch n con ư ng s n xu t cho phù h p nhưng ph i m b o tính an toàn và hi u qu cao. T i Vi t Nam, vi n V c xin và sinh ph m y t Nha Trang ã nghiên c u s n xu t vacxin cúm A/H5N1 cho ngư i b ng phương pháp nuôi c y trên tr ng gà có phôi. Vi n ã s n xu t th 9 lo t vacxin thành công. Trư c khi ưa vào s d ng, vacxin cúm ph i t ư c các tiêu chu n an toàn, mi n d ch c n thi t theo quy nh
  10. -2- c a B Y t Vi t Nam và TCYTTG. M t trong s các tiêu chu n ó là hàm lư ng ovalbumin, protein trong lòng tr ng tr ng, là thành ph n có kh năng gây d ng r t cao. Theo tiêu chu n c a TCYTTG, lư ng ovalbumin trong m i li u vacxin cúm A/H5N1 s n xu t t tr ng gà có phôi không ư c vư t quá 1 µg [10]. Chính vì th , vi c tìm ra m t phương pháp xác nh hàm lư ng ovalbumin v i nh y và chính xác cao là m t i u tiên quy t. Có nhi u phương pháp khác nhau nh lư ng ovalbumin như: ELISA, i n di mi n d ch…Tuy nhiên, các nghiên c u trư c ó cho th y, phương pháp ELISA là phương pháp cho c hi u và chính xác r t cao, có kh năng phát hi n ovalbumin m c nanogam (ng) [10-13]. Các b kít ELISA dùng xác nh hàm lư ng ovalbumin r t t ti n và không phù h p khi ti n hành các ki m nh trong quá trình s n xu t. Chính vì v y, v i i u ki n trang thi t b hi n có, chúng tôi ti n hành nghiên c u tài “ NGHIÊN C U S N XU T KHÁNG TH TH KHÁNG OVALBUMIN DÙNG PHÁT HI N OVALBUMIN TRONG VACXIN CÚM A/H5N1” . M c tiêu tài: 1. S n xu t kh ng th th kháng ovalbumin. 2. Tinh ch kháng th (IgG) kháng ovalbumin. 3. ng d ng kháng th kháng ovalbumin tinh ch nh lư ng ovalbumin trong các m u vacxin cúm A/H5N1 b ng phương pháp ELISA và phương pháp i n di mi n d ch i lưu. .
  11. -3- CHƯƠNG 1: T NG QUAN TÀI LI U
  12. -4- 1.1. TÌNH HÌNH B NH CÚM A/H5N1 [3], [6] Cúm gà hay cúm gia c m do virus cúm typ A gây nên. Chúng thư ng gây b nh trên các loài gia c m và có th lây nhi m sang m t s loài ng v t có vú. Cúm gia c m lây lan r t nhanh và khó ki m soát. Chúng thư ng lây nhi m nhanh các loài lông vũ và gây ch t trên di n r ng. Năm 1996, virus cúm A/H5N1 l n u tiên ư c phân l p ng ng t i t nh Giang ông, Trung Qu c. Sau ó ti p t c lan r ng ra nhi u nư c châu Á và m t s nư c châu Âu. T năm 2003, d ch cúm gia c m H5N1 bùng phát m nh t i Thái Lan, Vi t Nam, Hàn Qu c, Nh t B n sau ó lan kh p châu Á. Thái Lan và Vi t Nam là hai qu c gia b nh hư ng n ng n nh t. Không ch gây b nh trên gia c m, virus cúm A/H5N1 còn là m i e d a cho s c kh e con ngư i. Theo th ng kê c a TCYTTG, tính n ngày 04/07/2006 ã có 229 ngư i b nhi m cúm A/H5N1 10 qu c gia trong ó có 131 ngư i t vong chi m t l 58% [6]. Vi t Nam v n là nư c có s ngư i nhi m cúm A/H5N1 r t cao. Tính n tháng 6/2007, t i 32 t nh thành trong c nư c có 98 ngư i b m c b nh, trong ó có 42 ngư i b ch t [3]. T năm 2003 n nay, tình hình lây nhi m virus cúm A/H5N1 di n bi n r t ph c t p. Không ch gây b nh trên gia c m, nó còn gây nhi m sang m t s ng v t khác như h (Thái Lan), mèo (Thái Lan, Indonesia, Iraq, c), l n (Indonesia, Vi t Nam), ch n (bi n Baltic, c). S ngư i nhi m do H5N1 cũng gia tăng không ng ng c v s lư ng l n ph m vi nh hư ng. M c dù các trư ng h p nhi m virus cúm A/H5N1 trên ngư i trong su t nh ng mùa d ch v a qua cho th y, s nhi m virus ch x y ra khi có s ti p xúc khá ch t ch gi a ngư i v i các loài gia c m b nh. Tuy nhiên, vi n c nh xu t hi n nh ng ch ng virus cúm có kh năng lây t ngư i sang ngư i là m t i u có th tiên li u ư c. TCYTTG ã ưa ra c nh báo r ng i d ch cúm ang n g n và nhi u kh năng là do m t bi n ch ng c a virus cúm gia c m H5N1. Vì v y, công tác phòng ch ng d ch ang di n ra nhi u nư c trên th gi i. Hi n nay, gi i pháp ư c nhi u nư c trên th gi i ang th c hi n là s n xu t vacxin phòng cúm cho ngư i.
  13. -5- 1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN C U S N XU T VACXIN CÚM A/H5N1 HI N NAY [1], [3], [6] Trư c nguy cơ i d ch cúm ang n g n, công tác phòng ch ng d ch ang di n ra r t kh n trương nhi u nư c trên th gi i. phòng ch ng i d ch thì vi c s d ng vacxin là phương th c h u hi u nh t b o v c ng ng, làm gi m t l m c b nh và t l ch t. Tình hình th gi i: TCYTTG và t ch c Nông lương th gi i khuy n cáo t t c các nư c, c bi t là các nư c ang phát tri n ph i t nghiên c u và s n xu t vacxin cúm A/H5N1 ch ng ngu n vacxin ph c v cho nhu c u b o v s c kh e c ng ng khi i d ch x y ra. TCYTTG ã ưa ra ba lo i vacxin cúm sau cho các nư c l a ch n s n xu t: Vacxin b t ho t trên tr ng gà có phôi và nuôi c y t bào; vacxin s ng trên tr ng gà có phôi và nuôi c y t bào; vacxin s ng d ng phun mù, hít qua mũi [3]. Hi n nay, trên th gi i m c dù ã có r t nhi u nư c nghiên c u và s n xu t vacxin cúm A/H5N1 nhưng chưa có nư c nào ư c c p gi y phép lưu hành. Nhi u hãng s n xu t vacxin l n như hãng Sanofi Pasteur (M , Pháp), hai hãng Nobilon, Sovay Pharmaceutials c a Hà Lan vv... ang nghiên c u s n xu t vacxin cúm A/H5N1 b ng phương pháp nuôi c y trên tr ng gà có phôi ho c nuôi c y trên các dòng t bào (như t bào Vero, MDCK .v.v...). Tình hình Vi t Nam: Vi t Nam là nư c có khí h u nhi t i gió mùa nên r t d cho d ch cúm bùng phát và lây lan ra di n r ng. Ngoài ra, àn gia c m v i s lư ng l n cũng là m t y ut nh hư ng r t l n n vi c bùng n d ch cúm. Trư c nguy cơ i d ch cúm ang n g n, v n cân nh c và l a ch n m t dây chuy n s n xu t vacxin cúm sao cho phù h p v i tình hình th c t t nư c mà v n m b o ch t lư ng ang là m i quan tâm hàng u c a nư c ta hi n nay. V n càng tr nên g p rút hơn khi d ch cúm m i ngày m t ti n g n hơn. Trư c tình hình ó, căn c vào ưu như c
  14. -6- i m c a t ng phương pháp mà hi n nay Vi t Nam ã có nhi u ơn v s n xu t vacxin cúm H5N1 như: Năm 2004, vi n V sinh d ch t Trung ương nghiên c u s n xu t vacxin cúm A/H5N1 dùng cho ngư i b ng phương pháp nuôi c y trên t bào th n kh . Ngày 18/03/2006, vi n Pasteur Tp.HCM ph i h p v i vi n V c xin và sinh ph m y t Nha Trang và vi n Công ngh sinh h c Hà N i ã b o v thành công tài c p nhà nư c mang tên “Nghiên c u quy trình s n xu t vacxin cúm A/H5N1 dùng cho ngư i b ng k thu t nuôi c y trên tr ng gà có phôi và trên t bào Vero” t iH i ng Khoa h c, B khoa h c công ngh [6]. Ti p theo ó, năm 2007, Vi n V c xin và sinh ph m y t Nha Trang ã xây d ng quy trình s n xu t vacxin cúm t tiêu chu n GMP v i s h tr c a TCYTTG, quy mô s n xu t là 1 tri u li u/năm. 1.3. GI I THI U VACXIN CÚM A/H5N1 S N XU T TRÊN TR NG GÀ CÓ PHÔI [3], [4] 1.3.1. Nguyên li u s n xu t Nguyên li u s n xu t vacxin cúm theo phương pháp này là tr ng gà s ch có phôi 10 n 11 ngày tu i. Tr ng ư c cung c p t nh ng cơ s s n xu t tr ng s ch t tiêu chu n trong và ngoài nư c. 1.3.2. Ch ng s n xu t Hi n nay, Vi n V c xin và sinh ph m y t Nha Trang ang s d ng ch ng s n xu t NIBRG-14 (Vi n NIBSC-Anh), ư c tái t h p t hai ch ng virus cúm A/VietNam/1194/2004 (H5N1) và A/PR/8/34 (H1N1), trong ó gen mã hóa H5 và N1 l y t ch ng A/VietNam/1194/2004. Vùng quy t nh tính c trên gen H5 g m 4 axit amin mang tính ki m b c t b , 6 gen còn l i l y t ch ng A/PR/8/34. Ch ng NIBRG-14 có kháng nguyên b m t (H5 và N1) g n gũi v i ch ng virus cúm A/H5N1 ã phân l p ư c Vi t Nam và ư c TCYTTG cho phép s d ng làm vacxin [3].
  15. -7- 1.3.3. Quy trình s n xu t và ki m nh vacxin cúm A/H5N1 trên tr ng gà có phôi Tr ng gà s ch có phôi 10÷11 ngày tu i ư c c y ch ng virus cúm. Sau khi vào trong tr ng, virus cúm s nhân lên v i s lư ng l n. n khi s lư ng, ti n hành ti n hành thu g t d ch ni u nang. D ch ni u nang ư c tinh ch sau ó ư c hoàn nguyên và b t ho t b ng formandehyde. S n ph m ư c em i h p ph tá ch t và pha bán thành ph m. Sau ó, s n ph m ư c óng l t o thành vacxin thành ph m. Song song v i quy trình s n xu t, quy trình ki m nh cũng di n ra theo sơ (ph l c 1). 1.3.4. Tiêu chu n ch t lư ng c a vacxin cúm A/H5N1 [10] M i lô vacxin cúm A/H5N1 trong quá trình s n xu t cũng như khi thành ph m, trư c khi ưa vào s d ng u ph i tr i qua quá trình ki m nh r t ch t ch . Các tiêu chí ki m tra u d a trên các tiêu chu n hi n hành c a B Y t Vi t Nam và các quy nh c a TCYTTG cho vacxin cúm u ng cho ngư i. i v i vacxin cúm s n xu t trên tr ng gà có phôi, có m t ch tiêu ki m tra c trưng mà i v i các vacxin s n xu t trên t bào không có ó là ki m tra hàm lư ng ovalbumin. ây là m t ch tiêu r t quan tr ng trong s hàng lo t các ch tiêu ki m nh vacxin cúm s n xu t trên tr ng gà có phôi. Ovalbumin là protein có trong lòng tr ng tr ng, trong quá trình s n xu t vacxin cúm trên tr ng gà, thành ph n này có th còn t n t i trong vacxin cúm thành ph m. Ovalbumin là ch t gây d ng cho cơ th ngư i và ng v t nên vi c ki m tra hàm lư ng ovalbumin c a các lô vacxin cúm thành ph m là m t yêu c u b t bu c. Theo TCYTTG (WHO/TRS 927/2005) thì hàm lư ng ovalbumin ph i ≤ 1 µg/1 li u ơn cho ngư i [10], (ph l c 2).
  16. -8- 1.4. OVALBUMIN 1.4.1. c tính [17], [18], [19] Ovalbumin là m t protein chính ư c tìm th y trong lòng tr ng tr ng (chi m 60÷65% protein t ng s ), có tr ng lư ng phân t là 45kDa [17]. Trong i n di ovalbumin có i m ng i n (pHi) t i pH= 4,6 [19]. Hi n nay ã có m t s nghiên c u v ovalbumin trong m t s lĩnh v c khác nhau như: − Nh ng nghiên c u chung v c u trúc và c tính − Nh ng nghiên c u v c u trúc serpin và ch c năng − Proteomic − Nh ng nghiên c u trong lĩnh v c mi n d ch h c Tuy nhiên, ây m i ch là nh ng nghiên c u ban u, ch c năng c a ovalbumin v n chưa ư c bi t n m c dù nó ư c d oán là m t protein có nhi u ti m năng. M t trong nh ng ng d ng c a ovalbumin hi n nay là dùng trong i n di trên gel, nó ư c dùng như m t phân t chu n làm m c ánh d u. Bên c nh ó, ovalbumin cũng ư c dùng trong ch a b nh. Trong trư ng h p b nghi ng ng c kim lo i n ng (ví d như s t) ovalbumin có th ch a tr ư c vì ovalbumin có kh năng b y các ion này trong liên k t sulfuhydrin c a nó. i u này ã ngăn c n s thu hút kim lo i xâm nh p vào trong h tiêu hóa (d dày và ru t) và ngăn c n s nhi m c [17]. Tuy nhiên, trong lĩnh v c mi n d ch h c thì ovalbumin là ch t gây d ng i v i ngư i và ng v t. Do ó, ây là thành ph n b t bu c ph i ki m tra i v i các s n ph m b nghi ng là có ch a ovalbumin như các dư c ph m: thu c, vacxin…, các s n ph m th c ph m có ngu n g c t : tr ng, s a… Ovabumin có th n nh trong th i gian 1 năm khi b o qu n nhi t t 2÷8OC [19].
  17. -9- 1.4.2. C u t o [17], [18], [19] Ovalbumin trong lòng tr ng tr ng ư c c u t o b i 385 amino acid. Nó là m t glycoprotein v i 4 v trí g n glucoza. Là m t protein ti t ra t t bào m c dù nó thi u 1 u nitơ (-N) trong trình t c a nó. C u trúc c a ovalbumin thu c v d ng c u trúc serpin c a protein, m c dù không gi ng ph n l n các serpin khác - ovalbumin không có kh năng c ch b t kì m t enzym th y phân protein nào. i u này ư c làm rõ khi so sánh c u trúc c a nó v i các serpin. 1.4.3. Tính sinh mi n d ch [2], [5], [8] Ovalbumin là m t ch t sinh mi n d ch m nh vì nó có các y u t c a m t ch t sinh mi n d ch. ó là: Tính l : Thông thư ng m t ch t ư c g i là kháng nguyên trư c h t ph i là m t ch t l i v i cơ th vì bình thư ng cơ th không áp ng b o v v i m t ch t c a b n thân. Ovalbumin là m t protein có trong lòng tr ng tr ng, do ó i v i các cơ th ng v t nó là m t protein l (ch t l ). Khi protein này ư c ưa vào cơ th ng v t (gây mi n d ch) nó s kích thích cơ th ng v t s n xu t ra kháng th . Tr ng lư ng phân t l n: Các kháng nguyên thông thư ng có tr ng lư ng phân t trên 6.000 dalton. V i tr ng lư ng phân t 45.000 dalton, ovalbumin i u ki n tr thành m t kháng nguyên m nh. C u trúc ph c t p: B t kì m t ch t sinh mi n d ch nào cũng ph i có c u trúc phân t tương i ph c t p. Các ch t có c u trúc càng ph c t p thì tính sinh mi n d ch càng cao, ovalbumin cũng th a mãn tính ch t này b i vì ovalbumin có b n ch t là protein. C u trúc c a nó ph c t p do nó ư c c u t o t các acid amin s p x p theo các t h p khác nhau.
  18. - 10 - Như v y, v i các c i m trên, ovalbumin là m t kháng nguyên m nh hay nó có tính sinh mi n d ch m nh. Do nó là thành ph n gây d ng i v i cơ th nên m b o an toàn i v i ngư i và ông v t, thì các s n ph m là thu c, vacxin có ngu n g c t tr ng, s a b t bu c ph i ki m tra thành ph n này. 1.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HI N OVALBUMIN VÀ KHUY N CÁO V CÁCH PHÁT TRI N VÀ TH M NH PHƯƠNG PHÁP [5], [8], [14], [15], [16] 1.5.1. Các phương pháp phát hi n ovalbumin [5], [8], [14] So v i các tiêu chu n các ch t và thành ph n khác thì ki m tra hàm lư ng ovalbumin tương i khó. V i hàm lư ng phát hi n th p ≤ 1 µg/1 li u ơn cho ngư i, òi h i ph i có m t phương pháp phát hi n phù h p. T b n ch t c a ovalbumin là m t kháng nguyên, không th th y b ng m t thư ng nên ch có th phát hi n ư c khi g n v i kháng th c hi u. Do s liên k t gi a kháng nguyên và kháng th luôn mang tính c hi u cao nên phát hi n s có m t và nh lư ng kháng nguyên hay kháng th cho chính xác cao. Có nhi u phương pháp khác nhau dùng xác nh m i tương tác gi a kháng nguyên và kháng th như: – Ph n ng k t t a (Precipitation test) – Ph n ng ngưng k t (Agglutination test) – Ph n ng k t h p b th – Mi n d ch i n di – K thu t huỳnh quang mi n d ch (Immunofluorescent technique) – Thí nghi m mi n d ch phóng x (Radioimmunoassay-RIA) – ELISA- K thu t ch t h p ph g n enzyme (Enzyme-Linked immunosorbent Assay). Các k thu t này u d a vào s tương tác gi a kháng nguyên và kháng th xác nh s có m t và nh lư ng kháng nguyên ho c kháng th trong m u nghiên c u. Trong ph m vi tài này, 4 phương pháp sau s ư c miêu t chi ti t hơn.
  19. - 11 - 1.5.1.1. Phương pháp Ouchterlony (khuy ch tán mi n d ch kép) [5] Nguyên lý: K thu t là s ngưng k t c hi u gi a kháng nguyên và kháng th x y ra khi chúng di chuy n trên gel agarose khi cho kháng nguyên và kháng th pha loãng thích h p ( n ng x y ra ph n ng ngưng k t). N u kháng th và kháng nguyên ngưng k t c hi u s cho cung k t t a màu tr ng và ngư c l i, s không có cung k t t a n u kháng nguyên và kháng th không ngưng k t c hi u. Ưu i m: ây là k thu t ơn gi n nh t, d th c hi n, ít t n kém do không ph i s d ng nhi u máy móc, hoá ch t. Như c i m: Th i gian hoàn thành m t th nghi m kéo dài t 3 n 4 ngày; s phát hi n kháng nguyên ho c kháng th ch mang tính nh tính, không nh lư ng chính xác ư c hàm lư ng; hàm lư ng kháng nguyên t i a có th phát hi n ư c r t l n (t 20÷30µg/ml) nên không th xác nh ư c nh ng m u có hàm lư ng kháng nguyên nh hơn. V i nh ng ưu và như c i m như trên, k thu t này ư c ng d ng phát hi n kháng th ho c kháng nguyên trong nghiên c u chu n oán b nh, trong nh ng trư ng h p xu t hi n kháng nguyên l . 1.5.1.2. Phương pháp i n di mi n d ch i lưu [5], [15] Nguyên lý: K thu t này tương t như k thu t khuy ch tán Ouchterlony nhưng thay cho khuy ch tán t nhiên ngư i ta ã dùng m t l c i n di hư ng d n cho kháng nguyên và kháng th g p nhau nhanh hơn trên gel agarose. Trong phương pháp này, kháng th IgG và IgM s di chuy n v phía c c âm, dư i tác d ng c a dòng i n kháng nguyên và kháng th g p nhau trên gel. Ưu i m: Th i gian cho k t qu nhanh ch sau 1 gi . Như c i m: Cũng gi ng phương pháp Ouchterlony, phương pháp này ch mang tính nh tính; t n chi phí nhi u hơn vì ph i s d ng thêm máy móc, hoá ch t.
  20. - 12 - 1.5.1.3. Phương pháp mi n d ch phóng x (Radioimmunoassay- RIA) [8] Nguyên lý: Phương pháp d a trên s c nh tranh gi a kháng nguyên ánh gi u ng v phóng x v i kháng nguyên không ánh d u ng v phóng x g n vào kháng th c hi u. lô i ch ng l y m t lư ng nh t nh kháng nguyên tinh khi t ánh d u phóng x . Kháng nguyên này cùng lo i v i m u th nghi m. Tr n kháng nguyên ánh d u trên v i lư ng kháng nguyên tương ương kháng th c hi u, r i . R a kháng nguyên ánh d u t do (không g n v i kháng th ). o phóng x c a ph c h kháng nguyên - kháng th (A). lô ki m nghi m, ngoài kháng nguyên ánh d u và kháng th như trên còn tr n thêm kháng nguyên c n th không ánh d u g n vào kháng th . R a kháng nguyên ánh d u t do. o phóng x c a ph c h kháng nguyên - kháng th (B). D a vào t l phóng x o ư c A/B xác nh n ng kháng nguyên trong m u th so v i ư ng cong chu n. Ưu i m: Phương pháp này cho k t qu nhanh và có chính xác cao. Như c i m: Phương pháp này r t t n kém, s d ng ch t phóng x nên không an toàn v i ngư i th c hi n. 1.5.1.4. Phương pháp ELISA – K thu t ch t h p ph mi n d ch g n enzyme (Enzyme – Linked immunosorbent Assay) [5], [7], [8] Enzyme – linked immunosorbent Assay (ELISA) là m t kĩ thu t sinh hoá ư c s d ng chính trong lĩnh v c mi n d ch h c tìm ra m t kháng nguyên ho c m t kháng th trong m u v i chính xác cao. ELISA ư c dùng như m t công c h u hi u chu n oán trong y h c và tìm các tác nhân gây b nh [5]. Vì ELISA có th xác nh ư c lư ng kháng nguyên và kháng th trong m u nên nó là m t công c h u ích xác nh n ng c a kháng th có trong huy t thanh [7]. Nó còn ư c dùng tìm kháng nguyên [8]. Trong công nghi p th c ph m, ELISA ư c ng d ng tìm các ch t gây d ng có trong m t s lo i th c ph m như: s a, l c, qu óc chó, qu h nh và tr ng.

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

Đồng bộ tài khoản