Nghiên cứu kiểu nhân ở người

Chia sẻ: Nguyen Phuonganh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:18

0
47
lượt xem
7
download

Nghiên cứu kiểu nhân ở người

Mô tả tài liệu
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Các chất như giêm sa, orcein là các chất nhuộm đồng hình, do vậy khó có thể phân biệt được các thể nhiễm sắc có kích thước và hình dạng giống nhau.

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu kiểu nhân ở người

  1. Nghiên cứu kiểu nhân ở người Các chất như giêm sa, orcein là các chất nhuộm đồng hình, do vậy khó có thể phân biệt được các thể nhiễm sắc có kích thước và hình dạng giống nhau. Tuy nhiên, có một số phương pháp nhuộm có thể tạo ra các thể nhiễm sắc bắt màu đậm, nhạt khác nhau, cho các băng nhuộm rất đặc trưng. Nhờ các băng nhuộm đó người ta có thể dễ dàng phân biệt các thể nhiễm sắc có hình dạng và kích thước giống nhau.
  2. Ở tế bào nhân chuẩn, thể nhiễm sắc có sự phân hóa cao về cấu trúc và chức năng. Sự phân hóa về tổ chức cũng như vật chất di truyền ở tế bào nhân chuẩn thể hiện qua sự phân hóa thể nhiễm sắc cả chiều ngang và lẫn chiều dọc. Bằng những phương pháp nhuộm đặc biệt gọi là nhuộm cắt băng (banding techniques) có thể thấy rõ vùng dị nhiễm sắc (heterochromatin) được phân bố riêng và đặc trưng cho từng thể nhiễm sắc ở mỗi loài. Nhiều nghiên cứu về sinh hóa tế bào cho thấy miền dị nhiễm sắc chỉ chứa một số lượng gen rất nhỏ, sợi nhiễm sắc trong vùng này luôn luôn ở trạng thái xoắn với hàm lượng ADN cao. Chức năng của chất dị nhiễm sắc, như các tác giả đã cho thấy, có ý nghĩa
  3. đối với qúa trình tiếp hợp và phân ly của các thể nhiễm thể tương đồng, đặc biệt là đối với qúa trình tiến hóa, thông qua tái cấu trúc của thể nhiễm sắc và điều hòa hoạt động của gen. Có thể phát hiện các vùng dị nhiễm sắc (heterochromatin region) trên thể nhiễm sắc bằng các phương pháp nhuộm băng. Rooney đã tổng kết trên 20 phương pháp nhuộm băng điển hình, đó là các băng Giêmsa (G - banding), băng Quinacrin (Q - banding), băng C (C - banding) và băng huỳnh quang (Hoechest - 33258: H - 33258 banding) và còn rất nhiều các phương pháp nhuộm băng khác. Kỹ thuật nhuộm băng giêmsa đã được ứng dụng rộng rãi nhất đối với các nghiên cứu thể nhiễm sắc đặc biệt ở côn trùng.
  4. Chi tiết của phương pháp nhuộm băng được trình bày dưới đây: a) Phương pháp nuôi cấy tủy xương Phương pháp nuôi cấy máu và tủy xương 24 giờ trong môi trường nhân tạo để tìm những thể nhiễm sắc bất thường. Nguyên lý của kỹ thuật này dựa trên sự phân bào tự nhiên của các tế bào non trong máu và tủy mà không cần sử dụng chất kích thích phân bào P.H.A (Phytohaemaglutinin). * Tiến hành nuôi cấy Nuôi cấy tủy xương trong 24 giờ (dựa theo kỹ thuật của B. Durtillaux và J. Coutuier, 1981; C. Harison, 1987).
  5. + Bước 1: Chuẩn bị dụng cụ Các dụng cụ như kim chọc tủy, bơm tiêm, lọ nuôi cấy v.v. đều phải được sấy vô trùng trước khi sử dụng, các thao tác phải được đảm bảo từ khâu lấy bệnh phẩm (lấy tủy hoặc lấy máu) cho đến khi kết thúc nuôi cấy. + Bước 2: Thao tác lấy bệnh phẩm Đặt bệnh nhân nằm sấp, chân duỗi thẳng, tay để phía trên đầu. Sát trùng vùng mào chậu định chọc tủy bằng cồn iot và cồn 70o. Gây tê điểm chọc tủy để thông lấy tủy. Bơm tiêm vô trùng được tráng 0,1ml heparin 5000UI/ml để chống đông máu. Hút lấy khoảng 0,5-1ml dịch tủy xương, lắc nhẹ cho tủy hòa đều với heparin để không bị đông.
  6. + Bước 3: Đếm bạch cầu Dùng một phần nhỏ dịch tủy đã lấy được và tiến hành đếm bạch cầu + Bước 4: Nuôi cấy dịch tủy Môi trường nuôi cấy cho mỗi lọ: Môi trường Parker 199: 6ml Huyết thanh AB: 2ml Tủy chống đông được sử dụng để nuôi cấy tùy thuộc vào số lượng bạch cầu với tỉ lệ thích hợp là 5.105 bạch cầu/1ml môi trường, tức là mỗi lọ cấy khoảng 40. 105 bạch cầu.
  7. Các lọ nuôi cấy được đậy bằng nút cao su đã vô trùng, lắc nhẹ tay cho đều sau đó để tủ ấm 37oC trong 24 giờ. b) Nuôi cấy máu ngoại vi Theo kỹ thuật của B. Dutrillaux và J. Couturier, 1981 + Bước 1: Chuẩn bị dụng cụ Giống như nuôi cấy tủy xương. + Bước 2: Thao tác lấy bệnh phẩm Bơm kim tiêm vô trùng, tráng 0,1 heparin 5000UI/ml. Lấy 1-2ml máu tĩnh mạch của người bệnh, lắc nhẹ cho máu hòa đều Heparin để không bị đông.
  8. + Bước 3: Đếm bạch cầu + Bước 4: Nuôi cấy Môi trường nuôi cấy của mỗi lọ cũng giống như nuôi cấy tủy xương 24 giờ. Lọ cấy cũng được để ở tủ ấm 37oC trong 24 giờ. * Thu hoạch dịch cấy làm tiêu bản Tiến trình thu hoạch dịch cấy tủy và máu giống nhau dựa theo các nhà nghiên cứu trên. + Bước 5: Ức chế phân bào bằng Colchicine Sau khi nuôi cấy ở 37oC trong 22 giờ 30
  9. phút, sử dụng Colchicine làm đứt thoi vô sắc, ức chế phân bào ở giai đoạn Metaphase, ở giai đoạn này, các nhà nghiên cứu thấy rằng thể nhiễm sắc có kích thước lớn và hình dạng rõ nhất. Cho vào mỗi lọ nuôi cấy 0,05ml Colchicine nồng độ 4mg/ml. Lắc nhẹ, giữ trong tủ ấm 37oC tiếp trong 1 giờ 30 phút. + Bước 6: Nhược trương tế bào Dung dịch nhược trương có nồng độ tương ứng như sau: Nước cất để ấm: 5ml Huyết thanh AB: 1ml KCl 0,07M: 3ml EDTA: 0.1ml Chuyển toàn bộ dịch cấy sang ống ly tâm
  10. nhọn đáy, đem ly tâm 1000 vòng/phút, hút bỏ phần trên, cho vào mỗi ống 7ml dung dịch nhược trương (đã được để ấm 37oC), trộn nhẹ bằng pipet Pasteur. Để ống trong tủ ấm 37oC cho tế bào thẩm thấu dung dịch nhược trương trong 12 phút. Sau đó cho thêm vào mỗi ống 0,1ml dung dịch Carnoy II trộn nhẹ, lại ly tâm 1000 vòng/phút. Hút bỏ phần trên. + Bước 7: Cố định thể nhiễm sắc Để giữ hình dạng thể nhiễm sắc ở metaphase cần định hình bằng hai dung dịch Carnoy có thành phần như sau: Dung dịch Carnoy I: + Cồn 96o: 3 thể tích
  11. + Axit axetic: 1 thể tích Dung dịch Carnoy II: + Cồn 96o: 6 thể tích +Clorofooc: 3 thể tích + Axit axetic: 1 thể tích Bước định hình đầu tiên là: Cho 6ml dung dịch Carnoy I vào mỗi ly tâm nhọn đáy, trộn nhẹ, để 5 phút ở nhiệt độ phòng, ly tâm trong 1000vòng/phút trong 5 phút, hút bỏ phần ở trên Bước định hình tiếp theo bằng dung dịch Carnoy II, cho vào mỗi ống ly tâm nhọn đáy 6ml, trộn nhẹ, để 5 phút ở nhiệt độ phòng, ly tâm 1000vòng /phút trong 5
  12. phút, hút bỏ phần trên, lấy dịch ở đáy ống ly tâm làm tiêu bản. + Bước 8: Làm tiêu bản. Sử dụng lam kính sạch, đã để vào ngăn đá của tủ lạnh cho phủ một lớp băng trên mặt lam. Nhỏ một giọt dịch tế bào ở mỗi ống ly tâm lên lam kính sao cho hỗn dịch lan theo mặt băng và tan đều trên mặt lam. Khi đó các thể nhiễm sắc hiện diện trên lam kính thành từng cụm. c) Các kỹ thuật nhuộm tiêu bản thể nhiễm sắc 1) Nhuộm Giêm sa nguyên chất Dung dịch Giêm sa:
  13. Bột Giêm sa nguyên chất: 1g Methanol: 66ml Glyxerin: 66ml Pha loãng dung dịch trên 4%, nhuộm tiêu bản trong 20 phút. Rửa tiêu bản bằng nước thường hoặc nước cất, để khô và đưa lên soi trên kính hiển vi. Bằng phương pháp nhuộm này, các thể nhiễm sắc bắt màu như nhau nên khó quan sát được những tổn thương cấu trúc của thể nhiễm sắc. Để khắc phục nhược điểm trên có thể áp dụng một số kỹ thuật nhuộm băng thể nhiễm sắc. Nguyên lý của các kỹ thuật này dựa trên tính chất đặc trưng về sự phân bố đoạn ADN giàu A - T hoặc G - C kéo theo sự phân bố các loại gen mã hóa cho các protein đặc trưng trên thể
  14. nhiễm sắc đó. Dưới tác dụng của nhiệt độ cao, trong môi trường muối các cặp thể nhiễm sắc do tính chất trên sẽ bị phân hủy ở những vị trí đặc hiệu, và sau khi nhuộm giêm sa thông thường sẽ tạo nên những băng ngang đậm, nhạt xen kẽ nhau có tính chất đặc trưng riêng cho từng thể nhiễm sắc. Do vậy, có thể nhận định chính xác từng cặp thể nhiễm sắc và từng phần của nó giúp chúng ta phát hiện ra những khác biệt hoặc rối loạn cấu trúc của thể nhiễm sắc. 2) Nhuộm băng R ( Reverse-banding technique) Theo kỹ thuật của B. Dutrillaux và Lurwune (1971), Sehested (1974), và Vowjma và Lubs (1975).
  15. Phương pháp nhuộm này để nhận dạng thể nhiễm sắc Philadelphia trong bệnh Leukemia mãn tính và phát hiện tổn thương cấu trúc của thể nhiễm sắc ở các nhóm Leukemia khác Phương pháp tiến hành như sau: Tiêu bản trước khi nhuộm được sấy khô trong tủ ấm ở 37oC trong 3 ngày cho các thể nhiễm sắc bám chặt trên mặt lam. Xử lý tiêu bản trong dung dịch đệm Earle pH = 6,5 ở 87oC trong bể men 100ml khoảng 15 - 45 phút. Rửa nước, để khô, nhuộm Giêm sa 2% trong dung dịch đệm.
  16. Quan sát thể nhiễm sắc với các băng sáng và tối xen kẽ nhau dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1.000 lần. 3) Kỹ thuật nhuộm băng Giemsa (G- banding technique): Theo kỹ thuật của Sun, N.C; Chu, E.H.Y và Chang, C.C (1973) + Bước 1: Chuẩn bị các dung dịch Dung dịch Giêm sa chuẩn (đậm đặc). Bột Giêm sa nguyên chất: 1g Methanol: 66ml Glyxerin: 66ml Sau khi pha dung dịch được để hai ngày ở nhiệt độ phòng trong lọ màu tối và để trong tủ lạnh trước khi dùng ít nhất hai tuần.
  17. Dung dịch nhuộm băng ( chỉ sử dụng trong 1 ngày) Dung dịch đệm pH 6,8: 26ml Methanol: 7ml Trypsin1/250 ( DIFCO5g/l)+ EDTA: 2g/l Giêm sa chuẩn: 0.8ml + Bước 2: Trình tự nhuộm Ủ tiêu bản trong dung dịch đệm phosphat pH 6,8 ở 560C trong 8 phút. Nhuộm tiêu bản ngập trong dung dịch nhuộm 8 phút ở nhiệt độ phòng. Rửa tiêu bản trong nước cất, để khô. Soi kính không cần đậy lamen d) Kỹ thuật nhuộm băng Q Kỹ thuật được tiến hành với một chất
  18. nhuộm đặc biệt là Qinacrin với quy trình thực hiện phức tạp, kết quả chất nhuộm được gắn vào vùng giàu A - T của ADN và ta có thể quan sát được dưới kính hiển vi huỳnh quang. Màu hồng của các băng rất đặc trưng cho từng cặp thể nhiễm sắc. Đây là những đặc điểm có ích đối với phân tích di truyền và thông tin về các phần chứa gen đặc thù. Sắp xếp công thức thể nhiễm sắc Đọc tiêu bản dưới kính hiển vi với độ phóng đại 1.000 lần, quan sát những bất thường nếu có và xếp bộ thể nhiễm sắc theo công thức quy định về danh pháp thể nhiễm sắc đã được thông qua hội nghị Di truyền tế bào học năm 1960 ở Denver - Mỹ.

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

Đồng bộ tài khoản