Quyết định số 16/2001/QĐ-BNN-KHCN về phương pháp kiểm tra phân vi sinh vật kị khí cố định nitơ và phân giải xenlulo (445 - 2001) do Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ban hành

Chia sẻ: Son Nguyen | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:10

0
52
lượt xem
18
download

Quyết định số 16/2001/QĐ-BNN-KHCN về phương pháp kiểm tra phân vi sinh vật kị khí cố định nitơ và phân giải xenlulo (445 - 2001) do Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ban hành

Mô tả tài liệu
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Tham khảo tài liệu 'quyết định số 16/2001/qđ-bnn-khcn về phương pháp kiểm tra phân vi sinh vật kị khí cố định nitơ và phân giải xenlulo (445 - 2001) do bộ trưởng bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn ban hành', văn bản luật, bộ máy hành chính phục vụ nhu cầu học tập, nghiên cứu và làm việc hiệu quả

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Quyết định số 16/2001/QĐ-BNN-KHCN về phương pháp kiểm tra phân vi sinh vật kị khí cố định nitơ và phân giải xenlulo (445 - 2001) do Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ban hành

  1. B NÔNG NGHI P VÀ C NG HOÀ XÃ H I CH NGHĨA VI T NAM PHÁT TRI N NÔNG c l p - T do - H nh phúc THÔN ******** ****** S : 16/2001/Q -BNN-KHCN Hà N i, ngày 23 tháng 02 năm 2001 QUY T Đ NH BAN HÀNH TIÊU CHU N NGÀNH V : PHƯƠNG PHÁP KI M TRA PHÂN VI SINH V T K KHÍ C Đ NH NITƠ VÀ PHÂN GI I XENLULO (445-2001) B TRƯ NG B NÔNG NGHI P VÀ PHÁT TRI N NÔNG THÔN Căn c Ngh nh s 73/CP ngày 01 tháng 11 năm 1995 c a Chính ph quy nh ch c năng, nhi m v , quy n h n và t ch c b máy c a B Nông nghi p và Phát tri n Nông thôn. Căn c Ngh nh 86/CP ngày 08 tháng 12 năm 1995 c a Chính ph quy nh phân công trách nhi m qu n lý Nhà nư c v ch t lư ng hàng hoá Xét ngh c a ông V trư ng V Khoa h c Công ngh và Ch t lư ng s n ph m QUY T Đ NH: i u 1: Nay ban hành tiêu chuNn ngành sau: 10TCN : 445-2001 Phương pháp ki m tra phân vi sinh v t k khí c nh nitơ và phân gi i xenlulo g m 3 m c 14 di m. i u 2: Quy t nh có hi u l c sau 15 ngày k t ngày ký i u 3: Các ông Chánh Văn phòng, V trư ng V Khoa h c Công ngh và Ch t lư ng s n phNm, các t ch c, cá nhân có liên quan ch u trách nhi m thi hành quy t nh này. KT. B TRƯ NG B NÔNG NGHI P VÀ PHÁT TRI N NÔNG THÔN TH TRƯ NG Ngô Th Dân TIÊU CHU N NGÀNH 10TCN: 445-2001
  2. PHƯƠNG PHÁP KI M TRA PHÂN VI SINH V T KN KHÍ C NNH NITƠ VÀ PHÂN GI I XENLULO L I NÓI U Tài li u làm căn c chính khi biên so n tiêu chu n: 1. Enzym vi sinh v t. 1982. Lê Ng c Tú, La Văn Tr , Ph m Chân Châu. 2. M t s phương pháp nghiên c u vi sinh v t h c t p II. 1976. Nguy n Lân Dũng, Nguy n Văn c, ng H ng Miên, Nguy n Vĩnh Phư ng, Nguy n ình Quy n, Nguy n Phùng Ti n, Ph m Văn Ty 3. Thí nghi m vi sinh v t công nghi p. 1992. Tr nh Th Ng t, Nguy n Th Sơn 4. Symposium on emzymetic hydrolysis of cellulose. 1975. Sictra - Filand. 5. Manual of clinical microbiology. 1970. J.E.Blair, E.H.Lennette, J.P.Truant. 6. Manual of industrial microbiology and biotechnology. 1986. A.L.Demain and N.S.Solomon. American Society for microbiology. Washington, D.C. 7. Manual of microbiological methods. 1957. M.J.Pelczar, R.C.Bard, G.W.Burnett, H.J.Conn, R.D.Demmoss, E.E.Evans, M.W.Jennison, A.P.Mckee, A.J.Riker, J.Warren, O.B,Weeks, F.A.Weiss. T ch c ch u trách nhi m biên so n tiêu chu n: VI N KHOA H C K THU T NÔNG NGHI P VI T NAM Cơ quan ngh ban hành tiêu chu n : V KHOA H C CÔNG NGH - CH T LƯ NG S N PH M Cơ quan ban hành tiêu chu n: B NÔNG NGHI P VÀ PHÁT TRI N NÔNG THÔN Nhóm B: TIÊU CHU N NGÀNH 10TCN: 445-2001 PHƯƠNG PHÁP KI M TRA PHÂN VI SINH V T K KHÍ C Đ NH NITƠ VÀ PHÂN GI I XENLULO. Anaerobic nitrogen fixing and cellulotic degradating biofertylizer. Method for quality control 1/ Ph m vi áp d ng:
  3. Tiêu chuNn này áp d ng cho vi c ki m tra m t các vi sinh v t có kh năng c nh nitơ ho c phân gi i xenlulo k khí trong phân bón vi sinh v t. 2/ Thu t ng , nh nghĩa: 2.1. Phân vi sinh v t (g i t t là phân vi sinh) là s n phNm ch a m t hay nhi u ch ng vi sinh v t s ng h u ích ã ư c tuy n ch n có m t t theo tiêu chuNn hi n hành thông qua các ho t ng s ng c a chúng trong t t o nên ch t dinh dư ng mà cây tr ng có th s d ng ư c (N, P, K) hay các ho t ch t sinh h c, góp ph n nâng cao năng su t và ch t lư ng nông s n. Phân vi sinh v t không gây nh hư ng x u n ch t lư ng nông s n, ngư i, ng v t, th c v t và môi trư ng sinh thái. 2.2. Phân vi sinh v t k khí c nh nitơ là s n phNm ch a m t hay nhi u ch ng vi sinh v t s ng, ã ư c tuy n ch n v i m t t theo tiêu chuNn hi n hành, có kh năng c nh nitơ trong i u ki n k khí, t o i u ki n nâng cao năng su t ho c ch t lư ng s n phNm. Các ch ng vi sinh v t này không nh hư ng x u n ngư i, ng v t, th c v t, môi trư ng sinh thái và ch t lư ng nông s n. 2.3. Phân vi sinh v t k khí phân gi i xenlulo là s n phNm ch a m t hay nhi u ch ng vi sinh v t s ng, ã ư c tuy n ch n v i m t t theo tiêu chuNn hi n hành, có kh năng phân gi i xenlulo trong i u ki n k khí, t o i u ki n nâng cao năng su t ho c ch t lư ng s n phNm. Các ch ng vi sinh v t này không nh hư ng x u n ngư i, ng v t, th c v t, môi trư ng sinh thái và ch t lư ng nông s n. 2.4. Vi sinh v t ã ư c tuy n ch n là vi sinh v t ã ư c nghiên c u, ánh giá ho t tính sinh h c và hi u qu i v i t, cây tr ng dùng s n xu t phân vi sinh v t. 2.5. Vi sinh v t t p là vi sinh v t có s n trong phân vi sinh v t nhưng không thu c lo i vi sinh v t ã ư c tuy n ch n. 3/ N i dung, phương pháp: 3.1. Trang thi t b : - T s y (thi t b ti t trùng khô) và n i h p áp l c (thi t b ti t trùng ư t) -T m - T c y vô trùng - Cân k thu t có chính xác t i 0,01g - Que c y - Que g t th y tinh - ng nghi m th y tinh - ng ong
  4. - Bình tam giác - ĩa petri (h p l ng) - Pipet chia , pipetman - èn c n ho c èn gas - D ng c l y m u ph i là lo i thép không g ho c b ng thu tinh. - D ng c nuôi c y k khí: có th s d ng m t trong các d ng c sau: + T nuôi k khí + Bình chân không + Bình nuôi k khí: Gas Pak 3.2. Ti n hành: 3.2.1. Chu n b d ng c : Các d ng c l y m u và d ng c dùng trong xác nh vi sinh v t ph i ti t trùng b ng m t trong các phương pháp dư i ây: - Trong t s y nhi t 160 - 1750C không ít hơn 2 gi . - Trong n i h p áp l c 1 at (1210C) không ít hơn 20 phút. 3.2.2. Chu n b môi trư ng: 3.2.2.1. Môi trư ng dùng ki m tra phân vi sinh v t k khí c nh nitơ, phân gi i xenlulo ph thu c vào ch ng lo i vi sinh v t mà nhà s n xu t s d ng. N u không có yêu c u c a nhà s n xu t, khi ki m tra s d ng môi trư ng ( ph l c kèm theo). Môi trư ng ư c pha ch theo th t các hoá ch t trong thành ph n ã cho. Sau ó phân ph i vào các d ng c thu tinh ã chuNn b trư c r i kh trùng nh ng i u ki n phù h p. ngu i môi trư ng n 45-500C r i phân ph i vào các ĩa petri vô trùng. Thao tác này ư c th c hi n trong i u ki n vô trùng. Ki m tra s ch c a môi trư ng sau 2 ngày nhi t t 28 n 300C. Ch s d ng các ĩa petri ch a các môi trư ng nuôi c y vi sinh v t không phát hi n th y t p nhi m. 3.2.2.2. D ch pha loãng là nư c mu i sinh lý (NaCl 0,85%), không ch a các h p ch t nitơ, sau khi kh trùng có pH là 7,0. Phân ph i d ch pha loãng vào các ng nghi m, bình tam giác có dung tích thích h p v i m t lư ng sao cho sau khi kh trùng, m i ng nghi m ch a 9ml, m i bình tam giác ch a 90ml. Làm nút bông và kh trùng 1 at (1210C) trong 30 phút.
  5. N u chưa s d ng ngay, d ch pha loãng c n ư c b o qu n trong t l nh nhi t 4- 100C, th i gian b o qu n không quá 1 tháng k t ngày chuNn b . Ghi chú: tránh làm nh hư ng n các vi sinh v t do thay i nhi t t ng t, nên i u ch nh nhi t c a d ch pha loãng n nhi t phòng th nghi m trư c khi s d ng. 3.2.3. L y m u: 3.2.3.1. Qui nh chung: Vi c l y m u ư c ti n hành sao cho m u ki m tra ph i là m u i di n cho c lô hàng. Ngư i l y m u ph i ư c hu n luy n và có kinh nghi m trong vi c l y m u. Trong quá trình l y m u, v n chuy n và x lý m u, ph i m b o tránh s lây nhi m t bên ngoài và ph i m b o là m u ph i ư c gi nguyên tr ng như ban u cho t i khi em phân tích trong phòng thí nghi m. Không ư c b sung thêm b t c m t tác nhân b o qu n, di t khuNn ho c di t n m nào vào m u ki m tra. M u ư c l y ph i t các bao nguyên gói. Ph i ti n hành l y m u nh ng nơi không có hơi nư c nóng, hoá ch t c h i, không có ánh n ng gay g t ho c b i và ư c ưa ngay vào d ng c ch a m u. Các d ng c l y m u và ch a m u ph i vô trùng. 3.2.3.2. S lư ng m u: Lô hàng bao g m các bao (túi) ư c s n xu t cùng m t t v i cùng m t ngu n nguyên li u. S lư ng bao (túi) c n l y ki m tra i v i m i lô hàng ph thu c vào l nc a lô hàng ó và phù h p v i qui nh trong b ng 1 B ng 1: S lư ng bao (túi) c n l y ki m tra C lô hàng (bao, túi) S lư ng m u c n l y (bao, túi) n 100 7 T 101 n 1000 11 T 1001 n 10000 15 L n hơn 10000 19 Các bao (túi) m u ư c l a ch n ng u nhiên theo TCVN 1964-75
  6. Ti n hành l y m u trung bình t m u chung là t p h p các m u ban u trong lô hàng ki m tra. Chia m u trung bình làm 2 ph n b ng nhau r i bao gói phù h p v i yêu c u c a s n phNm. M t ph n dùng ki m tra và m t ph n lưu và b o qu n trong i u ki n qui nh mà m i lo i s n phNm yêu c u dùng khi phân tích tr ng tài. Trên m i gói m u ph i có nhãn ghi rõ: Tên m u và i tư ng cây tr ng ư c s d ng Tên cơ s s n xu t Th i gian s n xu t Th i gian và a i ml ym u Tên ngư i l y m u, cơ quan l y m u. 3.2.4. Ki m tra: 3.2.4.1. M t vi sinh v t k khí c nh nitơ: 3.2.4.1.1. Pha loãng m u: a/ i v i m u d ng l ng: Dùng pipet vô trùng l y 10ml m u cho vào 90ml d ch pha loãng ã chuNn b s n (xem 3.2.2.2), tránh ch m pipet vào d ch pha loãng. Tr n k b ng cách dùng m t pipet vô trùng khác hút lên xu ng 10 l n ho c b ng d ng c tr n cơ h c trong 5-10 giây. Dung d ch t o ra ư c g i là dung d ch huy n phù ban u. b/ i v i m u d ng b t: Cân 10g m u có chính xác t i 0,01g và cho vào 90ml d ch pha loãng ã chuNn b s n (xem 3.2.2.2). Tr n k b ng d ng c tr n cơ h c t 5 n 10 phút sao cho có ư c m t dung d ch có phân b ng u, l ng các ph n t n ng trong kho ng 15 phút, g n ư c dung d ch huy n phù ban u. c/ Dùng pipet ã vô trùng hút 1ml d ch huy n phù ban u (a ho c b) cho vào 9 ml d ch pha loãng, tránh ch m pipet vào d ch pha loãng. Tr n k b ng cách dùng m t pipet vô trùng khác hút lên xu ng 10 l n ho c b ng d ng c tr n cơ h c trong 5-10 giây, có d ch pha loãng m u có n ng là 10-2. L p l i các thao tác này thu ư c d ch pha loãng i phân vi sinh v t trên n n ch t mang kh trùng là 10-5, 10-6, 10 -7 và i v i phân vi sinh v t trên n n ch t mang không kh trùng là 10-3, 10-4 và 10-5. 3.2.4.1. 2. C y m u: Dùng pipet vô trùng l y t d ch m u pha loãng 10-5, 10-6, 10-7 i v i phân vi sinh v t trên n n ch t mang kh trùng và 10-3, 10-4, 10-5 i phân vi sinh v t trên n n ch t mang không kh trùng m t lư ng d ch là 0,05 ml (1 gi t) c y vào 1 ĩa petri ch a môi trư ng ã chuNn b s n (xem 3.2.2.1). M i m u pha loãng ư c c y l p l i trên 3 ĩa petri.
  7. Dùng que g t vô trùng g t u d ch m u trên b m t th ch, i khô và úp ngư c h p petri sau ó ưa vào nuôi i u ki n k khí (*) trong th i gian và nhi t thích h p v i t ng lo i vi sinh v t. m s lư ng khuNn l c c trưng c a m u gi ng vi sinh v t trên m i ĩa petri. M t vi sinh v t trên m t ơn v ki m tra (ml) ư c tính theo công th c sau: a x 20 A = ----------- d Trong ó: A: M t vi sinh v t c nh nitơ trên ơn v ki m tra (g ho c ml) a: s khuNn l c trung bình có trong ĩa petri d: n ng d ch pha loãng Ghi chú: S lư ng khu n l c trung bình ư c tính là trung bình c ng s khu n l c c a các ĩa petri ư c câý t cùng m t pha loãng, trong ó ch tính các ĩa petri ch a t 5-50 khu n l c. S lư ng khu n l c trung bình cũng có th ư c tính là trung bình. C ng s lư ng khu n l c c a các ĩa petri ư c c y t hai pha loãng k ti p nhau b ng cách tính s khu n l c trung bình c ng m i pha loãng, trong ó s khu n l c pha loãng cao hơn ư c nhân v i 10, sau ó l y trung bình c ng c a hai giá tr trên n u t s gi a giá tr l n và giá tr nh không l n hơn 2. N u t s này l n hơn 2 thì l y giá tr nh làm k t qu . M t vi sinh v t trên m t ơn v ki m tra ư c bi u th b ng m t s gi a 1,00 và 9,99 nhân v i 10n, n là s mũ thích h p. (*): Có th s d ng m t trong các phương pháp t o i u ki n k khí sau: - Lo i b oxi b ng phương pháp v t lí: + T nuôi k khí ho c + Bình hút Nm có vòi hút chân không, hàn kín b ng vadơlin, không khí trong bình ư c hút ra và thay b ng h n h p khí CO2, N2, H2 (bình chân không). lo i b oxi m t cách tri t , trư c ó nên t vào trong bình các c c ng ch t h p th oxi như dithionit, clorua ng, iot... Có th làm gi m tác d ng c a oxi b ng cách thêm vào môi trư ng dinh dư ng các ch t kh oxi như axit thioglycolic (0,3 ml/l) và systein (0,75 g/l). - Lo i b oxi trong không khí b ng phương pháp hoá h c: + Bình nuôi k khí Gas Pak.
  8. + S d ng dung d ch xanh metylen-NaOH-glucoza: Tr n u 3 dung d ch v i 1 lư ng b ng nhau (6ml NaOH 10N trong 100ml nư c c t; 3,0ml xanh metylen 5% trong 100ml nư c c t và 6g glucoza trong 100ml nư c c t có b sung m t chút thymol k t tinh) r i cho vào ng nghi m và un cách thu n m t màu. t ng ch th này vào thi t b nuôi c y kín. ng ch th s t o ra tình tr ng y m khí trong thi t b ( ôxy ư c kh hoàn toàn khi màu xanh c a dung d ch ch th b bi n m t và không tái hi n tr l i). - Nuôi c y trong môi trư ng làm ng p kép: D ch pha loãng m u ư c tr n v i môi trư ng th ch dinh dư ng phù h p v i t ng lo i vi sinh v t sau khi kh trùng ã ngu i n 40 - 450C và vào ĩa petri. Sau khi th ch ông thêm m t l p th ch - nư c vô trùng (ngu i n 40 - 450C). các ĩa th ch nhi t thích h p. 3.2.4.2. Ki m tra m t vi sinh v t k khí phân gi i xenlulo: 3.2.4.2.1. Pha loãng m u: Xem 3.2.4.1.1 3.2.4.2.2. C y m u: Xem 3.2.4.1.2 - Phát hi n vòng phân gi i: Sau khi khuNn l c vi sinh v t ã phát tri n trên ĩa petri ch a môi trư ng ki m tra, ĩa petri vào t l nh trong 12 gi . Sau ó cho vào t m 0 40 C trong 6 gi . L y ra, cho vào m i ĩa petri 5ml thu c th lugon, tráng u kh p m t th ch, trong 15 phút r i g n b h t thu c th lugon i. m s khuNn l c trong ĩa petri t o vòng phân gi i (vòng trong su t) bao quanh khuNn l c. - Tính toán k t qu : xem 3.2.4.1.2 PH L C: I/ MÔI TRƯ NG KI M TRA VI SINH V T C NNH NITƠ KN KHÍ: 1. Môi trư ng 1: Nư c c t 1000ml Glucoza 20,0g K2HPO4 1,0g MgSO4.7H2O 0,5g NaCl v t FeSO4.7H2O v t MnSO4.5H2O v t
  9. CaCO3 40,0g axit ascobic 1,0g E.D.T.A. (Trilon B) 1,0g Th ch b t 15,0g 2. Môi trư ng2: Nư c chi t khoai tây(*) 1000ml Glucoza 20,0g K2HPO4 0,2g MgSO4.7H2O 0,2g Axit ascobic 1,0g CaCO3 3,0g Th ch b t 15,0g (*) Nư c chi t khoai tây: Khoai tây: 200,0g Nư c c t: 500ml Khoai tây g t v , c t nh , un sôi trong 15 phút, l c trong, b sung 1000ml II/ MÔI TRƯ NG KI M TRA VI SINH V T PHÂN GI I XENLULO KN KHÍ: 1. Môi trư ng 3: Nư c máy 1000ml NaNH4HPO4 1,5g KH2PO4 0,5g NaCl 0,1g K2HPO4 0,5g MgSO4.7H2O 0,4g
  10. Pepton 5,0g CaCO3 2,0g Dung d ch MnSO4.5H2O 1% 1 gi t Dung d ch FeSO4.7H2O 1% 1 gi t CMC 20,0g Th ch b t 15,0g pH: 7,0-7,4 Môi trư ng 4: Nư c máy 500ml Nư c th t-pepton 500ml CaCO3 2,0g CMC 15,0g Th ch b t 15,0g pH: 7,0-7,4 3/ Môi trư ng 5: Nư c máy 900ml Nư c chi t n m men 100ml Glucoza 0,5g Pepton 5,0g CMC 3,0g Th ch b t 15,0g pH: 7,4
Đồng bộ tài khoản