Tối ưu hóa điều kiện thủy phân giới hạn pectin vỏ chanh leo tạo pectic oligosaccharide (POS)

TAP CHI SINH HOC 2015, 37(1se): TCSH14­106<br />  DOI:     10.15625/0866­7160/v37n1se.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN THỦY PHÂN GIỚI HẠN <br /> PECTIN VỎ CHANH LEO TẠO PECTIC OLIGOSACCHARIDE (POS)<br /> <br /> Vũ Kim Dung1, 2*, Nguyễn Thị Xuân Sâm2, Nguyễn Thị Thu Hương2, Đặng Thị Thu2<br /> 1<br /> Trường Đại học Lâm nghiệp, *dungvucnsh@gmail.com<br /> 2<br /> Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội<br /> <br /> TÓM TẮT:  Bài báo khảo sát quá trình thủy phân giới hạn pectin vỏ  chanh leo trong khoảng  <br /> nồng độ 1­5% (w/v) bởi lượng Pectinex Ultra SP­L từ 30­50 U/g pectin  ở kho ảng pH 3­5, nhiệt  <br /> độ  40­60oC, tốc độ  khuấy 200­350 vòng/phút với thời gian thủy phân 1­7 giờ  và đã tìm được <br /> phương án thủy phân phù hợp cho 18,76 mg POS/ml dịch phản ứng. Tối ưu điều kiện thủy phân  <br /> theo quy hoạch thực nghiệm bậc 2 Box­Benken đã nâng cao được nồng độ POS lên 24,55 mg/ml  <br /> (53oC, 44 U/g, 270 vòng/phút, pH 4 sau 4 giờ thủy phân). Phổ sản phẩm POS thu được chứa chủ <br /> yếu di­galacturonic và tri­galacturonic. <br /> Từ khóa: pectic oligosaccharide, pectin vỏ chanh leo, pectinase, prebiotic, thủy phân giới hạn. <br /> <br /> MỞ ĐẦU Để nâng cao hiệu suất quá trình thủy phân,  <br /> nhiều   nghiên   cứu   đã   được   thực   hiện   theo  <br /> Pectin có nguồn gốc từ  thực vật, có nhiều <br /> hướng thủy phân liên tục, sử  dụng kỹ  thuật  <br /> trong vỏ  táo, cam, chanh, quýt, mận... Vo qua<br /> ̉ ̉ <br /> thủy   phân  màng  hoặc   nâng  cao   nồng  độ   cơ <br /> chanh leo chiếm khoảng 60% khối lượng quả <br /> chất   pectin  <br /> và chứa 2­3% pectin, là một nguồn phụ  phẩm <br /> [1, 5].<br /> đáng kể để thu nhận pectin.<br /> Mục   đích  của   nghiên  cứu  này  nhằm   lựa <br /> Pectic   oligosaccharide   (POS)   là   một  chọn và tối  ưu hóa điều kiện thủy phân giới <br /> prebiotic thế hệ mới được thu nhận bằng cách  hạn pectin chanh leo bằng Pectinex Ultra SP­L  <br /> thủy phân giới hạn pectin [2, 6­9]. POS được   để thu nhận POS.<br /> cấu   tạo   từ   2­10   gốc   D­galacturonic   nối   với <br /> nhau   bằng   liên   kết   α   (1­4)   glucoside   và   đã  VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> được   chứng   minh   là   loại   prebiotic   có   nhiều <br /> hoạt   tính   sinh   học  có   lợi   cho  sức   khỏe   của   Vật liệu gồm polygalacturonic acid; mono,  <br /> người và vật nuôi [3, 4, 8].  di­galacturonic,   tri­galacturonic   acid   (G1,   G2, <br /> G3 tương  ứng);  DNS,  ban m ̉ ỏng silica TLC,  <br /> Hàm lượng POS thu nhận từ dịch thủy phân  butanol, acetic acid (Merck); pectinex utra­SPL <br /> giới hạn khác nhau tùy thuộc vào nguyên liệu  có   hoạt   độ   endo   polygalacturonase   6835,4 <br /> pectin, thời gian và điều kiện phản  ứng.   Trên  U/ml   (Novozymes);   pectin   (từ   vỏ   chanh   leo  <br /> 100 kg cơ chất pectin củ cải đường, Martinez et  vàng (Passiflora edulis flavicarpa) chiết bằng <br /> al. (2009)    sử  dụng hỗn hợp  polygalacturonase  acid  citric,   DE   38%,   hàm   lượng   pectin  95%,  <br /> 10 U/g pectin, cellulase 0,725 U/g trong 12,8 giờ  Đại học Bách Khoa Hà Nội).<br /> thu được 26,7 kg oligosaccharide. Từ pectin oliu <br /> kết   hợp  pectinesterase,  polygalacturonase   và  Xác định hoat đô endo polygalacturonase:<br /> ̣ ̣  <br /> pectin lyase thủy phân  ở  40oC trong 72 giờ  thu  theo Combo et al. (2012) [2]. Phản  ứng được <br /> được POS  dưới  3.000  Da [7]. Sabajanes et al.  thực hiện với 1 ml dung dịch pectin 3% (w/v)  <br /> (2012) [9] thủy phân pectin từ vỏ cam sau 20 giờ  và 250 µl dung dịch enzyme  ở  50oC. Sự  giảm <br /> ở 37oC, pH 5 thu được 13 kg POS/100 kg nguyên   độ  nhớt của dung dịch thủy phân pectin được <br /> liệu. xác   định   với   nhớt   kế   Elcometer   (Model  <br /> 2300RV, Hoa Kỳ), tốc độ quay 200 vòng/phút, <br /> trục  L2  trong  thời   gian  30 phút.   Môṭ  đơn  vị  khảo   sát   là   nhiệt   độ  (45­55oC),   tỷ   lệ <br /> hoạt   độ   endo   polygalacturonase   là   lượng  enzyme/cơ   chất   (30­50   U/g),   tốc   độ   khuấy <br /> enzyme cần thiết làm giảm 50% độ  nhớt của   (200­300 vòng/phút).<br /> dung dịch trong 30 phút ở 50oC và pH 4,5. <br /> Xác   định   hàm   lượng   pectic   KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> oligosaccharide:   giá   trị   POS   được   xác   định  Lựa   chọn   nồng   độ   cơ   chất   và   tỷ   lệ <br /> bằng hiệu số  của lượng đường khử  tổng của <br /> enzyme/cơ chất thích hợp<br /> dịch thủy phân 2 trừ đi lượng đường khử tổng <br /> của dịch thủy phân 1 và nhân với hệ số 0,9. Trong   khoảng   khảo   sát,   với   cùng   một <br /> Pectin + enzyme   Dịch thủy phân 1 (chứa POS) lượng enzyme sử dụng, nhận thấy  ở các nồng <br /> độ  cơ  chất thấp (1 và 2%) phản  ứng diễn ra  <br /> Dịch thủy phân 1 + HCl   Dịch thủy phân 2 nhanh chóng, sản phẩm đạt cực đại chỉ sau 2­<br /> Khảo sát các yếu tố   ảnh hưởng tới quá trình   3 giờ. Khi tăng nồng độ  cơ  chất lên độ  nhớt <br /> thủy phân giới hạn pectin  của dịch phản ứng tăng nhanh và vận tốc phản <br /> Ảnh   hưởng   của   các   yếu   tố   tới   quá   trình  ứng cũng giảm xuống rõ rệt nhất là ở nồng độ <br /> thủy   phân   được   khảo   sát   trong   100   ml   dịch   4­5%.  Với   nồng   độ   pectin   3%   (w/v)   tốc   độ <br /> phản   ứng   với   khoảng   nồng   độ   pectin   1­5%  phản   ứng   được   duy   trì   và   ổn   định   trong  <br /> (w/v), tỷ lệ enzyme/cơ chất 30­50 U/g, pH 3­5,   khoảng 3 giờ, hàm lượng oligosaccharide ngày <br /> nhiệt   độ   40­60oC,   tốc   độ   khuấy   200­350  càng   tăng   lên   (hình   1a).   Phổ   sản   phẩm   trên <br /> vòng/phút, thời gian 1­7 giờ. Dich sau th<br /> ̣ ủy phân  hình 1b cho thấy  ở  nồng độ  4­5% còn nhiều  <br /> được   phân   tích   hàm   lượng   POS   và   phổ  pectin chưa được thủy phân. Do vậy, nồng độ <br /> oligosaccharide bằng sắc ký lớp mỏng TLC với  cơ chất 3% được lựa chọn cho các thử nghiệm <br /> hệ  dung môi butanol: axit acetic: nước là 9: 4:  tiếp   với   các   lượng   enzyme   khác   nhau   nhằm <br /> 7   (v/v/v),   hiện   màu   bằng   dung   dịch   acid  tăng lượng POS tạo thành.<br /> sulfuric 10% trong ethanol, sây  ́ ở 120oC trong 5 <br /> phút. <br /> Tối   ưu   hóa   điều   kiện   thủy   phân   giới   hạn  <br /> pectin tạo POS<br /> Sử   dụng   phần   mềm   Design­Expert   7.1.5  <br /> (State­Ease,   Inc.,   Minneapolis,   Hoa   Kỳ)   với  <br /> quy hoạch Box­Benken, ma trận thực nghiệm <br /> gồm   17  thí   nghiệm   với   khoảng   chạy   của   3  <br /> yếu tố <br /> <br /> <br /> a b    M    1     2     3     4     5 c    M     1      2      3        4     5<br /> G1 G1<br /> <br /> G2 G2<br /> G3 G3<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 1. Ảnh hưởng của nồng độ pectin (a, b) và tỷ lệ enzyme/cơ chất (c) <br /> đến thủy phân pectin chanh leo tạo POS <br />  M: oligosaccharide chuẩn; b: giếng 1­5 tương ứng nồng độ cơ chất 1, 2, 3, 4, 5%; <br /> c: giếng 1­5 tương ứng với tỷ lệ enzyme/cơ chất 20, 30, 40, 50, 60 U/g.<br /> <br /> Bảng 1. Ảnh hưởng của một số yếu tố thủy phân tới lượng POS thu được<br /> Hàm lượng POS (mg/ml phản ứng)<br /> 20 9,65±0,42 Tốc  200 11,97±0,55 1 7,02±0,31<br /> Tỷ lệ  30 13,95±0,65 độ  250 18,43±0,90 2 9,98±0,45<br /> E/S  40 15,65±0,70 khuấy  300 13,84±0,62 Thời  3 13,79±0,65<br /> (U/g) 50 12,64±0,60 (vòng/ 350 11,04±0,52 gian  4 18,76±0,90<br /> 60 10,57±0,52 phút) (gi ờ ) 5 18,53±0,91<br /> Nhiệt  40 13,34±0,61 3 10,07±0,50 6 18,05±0,90<br /> độ  50 16,13±0,80 pH 4 17,63±0,81 7 17,87±0,85<br /> ( C)<br /> o<br /> 60 9,06±0,43 5 13,05±0,62<br /> Thử nghiệm thủy phân ở nồng độ cơ chất   hiện lượng G2 và G3 mong muốn.<br /> 3% cho thấy khi sử dụng tỷ lệ enzyme/cơ chất <br /> 20 và 30 U/g, lượng enzyme khá ít nên sau 4  Thử  nghiệm  ảnh hưởng của pH đến quá <br /> giờ phản ứng vẫn còn nhiều pectin chưa được  trình th ủy phân pectin biểu diễn trên hình 2b <br /> thủy phân. Tuy nhiên, khi tăng tỷ lệ này lên tới  cho th ấ y  ở  pH 4 lượng G2 và G3 được tạo  <br /> 50 và 60 U/g, quá trình thủy phân xảy ra sâu  thành nhiều và đường đơn ít, trong khi đó  ở <br /> hơn, phổ  sản phẩm xuất hiện lượng  đường  giá trị pH 3 và pH 5 cho kết quả ngược lại. <br /> đơn (G1) khá nhiều (hình 1c).  Ở  tỷ  lệ  40 U/g  Do dịch pectin có độ  nhớt khá cao nên tốc  <br /> phổ   sản   phẩm   chứa   chủ   yếu   là   đường   đôi,   độ  phản  ứng thủy phân bị   ảnh hưởng mạnh <br /> đường ba và hàm lượng POS lớn nhất (bảng 1). bởi tốc độ  khuấy. Trong các thử  nghiệm, tốc <br /> độ   khuấy   250   vòng/phút   được   lựa   chọn   do <br /> Ảnh   hưởng   của   nhiệt   độ,   pH,   tốc   độ <br /> phổ  sản phẩm thu được chủ  yếu là G2 và G3 <br /> khuấy và thời gian <br /> (hình 2c và bảng 1). <br /> Nghiên cứu  ảnh hưởng của nhiệt độ  đến <br /> Thời   gian   thủy   phân   phù   hợp   được   lựa <br /> quá trình thủy phân pectin tạo POS được diễn <br /> ch ọn sau 4 gi ờ, khi đó lượng POS đạt cao nhất  <br /> ra   ở   khoảng   40­60oC   (hình   2a).   Ở   nhiệt   độ <br /> (bảng 1), có thể do trong 3 giờ đầu pectin chưa  <br /> 40 C tốc độ phản ứng thủy phân chậm (lượng  phân cắt thành các oligosaccharide nên tạo vệt <br /> G2 và G3 ít). Khi tăng nhiệt độ  phản  ứng lên  dài trên bản sắc ký (hình 2d). Kéo dài thời gian <br /> 60 C,   lượng   đường   đơn   tạo   ra   quá   nhiều.  thủy phân đến 5­7 giờ, pectin bị thủy phân triệt <br /> Trong   khi   phản   ứng   tiến   hành   ở   50 C,   dịch  để  tạo thành đường đơn nên lượng POS giảm <br /> thủy phân đã xuất dần. <br /> <br /> a M      1       2      3 b M     1      2       3 c  M    1      2    3     4 d M  1   2    3   4    5   6 <br /> z G1<br /> G1 G1<br /> G1 b<br /> G2 G2 G2 G2<br /> <br /> G3 G3 G3 G3<br /> <br /> <br /> <br /> a<br />  Hình 2. Ảnh hưởng nhiệt độ (a), pH (b), tốc độ khuấy (c) <br /> và thời gian (d) đến thủy phân pectin chanh dây tạo POS <br /> M: oligosaccharide chuẩn; a: giếng 1­3 tương ứng với nhiệt độ 40, 50, 60oC; <br /> b: giếng 1­3 với pH 3, pH 4, pH 5; c: giếng 1­4 với tốc độ khuấy 200, 250, 300, 350 vòng/phút; <br /> d: giếng 1­6 với thời gian thủy phân 1, 2, 3, 4, 5 và 6 giờ<br /> <br /> Sau khi thủy phân giới hạn pectin vỏ chanh   nghiệm và hàm lượng POS được thể  hiện  ở <br /> leo 3% (w/v) bởi lượng Pectinex Ultra SP­L 40   bảng 2.<br /> U/g   pectin   ở   pH   4,   nhiệt   độ   50oC,   tốc   độ  Kết quả phân tích phương sai của mô hình <br /> khuấy 250 vòng/phút và thời gian thủy phân 4  tối   ưu   bằng   phần   mềm   DX7.1.5   trình   bày <br /> giờ   lượng   POS   thu   được   18,76   mg/ml   dịch  trong   bảng   3   cho   thấy,   cả   3   yếu   tố   tỷ   lệ <br /> phản ứng. enzyme/cơ   chất,   tốc   độ   khuấy   và   nhiệt   độ <br /> Tối  ưu hóa các điều kiện thủy phân pectin   đều ảnh hưởng mạnh đến quá trình thủy phân <br /> tạo POS  pectin tạo POS (giá trị p của X1, X2, X3