Ứng dụng liệu pháp gene trong điều trị HIV

Chia sẻ: Duong Van Huy | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:27

0
244
lượt xem
82
download

Ứng dụng liệu pháp gene trong điều trị HIV

Mô tả tài liệu
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Sự tái phát khi điều trị HIV dùng thuốc thường xảy ra sau những thành công điều trị đầu tiên. Hơn nữa, dùng thuốc để điều trị rất tốn kém và thường mang lại hiệu ứng phụ đáng kể. Tần số đột biến của các virus do sự phát triển của các virus kháng lại thuốc dùng trong điều trị là một rủi ro lớn, có thể làm virus ngày càng khó điều trị hơn. Điểm cuối cùng là các chế độ điều trị hiện nay dường như không điều trị tận gốc được các virus trong người bệnh, những người yên tâm dùng thuốc...

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Ứng dụng liệu pháp gene trong điều trị HIV

  1. Liệu pháp gene trong điều trị HIV Nguyễn Xuân Hưng 3. Ứng dụng liệu pháp gen trong điều trị bệnh AIDS 3.1. GIỚI THIỆU CHUNG Sự tái phát khi điều trị HIV dùng thuốc thường xảy ra sau những thành công điều trị đầu tiên. Hơn nữa, dùng thuốc để điều trị rất tốn kém và thường mang lại hiệu ứng phụ đáng kể. Tần số đột biến của các virus do sự phát triển của các virus kháng lại thuốc dùng trong điều trị là một rủi ro lớn, có thể làm virus ngày càng khó điều trị hơn. Điểm cuối cùng là các chế độ điều trị hiện nay dường như không điều trị tận gốc được các virus trong người bệnh, những người yên tâm dùng thuốc cho cuộc sống của họ. Một lí do của vấn đề này là virus HIV có thể sống âm ỷ trong các tế bào bị nhiễm và ở các điểm bí mật (privileged sites) trong cơ thể, nơi mà các loại thuốc và hệ thống miễn dịch không thể vươn tới chúng. Cần phải có một phương thức điều trị mới ngoài phương pháp dùng thuốc truyền thống. Điều này tạo nên tiềm năng phát triển mạnh mẽ của các liệu pháp gen chống lại HIV. 3.2. CÁC CHIẾN LƯỢC ĐIỀU TRỊ HIV Các chiến lược liệu pháp gen dựa trên những tiến bộ của chúng ta trong hiểu biết về di truyền của virus HIV (sinh học phân tử và sinh bệnh học của HIV) trong những năm gần đây. Cấu trúc của virus HIV và sự nhân lên của HIV trong tế bào chủ đã được trình bày ở phần trên. Theo lí thuyết, chu trình sống và tái bản của virus có thể bị kìm hãm bởi sự kìm hãm chức năng của một hay nhiều gen và các protein thích hợp của chúng. Mẫu động vật là không tốt cho các nghiên cứu HIV; rất nhiều nghiên cứu liệu pháp gen y học ban đầu có cơ sở là các kinh nghiệm trong nuôi cấy tế bào in vitro. Trên cơ sở các kinh nghiệm đầu tiên này, một số chiến lược được cố gắng thử nghiệm trên pha I (trong một số trường hợp trên các thử nghiệm pha II) với các cá nhân nhiễm HIV. (bảng 4) Tất cả các thử nghiệm khoa học đòi hỏi các phác thảo thử nghiệm công phu, nó mô tả chi tiết chế độ điều trị, tiêu chuẩn đáp ứng miễn dịch với việc phát triển sổ theo dõi thông tin chi tiết người bệnh (người bệnh thu được lợi ích gì từ điều trị, mô tả các phản ứng phụ…). Trên thực tế, người bệnh hoàn toàn tự nguyện và có thể lút lui khỏi thử nghiệm bất cứ lúc nào.  Các thử nghiệm pha I: nhằm xác định hiệu ứng phụ, đánh giá liều lượng điều trị lớn nhất cho phép ở người và tìm các dấu hiệu phản ứng. Người bệnh đầu tiên nhận được liều lượng thấp, cho phép các hiệu ứng phụ nhỏ nhất trên cơ sở kinh nghiệm từ các mẫu động vật. Mỗi cấp liều lượng thường có 3 người bệnh được điều trị. Mức độ liều lượng không tăng lên ở mỗi cá nhân trong nhóm này nhưng tăng lên trong nhóm 3 người bệnh mới nếu các hiệu ứng phụ xảy ra một cách hợp lí. Số người bệnh lớn hơn sau đó được điều trị với liều lượng này hoặc liều lượng thấp hơn khi các đánh giá về liều lượng tối đa có thể chấp nhận được đã hoàn thành. Các hồ sơ đầy đủ về các hiệu ứng phụ chủ quan hoặc khách quan được giữ lại. Liệu pháp gen đem lại một số hiệu ứng phụ khách quan do đó liều lượng thích hợp tối đa thường khác nhau với mỗi điều trị.
  2.  Các thử nghiệm pha II: Nếu các điều trị mới không cho dấu hiệu rõ ràng về hiệu quả của liệu pháp gen qua thử nghiệm pha I, cần tiến hành các thử nghiệm tiếp theo trên các nhóm người bệnh không nhận được nhiều lợi ích từ điều trị. Mục đích của các thử nghiệm pha II là để tìm ra thuốc có hiệu quả cho liệu pháp. Các thử nghiệm pha II thường sử dụng một liều lượng không đáng kể so với liều lượng tối đa cho phép trong pha I. Ghi chép cẩn thận về hiệu ứng phụ cũng được bảo tồn trong các thử nghiệm pha II.  Các thử nghiệm pha III: các thử nghiệm pha III là sự xác định phức tạp hơn các vấn đề cho liệu pháp mới bên cạnh các phương thức liệu pháp trung gian. Sự điều trị phải được kiểm tra đối chứng với các phương thức đã được thiết lập, thường trong các thử nghiệm y học ngẫu nhiên. Điều này có nghĩa rằng những người bệnh ngẫu nhiên được lựa chọn để điều trị với liệu pháp mới sau đó so sánh kết quả. Sự trình bày quan trọng dưới đây sẽ là các nghiên cứu liệu pháp gen luôn có trong các thử nghiệm. Hai chiến lược chính cho liệu pháp gen chống lại HIV đang được cố gắng tiến hành: - Đưa các gen mới tới các tế bào đích nhiễm HIV nhằm chống lại quá trình tái bản của HIV. - Biến đổi di truyền của các tế bào miễn dịch nhằm tăng đáp ứng miễn dịch đặc hiệu chống lại HIV. Mỗi nguyên lí chính này có một số dạng chiến lược khác nhau được thể hiện trong (bảng 2) 3.3. SỰ KÌM HÃM HIV NỘI BÀO Liệu pháp gen nhằm kìm hãm HIV nội bào có cơ sở không những trên các axit nucleic của virus mà còn trên các protein của tế bào. 3.3.1. Liệu pháp có dựa trên các axit nucleic của virus Liệu pháp dựa trên các axit nucleic của virus được chia thành hai nhóm chính: - Các chiến lược RNA cơ sở dựa vào antisense, ribozymes, hoặc các bẫy (Decoys) - Nhân tố ngoại sinh được đưa vào các DNA oligonucleotides với những tính chất của mạch đối (antisense properties) 3.3.1.1 Antisense Trong liệu pháp antisense, gen được đưa vào các tế bào đích (tế bào khởi sự biểu hiện của các phân tử RNA), bổ sung đến RNA virus muốn tấn công. Trong tế bào, RNA liệu pháp sẽ gắn đặc hiệu tới các phân tử virus đích, kìm hãm chức năng và phá vỡ phân tử. Chiến lược này cho thấy có hiệu quả chắc chắn trên các dạng RNA virus trong các tế bào nuôi cấy. Các thử nghiệm pha I trên người bệnh nhiễm HIV đang tiến hành với liệu pháp antisense nhằm vào các phân tử virus đích quan trọng: gọi là chuỗi TAR, mRNA cho gen Rev, Pol gen và RNA của bộ gen virus. Chuỗi TAR là điểm gắn của Tat, protein virus điều hoà cực kỳ quan trọng cho tốc độ tái bản của virus trong tế bào. Protein Rev gắn với nhân tố RRE, nhân tố đại diện
  3. chung cho mRNA của virus và có chức năng quyết định trong thông tin của các virus mới trong tế bào. Có một số vấn đề với chiến lược antisense. Đầu tiên, hiệu quả kháng virus đòi hỏi sự kết tụ nội bào cao của RNA mạch đối đã được biểu hiện. Vấn đề này có thể được giải quyết thông qua sự tiến triển của công nghệ trong mối quan hệ với hiệu quả của sự biểu hiện gen. Một vấn đề quan trọng khác là, sự phổ biến trong phương pháp thuốc kháng HIV truyền thống cũng như rủi ro lớn của sự phát triển kháng thuốc của vật chất di truyền của virus sẽ làm giảm hoặc trung hoà hiệu quả của RNA mạch đối (antisense RNA) được sử dụng. Rất có thể, chiến lược antisense sẽ được sử dụng kết hợp với các liệu pháp khác để ngăn cản sự phát triển đối kháng. 3.3.1.2 Ribozymes Ribozymes là các phân tử antisense có hoạt tính xúc tác. Sau khi gắn tới đích (các phân tử RNA của virus), chúng gây ra sự phá huỷ. Ribozymes nhỏ đên mức mà một số ribozyme khác nhau với các góc độ tấn công khác nhau có thể được xây dựng trong cùng một hệ thống vector; tại cùng một thời điểm, điều này quan trọng để thiết kế các phân tử ribozyme đa đích (multitargeted ribozyme) cùng tấn công các vùng khác nhau trong RNA của virus. Ribozyme cho thấy khả năng tiềm tàng của liệu pháp kháng HIV, do các lí do đã đề cập ở trên, ribozyme có thể tấn công RNA của virus cả trước và sau khi vật chất di truyền của virus được gắn vào DNA của nhiễm sắc thể tế bào chủ. Hơn nữa, có các kết quả ban đầu đầy hứa hẹn từ các cố gắng thao tác trên ribozyme nên chúng có thể hướng trực tiếp tới các vùng trong tế bào bị nhiễm HIV, nơi có RNA của virus. Một số nghiên cứu pha I của liệu pháp ribozyme hiện nay đang tiến triển. Vấn đề chủ yếu là các virus có thể phát triển sự kháng đột biến với các ribozyme được sử dụng. Rất có thể liệu pháp này cũng sẽ được sử dụng kết hợp với các phương thức khác.
  4. Hình 19: sử dụng Ribozymes trong điều trị HIV 3.3.1.3 Các bẫy (Decoys) Như đã đề cập ở trên, các vùng TAR và RRE trên RNA của virus là các vị trí gắn quan trọng của Tat và Rev, các protein điều hoà chủ yếu. Sự kết gắn này có thể bị khoá bởi liệu pháp gen thông qua phương pháp bẫy. Cơ sở của phương pháp là đưa vào trong các tế bào chủ gen biểu hiện các phân tử RNA ngắn, cấu trúc giống TAR và RRE của virus. Các phân tử bẫy sẽ gắn với các protein điều hoà của virus (Tat và Rev), làm chúng tách khỏi TAR và RRE. Nguyên tắc này có giá trị hiệu quả kháng virus trong các tế bào nuôi cấy. Tuy nhiên, điều này gây ra các hiệu ứng phụ nghiêm trọng. Công việc là phát triển phân tử bẫy không gắn với các protein này nữa. 3.3.1.4 DNA oligonucleotide Gồm có các nguyên lí của mạch đối (antisense principles) ở đây, như các oligonucleotide được sử dụng để thiết kế để chúng gắn đặc hiệu với mRNA của virus. Các khối mRNA này tương ứng với protein của virus không được tổng hợp trong tế bào. Các dạng này của liệu pháp gen có tiềm năng to lớn. Chúng có hiệu quả trong các thử nghiệm trên tế bào nuôi cấy và cũng xuất hiện hiệu quả mở rộng in vitro trong các thuốc kháng HIV truyền thống. Các thí nghiệm pha I mở đầu với oligonucleotide này (GEM 91) nhằm tới mRNA cho gen gag trong bộ gen của virus đã được báo cáo và sự tiến triển của nó (GEM 92) sẽ sớm được sử dụng trong các thử nghiệm y học.
  5. 3.3.2. Các phương pháp dựa vào protein nội bào với hiệu ứng kháng HIV Các lựa chọn chiến lược khác nhau nhằm kìm hãm chức năng các protein của virus hay protein của tế bào bị nhiễm HIV. 3.3.2.1 Dominant negative proteins Cách tiếp cận ở đây là đưa các gen hay các đoạn gen (không có các thuộc tính thiết yếu của protein virus tự nhiên) tổng hợp protein liên quan chặt chẽ với các protein quan trọng của virus. Các protein đã bị biến đổi này sẽ có hiệu quả kháng virus, một phần do gắn cạnh tranh trên mRNA với các protein virus tự nhiên, thứ hai do sự chiếm giữ (capturing) các nhân tố tế bào chứa sự gắn tự nhiên giữa protein và RNA virus, và cuối cùng do gắn các phức hệ với protein virus tự nhiên làm trung hoà nó. Chiến lược này tấn công một số protein của virus trong các kinh nghiệm nuôi cấy tế bào. Trong hầu hết các thử nghiệm y học tiến bộ, gen mã hoá sự biến đổi protein Rev (Rev M10) được đưa vào. Có ít nhất hai thử nghiệm pha I đang diễn ra. Điều này đang được quan tâm để sản xuất protein bằng cách kết hợp các protein Tev và Tat đã bị biến đổi. Sự gắn chặt của chuỗi vật chất di truyền với protein này trong các tế bào nuôi cấy có giá trị tăng hiệu ứng kháng HIV và rõ ràng là rất có khả năng cho liệu pháp gen. Vấn đề tiềm tàng trong liệu pháp gen dựa vào dominant negative proteins là các protein này xa lạ với cơ thể do đó có thể khởi động đáp ứng miễn dịch khi được biểu hiện trong các tế bào chủ làm chúng bị tiêu diệt nên không xuất hiện hiệu quả điều trị. 3.3.2.2 Các protein của tế bào Sự gắn chặt của các gen mã hoá protein thuộc tế bào (ví dụ các protein của tế vật chủ ban đầu với hiệu quả kháng HIV) có thể được sử dụng trong liệu pháp gen chống HIV. Phân tử CD4 được biểu hiện trên bề mặt các lympho bào CD4+ và có thể gắn với HIV. Trong canh trường tế bào, các tế bào mà gen được đưa vào để các phân tử CD4 đã biến đổi giữ lại trong tế bào chất, cho thấy chắc chắn hiệu quả kháng HIV, nhưng điều này không thành công trên in vivo. Sự đưa gen vào interferon a-2 (một loại protein do tế bào cơ thể sinh ra khi bị virus tấn công nhằm ngăn không cho virus phát triển) rõ ràng có hiệu quả kháng HIV trong canh trường tế bào không được tiến hành xa hơn trong các thử nghiệm y học, một phần bởi rủi ro của các phản ứng phụ với chiến lược này. Hơn nữa, các kết quả thú vị đã được báo cáo với việc đưa gen tới interferon b trong canh trường tế bào từ các bệnh nhân HIV. Cách này duy trì được sự tái tạo thấp của interferon b đã đạt được trong các tế bào. Điều này rõ ràng có hiệu quả kháng HIV và nó cũng làm tăng chức năng miễn dịch của các tế bào. 3.3.2.3 Intrabodies Nó khả thi trong việc chuyển gen trong các tế bào chủ, gồm cả các lympho bào CD4, nhân tố cần cho sự tổng hợp của intrabodies, antigene gắn với các chuỗi đơn thu được từ các các phân tử kháng nguyên bình thường. Các intrabodie này có thể được thiết kế để phản ứng chọn lọc với các protein HIV thiết yếu và có thể kìm hãm sự tái bản của virus trong các canh trường tế bào. Các thử nghiệm pha I đầu tiên của các bệnh nhân HIV thường tiến triển với liệu pháp gen dựa vào các intrabodie chống lại protein Rev và chống lại HIV-1 gp 120 (Env).
  6. 3.3.2.4 Các gen tự sát (Suicide gene) Đưa trực tiếp hay gián tiếp một số gen tự sát khác nhau vào canh trường nuôi cấy sẽ làm cho các tế bào nhiễm HIV bị chết. Điều này có thể đạt được chẳng hạn bởi việc đưa gen diphtheria toxin hay gen thymidin kinase từ Herpes simplex virus (virus làm tế bào chết nếu nó tiếp xúc trực tiếp với thuốc kháng virus ganciclovir) Hình 20: liệu pháp gen tự sát. (a) Vector adenovirus (AdV) phân phối gen Herpes simplex thymidine kinase (TK) tới tế bào đích của nó. (b) Sự biểu hiện của thuốc chống virus ganciclovir (GCV). (c) GCV-P có thể chuyển đến ngay sát các tế bào xuyên qua khe hở nơi (d) các enzim kinases của động vật có thể gắn thêm 2 phosphates tạo thành trinucleotide (GCV-P- P-P). (e) GCV-P-P-P có thể hợp nhất vào DNA; tuy nhiên, DNA polymerases không tái bản DNA chứa GCV-P-P-P. Sự phân bào bị gián đoạn và các tế bào chết. Vì GCV-P có thể chuyển tới các tế bào gần kề nên không cần chuyển gen tới tất cả các tế bào bởi vector virus và gọi là hiệu ứng ngoài. 3.4. LIỆU PHÁP MIỄN DỊCH Từ một số triển vọng trong sự kìm hãm chu trình sống nội bào và tái bản của virus, liệu pháp gen cũng có thể được sử dụng để khởi động đáp ứng miễn dịch của người bệnh chống
  7. lại HIV. Điều này có thể dạt được thông qua các chiến lược vừa khởi động các phản ứng miễn dịch chống lại HIV vừa làm tăng đáp ứng miễn dịch tế bào trung gian thông thường. 3.4.1. Liệu pháp miễn dịch đặc hiệu HIV 3.4.1.1 Cytotoxic T-lymphocytes Đây không phải các yếu tố được thiết lập cuối cùng quyết định tính kháng HIV trong hệ thống miễn dịch, nhưng một số quan sát đã chỉ ra rằng các lympho bào cytotoxic CD8 là quan trọng trong khía cạnh này. Nó đã sớm được thẻ nghiệm để chứa các lympho bào CD8 từ người bệnh, tăng số lượng các tế bào bằng nuôi cấy ex vivo, sau đó cấy các tế bào trở lại người bệnh. Một thăm dò mới để sử dụng liệu pháp lympho bào CD8 dựa trên sự biến đổi liệu pháp gen của lympho bào CD8 tự chủ, bằng cách gắn xen gen dẫn đầu sự biểu hiện của bề mặt cơ quan thụ cảm (cơ quan gắn chọn lọc với các lympho bào CD4 bị nhiễm HIV). Sau khi gắn, các tế bào đã nhiễm bị chết. Vấn dền với phương thức này là các lympho bào CD8 có khả năng sống rất hạn chế trong cơ thể. Ba nghiên cứu thử nghiệm pha I khác nhau dựa vào nguyên lí này đang phát triển. 3.4.1.2 Vắcxin DNA Các vắcxin cổ điển đưa virus không có hoạt tính hoặc hoạt tính yếu vào cơ thể nhằm khởi động hệ thống miễn dịch chống lại (hay ngăn cản) virus không phải lúc nào cũng thích hợp và thành công. Trong một số trường hợp nó gây ra các bệnh nghiêm trọng. Vắcxin DNA là khái niệm tương đối mới trong đó các đoạn DNA hay các đoạn gen được tiêm vào cơ, gây đáp ứng miễn dịch trực tiếp đến sản phẩm gen tạo bởi đoạn DNA lạ. Khi virus hay vi khuẩn với sản phẩm gen vào trong cơ thể, sự phát triển sau này của nó sẽ bị ngăn cản bởi các kháng thể đã được sản xuất hay các tế bào T (T-cells) đã được hoạt hoá nhằm vào các protein lạ. Phương pháp này có thể xem như dạng đặc biệt của liệu pháp gen. Tiêm chủng DNA đã được sử dụng trong các thí nghiệm động vật từ 30 đến 40 năm trước đây, sự nhiễm DNA riêng biệt từ các vi khuẩn gây bệnh được tạo ra để gây đáp ứng miễn dịch chống lại chính chúng. Kết quả tạo thành các protein từ DNA, protein gây đáp ứng miễn dịch. Khi kỹ thuật DNA tái tổ hợp được sử dụng, nó trở nên dễ dàng hơn trong việc chuyển các đoạn DNA xác định từ vi sinh vật gây bệnh và liên kết chúng với các phân tử chất mang (plasmids). Bằng cách này, vắcxin rẻ và có hiệu quả hơn, plasmid có thời gian tồn tại lâu hơn. Các thí nghiệm trên động vật (như chuột) cho thấy khi bị tiêm vào cơ, các plasmid gây ra đáp ứng miễn dịch chống lại các sản phẩm gen có dạng DNA trong plasmid. Điều này có nghĩa rằng plasmid DNA vào nhân tế bào sau đó vật chất di truyền được giải mã và các sản phẩm gen thích hợp được sinh ra. Các sản phẩm này sau đó bị bài tiết hoặc bị suy biến và xuất hiện trên bề mặt các tế bào T (T-cells), gây ra đáp ứng dịch thể (humoral cellular response) và đáp ứng tế bào (cellular response). Đáp ứng tế bào có thể áp chế và là đáp ứng miễn dịch trung gian quan trọng nhất chống lại sự nhiễm các vi sinh vật. Khái niệm này mang lại khả năng của công nghệ DNA trên plasmid với các cách đặc biệt và các gen phân lập cho các protein bề mặt quan trọng của các vi sinh vật gây bệnh. Vắcxin DNA có rất nhiều hứa hẹn, với các ứng dụng trong y học dự phòng cũng như liệu pháp gen. Các vắcxin này có khả năng chống lại sự nhiễm bệnh. Tuy có nhiều kết quả tốt song vẫn còn tồn tại một số thách thức đáng kể:  Tiên đoán, lựa chọn và xác định của các kháng thể tốt và sự tổ hợp của chúng.  Tính ổn định và khả năng đáp ứng kháng thể tiếp tục ngày càng giảm.
  8.  Quản lí liều lượng và hiệu ứng.  Tế bào đích đặc hiệu của vắcxin và tăng đáp ứng miễn dịch.  Các liệu pháp tổ hợp với các phương thức nhằm nâng cao hiệu quả và mở rộng phổ đáp ứng miễn dịch. Hình 21: Hai chiến lược để gắn vắcxin DNA HIV. a. Mô tả 9 cấu trúc đọc mở (open reading frames) - Gag, Env, Pol, Tat, Rev, Vpu, Vif, Vpr và Nef trong bộ gen của HIV-1. b.Ví dụ của sự biểu hiện của một số protein từ DNA đơn bởi protein điều hoà HIV (Rev) - phụ thuộc sự cắt nối. Tạo thành vắcxin DNA HIV-1 mà chúng ta triển khai trên các thử nghiệm ở người. ‘X’ bao hàm một sự biến đổi an toàn mà hoạt hoá enzim phiên mã ngược hoặc các zinc finger có vai trò trong bao gói RNA của virus. c. Ví dụ sự biểu hiện lạc quan của protein dung hợp codon (codon-optimized fusion protein). Vắcxin DNA này được cấu trúc bằng cách xoá đoạn giữa các gen mã hoá nhóm kháng nguyên đặc hiệu (Gag) và các enzim protease (PR), enzim phiên mã ngược (RT) và enzim integrase (IN) của virus. Gen PR chứa một sự biến đổi được hoạt hoá. Đoạn gắn được phát triển tại National Institutes of Health Vaccine Research Center. Gen PR gồm có một sự đột biến được hoạt hoá. Đoạn gắn được phát triển tại National Institutes of Health Vaccine Research Center. CA, lớp vỏ protein p24; Env, protein màng ngoài; LTR, chuỗi lặp cuối cùng; MA, p17 matrix protein; NC, p7 protein vỏ nhân; RT, p66/p51 enzim phiên mã ngược; SU, gp120 vỏ protein bề mặt; TM, gp41 transmembrane envelope protein. vif, vpr, vpu and nef là các protein phụ của virus; tat và rev là protein điều hoà của virus.
  9. Hình 22: Tạo các bộ gen chức năng Hình 23: Các vắcxin DNA tái bản nhanh chóng sản xuất nhiều protein kháng nguyên hơn
  10. Hình 24: Phác hoạ gen của vắcxin Hình 25: Sự sinh sản của CTL bởi các vắcxin DNA
  11. 3.4.2. Liệu pháp miễn dịch không đặc hiệu: Một số người bệnh phản ứng một cách hài lòng với các thuốc HIV hiện đại theo các tiêu chuẩn thông thường, nhưng không khôi phục hoàn toàn chức năng miễn dịch. Điều này có thể làm giảm khả năng chống lại HIV cũng như các vi khuẩn khác của người bệnh và gây ra các vấn đề lớn. Việc tiến hành các chiến lược liệu pháp gen với mục đích khởi động lại toàn bộ đáp ứng miễn dịch của các người bệnh có thể rất hứa hẹn. Nhưng phương thức liệu pháp này vẫn trong giai đoạn khởi đầu. 3.5. CÁC VẤN ĐỀ VỚI LIỆU PHÁP GEN ĐIỀU TRỊ BỆNH AIDS Một số vấn đề phải được giải quyết trước khi liệu pháp gen có giá trị lựa chọn cho HIV. Một số vấn đề là chung cho các liệu pháp gen ngày nay, một số quan hệ tới tính phức tạp của chính sự nhiễm HIV. Các lympho bào TCD4 và TCD8 là các tế bào đích được nghiên cứu trong nuôi cấy tế bào và trong các thử nghiệm y học do chúng có tầm quan trọng nhất trong sự tấn công của virus, thứ hai là do chúng rất quan trọng trong đáp ứng miễn dịch chống lại HIV. Thật khó có các tế bào đích lí tưởng, tuy nhiên các lympho bào T CD4 và T CD8 có khoảng thời gian sống giới hạn trong cơ thể và việc biến đổi di truyền của các tế bào này sẽ không gây ra sự bùng nổ mạnh mẽ về số lượng thông qua phân bào. Hơn hết, hệ thống chuyển gen được sử dụng không hiệu quả lắm trong quan hệ với các tế bào này, một phần là do chúng không sinh sản trong thời gian tiến hành. Cuối cùng, số lớn nhất các lympho bào không được tìm thấy trong máu, nhưng tìm thấy tại mô lymphoid trong cơ thể (nơi cũng chứa số lượng lớn virus) và chỉ một quy mô nhỏ người bệnh các lympho bào T CD4 có thể bị biến đổi di truyền bằng cách này. Khi nhiễm HIV, nó sẽ thu hút hơn nhiều để sử dụng các tế bào gốc haematopoietic như các tế bào đích, thay vì các lympho bào T. Các tế bào gốc bị biến đổi di truyền có thể sinh ra một số lớn các tế bào con với cùng một gen, nên một phần đáng kể hệ thống miễn dịch của người bệnh sẽ phục hồi với các tế bào bị biến đổi. Các thí nghiệm đã cho thấy rằng có thể chiết các tế bào gốc CD34+ có giá trị từ ngoại vi máu (peripheral blood) và máu dây rốn (umbilical cord blood) trong người bệnh HIV. Hệ thống phân phối được sử dụng trong liệu pháp gen không có giá trị lắm trong quan hệ với các tế bào gốc CD34+, nhưng các kết quả mới chỉ ra rằng các vector lentivirus có thể đáp ứng được khía cạnh này. Tuy nhiên, các khía cạnh an toàn của chuyển gen không được giải thích đầy đủ. Tính không đồng nhất của virus HIV gây ra các vấn đề chủ yếu. Một số lớn các virus khác nhau có thể tồn tại trong cùng một người bệnh, về lí thuyết mà nói, chúng có thể phản ứng khác nhau đối với chiến lược liệu pháp gen. Một vấn đề quan trọng hơn là virus này có xu hướng biến dị lớn kháng lại liệu pháp. Tiếp đến là tồn tại vùng bí mật (privileged) của virus trong cơ thể (như hệ thần kinh trung ương) nơi mà liệu pháp không với tới được, vấn đề này đã được nhận thấy trong các phương pháp dùng thuốc truyền thống. Tất cả các vấn đề này có
  12. nghĩa rằng, trong tương lai, liệu pháp gen có thể sẽ kết hợp với các phương thức khác, trong đó có phương pháp dùng thuốc. Các vấn đề và trở ngại vấp phải trong liệu pháp gen chống lại HIV là không thể đánh giá hết được. Tuy nhiên, khả năng điều trị bằng phương thức này sẽ trở nên có giá trị trong một vài năm tới. 3.6. XU HƯỚNG PHÁT TRIỂN VÀ TRIỂN VỌNG Hiện nay có khá nhiều nghiên cứu mới với liệu pháp gen qua miệng (oral gene therapy) ví dụ như phân phối các gen liệu pháp qua thành ruột. Các thí nghiệm trên mẫu động dị ứng đậu phụng, gen mã hoá hầu hết các chất gây dị ứng quan trọng được phân phối tới động vật qua đường miệng. Điều này làm yếu các đáp ứng miễn dịch dị ứng của các động vật khi chúng tiếp xúc với chất dị ứng đậu. Các nghiên cứu cũng chỉ ra sự cung cấp qua đường miệng của gen b-galactosidase trong vector AAV mang lại sự tiến triển y học trong một thời gian dài ở mẫu động vật không chịu được lactoza (lactose intolerance). Theo cách đó, liệu pháp gen qua miệng sử dụng các viên thuốc di truyền (genetic pills) có tiềm năng điều trị các bệnh khác nhau. Các thử nghiệm như vậy chưa được bắt đầu với các dự án ở người. Các nhiễm sắc thể nhân tạo có nhiều thuận lợi rõ rệt. chúng có thể chứa vật chất di truyền lớn hơn và do đó chuyển các gen lớn cũng như các vùng điều khiển phức tạp. Các nhân tố này sẽ được tái tạo và cách ly ổn định trong phân bào, hơn hết, chúng có thuận lợi bởi sự nghỉ ngơi của vật chất di truyền không bị tổn hại do hoà nhập. Tuy nhiên, việc phân phối có một số vấn đề: các phân tử lớn đến nỗi mà chúng phải được cấy trực tiếp lên tế bào. Điều này gây ra giới hạn ứng dụng với sự biến đổi các tế bào gốc. Nó là điểm quan trọng cho các hiểu biết sinh học về bệnh và nguyên nhân sinh lí học sẽ đóng góp tốt hơn và logic hơn với phương pháp liệu pháp gen. Với sự hoàn thành của bản đồ bộ gen người và hiểu biết về chức năng sinh học của các gen khác nhau sẽ góp phần tăng cường giá trị hiểu biết về và điều trị bệnh. 3.7. KẾT LUẬN Một lượng lớn các phác thảo liệu pháp gen điều trị HIV ngày nay đang được tiến hành. Kinh nghiệm thu được từ các thử nghiệm y học sẽ có ích trong sự phát triển của liệu pháp gen điều trị virus HIV cũng các virus khác. Đây là lí do để hy vọng liệu pháp gen trong các năm tới sẽ được lựa chọn hoặc bổ sung thêm cho liệu pháp thuốc chống virus. Kỹ thuật Phage display Ngay sau khi ra đời vào năm 1985, phage display đã trở thành một trong những kỹ thuật được nghiên cứu cũng như ứng dụng triển khai mạnh mẽ nhất. Không kể đến số công trình công bố vô cùng lớn, hiện tại cũng đã có một loại kháng thể đơn dòng (adalimumab) tạo ra bằng kỹ thuật này được FDA phê chuẩn áp dụng trong điều trị.
  13. Phage display vẫn không ngừng được cải tiến và ứng dụng, ngày càng thể hiện vai trò to lớn trong nghiên cứu y-sinh học. Mời thảo luận tại đây: http://www.sinhhocvietnam.com/forum/showthread.php?t=2183 Nguyễn Xuân Hưng 1. KỸ THUẬT PHAGE DISPLAY 1.1 Giới thiệu chung Kể từ khi được mô tả lần đầu tiên năm 1985, các công bố liên quan đến phage display đều dựa trên một nguyên lý chung là liên kết virus (bacteriophage) với thực thể được display (peptide, protein, đoạn kháng thể) [1-5]. Sự kết hợp này cho phép thực hiện chọn lọc protein với đặc trưng mong muốn từ một hỗn hợp chứa hàng triệu protein khác, sau đó có thể khuếch đại gen mã hóa protein này như một phần của bộ gen phage. Thực thể display thường được dùng nhất là scFv và Fab [6], tuy nhiên gần đây thư viện phage display với một đoạn kháng thể chuỗi nặng VH (sdAb) đã được tạo ra và cho thấy nhiều ưu điểm (hình 1) [7]. Phần virus trong kỹ thuật này thường dùng filamentous bacteriophage M13 và họ hàng gần của nó (fd), các peptide và protein cũng được biểu hiện và gắntrên bề mặt của bacteriophage [8-10] và virus eukaryote khác [8-10]. Ngoài ra còn một số kỹ thuật display khác như RNA display [11, 12], ribosome display [13] ..., mỗi kỹ thuật có đặc trưng riêng và được sử dụng tùy theo mục đích. Hình 1: Cấu trúc chung của một số loại kháng thể [Theo 14].
  14. 1.2 Filamentous phage M13 Cấu tạo Cấu trúc của virion M13 đã được nghiên cứu kỹ (hình 2). M13 kiểu dại có đường kính 65 Å và dài 9300 Å. Virion chứa bộ gen DNA mạch đơn có độ lớn 6407 bp [15] bao gói trong 2700 bản sao protein vỏ chính, pVIII. Mỗi đầu của phage được bao phủ bởi 2 protein vỏ phụ: một đầu gồm 5 bản sao của pVII và pIX, đầu kia chứa 5 bản sao của pIII và pVI. Ngoài các protein vỏ, M13 còn tạo ra 6 protein khác là pII, pX, pV, pI, pIV, pXI (bảng 1) [16]. Chiều dài của virion phụ thuộc vào chiều dài bộ gene: bộ gen dài hơn sẽ tạo ra phage dài hơn và ngược lại. Hình 2: Các protein cấu thành virion của M13 [17]. Nghiên cứu cấu trúc tinh thể của phân đoạn pIII chứa các miền N1 và N2 [18, 19] cho thấy đầu N của N1 tiếp xúc với dung dịch nên có thể gắn peptide hoặc protein với N1 mà không cản trở chức năng của pIII.
  15. Chu kỳ sống Vòng đời của M13 đã được nghiên cứu khá chi tiết. Quá trình xâm nhiễm bắt đầu khi phage tiếp xúc với bề mặt vi khuẩn thông qua tương tác giữa pIII với F pilus của E. coli [20]. Sau đó phage chuyển bộ gen của nó vào tế bào chủ và các protein vỏ gắn với màng vi khuẩn [21]. Bên trong vi khuẩn, bộ gen của phage chuyển thành DNA mạch kép (dsDNA) nhờ các enzyme của vi khuẩn và bắt đầu tổng hợp 11 protein của M13 (hình 3)
  16. Hình 3: Chu kỳ sống của bateriophage trong E. coli [Theo 22]. Khi các protein của phage và bộ gen DNA mạch đơn tíchlũy đủ trong vi khuẩn bị nhiễm, quá trình lắp ráp virion bắt đầu. Các protein cấu trúc pVIII, pVII, pIX, pVI, và pIII đồng thời gắn với màng trong vi khuẩn và chờ đợi bộ gen DNA mạch đơn tái bản. Khi đủ nồng độ, pV bọc bộ gen mạch đơn mới tổng hợp của phage và ngăn cản sự chuyển hóa của nó thành DNA mạch kép [23, 24]. Sau đó virion lắp ráp và được đẩy ra khỏi
  17. vi khuẩn [16]. Một chú ý quan trọng là M13 là bacteriophage không sinh tan nên tế bào chủ không bị chết sau khi nhiễm [16]. 1.3 Tạo thư viện phage display Các phương pháp và phagemid vector khác nhau đã được sử dụng để tạo nên các thư viện phage display từ một số nguồn khác nhau. Bên cạnh các thư viện truyền thống chứa gen mã hóa immunoglobulin được tách dòng, các thư viện bán tổng hợp hoặc tổng hợp hoàn toàn ở đó các vùng CDR nhất định được thay bằng các trình tự ngẫu nhiên đã được mô tả (hình 4) [25]. Về cơ bản, để tạo ra thư viện kháng thể cần khuếch đại các đoạn gen chuỗi nặng và chuỗi nhẹ từ mô bạch huyết hoặc lympho bào máu ngoại biênbằng phiên mã ngược và PCR. Cắt sản phẩm PCR bằng các enzyme giới hạn và tách dòng vào vector phagemid [6]để có thể biểu hiện khi dung hợp với protein của phage [16]. Tất cả các protein vỏ trong của phage đã được sử dụng cho mục đích display. Cách tiếp cận phổ biến nhất với peptide display là dung hợp các trình tự ngoại lai với đầu N của pIII hoặc pVIII, trong khi các protein thường được gắn với pIII. Peptide và protein dung hợp với đầu N của pVII [26], pIX [27] cũng như với đầu C của pVI [28], pVIII [29], và pIII nhân tạo đã được công bố [30]. Điều này có thể được làm bằng hai bước tách dòng sử dụng một số enzyme giới hạn hoặc bởi dung hợp các đoạn chuỗi nặng và nhẹ đã khuếch đại bằng PCR. Bước lắp ghép này cùng với việc sử dụng enzyme giới hạn hiếm SfiI, cho phép tách dòng theo một chiều duy nhất [6]. Sau đó biến nạp thư viện phagemid chứa kháng thể vào E. coli [16]. Để display các peptide hoặc protein sử dụng hệ thống phagemid, bổ sung helper phage vào canh trường vi khuẩn mang DNA phagemid để tạo ra hạt virus sử dụng trong sàng lọc. Khi nhiễm vào vi khuẩn mang phagemid, bộ gen của helper phage bắt đầu tổng hợp tất cả các protein của phage kiểu
  18. dại. Khi DNA phagemid mang promoter phage ngược dòng trình tự mã hóa protein dung hợp, protein này cũng được tổng hợp và gắn với protein của phage. Khi quá trình lắp ráp phage bắt đầu, các virion ưu tiên sử dụng DNA phagemid hơn là DNA của helper phage vì nó mang tín hiệu đóng gói đầy đủ chức năng. Các hạt phage được tiết ra sẽ display trình tự ngoại lai trên protein vỏ và mang phagemid mã hóa trình tự này [16]. Hình 4:Sơ đồ tạo thư viện kháng thể phage display [Theo 17].
  19. Một số thư viện đã được tạo ra và sử dụng phổ biến là Nissim Library, được tạo ra trong phòng thí nghiệm của Dr G. Winter tại Cambridge (1994), và thư viện của De Kruif và cộng sự (1995) [31]. Nổi bật nhất là thư viện tổng hợp Fab và scFv do Griffiths và cộng sự tạo ra [32]. 1.4 Sàng lọc với thư viện phage display Hầu hết các thủ tục sàng lọc dựa trên nguyên lý chọn lọc ái lực và gồm các bước cơ bản sau: 1, khuếch đại thư viện và tạo phage; 2, cho phage tiếp xúc với đích; 3, loại bỏ phage không gắn bằng cách rửa; 4, tách phage gắn; và 5, tái xâm nhiễm vào vi khuẩn chủ để khuếch đại chúng lên (hình 5). Các vòng sàng lọc này sau đó được lặp lại [17]. Khuếch đại thư viện và tạo phage Trong kỹ thuật phage display, cần dùng thư viện có độ đa dạng càng cao càng tốt [33]. Thông thường, thư viện phage được giữ dưới dạng phagemid nằm trong tế bào chủ là E. coli. Do đó, bước khuếch đại này thực chất là khuếch đại tế bào E. coli. Một điều quan trọng là kiểm tra về mặt thực nghiệm độ đa dạng của các thư viện trước khi bắt đầu bất kỳ chu kỳ sàng lọc nào [17]. Cho phage tiếp xúc với đích
  20. Sau khi khuếch đại thư viện và tạo phage với các đoạn kháng thể ngẫu nhiên được biểu hiện trên bề mặt của nó, cần cho hỗn hợp phage này tiếp xúc với phân tử đích (kháng nguyên đích) nhằm sàng lọc dòng phage có ái lực gắn tốt nhất với đích. Để làm được điều này, cần cố định kháng nguyên đích. Rất nhiều phương pháp cố định kháng nguyên đã được phát triển cho kỹ thuật phage display (hình 6). Cách đơn giản và thường được sử dụng nhất là cố định các phân tử đích trên giá thể và cho dung dịch chứa phage đi qua. Một số biến thể của phương pháp này đã được sử dụng thành công bao gồm cố định trên các ống hoặc phiến kính có bề mặt biến đổi hóa học, trong các cột hoặc trên bề mặt của các hạt từ.

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

Đồng bộ tài khoản