Báo cáo khoa học: Bước đầu nghiên cứu quy trình tách và nuôi cấy tế bào gốc phôi chuột

BOÄ GIAÙO DUÏC VAØ ÑAØO TAÏO TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC SÖ PHAÏM TP. HCM KHOA SINH HOÏC *****  *****

BAÙO CAÙO TOÅNG KEÁT ÑEÀ TAØI NGHIEÂN CÖÙU KHOA HOÏC CAÁP CÔ SÔÛ

ÑEÀ TAØI :

BÖÔÙC ÑAÀU NGHIEÂN CÖÙU QUI TRÌNH TAÙCH VAØ NUOÂI CAÁY TEÁ BAØO GOÁC PHOÂI CHUOÄT MAÕ SOÁ : CS.2004.23.64

CHUÛ NHIEÄM ÑEÀ TAØI: TS. Döông Thò Baïch Tuyeát

Thaønh Phoá Hoà Chí Minh - 12/2005

Coäng taùc vieân: ThS.Phan Kim Ngoïc ThS.Nguyeãn Ñaêng Quaân CN.Phaïm Vaên Phuùc (ÑHKHTN Tp. HCM) CN.Leâ Phan Quoác CN.Tröông Vaên Trí (ÑHSP Tp.HCM)

DANH MUÏC CAÙC TÖØ VIEÁT TAÉT

AS Adult stem cell Teá baøo maàm tröôûng thaønh

D`MEM Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium Moâi tröôøng D`MEM

dpc day postcoitum Ngaøy sau giao phoái

Ebs Embryonic bodys Theå phoâi

EC Embryonic carcinoma Teá baøo khoái u

EGC Embryonic germ cell Teá baøo maàm phoâi

ES Embryonic stem cell Teá baøo goác phoâi

FBS Fetal bovine serum Huyeát thanh baøo thai boø

FGF Fibroblast growth factor Nhaân toá taêng tröôûng nguyeân baøo sôïi

GC Germ cell Teá baøo maàm

ICM Inner mass cell Khoái teá baøo beân trong

LIF Leukimia inhibitory factor Nhaân toá öùc cheá baïch caàu

MEF Mouse embryonic fibroblast Teá baøo fibroblast phoâi chuoät

MHC Major Histocompatibitity complex Phöùc hôïp töông hôïp moâ

PGC Primordial germ cell Teá baøo maàm sinh duïc sô khai

LÔØI MÔÛ ÑAÀU

Theá kyû 21 - vôùi söï buøng noå cuûa thaønh töïu Coâng Ngheä Sinh hoïc ñaõ ñem laïi

nguoàn lôïi to lôùn cho cuoäc soáng nhaân loaïi. Con ngöôøi khoâng ngöøng tìm kieám nhöõng

höôùng nghieân cöùu môùi trong Sinh hoïc Phaân töû vaø Sinh hoïc teá baøo. Ñaëc bieät laø vieäc

nghieân cöùu teá baøo goác (Stem cell) nhaèm taän duïng nguoàn giaù trò voâ taän cuûa loaïi teá

baøo naøy trong coâng taùc chöõa beänh nhaát laø beänh nan y.

“Teá baøo goác” ñaõ trôû thaønh moät khaùi nieäm khoâng coøn xa laï trong lónh vöïc Y-

Sinh hoïc do nhöõng ñaëc tính öu vieät cuûa noù. Tuy nhieân Coâng ngheä teá baøo goác (Stem

cell biotech) cuõng ñaõ trôû thaønh noãi baên khoaên cho nhaân loaïi khi noù ñöôïc nghieân cöùu

vaø thao taùc treân chính con ngöôøi.

Nhieàu quoác gia treân theá giôùi ñaõ cho pheùp tieán haønh caùc thao taùc treân teá baøo goác

phoâi ngöôøi (Human embryo) vaø cuõng coù nhieàu nöôùc caám, trong ñoù coù Vieät Nam.

Vaán ñeà naøy coøn ñang coù nhieàu tranh caõi vaø hieån nhieân seõ coøn bò haïn cheá cho ñeán khi

tìm ra caùc phöông phaùp kieåm soaùt chaët cheõ.

Trong caùc ñoái töôïng nghieân cöùu phoå bieán hieän nay, chuoät nhaét traéng coù leõ laø khaù

quen thuoäc trong phoøng thí nghieäm vì nhöõng ñaëc tính thuaän lôïi cuûa noù: kích thöôùc

nhoû, voøng ñôøi ngaén, ñaëc ñieåm sinh lyù gaàn vôùi ngöôøi …

Vieäc thu nhaän teá baøo goác töø phoâi chuoät ñaõ ñöôïc thöïc hieän töø raát laâu treân theá giôùi

vaø ñaõ ñaït ñöôïc nhieàu thaønh töïu. Tuy nhieân, lónh vöïc nghieân cöùu naøy coøn raát haïn cheá

ôû Vieät Nam.

Ñeå baét ñaàu tieáp caän vôùi ñoái töôïng nghieân cöùu môùi naøy, chuùng toâi böôùc ñaàu

nghieân cöùu qui trình taùch vaø nuoâi caáy teá baøo goác phoâi chuoät.

Maëc duø böôùc ñaàu ñaõ ñaït ñöôïc moät soá keát quaû nhaát ñònh nhöng chaéc chaén raèng

coøn nhieàu ñieàu chöa hoaøn thieän. Raát mong söï quan taâm vaø goùp yù cuûa nhöõng ai quan

taâm ñeán vaán ñeà naøy ñeå ñeà taøi ñöôïc hoaøn thieän hôn.

Chaân thaønh caûm ôn.

TP HCM, thaùng 12/2005

Döông Thò Baïch Tuyeát

Thay maët nhoùm taùc giaû

PHAÀN 1

TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU

1. TEÁ BAØO GOÁC

1.1. Khaùi nieäm

Teá baøo goác laø moät loaïi teá baøo chöa chuyeân hoaù, coù khaû naêng phaân chia voâ haïn

trong caùc toå chöùc soáng, coù nguoàn goác töø phoâi, baøo thai hay moâ cô theå tröôûng thaønh.

Döôùi ñieàu kieän thích hôïp hay coù tín hieäu kích thích, teá baøo goác seõ phaùt trieån thaønh

nhieàu loaïi teá baøo chuyeân hoaù taïo thaønh caùc cô quan hay toå chöùc cuûa cô theå. [1][2]

1.2. Ñaëc ñieåm

 Coù khaû naêng phaân chia voâ haïn.

 Caáu truùc di truyeàn (Boä NST löôõng boäi) trong caùc teá baøo vaãn duy trì vaø oån

ñònh vôùi moãi loaøi.

 Coù theå bieät hoaù thaønh caùc loaïi teá baøo chuyeân hoaù khaùc nhau thu töø 3 lôùp

maàm nguyeân thuûy.

 Coù khaû naêng nhaân doøng teá baøo.[1][2]

1.3. Phaân loaïi

Goàm 2 nhoùm chính : [7][9]

 Teá baøo goác phoâi (Embryonic Stem Cell – ES)

 Teá baøo goác phoâi – ES

 Teá baøo maàm phoâi (Embryonic Germ Cell – EGC)

 Teá baøo goác tröôûng thaønh (Adult Stem Cell – AS)

1.4. Sô löôïc tình hình nghieân cöùu

Caùc teá baøo goác phoâi (ES _ Embryo stem cell, ) laàn ñaàu tieân ñöôïc coâ laäp vaøo

nhöõng naêm 1980 bôûi nhieàu nhoùm nghieân cöùu laøm vieäc ñoäc laäp. Nhöõng nhaø nghieân

cöùu naøy ñaõ nhaän ra ñaëc tính bieät hoùa ña höôùng cuûa teá baøo ES ñeå cho ra caùc loaïi teá

baøo cuûa caû ba lôùp maàm sô khôûi.

Gossler vaø coäng söï ñaõ mieâu taû khaû naêng vaø lôïi ñieåm cuûa vieäc duøng teá baøo ES ñeå

taïo ra ñöôïc caùc ñoäng vaät chuyeån gene. Thomas vaø Capechi ñaõ baùo caùo veà khaû naêng

bieán ñoåi boä gene cuûa caùc teá baøo ES baèng taùi toå hôïp töông ñoàng.

Smithies vaø caùc ñoàng nghieäp sau ñoù ñaõ chöùng minh raèng caùc teá baøo ES ñöôïc bieán

ñoåi gen khi vaøo Blastocyst, coù theå truyeàn laïi nhöõng bieán ñoåi di truyeàn naøy qua caùc

doøng teá baøo .

Ngaøy nay caùc bieán ñoåi di truyeàn treân boä gene chuoät baèng kyõ thuaät teá baøo ES laø

moät caùch tieáp caän quan troïng ñeå tìm hieåu chöùc naêng cuûa caùc teá baøo ñoäng vaät höõu

nhuõ in vivo. Caùc nghieân cöùu veà caùc teá baøo ES cuûa caùc ñoäng vaät höõu nhuõ: chuoät ñoàng,

chuoät, choàn, heo vaø boø ñaõ ñöôïc coâng boá; tuy nhieân, chæ coù teá baøo ES chuoät laø thaønh

coâng trong vieäc truyeàn laïi caùc bieán ñoåi di truyeàn töø teá baøo ES thoâng qua doøng teá baøo

maàm sinh duïc.

Gaàn ñaây, caùc quan taâm veà caùc teá baøo goác ñaõ taêng maïnh nhôø nhöõng baùo caùo veà

coâ laäp teá baøo ES ôû ngöôøi vaø linh tröôûng.

Caùc coâng trình taïo phoâi lai giöõa ngöôøi vaø thoû, bieán teá baøo goác thaønh tröùng vaø tinh

truøng, thu teá baøo maàm maø khoâng laøm cheát phoâi … ñaõ thu ñöôïc nhieàu keát quaû khaû

quan trong hai thaäp kyû qua.

Ñaëc bieät, vaøo thaùng 5/2004 A. Melton vaø coäng söï ñaõ bieät hoaù 17 loaïi teá baøo

khaùc nhau töø ES thu nhaän töø khoái teá baøo beân trong cuûa blastocyst ôû ngöôøi.

Caùc nhaø khoa hoïc Haøn quoác ñaõ toû ra vöôït troäi vaø ñaõ coù caùc coâng trình coù tính

tieân phong trong lónh vöïc thu nhaän teá baøo goác phoâi ngöôøi.

Tính ñeán nay, treân theá giôùi, ít nhaát ñaõ coù 4 ngaân haøng teá baøo goác ra ñôøi vaø ñi

vaøo hoaït ñoäng (Haøn quoác, Anh, Myõ, Trung quoác).

Hình 1.1 : a) Blastocyst b) phoâi ngöôøi giai ñoaïn 8 teá baøo

Rieâng ôû Vieät Nam, vieäc nghieân cöùu teá baøo goác chæ môùi ñang trong giai ñoaïn

khôûi ñaàu vaø ñöôïc taäp trung chuû yeáu taïi hai trung taâm lôùn (Ñaïi hoïc Khoa hoïc Töï

nhieân Haø noäi vaø Ñaïi hoïc Khoa hoïc Töï nhieân TP HCM). Maëc daàu vaäy, caùc phoøng

Thí nghieäm coâng ngheä cao cuûa hai Tröôøng noùi treân cuõng ñaõ ñaït ñöôïc moät soá thaønh

töïu laøm tieàn ñeà cho caùc nghieân cöùu saâu hôn veà teá baøo goác. Chaúng haïn nhö xaây döïng

caùc quy trình thu nhaän nguoàn phoâi in vitro, in vivo töø ñoäng vaät laøm nguyeân lieäu cho

khai thaùc teá baøo goác, caáy gheùp da thu ñöôïc töø nuoâi caáy teá baøo ñeå ñieàu trò caùc ca

boûng, gheùp teá baøo goác CD34+ maùu ngoaïi vi ñeå ñeå ñieàu trò beänh lyù aùc tính, thu teá

baøo goác sinh maùu töø tuyû xöông, cuoáng roán … [7][9]

2. TEÁ BAØO GOÁC PHOÂI

2.1. Khaùi nieäm vaø ñaëc ñieåm

Teá baøo goác phoâi ñöôïc ñònh nghóa bôûi nguoàn goác cuûa noù, chuùng coù nguoàn goác töø

daïng blastocyst cuûa phoâi. Blastocyst laø moät daïng phaùt trieån taát yeáu cuûa phoâi tröôùc

khi baùm vaøo thaønh töû cung. ÔÛ giai ñoaïn naøy, phoâi chuoät goàm lôùp teá baøo ngoaøi (ngoaïi

phoâi bì), khoang phoâi vaø khoái teá baøo beân trong.

Teá baøo goác taêng nhanh veà soá löôïng vaø bieät hoùa chöùc naêng thaønh caùc cô quan

tröôûng thaønh. Neáu taùch teá baøo goác ra khoûi phoâi vaø chuyeån chuùng vaøo moät cô quan

khaùc hay cô theå tröôûng thaønh, chuùng coù theå hoøa nhaäp, tieáp tuïc phaân chia vaø theå hieän

khaû naêng chuyeân bieät theo cô quan ñoù.

Töông töï, neáu caùc teá baøo naøy ñöôïc coâ laäp invitro, taïo doøng (colony) vaø taùc ñoäng

bieät hoùa, chuùng seõ coù khaû naêng bieán ñoåi hình thaùi vaø ñaëc ñieåm sinh lyù ñeå cho caùc

daïng teá baøo khaùc trong phoøng thí nghieäm.[1][2]

Haàu heát nhöõng teá baøo trong cô theå ñeàu coù nguoàn goác töø söï töï sao cheùp teá baøo

goác. Do ñoù, caùc nhaø khoa hoïc nhaän thaáy caàn phaûi phaùt trieån ñaëc ñieåm ñaëc bieät naøy

ñeå giuùp teá baøo goác bieät hoùa toát hôn. Austin Smith ñaõ xaùc ñònh caùc ñaëc ñieåm cuï theå

cuûa teá baøo goác phoâi nhö sau:

 Chuyeån hoùa töø lôùp teá baøo beân trong hay noäi phoâi bì cuûa blastocyst.

 Toàn taïi vaø duy trì oån ñònh boä nhieãm saéc theå ôû daïng löôõng boäi.

 Coù theå phaùt trieån thaønh caùc loaïi teá baøo khaùc nhau vaø xuaát phaùt töø 3 lôùp maàm

rieâng bieät cuûa phoâi (noäi bì, trung bì vaø ngoaïi bì).

 Coù khaû naêng hôïp thaønh moät theå thoáng nhaát trong taát caû caùc moâ thai trong suoát

thôøi kyø phaùt trieån.

 Coù khaû naêng nhaân doøng teá baøo vaø phaùt trieån thaønh teá baøo tröùng vaø tinh truøng.

 Bieåu hieän nhaân toá sao cheùp Octo-4, laøm hoaït hoùa hay kìm haõm moät gene ñích

vaø duy trì söï phaùt trieån nhanh cuûa teá baøo goác phoâi khoâng bieät hoùa.

 Coù theå tieáp tuïc phaùt trieån vaø töï ñoåi môùi chính noù.

 Doøng caùc teá baøo goác phoâi ñôn baøo coù theå phaùt trieån thaønh doøng teá baøo thuaàn

hay doøng teá baøo coù nguoàn goác nhö nhau.

 Trong toång hôïp DNA, khaùc vôùi teá baøo sinh döôõng, teá baøo goác phoâi khoâng ñoøi

hoûi caùc taùc nhaân kích thích beân ngoaøi khi baét ñaàu sao cheùp DNA.

 ÔÛ moãi teá baøo sinh döôõng cuûa ñoäng vaät höõu nhuõ caùi, moät trong hai nhieãm xaéc

theå X trôû neân baát hoaït hoaøn toaøn , nhöng söï baát hoaït cuûa nhieãm saéc theå X khoâng

xuaát hieän ôû teá baøo ES.[1][2][7][9]

Hình 1.2: Sô ñoà bieät hoùa caùc teá baøo töø tuùi phoâi ôû ngöôøi

2.2. Nguoàn goác cuûa teá baøo goác phoâi

Phoâi ñoäng vaät coù vuù khi phaùt trieån thì töøng ñaùm teá baøo trong ñaùm ñaïi phoâi baøo

chìm xuoáng, tröôùc khi phoâi baùm vaøo thaønh töû cung. Ñaây laø caùc teá baøo ña naêng, coù

nghóa laø chuùng coù khaû naêng phaùt trieån thaønh caùc teá baøo cuûa 3 lôùp maàm sô caáp.

Caùc teá baøo ña naêng naøy ñöôïc hình thaønh töø khoái teá baøo beân trong cuûa phoâi ôû giai

ñoïan tuùi phoâi, sau ñoù moät soá trong chuùng di chuyeån ra phía ngoaøi ñeå taïo ngoaïi phoâi

bì.

Maët khaùc caùc teá baøo ña naêng naøy cuõng coù khaû naêng keùo daøi söï töï ñoåi môùi töùc laø

chuùng coù theå khoâng bieät hoùa theo sô ñoà ñònh saün.

Caùc teá baøo ôû vuøng naèm saùt giöõa ngoaïi phoâi bì vaø khoái teá baøo beân trong seõ taïo ra

teá baøo goác phoâi toát nhaát.[9][10]

3. TEÁ BAØO MAÀM SINH DUÏC

3.1. Khaùi nieäm

Teá baøo maàm sinh duïc (goïi taét teá baøo maàm – Germ Cell ) laø nhöõng teá baøo goác ña

naêng coù theå phaân chia lieân tuïc vöøa töï laøm môùi vöøa bieät hoùa taïo thaønh caùc giao töû

(tinh truøng, tröùng) töø ñoù taïo ra cô theå môùi.[5]

3.2. Söï hình thaønh vaø toàn taïi cuûa caùc teá baøo maàm

Trong quaù trình phaùt trieån cuûa phoâi, hôïp töû sau khi ñöôïc taïo thaønh, qua nhöõng

laàn phaân chia ñaàu tieân caùc teá baøo con ñöôïc sinh ra. Nhöõng teá baøo naøy seõ phaùt trieån

theo caùc höôùng khaùc nhau vôùi caáu truùc vaø chöùc naêng rieâng bieät.

Moät trong nhöõng höôùng bieät hoùa laø höôùng hình thaønh neân caùc teá baøo maàm sô

khai (teá baøo maàm sinh duïc sô khai – Primordial Germ Cell – PGC ). Nguyeân nhaân

taïo ra höôùng bieät hoùa laø vì trong teá baøo chaát cuûa hôïp töû chöùa nhieàu nhaân toá ‘‘quyeát

ñònh’’ (determint factor), caùc nhaân toá naøy laïi phaân boá khoâng ñoàng ñeàu. Do ñoù, khi

hôïp töû phaân caét thì moãi teá baøo con seõ nhaän ñöôïc moät phaàn teá baøo chaát coù chöùa caùc

nhaân toá ‘‘quyeát ñònh’’ coù thaønh phaàn vaø haøm löôïng khoâng gioáng nhau.

Nhöõng teá baøo con naøo nhaän ñöôïc nhaân toá naøy seõ bieät hoùa theo höôùng maø nhaân toá

quyeát ñònh quy ñònh.[4][5]

Caùc teá baøo maàm sinh duïc xuaát hieän töø giai ñoaïn khaù sôùm trong söï phaùt trieån cuûa

phoâi, ñoù laø giai ñoaïn phoâi vò hoùa (phoâi ba laù). Caùc teá baøo ôû raõnh sinh duïc (PGC) laø

neàn taûng cho doøng teá baøo maàm sinh duïc. Theá heä con chaùu cuûa chuùng seõ hình thaønh

neân caùc giao töû ôû ñoäng vaät tröôûng thaønh. Caùc teá baøo PGC giöõ vai troø quan troïng

trong söï soáng soùt cuûa moät loaøi.

ÔÛ ñoäng vaät höõu nhuõ noùi chung vaø chuoät noùi rieâng, PGC laø moät quaàn theå caùc teá

baøo di ñoäng. Chuùng ñöôïc hình thaønh trong quaù trình phaùt trieån cuûa phoâi, sau ñoù di

chuyeån, kheách ñaïi vaø ñònh cö ôû boä phaän sinh duïc.

Caùc teá baøo maàm laàn ñaàu tieân ñöôïc xaùc ñònh khi coù moät daáu hieäu yeáu cuûa nhöõng

teá baøo döông tính vôùi phaûn öùng alkaline phosphatase taïi raõnh sinh duïc nguyeân thuûy

vaøo ngaøy 7 dpc (day postcoitum). Soá löôïng teá baøo maàm sinh duïc nguyeân thuûy chöøng

50 – 80 teá baøo vaøo cuoái giai ñoaïn phoâi vò hoùa (giai ñoaïn ba laù phoâi).

Vaøo giai ñoaïn 8 – 8,5 dpc thì soá löôïng teá baøo cuûa chuùng chöøng 100 teá baøo, ñònh

vò taïi lôùp trong ruoät sau vaø di chuyeån leân lôùp bieåu moâ ruoät sau vaøo ngaøy 9 – 9,5 dpc,

taïi ñaây soá löôïng cuûa chuùng taêng leân chöøng 350 teá baøo. Töø ñaây, chuùng di chuyeån theo

höôùng löng doïc theo caùc nieâm maïc ruoät sau veà phía caàu sinh duïc phaùt trieån (genital

ridge) vaø ñònh cö ôû ñaây vaøo ngaøy 10,5 dpc, khi ñoù soá löôïng cuûa chuùng khoaûng 1000.

Beân trong boä phaän sinh duïc, caùc teá baøo maàm sinh duïc tieáp tuïc phaân chia vaø quaàn theå

teá baøo ñaït chöøng 25000 teá baøo vaøo ngaøy 13,5 dpc. [5]

Caàu sinh duïc (genital ridge) laø tieàn thaân cuûa cô quan sinh duïc sau naøy. Caùc teá

baøo maàm toàn taïi trong caàu sinh duïc seõ di chuyeån veà cô quan sinh duïc ñang hình

thaønh trong caùc giai ñoaïn phaùt trieån cuûa phoâi.

ÔÛ giai ñoaïn 12.5 dpc, caàu sinh duïc baùm vaøo trung thaän (mesonephros) hay coøn

goïi laø thaän thai (fetus kidney). Sau khi boû heát phaàn noäi quan, caàu sinh duïc vaø trung

thaän naèm gaàn saùt vaøo löng. Coù theå quan saùt baèng maét thöôøng hay qua kính luùp hoaëc

kính hieån vi soi noåi ñeå thaáy hai boä phaän naøy.

Kích thöôùc cuûa caàu sinh duïc vaø trung thaän chöøng 1 – 2 mm tuyø thuoäc troïng

löôïng, kích thöôùc phoâi. Khi chöa taùch rôøi, caàu sinh duïc vaø trung thaän taïo thaønh hình

löôõi lieàm. Döôùi kính hieån vi, löôõi lieàm coù hai lôùp: moät lôùp beân phía chieàu cong beân

trong coù maøu saùng hôn laø caàu sinh duïc, moät lôùp coù maøu saãm hôn laø trung thaän.

Hình 1.3: Söï ñònh vò vaø toàn taïi cuûa teá baøo maàm ôû caùc giai ñoaïn phaùt trieån cuûa phoâi

(Phaàn maøu ñoû laø caùc teá baøo maàm sinh duïc).

Ñeå nghieân cöùu GC in vitro, ngöôøi ta döïa vaøo söï ñònh vò cuûa chuùng trong phoâi

theo tuoåi maø thu nhaän vaø nuoâi caáy.

Sau 12,5 dpc, caùc teá baøo maàm sinh duïc taäp trung vaøo caùc cô quan sinh duïc.

Buoàng tröùng naèm caïnh thaän trong khi ñoù tinh hoaøn thì naèm ôû vò trí gaàn boùng ñaùi.

Bieåu ñoà 1.1: Moái quan heä giöõa tuoåi (dpc) vaø soá löôïng teá baøo maàm sinh duïc ôû phoâi

chuoät Mus musculus var.Albino. Theo Tam vaø Snow (1981). [ 5]

3.3. Xaùc ñònh teá baøo maàm

Hieän taïi coù ba phöông phaùp xaùc ñònh teá baøo maàm sinh duïc döïa vaøo:

(1) Ñaëc ñieåm hình daïng,

(2) Khaùng theå nhaän dieän khaùng nguyeân ñaëc tröng cho teá baøo GC

(3) Söï bieåu hieän cuûa enzym Alkaline phosphatase.

3.3.1. Ñaëc ñieåm hình daïng teá baøo maàm

Caùc teá baøo GC sau khi ñöôïc rôøi ra töø caùc maûnh moâ coù theå phaân bieät ñöôïc chuùng

vôùi caùc teá baøo sinh döôõng khaùc khi xem döôùi kính hieån vi soi noåi hay caét lôùp. Teá baøo

maàm sinh duïc vöøa môùi thu nhaän thì seõ coù hình troøn, beà maët laùng vaø phaûn chieáu aùnh

saùng. Chuùng coù ñöôøng kính töø 18 - 20 μm neân lôùn hôn haàu heát caùc teá baøo sinh

döôõng. Chuùng laên troøn ñeàu treân maët ñaùy cuûa gieáng nuoâi.

Sau moät thôøi gian nuoâi caáy ngaén, caùc teá baøo sinh döôõng baùm vaøo ñaùy bình trong

khi ñoù caùc teá baøo maàm sinh duïc vaãn khoâng baùm vaøo ñaùy bình. Teá baøo GC haàu nhö

khoâng coù maøu do vaäy coù theå phaân bieät vôùi nhöõng teá baøo hoàng caàu khoâng nhaân,

khoâng baùm vaø coù cuøng kích thöôùc vôùi teá baøo GC bôûi caùc teá baøo hoàng caàu coù maøu ñoû

hoàng nhaït.

Sau moät vaøi giôø nuoâi caáy treân lôùp teá baøo ñôn (lôùp feeder, thöôøng laø fibroblast),

chuùng seõ dính vaøo lôùp teá baøo beân döôùi vaø thay ñoåi hình daïng – hình daïng cuûa chuùng

coù veû nhö hình cuûa fibroblast. Khi ñoù, chuùng ta khoâng theå naøo xaùc ñònh ñöôïc chuùng

qua hình daïng maø ñeå xaùc ñònh chuùng phaûi thoâng qua khaùng theå hay alkaline

phosphatase.

3.3.2. Xaùc ñònh döïa vaøo khaùng theå

Caùc teá baøo maàm sinh duïc theå hieän moät soá khaùng nguyeân beà maët chuyeân bieät

(Donovan vaø coäng söï, 1986). Caùc khaùng nguyeân naøy seõ keát hôïp ñöôïc vôùi khaùng theå

TG-1 vaø SSEA-1. Söï hieän dieän cuûa caùc khaùng nguyeân naøy laø moät phöông tieän ñaùng

tin caäy cho vieäc xaùc ñònh teá baøo GC soáng trong nuoâi caáy.

Tuy nhieân, thaät caån thaän raèng caùc phaûn öùng khaùng theå khoâng hoaøn toaøn ñaëc hieäu

cho teá baøo GC. Moät soá khaùng theå ña doøng ñöôïc bieát phaûn öùng chuyeân bieät vôùi teá

baøo GC nhöng cuõng ñoàng thôøi phaûn öùng vôùi caùc kieåu teá baøo khaùc. [5]

3.3.3. Xaùc ñònh döïa vaøo Alkaline phosphatase

Nhieàu nghieân cöùu cho thaáy raèng caùc teá baøo GC theå hieän söï hoaït ñoäng maïnh cuûa

Alkaline phosphatase. Hoaït tính cuûa Alkaline phosphatase ñaàu tieân ñöôïc xaùc ñònh

vaøo ngaøy thöù 7 dpc vaø tieáp tuïc bieåu hieän cho ñeán cuoái ñôøi soáng cuûa phoâi.[5]

Maëc duø trong phoâi cuõng coù nhöõng teá baøo khaùc cuõng döông tính vôùi alkaline

phosphatase nhöng söï hieän dieän cuûa teá baøo döông tính vôùi alkaline phosphatase thu

nhaän töø maãu moâ sinh duïc (nhö caàu sinh duïc) laø khoâng theå nhaàm laãn ñöôïc bôûi vì

khoâng coù kieåu teá baøo naøo bieåu hieän ñaëc tính naøy.

Teá baøo maàm thu nhaän töø caàu sinh duïc ñöôïc xaùc ñònh baèng phöông nhuoäm

Alkaline phosphatase. Traïng thaùi chöa bieät hoaù cuûa teá baøo maàm coù theå ñöôïc nhaän

bieát nhôø möùc ñoä bieåu hieän cao cuûa enzym Alkaline Phosphatase. Enzym naøy hoaït

ñoäng toái öu trong moâi tröôøng pH kieàm, do vaäy goïi laø Alkaline phosphatase (Alkaline

nghóa laø kieàm). Trong teá baøo, Alkaline phosphatase giöõ vai troø raát quan troïng trong

vieäc phaân giaûi caùc nhoùm phosphate cuûa caùc phaân töû nucleotide, protein vaø akaloide.

ÔÛ teá baøo goác vaø teá baøo maàm trong moät khoaûng thôøi gian nhaát ñònh trong thôøi gian

phaùt trieån cuûa phoâi thì enzym naøy hoaït ñoäng maïnh. Söï bieåu hieän maïnh cuûa enzym

naøy haàu nhö ít xaûy ra ôû caùc teá baøo ñaõ bieät hoaù. Do vaäy, söï bieåu hieän maïnh cuûa

Cô cheá phaûn öùng

enzym naøy laø moät daáu hieäu ñeå xaùc ñònh teá baøo goác vaø teá baøo maàm.[5][9]

Ñaàu tieân, Naphthol AS-BI phosphaste seõ bò caét ñi goác Phosphate thaønh Naphthol

AS-BI. Sau ñoù, Naphthol AS-BI seõ phaûn öùng trôû laïi vôùi Fast Blue BB Salt vaø taïo ra

saûn phaåm coù maøu xanh baùm treân beà maët teá baøo. Maøu xanh naøy coù theå quan saùt döôùi

kính hieån vi.

APase

Naphthol AS-BI phosphaste Naphthol AS-BI

Naphthol AS-BI + Fast Blue BB Salt Blue Pigment (Saéc toá maøu xanh).

4. NGUOÀN GOÁC THU NHAÄN VAØ PHÖÔNG PHAÙP THU NHAÄN TEÁ BAØO

GOÁC ÑA NAÊNG

Haàu heát caùc nhaø khoa hoïc söû duïng teá baøo goác ña naêng (pluripotent stem cell hay

leuripotent stem cell) ñeå chæ nhöõng teá baøo goác thu nhaän töø tuùi phoâi. Töø pluri coù

nguoàn goác töø tieáng Hy laïp laø plures nghóa laø nhieàu. Do vaäy, nhöõng teá baøo goác ña

naêng coù theå bieät hoùa thaønh baát kì teá baøo naøo tröø caùc teá baøo thu nhaän töø maøng phoâi.

Ñaây laø moät ñaëc tính ñöôïc quan saùt trong ñieàu kieän in vivo vaø caû trong ñieàu kieän in

vitro.[5]

Caùc teá baøo goác ña naêng coù theå ñöôïc thu nhaän töø ba nguoàn goác:

 Caùc teá baøo goác phoâi (ES) thu nhaän töø phoâi giai ñoaïn blastocyst.

 Caùc teá baøo maàm sinh duïc (GC) thu nhaän töø phoâi thai (chuoät töø giai ñoaïn

8,5 – 12,5 dpc, ngöôøi 5 – 7 tuaàn tuoåi)

 Caùc teá baøo khoái u chöùa nhieàu loaïi teá baøo khaùc nhau cuûa caùc lôùp maàm.

Hình 1.4 : Nguoàn thu nhaän caùc teá baøo goác ña naêng Do trong quaù trình phaùt trieån cuûa phoâi, tính töø luùc sau khi thuï tinh (Do) thì caùc söï

kieän tieáp theo xaûy ra theo moät thôøi gian coù theå döï ñoaùn tröôùc. Nhôø ñoù maø ngöôøi ta

coù theå thöïc hieän caùc kyõ thuaät vi thao taùc ñeå thu nhaän moät hoãn hôïp teá baøo chöùa caùc teá

baøo goác phoâi ES, teá baøo maàm EG ôû caùc giai ñoaïn phoâi khaùc nhau töø caùc phoâi thuï

tinh töï nhieân in vivo hoaëc töø caùc phoâi thuï tinh in vitro baèng caùch theo doõi thôøi gian

phaùt trieån cuûa phoâi.[9]

Töø hoãn hôïp teá baøo thu nhaän ñöôïc ngöôøi ta tieán haønh caùc phöông phaùp nuoâi caáy

khaùc nhau ñeå töø ñoù caáy chuyeàn, phaân laäp baèng nhieàu phöông phaùp vaø cuoái cuøng thu

nhaän ñöôïc caùc doøng teá baøo goác ña naêng.

Thöôøng thì caùc nhaø khoa hoïc söû duïng caùc kyõ thuaät coâng ngheä cao ñeå phaân laäp

caùc teá baøo goác ña naêng nhö vieäc söû duïng coâng cuï FACS (Fluorescen Activated Cell

Sorting) ñeå phaân loaïi caùc teá baøo goác raát hieám töø haøng trieäu teá baøo khaùc. Vôùi kyõ

thuaät naøy, dòch huyeàn phuø caùc teá baøo ñöôïc gaén vôùi ñuoâi huyønh quang (nghóa laø chæ

gaén leân caùc marker beà maët cuûa teá baøo goác caùc tag huyønh quang thích hôïp), sau ñoù

ñöôïc chuyeån ñeán moät duïng cuï taïo ra söùc eùp xuyeân qua mieäng heïp - raát heïp ñeán noãi

caùc teá baøo phaûi xuyeân qua töøng caùi moät taïi moät thôøi ñieåm. Nhôø vaøo vieäc thoaùt khoûi

mieäng, caùc teá baøo sau ñoù chuyeån qua, töøng caùi moät, xuyeân qua moät nguoàn aùnh saùng,

thöôøng laø laser, vaø sau ñoù xuyeân qua moät tröôøng ñieän töø. Caùc teá baøo huyønh quang

tích ñieän aâm, trong khi caùc teá baøo khoâng huyønh quang tích ñieän döông, söï khaùc ñieän

tích cho pheùp caùc teá baøo goác ñöôïc taùch ra khoûi caùc teá baøo khaùc.

Coâng cuï naøy coøn ñöôïc duøng ñeå phaân laäp teá baøo goác döïa vaøo söï khaùc nhau veà ñoä

lôùn teá baøo, hình daïng beà maët, ñoä trong suoát, ñoä ñaäm ñaëc NST, caùc marker beà maët,

marker beân trong cuûa teá baøo …

Hình 1.5: Phöông phaùp phaân loaïi teá baøo coù hoaït tính phaùt huyønh quang FACS

5. ÖÙNG DUÏNG CUÛA TEÁ BAØO GOÁC

Teá baøo ES ñaõ môû ra raát nhieàu öùng duïng. Vaán ñeà ñöôïc xem laø noùng boûng nhaát laø

söû duïng tính ña theá cuûa teá baøo naøy trong lieäu phaùp caáy gheùp – nghóa laø thay theá

hoaëc phuïc hoài moâ ñaõ bò phaù huûy, bò thöông hoaëc beänh taät. Caùc beänh coù theå söû duïng

teá baøo ES ñeå ñieàu trò goàm: Parkinson, tieåu ñöôøng , chaán xöông coät soáng , söï suy

thoaùi teá baøo, loaïn döôõng cô, tim vaø taïo xöông. Tuy nhieân, tuøy theo muïc ñích ñieàu trò

cho moãi loaïi beänh maø teá baøo ES phaûi ñöôïc ñieàu khieån ñeå bieät hoùa thaønh caùc teá baøo

chuyeân bieät tröôùc khi caáy gheùp. Caùc nghieân cöùu naøy ñang ñöôïc tieán haønh, tuy nhieân

soá löôïng phoøng thí nghieäm ES ngöôøi thì raát ít.

Nhö vaäy, vieäc söû duïng teá baøo ES vaãn coøn laø tieàm naêng vaø caàn tính thöïc nghieäm cao.

Thuaän lôïi khaùc cuûa teá baøo ES laø noù coù khaû naêng taêng sinh voâ haïn trong oáng

nghieäm, do vaäy noù coù nhieàu trieån voïng ñeå phaùt trieån thaønh nhieàu daïng teá baøo thoâng

qua söï ñieàu khieån bieät hoùa, sau ñoù ñöôïc caáy gheùp ñeå thay theá hoaëc phuïc hoài caùc cô

quan bò toån thöông. Caùc teá baøo ES thuaän lôïi cho vieäc caáy gheùp neáu chuùng khoâng bò

heä thoáng mieãn dòch cuûa cô theå thaûi loaïi .

Teá baøo goác phoâi ngöôøi coù theå ñöôïc duøng ñeå nghieân cöùu caùc baát thöôøng trong söï

phaùt trieån cuûa phoâi ngöôøi: khuyeát taät baåm sinh, quaùi thai vaø nhaát laø saåy thai… Vieäc

nghieân cöùu teá baøo ES ngöôøi coù theå ñöôïc xaùc ñònh bôûi caùc nguyeân nhaân ôû möùc ñoä

phaân töû vaø möùc ñoä teá baøo.

Teá baøo ES cuõng coù theå ñöôïc duøng ñeå thaêm doø taùc ñoäng cuûa nhieãm saéc theå baát

thöôøng trong söï phaùt trieån cuûa phoâi sôùm. Ñieàu naøy bao goàm khaû naêng kieåm soaùt söï

phaùt trieån cuûa caùc moâ ung thö giai ñoïan sôùm. Teá baøo goác phoâi coøn duøng ñeå kieåm tra

caùc loaïi thuoác trò beänh môùi, saøng loïc caùc ñoäc toá tieàm aån.

Cuoái cuøng teá baøo ES ngöôøi coù theå ñöôïc söû duïng ñeå phaùt trieån caùc phöông phaùp

môùi cho kyõ thuaät di truyeàn nhö taùi toå hôïp töông ñoàng.[5][9]

Hình 1.6 : Chieán löôïc gheùp teá baøo goác

Hình 1.7: Chieán löôïc duøng teá baøo goác trong lieäu phaùp gene. Ñoái vôùi teá baøo maàm ( cuõng laø teá baøo goác ña naêng vaø laø nguoàn goác cho caùc teá baøo

sinh duïc) thì ngoaøi öùng duïng cuûa moät teá baøo goác ña naêng thì teá baøo maàm ñöôïc söû

duïng vaøo nhöõng muïc ñích chuyeân bieät nhö :

 Ñieàu trò beänh voâ sinh baèng caùch nuoâi moâ sinh duïc ñeå thu nhaän teá baøo maàm

vaø cho bieät hoaù thaønh teá baøo sinh duïc hoaøn chænh ñeå coù theå tham gia thuï

tinh.

 Nuoâi caáy bieät hoùa teá baøo maàm coøn coù yù nghóa trong baûo toàn gioáng. Nhöõng

loaøi ñoäng vaät quyù hieám sau khi bò cheát coù theå thu nhaän teá baøo cô quan sinh

duïc ñeå tröõ laïnh. Sau ñoù, nhöõng teá baøo naøy coù theå bieät hoùa vaø cho thuï tinh

 Söû duïng teá baøo maàm sinh duïc laøm moâ hình cho vieäc kieåm nghieäm caùc chaát

ñeå sinh con. Ñieàu naøy coù yù nghóa lôùn neáu con vaät chöa tröôûng thaønh.

gaây voâ sinh.

PHAÀN 2

VAÄT LIEÄU – PHÖÔNG PHAÙP

2.1. VAÄT LIEÄU VAØ HOÙA CHAÁT

2.1.1. Ñoái töôïng nghieân cöùu

Chuoät nhaét traéng (Mus musculus var. Albino) : töø hai ñeán ba thaùng tuoåi, caân naëng

töø 20 – 30g, coù söùc soáng khoûe maïnh, saïch beänh, do Vieän Pasteur TP.HCM cung caáp.

Hình 2.1: Chuoät nuoâi trong chuoàng 2.1.2. Duïng cuï – thieát bò

(chuoät ñöïc vaø caùi ñeàu tröôûng thaønh veà sinh duïc),

2.1.2.1.Duïng cuï

 Chuoàng nuoâi chuoät: Kích thöôùc 30cm x 20cm x 20cm, naép ñaäy baèng löôùi

theùp, coù loùt traáu khoâ, thoaùng, khoâ

 Duïng cuï giaûi phaãu:

- Khay inox

- Taám loùt cao su

- Ghim coá ñònh chuoät

- Keùo thaúng vaø keùo cong

- Keïp thaúng vaø keïp cong

- Becher (200ml,100ml)

 Duïng cuï taùch vaø thu nhaän teá baøo

- OÁng tieâm 1ml, 5ml

- Ñaàu kim tieâm 26G

- Maøng loïc teá baøo Cell Strainer 70μm

- Ñóa Petri nhöïa (ñöôøng kính 35 x10 mm)

- Micropipette (100 – 1000μl, 40 – 200 μl)

- Ñaàu tip (1000 μl, 100 μl)

- Eppendorf 1,5ml

- Buoàng ñeám hoàng caàu

- Bình Roux (25cm2, 75cm2)

- Ñóa nuoâi 24 gieáng

- Lame, lamelle

2.1.2.2.Thieát bò

- Phin loïc voâ truøng 0,22 μm

- Laminar

- Heä thoáng kính vi thao taùc

- Kính hieån vi ñaûo ngöôïc

- Kính hieån vi quang hoïc

- Maùy vi tính

- Maùy ño pH

- Caân phaân tích

- Heä thoáng chuïp aûnh

- Tuû laïnh maùt

- Tuû laïnh – 20oC

- Tuû aám CO2

2.1.3.Hoùa chaát

2.1.3.1.Hoùa chaát kích thích ruïng tröùng vaø thuï tinh

+ PMSG (Prenant Mare’s Serum Gonadotropin 1000 IU)

 Daïng boät

 Baûo quaûn 2 – 7oC, traùnh aùnh saùng.

 Coâng duïng: kích thích nang tröùng phaùt trieån.

 Pha PMSG 100IU/ml: caân moät löôïng PMSG töông ñöông 100IU hoøa vaøo

1ml dung dòch NaCl 0,9%.

 Tieâm vôùi lieàu 0,1ml/ chuoät (töông ñöông vôùi noàng ñoä 10IU/ chuoät)

+ Humagon: 75IU FSH/75IU LH

 Daïng boät.

 Baûo quaûn 25 oC, traùnh aùnh saùng.

 Coâng duïng: kích thích nang tröùng phaùt trieån.

 Pha dung dòch Humagon: caân moät löôïng 75IU hoøa vaøo 0,75 ml dung dòch

NaCl 0,9%.

 Tieâm vôùi lieàu 0,1ml/chuoät (töông ñöông vôùi noàng ñoä 10IU/chuoät).

+ Prenyl: Human Chorionic Gonadotropin 1500IU (Organon, Haø Lan).

 Daïng boät.

 Baûo quaûn: 2 - 15 oC, traùnh aùnh saùng.

 Coâng duïng: kích thích tröùng chín vaø ruïng.

 Pha Prenyl: caân moät löôïng 150IU hoøa vaøo 1,5 ml dung dòch NaCl 0,9%.

 Tieâm vôùi lieàu 0,1ml/ chuoät (töông ñöông vôùi noàng ñoä 10IU/ chuoät).

2.1.3.2. Moâi tröôøng giaûi phaãu

PBS (Phosphate Buffer Saline)

Caân hoãn hôïp muoái nhö sau :

8g NaCl + 0.2g KCl + 0.2g KH2PO4 + 2.285g Na2HPO4.12H2O

Sau ñoù cho nöôùc caát 2 laàn vaøo cho ñuû 1000 ml. Ñem haáp khöû truøng

2.1.3.3. Dung dòch Trypsin/EDTA 0,25%

Caùch pha:

 Caân 0,25g trypsin hoøa vaøo 98ml PBS , boå sung 2ml EDTA 1%.

 Loïc voâ truøng baèng phin loïc 0,22μm.

2.1.3.4. Moâi tröôøng nuoâi phoâi

D’MEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium), boå sung 10% huyeát thanh

thai boø (FBS – Fetal Bovin Serum).

Caùch pha:

 Caân 2g boät D’MEM vaø 0,74g NaHCO3 ,hoøa vaøo 150ml nöôùc caát 2 laàn.

 Chænh pH töø 7,4 ñeán 7,5 baèng dung dòch HCl 1M. Sau ñoù boå sung nöôùc caát

cho ñuû 200ml.

 Boå sung 10% huyeát thanh .

 Loïc baèng phin loïc 0,22μm.

 Giöõ laïnh ôû -4 oC.

2.1.3.5. Hoùa chaát nhuoäm Alkaline phosphatse

 Naphthol AS-BI (Sigma) - C18H15BrNO6P

 Fast Blue BB Salt (Sigma) - 2C17H18ClN3O3 · ZnCl2

Hai dung dòch Fast Blue BB Salt vaø Naphthol AS-BI phosphate phaûi giöõ rieâng

taïi nhieät ñoä – 20 C. Khi söû duïng troän laïi dung dòch treân vaø duøng lieàn, khoâng söû duïng

neáu dung dòch troän quaù 30 phuùt.

2.1.3.6. Dung dòch Collagenase 1 mg/ml

- 100 mg boät Collagenase II (Sigma)

- Dung dòch PBS vöøa ñuû 100 ml

Loïc voâ truøng baèng maøng loïc minipore 0,2 μm (Mini Start). Giöõ laïnh ôû – 4 o C

2.2. PHÖÔNG PHAÙP TIEÁN HAØNH

2.2.1. Phöông phaùp gaây ñoäng duïc chuoät caùi vaø cho thuï tinh töï nhieân

2.2.1.1. OÅn ñònh ñieàu kieän soáng cuûa chuoät

 Chuoät nhaét ñöôïc oån ñònh ñieàu kieän soáng taïi phoøng thí nghieäm sinh lyù ngöôøi

vaø ñoäng vaät khoaûng 3 – 5 ngaøy tröôùc khi gaây ñoäng duïc.

 Chuoät ñöïc vaø chuoät caùi ñöôïc nuoâi rieâng trong chuoàng nhöïa, moãi chuoàng 4

– 5 con.

 Chuoät ñöôïc nuoâi theo chu kyø saùng toái. Thöùc aên cho chuoät goàm: thoùc, caùm

vieân, luùa maàm, nöôùc uoáng laáy töø nguoàn nöôùc uoáng daân duïng.

2.2.1.2. Tieán haønh gaây ñoäng duïc vaø thuï tinh töï nhieân

 Tieâm PMSG hoaëc Humagon cho chuoät caùi taïi xoang buïng vôùi lieàu löôïng

10IU/ con.

 Ñeå chuoät oån ñònh 48 giôø.

 Tieâm HCG cho chuoät taïi xoang buïng vôùi lieàu 10IU/con. Thaû chuoät ñöïc vaøo

chuoàng theo tæ leä 1 ñöïc: 2 caùi.

 Kieåm tra noát nhaày aâm ñaïo.

 Theo doõi quaù trình giao phoái chuoät, sau 4 ngaøy baét chuoät ñöïc ra khoûi

chuoàng.

 9 ngaøy sau khi caùch ly chuoät ñöïc, xaùc ñònh chuoät caùi mang thai ñeå giaûi

phaåu thu phoâi.

2.2.1.3. Phöông phaùp tieâm thuoác

 Baét chuoät baèng caùch naém ñuoâi.

 Duøng ngoùn tay caùi vaø ngoùn troû cuûa tay traùi naém laáy vuøng da gaàn coå vaø

ngoùn tay uùt keïp goác ñuoâi chuoät vaøo loøng baøn tay traùi.

 Tieâm 0,1ml hormone vaøo xoang buïng baèng oáng tieâm 1ml.

 Caùc löu yù khi thöïc hieän thao taùc tieâm thuoác:

 Khoâng ñeå chuoät coù theå quay ñaàu vaø caén vaøo tay ngöôøi chích

 Traùnh tieâm vaøo cô hoaønh hay baøng quang.

 Thuoác sau khi tieâm khoâng bò chaûy ra ngoaøi.

 Choã tieâm khoâng bò chaûy maùu.

 Lôùp da khoâng bò phoàng leân.

 Tröôùc vaø sau khi tieâm phaûi saùt truøng vò trí tieâm.

Hình 2.2: Thao taùc tieâm thuoác

2.2.2. Phöông phaùp thu phoâi:

 Gieát chuoät baèng caùch keùo daõn daây soáng.

 Nhuùng toaøn boä cô theå chuoät vaøo coàn.

 Ñaët chuoät naèm ngöûa vaø saùt truøng baèng coàn 70o.

 Moå buïng chuoät ñeå loä noäi quan.

 Duøng keïp vaø keùo thaùo ruoät ra ngoaøi, ñònh vò 2 nhaùnh töû cung.

 Duøng keïp gaép töû cung leân vaø loaïi boû môû baùm beân ngoaøi töû cung.

 Caét laáy toaøn boä töû cung coù chöùa phoâi cho vaøo ñóa Petri nhöïa coù chöùa saün moâi

tröôøng PBS.

 Chuyeån töû cung chöùa phoâi laàn löôït sang 2 ñóa Petri moâi tröôøng PBS khaùc ñeå

röûa saïch maùu .

 Duøng keïp vaø keùo loaïi boû saïch phaàn môõ coøn laïi dính ngoaøi töû cung.

 Caét doïc töû cung ñeå loä phoâi ra ngoaøi vaø chuyeån caùc phoâi sang moät ñóa Petri

khaùc chöùa PBS. Luùc naøy phoâi vaãn coøn trong noaõn hoaøng.

 Duøng 2 kim 26G ñeå giöõ xeù raùch moät phaàn bao noaõn hoaøng quanh phoâi. Thao

taùc nheï nhaøng vaø caån thaän traùnh ñeå phoâi bò kim ñaâm thuûng.

 Duøng keïp aán maïnh beân phaàn bao noaõn hoaøng khoâng bò raùch ñeå ñaåy phoâi ra

ngoaøi.

 Chuyeån phoâi vöøa thu ñöôïc sang ñóa Petri PBS môùi.

 Söû duïng heä thoáng vi thao taùc, quan saùt vaø caét phoâi laøm ñoâi taïi vò trí naùch chi

tröôùc. Loaïi boû phaàn ñaàu cuûa phoâi, chuyeån phaàn sau cuûa phoâi sang ñóa Petri

PBS khaùc.

Hình 2.3 : Qui trình thu nhaän phoâi chuoät

(a) Chuoät sau khi gieát baèng ete, (b) Vò trí moå chuoät (c) Phoâi chuoät, (d) Chuøm phoâi trong töû cung.

 Chuù yù: Luùc chuyeån phoâi qua caùc moâi tröôøng vì phoâi nhoû neân coù theå duøng

micropipette ñeå huùt chuyeån phoâi qua laïi, caàn thao taùc caån thaän traùnh vôõ phoâi.

2.2.3. Phöông phaùp thu nhaän caàu sinh duïc

 Caét boû töû cung.

 Caét laáy maøng oái cuûa phoâi, taùch phoâi vaø nhau ra.

 Caét rôøi nhau thai vaø phoâi chuoät ra ngoaøi.

 Ñaët phoâi chuoät leân moät lôø giaáy thaám. Duøng keùo caét moät nöûa thaân chuoät taïi

vò trí döôùi caùnh tay.

 Duøng keùo nhoû caét moät ñöôøng doïc theo giöõa buïng vaø taùch heát ruoät vaø gan ra

ngoaøi baèng kim muõi cong.

 Chuyeån phaàn phoâi chuoät coøn laïi vaøo ñóa Petri nhöïa chöùa moâi tröôøng PBS vaø

ñaët maûnh phoâi sao cho löng chuoät naèm xuoáng döôùi.

 Caàu sinh duïc naèm phía döôùi cuûa noäi taïng, baùm vaøo trung thaän (thaän thai –

sau naøy phaùt trieån thaønh thaän). Caû trung thaän vaø caàu sinh duïc ñeàu baùm vaøo

maët trong cuûa löng chuoät.

 Chuyeån caàu sinh duïc qua moâi tröôøng môùi, taùch theå trung thaän ra khoûi caàu

sinh duïc baèng hai muõi kim 1ml döôùi kính luùp hay kính hieån vi ñaûo ngöôïc.

 Röûa caàu sinh duïc trong PBS.

Trong quaù trình tieán haønh ñeå teá baøo thu nhaän ít bò aûnh höôûng söùc soáng, thöôøng

xuyeân nhoû vaøi gioït dung dòch PBS leân treân phoâi.

Hình 2.4: Phoâi chuoät

Hình 2.5 : Phoâi chuoät 12,5 ngaøy sau khi taùch töû cung

Hình 2.6 : Phoâi chuoät ( ) vaø nhau thai ( )

Hình 2.7: Phoâi chuoät sau khi caét nhau thai

Hình 2.8: Vò trí caét phoâi ñeå taùch gan Gan chuoät, Vò trí caét, Dao caét

Hình 2.9: Phoâi sau khi caét phaàn ñaàu

2.2.4. Phöông phaùp taùch vaø nuoâi teá baøo phoâi

 Duøng pipetteman huùt phaàn phoâi taùch ñöôïc cho vaøo eppendorf coù chöùa

0,5ml trypsin – EDTA 0,25%.

 Cho töø 2 – 5 phoâi vaøo eppendorf tuøy theo kích thöôùc phoâi.

 UÛ phoâi ôû nhieät ñoä phoøng vôùi trypsin töø 3 – 5 phuùt tuøy theo kích thöôùc phoâi.

 Huùt boû trypsin, giöõ laïi phaàn phoâi trong eppendorf.

 Cho 0,5ml moâi tröôøng nuoâi D’MEM vaøo eppendorf ñeå röûa phoâi, thöïc hieän

hai laàn.

 Loaïi boû moâi tröôøng röûa, cho 1ml moâi tröôøng nuoâi D’ MEMvaøo eppendorf

vaø huùt suïc ñeå huyeàn phuø teá baøo.

 Xaùc ñònh maät ñoä teá baøo trong dòch huyeàn phuø ôû treân baèng buoàng ñeám hoàng

C =

310 = A x 104

AxDx NxV

caàu ( 25 oâ lôùn ) döôùi kính hieån vi.Ñeám 4 laàn vaø tính giaù trò trung bình:

Trong ñoù: C: laø maät ñoä teá baøo/ 1ml

A: soá teá baøo trong buoàng ñeám

D: Noàng ñoä pha loaõng =1

N: Soá oâ ñeám (400 oâ nhoû)

V: Theå tích 1 oâ nhoû = 1/20 x 1/20 x 1/10 = 1/4000 mm3

 Neáu nhö maät ñoä teá baøo trong buoàng ñeám cao hôn khoaûûng cho pheùp ñeám laø

30 ñeán 300 teá baøo thì phaûi pha loaõng ra ñeå keát quaû ñeám ñöôïc chính xaùc.

 Xaùc ñònh ñoä pha loaõng ñeå coù dòch huyeàn phuø teá baøo ñaït maät ñoä 106 teá baøo

trong 1ml.

 Cho dòch huyeàn phuø sau pha loaõng vaøo bình Roux (1ml dòch huyeàn phuø vaø

5ml moâi tröôøng/bình) vaø ñóa 24gieáng (1ml/gieáng).

 UÛ teá baøo trong tuû aám ôû 37oC, 5% CO2.

 Moãi ngaøy theo doõi söï phaùt trieån cuûa teá baøo döôùi kính hieån vi soi ngöôïc.

2.2.5. Phöông phaùp xaây döïng ñöôøng cong taêng tröôûng cuûa teá baøo

 Ñöôøng cong taêng tröôûng cuûa teá baøo phoâi trong nuoâi caáy ñöôïc xaùc ñònh baèng

caùch theo doõi söï thay ñoåi soá löôïng teá baøo theo thôøi gian sau moãi 24 giôø.

 Cho moät löôïng teá baøo baèng nhau (106 teá baøo/1ml) vaøo caùc gieáng cuûa ñóa 24

gieáng.

 Moãi ngaøy thu teá baøo vaø xaùc ñònh soá teá baøo coù trong moät gieáng.

 Teá baøo ñöôïc thu nhaän nhö sau:

 Huùt boû moâi tröôøng trong gieáng ra, röûa teá baøo vôùi 200μl PBS baèng caùch

traùng nheï vaøi laàn.

 Cho vaøo gieáng 50μl trypsin vaø uû trong 3 phuùt.

 Cho vaøo gieáng 450μl moâi tröôøng vaø huyeàn phuø maïnh ñeå lôùp teá baøo moïc

baùm döôùi ñaùy gieáng bò bong ra, huùt dòch huyeàn phuø teá baøo cho vaøo

eppendorf 1ml, huyeàn phuø teá baøo trong gieáng laàn 2 baèng 500μl moâi tröôøng.

Taát caû dung dòch thu ñöôïc cho vaøo cuøng eppendorf ôû treân, laéc ñeå teá baøo

ñöôïc phaân boá ñeàu trong eppendorf (toång theå tích 1ml).

 Xaùc ñònh maät ñoä teá baøo trong dòch huyeàn phuø treân baèng buoàng ñeám hoàng

caàu.

 Döïng ñoà thò veà söï thay ñoåi cuûa maät ñoä teá baøo theo thôøi gian.

 Xöû lyù soá lieäu thoáng keâ baèng phaàn meàm MSTATC.

* Löu yù: Thay moâi tröôøng trong caùc gieáng teá baøo sau moãi 48 giôø.

2.2.6. Phöông phaùp caáy chuyeàn teá baøo

 Huùt heát moâi tröôøng nuoâi caáy trong bình Roux.

 Cho 3 ml PBS môùi vaøo bình Roux.

 Laéc nheï ñeå röûa saïch teá baøo cheát vaø moâi tröôøng cuõ, sau ñoù loaïi boû PBS, laäp

laïi 2 – 3 laàn.

 Cho vaøo bình Roux 2ml trypsin/ EDTA , uû trong 3 phuùt.

 Huùt heát trypsin/EDTA.

 Caàm bình Roux voã nheï vaøo loøng baøn tay ñeå teá baøo bò bong ra khoûi ñaùy

bình.

 Cho vaøo bình Roux 1ml moâi tröôøng D’MEM, huyeàn phuø teá baøo baèng

pipette 1ml ñeán khi thu dòch teá baøo ñoàng nhaát.

 Xaùc ñònh maät ñoä teá baèng buoàng ñeám hoàng caàu.

 Caáy dòch huyeàn phuø teá baøo vaøo bình Roux moâi tröôøng D’MEM sao cho maät

ñoä teá baøo cuoái cuøng laø106 teá baøo/1ml.

 UÛ ôû tuû aám 37oC, 5%CO2.

2.2.7. Quy trình thu nhaän hoãn hôïp teá baøo chöùa teá baøo maàm (Germ Cell) töø

caàu sinh duïc

Trong phoâi chuoät, caùc teá baøo maàm sinh duïc lieân keát loûng leûo vôùi caùc teá baøo

khaùc nôi maø chuùng soáng, do vaäy ñeå taùch caùc teá baøo GC ngöôøi ta thöôøng khoâng duøng

enzym maëc duø xöû lyù baèng enzym seõ thu ñöôïc löôïng toái ña caùc teá baøo maàm sinh duïc,

song haïn cheá cuûa vieäc xöû lyù baèng enzym laø beà maët cuûa teá baøo coù theå bò aûnh höôûng.

Enzym thöôøng ñöôïc söû duïng laø collagenase vì khi hoaït ñoäng phaân caét caùc lieân

keát peptid chuùng ít laøm hö haïi teá baøo.

Quy trình tieán haønh :

 Caàu sinh duïc sau khi thu nhaän ñöôïc röûa baèng dung dòch PBS.

 Chuyeån 2 caàu sinh duïc vaøo ñóa petri chöùa dung dòch 0,5 ml collagenase II

coù noàng ñoä 1 mg/ml.

 UÛ caàu sinh duïc trong dung dòch collagenase trong 10 phuùt, ôû nhieät ñoä

phoøng.

 Boå sung vaøo ñóa petri 0,5 ml moâi tröôøng D’MEM 10% FBS ñeå ngöng phaûn

öùng.

 Duøng 2 muõi kim nhoïn taùch, xeù caàu sinh duïc ra thaønh nhieàu maûnh nhoû ñeå

cho caùc teá baøo maàm beân trong giaûi phoùng ra ngoaøi.

 Loïc thu nhaän teá baøo ñôn baèng cell strainer 70 μm.

 Cho caùc teá baøo ñôn thu ñöôïc vaøo trong eppendorf 1,5 ml, ly taâm thu caën.

 Huyeàn phuø laïi teá baøo trong 1 ml moâi tröôøng D’MEM coù boå sung 10% FBS.

2.2.8. Phöông phaùp nhuoäm teá baøo maàm sinh duïc baèng phaûn öùng APase

 Nhoû 50 μl huyeàn phuø teá baøo maàm thu nhaän ñöôïc leân taám lam saïch.

 Duøng moät taám lam khaùc daøn ñeàu gioït huyeàn phuø treân lam.

 Ñeå taám lam khoâ töï nhieân hoaøn toaøn.

 Ñaët nhöõng taám lam trong dung dòch coá ñònh aceton trong 20 – 30 giaây.

 Röûa taám lam döôùi voøi nöôùc trong 10 -20 giaây vaø ñeå khoâ.

 Nhuoäm alkaline phosphatase trong 15 phuùt.

 Kieåm tra döôùi kính hieån vi, ñeán khi maøu nhuoäm ñaäm röûa baèng nöôùc caát.

2.2.9. Phöông phaùp tinh saïch

Thaønh phaàn taïp nhieãm aûnh höôûng xaáu ñeán teá baøo maàm thu nhaän baèng phöông

phaùp treân chuû yeáu laø caùc teá baøo sinh döôõng. Trong nuoâi caáy, caùc teá baøo sinh döôõng

baùm raát toát treân beà maët nuoâi caáy nhö bình Roux, ñóa nuoâi… sau khoaûng 12 – 24 giôø

nuoâi caáy, trong khi ñoù moät soá teá baøo sinh döôõng khaùc thì chæ caàn sau 2 – 4 giôø nhö

caùc teá baøo fibroblast.

Trong khi ñoù, teá baøo maàm khoâng coù tính chaát naøy. Caùc teá baøo maàm khoâng theå

baùm vaøo ñóa nhöïa, ñóa thuûy tinh vaø agar. Söï khaùc bieät giöõa hai loaïi teá baøo: teá baøo

sinh döôõng vaø teá baøo maàm giuùp chuùng ta deã daøng choïn loïc, thu nhaän vaø tinh saïch

caùc teá baøo maàm sau khi taùch ra khoûi caàu sinh duïc baèng phöông phaùp nuoâi caáy.[ 15]

Quy trình tieán haønh :

 Huyeàn phuø teá baøo sau khi thu nhaän ñöôïc ôû treân cho vaøo bình Roux 25 cm3.

 Boå sung vaøo bình Roux 3 ml moâi tröôøng D’MEM 10% FBS.

 Nuoâi ôû ñieàu kieän 32 o C, 5% CO2.

 Sau 24 giôø, thu nhaän toaøn boä dòch noåi cho vaøo bình Roux môùi.

 Quan saùt.

48 giôø

Tieâm PMSG cho chuoät caùi

Tieâm Prenyl ( HCG )

4 ngaøy

Thaû chuoät ñöïc vaøo

9 ngaøy

Baét chuoät ñöïc ra rieâng

Giaûi phaãu chuoät caùi coù mang thai Thu phoâi

Taùch phoâi

Soá löôïng teá baøo daøy ñaëc ( khoaûng 48 giôø )

Xaùc ñònh ñöôøng cong taêng tröôûng

Caáy chuyeàn

Ñeám soá löôïng teá baøo Thay moâi tröôøng qua caùc ngaøy nuoâi

Sô ñoà 2.1 : Toùm taét toaøn boä quy trình thuï tinh,

thu nhaän vaø nuoâi caáy teá baøo phoâi chuoät

Tieâm PMSG cho chuoät caùi

48 giôø

Tieâm Prenyl ( HCG )

Thaû chuoät ñöïc vaøo

4 ngaøy

Baét chuoät ñöïc ra rieâng

9 ngaøy

Giaûi phaãu chuoät caùi coù mang thai Thu nhaän phoâi 12,5 dpc Thu nhaän caàu sinh duïc Thu nhaän teá baøo maàm sinh duïc Xaùc ñònh teá baøo maàm Tinh saïch

Sô ñoà 2.2 : Toùm taét toaøn boä quy trình thuï tinh,

thu nhaän vaø tinh saïch teá baøo maàm sinh duïc

PHAÀN 3

KEÁT QUAÛ – BIEÄN LUAÄN

3.1. TÆ LEÄ MANG THAI QUA THUÏ TINH TÖÏ NHIEÂN

Chuoät ñöïc gaây ñoäng duïc nhaân taïo, giao phoái töï nhieân (muïc 2.1.1).Keát quaû

trình baøy ôû baûng 3.1 vaø bieåu ñoà 3.1.

Baûng 3.1: Tæ leä chuoät mang thai qua giao phoái töï nhieân

Loâ thí Soá chuoät cho Soá chuoät Tæ leä chuoät coù

nghieäm giao phoái (con) mang thai (con) mang thai(%)

1 6 4 66,7

2 4 3 75,0

3 4 2 50,0

4 3 3 100,0

5 5 4 80,0

6 5 3 60,0

7 3 3 100,0

8 4 3 75,0

9 4 4 100,0

10 5 4 80,0

11 4 3 75,0

12 5 2 40,0

13 6 4 66,7

14 4 2 50,0

15 3 3 100

16 5 4 80

17 6 4 66,7

72,4 Toång 76 55

Soá chuoät

Loâ thí nghieäm

Chuoät giao phoái Chuoät mang thai Bieåu ñoà 3.1: Tyû leä chuoät mang thai qua giao phoái töï nhieân

Nhaän xeùt:

 Tæ leä chuoät mang thai baèng thuï tinh töï nhieân khaù cao, tæ leä trung bình laø 72,4

%. Keát quaû ñaït ñöôïc do ñieàu kieän vaø moâi tröôøng nuoâi oån ñònh, dinh döôõng

phuø hôïp, tæ leä phoái giöõa chuoät ñöïc vaø chuoät caùi thích hôïp.

 Caùc tröôøng hôïp chuoät khoâng mang thai laø do:

o Theå traïng chuoät khoâng toát.

o Quaù trình giao phoái töï nhieân khoâng ñaûm baûo.

o Chaát löôïng tinh truøng cuûa chuoät ñöïc khoâng toát.

o Thao taùc tieâm thuoác chöa hoaøn thieän aûnh höôûng ñeán khaû naêng giao

phoái cuûa chuoät.

3.2. SOÁ LÖÔÏNG PHOÂI THU ÑÖÔÏC

Giaûi phaãu chuoät vaø thu nhaän phoâi (2.2.2) . Keát quaû ñöôïc trình baøy ôû baûng 3.2.

Baûng 3.2: Soá löôïng phoâi thu ñöôïc

Loâ thí Soá chuoät Soá chuoät coù phoâi ñuùng giai Soá phoâi thu ñöôïc

nghieäm giaûi phaãu (con) ñoaïn caàn khaûo saùt (con) (phoâi)

1 6 4 1

1 6 3 2

1 5 2 3

1 7 3 4

3 18 4 5

1 5 3 6

2 10 3 7

1 9 3 8

3 15 4 9

3 13 4 10

2 8 3 11

1 7 2 12

3 14 4 13

1 6 2 14

2 10 3 15

2 9 4 16

1 7 4 17

Toång coäng 55 29 155

Nhaän xeùt:

 Soá phoâi thu ñöôïc ñuùng khoaûng thôøi gian quy ñònh trong quy trình. Do chu kyø

ñoäng duïc, mang thai cuûa chuoät khoâng oån ñònh vaø khoâng theå kieåm soaùt moät

caùch chính xaùc neân phaûi loaïi boû nhieàu phoâi non vaø giaø hôn thôøi gian caàn.

 Soá löôïng phoâi thu ñöôïc khoâng tæ leä vôùi soá chuoät giaûi phaãu. Coù moät soá tröôøng

hôïp soá löôïng phoâi thu ít hôn bình thöôøng do quaù trình mang thai cuûa chuoät

khoâng oån ñònh vaø thuoác kích duïc taùc duïng yeáu leân quaù trình ñoäng duïc.

 Ngoaøi ra, caùc phoâi coù caùc hieän töôïng khoâng bình thöôøng nhö coù maøu khaùc,

kích thöôùc khaùc so vôùi caùc phoâi coøn laïi ñeàu bò boû.

3.3 . TÖÔNG QUAN GIÖÕA SOÁ PHOÂI XÖÛ LÍ VAØ MAÄT ÑOÄ TEÁ BAØO BAN ÑAÀU

Sau khi thu nhaän phoâi, tieán haønh taùch caùc teá baøo phoâi vaø taïo dòch huyeàn phuø

(2.2.3.). Keát quaû ñöôïc trình baøy ôû baûng 3.3 vaø ñoà thò 3.1

Baûng 3.3: Maät ñoä teá baøo ban ñaàu.

Loâ thí Soá phoâi xöû lyù Maät ñoä teá baøo ban ñaàu

nghieäm (phoâi) (A x 104 teá baøo/1 ml)

1 6 325

2 6 212

3 5 784

4 7 1030

5 18 3200

6 5 274

7 10 2510

8 9 330

9 15 570

9 15 570

10 13 1500

11 8 487

12 7 355

13 14 2765

14 6 213

15 10 644

16 9 1387

17 7 563

Toång 155

Nhaän xeùt :

 Soá phoâi xöû lyù vaø maät ñoä teá baøo ban ñaàu coù moái quan heä töông quan vôùi nhau

neân maät ñoä teá baøo ban ñaàu seõ phuï thuoät vaøo soá löôïng phoâi thu ñöôïc .

 Do phoâi ñöôïc thu nhaän trong giai ñoaïn khaù roäng ( töø 9 ñeán 13 ngaøy ) neân kích

thöôùc cuûa phoâi raát khaùc nhau, ñieàu naøy daãn ñeán söï taêng maät ñoä teá baøo ban

ñaàu cuûa moät soá loâ thí nghieäm do kích thöôùc phoâi lôùn. ÔÛ caùc loâ 1, 2, 6, 8, 12 vaø

14 do kích thöôùc phoâi nhoû neân maät ñoä teá baøo khoâng cao .

3.4. KHAÛO SAÙT ÑÖÔØNG CONG TAÊNG TRÖÔÛNG

Ñeå xaây döïng ñöôøng cong taêng tröôûng cuûa phoâi chuoät trong ñieàu kieän in-vitro,

choïn nhöõng loâ ñaït yeâu caàu veà maät ñoä teá baøo ñeå khaûo saùt.Theo phöông phaùp neâu ôû

muïc 2.2.5, keát quaû trình baøy ôû baûng 3.4, ñoà thò 3.2 vaø 3.3.

Baûng 3.4: Maät ñoä teá baøo ñeám ñöôïc ôû caùc thí nghieäm.

Thí nghieäm Thí nghieäm Thí nghieäm Thí nghieäm Maät ñoä teá baøo

1 2 3 4 trung bình

(A x 104 teá Maät ñoä teá Maät ñoä teá Maät ñoä teá Ngaøy Maät ñoä teá

baøo/1 ml) baøo (A x 104 baøo (A x 104 baøo (A x 104 baøo (A x 104

teá baøo/1 ml) teá baøo/1 ml) teá baøo/1 ml) teá baøo/1 ml)

100 100 100 100 100 ± 0,00 0

(D)

142 96 132 144 128,5 ± 22,3 1

(CD)

121 89 111 113 108,5 ± 13,7 2

(D)

170 149 182 194 173,75 ± 19,2 3

(BC)

194 170 195 243 200,5 ± 30,6 4

(AB)

236 218 219 276 237,25 2± 7,1 5

(A)

191 163 186 245 196,25 ± 30,8 6

(B)

Ghi chuù:Nhöõng giaù trò trung bình coù cuøng moät chöõ caùi theo sau thì khoâng khaùc

bieätcoù yù nghóa ôû möùc xaùc suaát p = 0,05

Nhaän xeùt:

 Teá baøo phoâi chuoät coù khaû naêng thích nghi vaø taêng sinh trong ñieàu kieän nuoâi

caáy in vitro vôùi moâi tröôøng D’MEM 10% FBS.

 Trong ngaøy thöù nhaát soá löôïng teá baøo phoâi taêng chaäm sau ñoù giaûm vì luùc naøy

teá baøo caàn thôøi gian ñeå thích nghi vôùi moâi tröôøng nuoâi caáy in vitro.

 Sau 2 ngaøy nuoâi caáy trôû ñi thì soá löôïng teá baøo taêng leân khaù nhanh, maät ñoä cao

nhaát vaøo ngaøy thöù 5 sau nuoâi caáy do luùc naøy teá baøo ñaõ thích nghi vôùi ñieàu

kieän nuoâi caáy in vitro neân tieán haønh hoaït ñoäng phaân chia maïnh.

 Sau 5 ngaøy nuoâi caáy maät ñoä teá baøo phoâi baét ñaàu giaûm daàn do moät soá teá baøo

ñaõ coù söï phaân hoùa chöùc naêng vaø giaûm daàn khaû naêng phaân chia neân seõ cheát ñi

sau moät thôøi gian. Ñieàu naøy ñöôïc giaûi thích do trong moâi tröôøng nuoâi caáy

khoâng boå sung nhaân toá öùc cheá leukemia (nhaân toá öùc cheá bieät hoaù) neân khoâng

theå duy trì traïng thaùi chöa bieät hoaù cuûa caùc teá baøo goác (Smith vaø Hooper,

1987).

 Coù theå aùp duïng quy trình nuoâi caáy naøy ñeå thu nhaän caùc teá baøo fibroblast töø

phoâi chuoät ñeå taïo lôùp feeder nuoâi caáy teá baøo maàm.

 Caùc hình aûnh teá baøo nuoâi trong gieáng (chuïp ôû ñoä phoùng ñaïi 200 laàn)

Hình 3.1: Teá baøo tröôùc khi nuoâi trong gieáng

Hình 3.2: Teá baøo phoâi sau khi nuoâi trong gieáng 1 ngaøy

Hình 3.3: Teá baøo phoâi sau khi nuoâi trong gieáng 2 ngaøy

Hình 3.4: Teá baøo phoâi sau khi nuoâi trong gieáng 3 ngaøy

Hình 3.5: Teá baøo phoâi sau khi nuoâi trong gieáng 4 ngaøy

Hình 3.6: Teá baøo phoâi sau khi nuoâi trong gieáng 5 ngaøy

Hình 3.7: Teá baøo phoâi sau khi nuoâi trong gieáng 6 ngaøy

3.5. KEÁT QUAÛ TAÙCH, THU NHAÄN VAØ TINH SAÏCH TEÁ BAØO MAÀM

3.5.1. Thu nhaän caàu sinh duïc

Tieán haønh giaûi phaãu chuoät mang thai, thu phoâi vaø thu nhaän caàu sinh duïc. Theo

höông phaùp ôû muïc 2.2.3, chuùng toâi thu ñöôïc keát quaû ñöôïc trình baøy ôû baûng 3.5 p

Baûng 3.5 : Soá löôïng caàu sinh duïc thu ñöôïc qua caùc ñôït thí nghieäm

Ñôït Soá chuoät Soá phoâi Soá caàu sinh duïc Tyû leä (%)

1 2 3 4 5 6 7 8 Toång 2 3 1 3 2 2 1 1 15 11 18 4 20 13 13 6 8 93 16 25 7 40 24 26 12 16 166 72.7 69.4 87.5 100 92.3 100 100 100 90.2

Hình 3.8: Caàu sinh duïc vaø trung thaän

Caàu sinh duïc ( ) vaø trung thaän ( )

Nhaän xeùt :

Theo lyù thuyeát thì ôû moãi phoâi seõ thu nhaän ñöôïc 2 caàu sinh duïc ôû hai beân, tuy

hieân treân thöïc teá toång soá löôïng caàu sinh duïc thu ñöôïc ít hôn, chæ ñaït 90.2% Ñieàu n

aøy ñöôïc giaûi thích do quaù trình thu nhaän khaù khoù khaên vaø thao taùc chöa hoaøn thieän n

o vaäy treân moät phoâi coù theå thu ñöôïc 1, 2 hay khoâng coù caàu sinh duïc naøo. d

3.5.2 Thu nhaän hoãn hôïp teá baøo töø caàu sinh duïc

Tieán haønh caùc thao taùc theo muïc 2.2.7 ôû phaàn phöông phaùp, chuùng toâi thu ñöôïc

oät hoãn hôïp teá baøo töø caàu sinh duïc ñöôïc phaân caét ra. m

uyeàn phuø teá baøo. Caàu sinh duïc sau khi ñöôïc xöû lí vôùi collagenase vaø taïo moät h

rong dòch huyeàn phuø naøy laø moät hoãn hôïp teá baøo bao goàm caùc loaïi teá baøo nhö teá T

aøo maàm, teá baøo sinh döôõng vaø teá baøo hoàng caàu. Hoãn hôïp teá baøo naøy tieáp tuïc ñem b

uoâi caáy, xaùc ñònh, thu nhaän vaø tinh saïch. n

Hình 3.9:Hoãn hôïp teá baøo thu nhaän töø caàu sinh duïc

3.5.3. Nhaän dieän teá baøo maàm

Theo phöông phaùp ôû muïc 2.2.8, chuùng toâi thu ñöôïc hình aûnh sau:

ình 3.10: Teá baøo maàm khi nhuoäm Alkaline phosphatase

H Nhaän xeùt

Caùc teá baøo döông tính vôùi Aka line Phosphatase coù maøu xanh. Caùc teá baøo

döông tính naøy la ø caùc teá baøo maàm. Nhö ñaõ trình baøy ôû phaàn toång quan, caùc teá baøo

döông tính vôùi Akaline Phosphatase khoâng chæ laø nhöõng teá baøo maàm maø coøn ôû

nhöõng teá baøo goác, teá baøo khoái u vaø nhöõng teá baøo khaùc nhöng trong tröôøng hôïp naøy

caùc teá baøo döông tính treân ñaây laø caùc teá baøo maàm. Ñieàu naøy ñöôïc giaûi thích bôûi

nhöõng lí do sau:

 Caùc teá baøo thu nhaän töø caàu sinh duïc khoâng theå laø nhöõng teá baøo goác phoâi

hay teá baøo khoái u vaø nhöõng teá baøo khaùc nhö gan, ruoät…

 Trong caàu sinh duïc chæ toàn taïi nhöõng teá baøo sinh döôõng, teá baøo maùu vaø

nhöõng teá baøo maàm. Nhöõng teá baøo si nh döôõng vaø teá baøo maùu khoâng döông

kaline Phosphatase vì enzym naøy toàn taïi vôùi haøm löôïng ít. tính vôùi Al

Nhö vaäy töø hình aûnh treân ta thaáy raèng coù söï hieän dieän cuûa teá baøo maàm trong caàu

s inh duïc ôû giai ñoaïn phoâi 12.5 ngaøy.

3.5.4. Tinh saïch teá baøo maàm

Nhö ñaõ ñeà caäp ôû muïc 2.2.9 trong phaàn phöông phaùp thì caùc teá baøo sinh döôõng

s au khi laéng seõ baùm toát vaøo caùc giaù theå plastic, thuûy tinh hay agar trong nuoâi caáy.

T rong khi ñoù, teá baøo maàm khoâng coù ñaëc tính naøy.

ïi caùc Ñieàu naøy ñöôïc gi aûi thích laø vì treân beà maët caùc teá baøo maàm khoâng toàn ta

protein baùm nhö treân beà maët teá baøo sinh döôõng. Do vaäy, coù theå tinh saïch teá baøo

maàm ra khoûi teá ba nhieãm quan troïng th øo sinh döôõng (ñaây laø aønh phaàn teá baøo taïp

nhaát) baèng phöông phaùp nuoâi caáy.

Tieán haønh theo caáy chöøng 24 giôø, phöông phaùp ôû muïc 2.2.9 thì sau khi nuoâi

chuùng toâi ñaõ thu ñöôïc nhöõng t eá baøo maàm töông ñoái saïch.

Hình 3.11: Teá baøo maàm sau khi tinh saïch (Ñoä phoùng ñaïi 200 laàn)

Hình 3.12: Teá baøo maàm sau khi tinh saïch (Ñoä phoùng ñaïi 400)

Nhaän xeùt

Quaàn theå teá baøo maàm sau khi thu nhaän maëc duø ñaõ thöïc hieän tinh saïch, song vaãn

toàn taïi moät soá ít teá baøo hoàng caàu – teá baøo noåi vaø khoâng baùm ñöôïc vaøo ñóa nuoâi coøn

– vaø keå caû nhöõng teá baøo cheát. Do vaäy quaàn theå teá baøo maàm thu nhaän ñöôïc khoâng

ñaït ñöôïc ñoä tinh saïch 100%.

Tuy nhieân do khoâng coù khaû naêng soáng neân sau vaøi laàn nuoâi caáy (nuoâi caáy quaàn

theå teá baøo maàm thu ñöôïc sau khi tinh saïch treân lôùp feeder) caùc teá baøo hoàng caàu vaø

teá baøo cheát ñöôïc loaïi boû ra khoûi moâi tröôøng nuoâi caáy. Ñieàu naøy ñöôïc giaûi thích laø vì

teá baøo maàm khoâng theå soáng trong moät thôøi gian daøi maø khoâng coù lôùp feeder ñeå baùm

vaøo, neân khi nuoâi caáy thì teá baøo maàm baùm ø teá vaøo lôùp feeder coøn teá baøo hoàng caàu va

baøo cheát seõ ñöôïc loaïi khoûi moâi tröôøng nuoâi caáy sau vaøi laàn thay moâi tröôøng.

Hôn nöõa treân thöïc teá cuõng khoâng caàn ñaùnh giaù möùc ñoä nhieãm teá baøo hoàng caàu vaø

teá baøo cheát, bôûi leõ chuùng khoâng aûnh höôûng lôùn ñeán vieäc nuoâi caáy veà sau naøy vaø seõ

bò loaïi boû sau vaøi laàn thay moâi tröôøng nuoâi caáy.

3.6. KEÁT QUAÛ PHAÙT HIEÄN CAÙC TEÁ BAØO CO BOÙP

 Trong quaù trình nuoâi caáy ñaõ phaùt hieän vaø ghi nhaän ñöôïc nhöõng hình aûnh hoaït

ûa caùc teá baøo ñoäng cu cô coù khaû naêng co boùp trong moâi tröôøng vaø theo doõi hoaït

ûa caùc teá baøo ñoäng cu naøy trong voøng 14 ngaøy.

 Keát quaû ñöôïc trình baøy ôû baûng 3.5 vaø ñoà thò 3.4.

Thôøi gian Soá löôïng quan saùt

(ngaøy) (10 gieáng)

3 Sau 1 ngaøy

8 Sau 2 ngaøy

14 Sau 3 ngaøy

14 Sau 4 ngaøy

15 Sau 5 ngaøy

12 Sau 6 ngaøy

10 Sau 7 ngaøy

7 Sau 8 ngaøy

6 Sau 9 ngaøy

6 Sau 10 ngaøy

4 Sau 11 ngaøy

3 Sau 12 ngaøy

2 Sau 13 ngaøy

0 Sau 14 ngaøy

Baûng 3.5: Soá löôïng caùc teá baøo vaø cuïm teá baøo co boùp trong moâi tröôøng nuoâi caáy.

16

14

12

ù

10

8

p o b o c b t

á

6

o S

4

2

0

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10 11 12 13 14 15

Ngaøy

Ñoà thò 3.4: Soá löôïng caùc teá baøo vaø cuïm teá baøo co boùp trong moâi tröôøng nuoâi caáy

Nhaän xeùt:

 Khi taïo huyeàn phuø teá baøo, khoâng thaáy xuaát hieän caùc teá baøo coù khaû naêng töï co

boùp.

 Sau 24 giôø nuoâi caáy, baét ñaàu xuaát hieän caùc teá baøo vaø cuïm teá baøo coù khaû naêng

töï co boùp theo nhòp. Caùc teá baøo naøy ñöôïc ghi nhaän laø caùc teá baøo cô, coù theå

chuùng laø caùc teá baøo cô tim ñöôïc bieät hoùa trong quaù trình phaùt trieån cuûa phoâi.

 Caùc teá baøo vaø cuïm teá baøo coù taêng nhanh trong voøng 4 ngaøy nuoâi caáy, nhieàu

cuïm teá baøo môùi ñaõ ñöôïc phaùt hieän töï co boùp trong gieáng nuoâi. Trong khi caùc

cuïm teá baøo ñaõ ñöôïc phaùt hieän töø tröôùc vaãn giöõ ñöôïc hoaït ñoäng cuûa chuùng.

 Soá löôïng teá baøo coù khaû naêng töï co boùp khoâng ñoåi vaøo caùc ngaøy tieáp theo.

Ñieàu naøy coù theå ñöôïc giaûi thích do soá löôïng caùc teá baøo ñaõ ñöôïc bieät hoùa

thaønh caùc teá baøo coù khaû naêng ñaäp ñaõ bieåu hieän heát.

 Baét ñaàu töø ngaøy thöù 7 trôû ñi, caùc teá baøo naøy giaûm daàn veà soá löôïng. Coù theå caùc

teá baøo naøy ñaõ ñi vaøo chu trình töï dieät vì khoâng theå coù khaû naêng taäp hôïp laïi

thaønh moâ trong ñieàu kieän nuoâi caáy in-vitro. Caùc teá baøo giaûm maïnh ôû caùc ngaøy

tieáp theo vaø soá ngaøy quan saùt ñöôïc caùc teá baøo naøy laø 14 ngaøy sau khi nuoâi

caáy.

 Nhöõng teá baøo quan saùt ôû daïng moâ hoaëc cuïm teá baøo coù khaû naêng toàn taïi laâu

hôn caùc teá baøo rieâng leû, vaø do söï taäp hôïp laïi cuûa cuøng moät loaïi teá baøo neân

khaû naêng co boùp cuûa chuùng maïnh hôn nhieàu.

Ñeå xaùc ñònh caùc teá baøo coù khaû naêng co boùp nhòp nhaøng naøy laø teá baøo cô tim, chuùng

oâi tieán haønh taùch teá baøo t töø caùc phoâi lôùn hôn ñaõ hình thaønh vuøng tim. Döôùi kính vi

thao taùc phoâi ñöôïc taùch thaønh 2 vuøng: vuøng coù tim vaø vuøng khoâng coù tim. Teá baøo töø

hai vuøng naøy ñöôïc taùch rôøi baèng trypsin vaø nuoâi caáy theo phöông phaùp ñaõ neâu muïc

2.2.3. Keát quaû cho thaáy:

- Nhöõng teá baøo co ñaäp chæ xuaát hieän ôû loâ teá baøo ñöôïc taùch töø vuøng phoâi coù tim

- Hình daïng, kích thöôùc vaø kieåu co boùp cuûa nhöõng teá baøo naøy hoaøn toaøn gioáng

teá baøo co boùp phaân laäp töø daõi maàm cuûa phoâi.

- Caùc cuïm teá baøo co boùp coù theå soáng vaø hoaït ñoäng hôn 30 ngaøy trong moâi

tröôøng nuoâi caáy.

N hö vaäy coù theå keát luaän raèng trong quaàn theå teá baøo phaân laäp töø daõi maàm phoâi chuoät

c où hieän dieän caùc teá baøo goác cô tim, trong quaù trình nuoâi caáy caùc teá baøo goác naøy ñaõ

bieät hoaù thaønh teá baøo cô tim coù khaû naêng co boùp.

h Hình 3.13: Hình aûn caùc teá baøo vaø cuïm teá baøo cô tim

PHAÀN 4

KEÁT LUAÄN - ÑEÀ NGHÒ

4 .1 .KEÁT LUAÄN

Ñeà taøi ñaõ ñaït ñöôïc keát quaû sau:

 Thaønh coâng trong vieäc gaây ñoäng duïc nhaân taïo vaø tieán haønh cho thuï tinh töï

nhieân ôû chuoät nhaét traéng (Mus musculus Var . Albino).

 Xaây döïng quy trình phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo phoâi chuoät nhaét tra éng,

khaûo saùt khaû naêng taêng sinh cuûa teá baøo phoâi trong ñieàu kieän in vitro vôùi

moâi tröôøng D’MEM 10% FBS.

 Nhaän dieän ñöôïc söï hieän dieän cuûa teá baøo maàm trong quaàn theå teá baøo thu töø

caàu sinh duïc baèng phöông phaùp nhuoäm Enzym Alkaline phosphatase.

 Taùch, tinh saïc h vaø thu nhaän ñöôïc quaàn theå teá baøo maàm khaù tinh saïch.

 Khaûo saùt söï bieät hoùa cuûa teá baøo phoâi thaønh teá ba øo cô coù khaû naêng co boùp

trong thôøi gian 14 ngaøy.

nhieân vieäc tinh saïch teá baøo maàm baèng phöông phaùp nuoâi caáy coù theå loaïi boû Tuy

ôïc nhöõng teá baøo sinh döôõng nhieãm vaøo nhöng khoâng loaïi boû heát caùc teá baøo hoàng ñö

àu vaø caùc teá baøo cheát. ca

Döïa treân keát quaû ñaït ñöôïc , keát luaän cuûa ñeà taøi nhö sau:

 Teá baøo phoâi chuoät coù khaû naêng thích nghi vaø taêng sinh trong ñieàu kieän

nuoâi caáy in vitro vôùi moâi tröôøng D’MEM 10% FBS, d o vaäy coù theå söû duïng

quy trình nuoâi caáy naøy trong vieäc thu nhaän caùc teá baøo fibroblast ñeå taïo lô ùp

feeder vaø tieán haønh nuoâi caáy teá baøo maàm thu nhaän ôû treân cuõng nhö khaûo

saùt söï phaùt trieån cuûa chuùng.

 Phöông p haùp nhuoäm Enzym APase coù theå ñöôïc söû duïng ñeå nhaän dieän teá

baøo maàm trong quaàn theå teá baøo taùch töø caàu sinh duïc.

 Coù theå öùng duïng quy trình treân ñeå thu nhaän teá baøo maàm khaù tinh saïch töø

caàu sinh duïc ôû phoâi 12.5 dp c.

4 .2. ÑEÀ NGHÒ

 Thöû nghieäm vaø thieát laäp caùc phöông phaùp tinh saïch khaùc ñeå coù theå loaïi boû

teá baøo hoàng caàu vaø teá baøo maùu, töø ñoù thu nhaän tröïc tieáp quaàn theå teá baøo

maàm khoâng coøn taïp nhieãm.

 Boå sung vaø hoaøn thieän moâi tröôøng nuoâi baèng nhaân toá öùc cheá bieät hoaù LIF

( Leukemia Inhibitory Factor ) ñeå tieán haønh nuoâi caáy teá baøo maàm thu ñöôïc

treân lôùp feeder töø fibroblast vaø khaûo saùt söï taêng sinh cuûa chuùng.

 Tieán haønh thu nhaän teá baøo maàm töø caàu sinh duïc ôû caùc giai ñoaïn phoâi khaùc :

phoâi 8 dpc, phoâi 10 dpc , phoâi 14 dpc vaø khaûo saùt soá löôïng cuûa teá baøo maàm

ôû nhöõng giai ñoaïn phoâi khaùc nhau.

 Hoaøn thieän caùc thao taùc vaø xaây döïng caùc phöông phaùp thích hôïp cuøng vôùi

vieäc trang bò caùc thieát bò tieân tieán ñeå coù theå thu nhaän teá baøo goác phoâi ES.

TAØI LIEÄU THAM KHAÛO

Taøi lieäu Tieáng Vieät

[1] Hoaøng Traâm Anh, Löông Queá Anh, Cao Quoác Lieân, Stem Cell, Seminar Coâng

Ngheä Sinh Hoïc Ñoäng Vaät, ÑHQG Tp.HCM, Tröôøng Ñaïi Hoïc Khoa Hoïc Töï Nhieân,

Khoa Sinh, boä moân Coâng Ngheä Sinh Hoïc, Tp.HCM, 2003.

[2] Nguyeãn Thò Thanh Hieàn, Giang Hoa, Nguyeãn Giang Sôn, Traàn Ñaëng Hieàn Thaûo,

Stem Cell, Seminar Coâng Ngheä Sinh Hoïc Ñoäng Vaät, ÑHQG Tp.HCM, Tröôøng Ñaïi

Hoïc Khoa Hoïc Töï Nhieân, Khoa Sinh, boä moân Coâng Ngheä Sinh Hoïc, T p.HCM, 2003.

[3] Nguyeãn Thò Thöông Huyeàn, Thöû nghieäm thu nhaän, nuoâi caáy vaø chuyeån phoâi treân

chuoät nhaét traéng (Mus musculus var Albino), Luaän vaên thaïc syõ, 2004

[4] Phan Kim Ngoïc, Hoà Huyønh Thuyø Döông, Sinh hoïc cuûa söï sinh saûn, Nhaø xuaát baûn

Giaùo duïc, 2000.

[5] Phaïm Vaên Ph uùc, Thu nhaän vaø tinh saïch teá baøo maàm töø phoâi chuoät (Mus musculus

Var . Albino) (12,5 ngaøy) vaø taïo lôùp feeder mef nuoâi teá baøo maàm, Khoaù luaän cöû nhaân

khoa hoïc, 2005.

[6] Nguyeãn Ñaêng Quaân, Xaây döïng moâ hình thöû nghieäm caùc chaát choáng ung thö, Luaän

vaên thaïc syõ, 2003.

[7] Leâ Phan Quoác, Böôùc ñaàu phaân laäp vaø nuoâi teá baøo phoâi chuoät nhaét traéng (Mus

musculus Var. Albino giai ñoaïn 9-13 ngaøy, Khoaù luaän toát nghieäp, 2004.

[8] Traàn Linh Thöôùc, Phan Kim Ngoïc, Coâng Ngheä teá baøo ñoäng vaät, Tröôøng Ñaïi Hoïc

Khoa Hoïc Töï Nhieân, 2003.

[9] Tröông Vaên Trí, Phaân laäp cuïm teá baøo phoâi chuoät nhaét traéng (Mus musculus Var.

Albino) vaø khaûo saùt söï hieän dieän cuûa teá baøo maàm, Khoaù luaän toát nghieäp, 2005.

laäp vaø nuoâi caáy teá baøo phoâi chuoät nhaét traéng [10] Nguyeãn Leâ Xuaân Tröôøng, Phaân

(Mus musculus Var. Albino), Khoaù luaän cöû nhaân khoa hoïc, 2004.

Taøi lieäu Tieáng Anh

[11] Committee on Defining Science – based Concerns Associated with Products

of Animal Biotechnology, Animal Biotechnology: Science – based concerns, The

National Academies Press, Washington, D.C, 2002.

[12] Daniel R.Marshak, Richard L. Gardner, David Gottlieb, Stem cell biology.

[13] K. Skinboll, Ph.D. Director, Stem cell: Scientific progress and future research

directions, National instituses of Heath department of Heath and human services,

June 2001.

[14] Martin Evens, Tissue culture of Embryonic Stem cell, Cell and tissue, culture and

associated techniques, 1998.

[15] Paul M. Wassarman, Melvin L. Depamphilis, Guide to Techniques in mouse

Development, Academic Press Inc, 1993.

[16] Peter J. Quesenbery, Gary S. Stein, Bernard G. Forget, Sterman M.Weirsman,

Stem cell biology and gene theragy.

7] Scott F. Gilbert, Development biology, Surderland Massachusetts. [1