BÁO CÁO KHOA HỌC: "TẠO DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ ĐOẠN ADN ĐẶC HIỆU THUỘC GEN CRY1AB TỪ MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS THURINGIENSIS KURSTAKI PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM"

Chia sẻ: Linh Ha | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:24

Thêm vào BST

Báo xấu

176
lượt xem 33
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Trong những năm gần đây thuốc trừ sâu vi sinh Bacillus thuringiensis gọi tắt là (Bt) đã được ứng dụng an toàn và có hiệu quả để thay thế dần các thuốc trừ sâu hoá học. B. thuringiensis là vi khuẩn gram dương, mang các gen cry sinh tổng hợp bào tử và protein tinh thể độc tố có hiệu quả diệt đối với nhiều loài côn trùng thuộc các bộ cánh vảy, cánh cứng và hai cánh.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: BÁO CÁO KHOA HỌC: "TẠO DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ ĐOẠN ADN ĐẶC HIỆU THUỘC GEN CRY1AB TỪ MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS THURINGIENSIS KURSTAKI PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM"

TẠO DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ ĐOẠN ADN ĐẶC HIỆU THUỘC GEN CRY1AB TỪ MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS THURINGIENSIS KURSTAKI PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM Bùi Thị Hương, Nguyễn Thuỳ Châu Bộ môn Vi Sinh, Viện Công Nghệ Sau Thu hoạch. Đinh Duy Kháng Phòng Vi Sinh Phân tử, Viện Công Nghệ Sinh học, Trung Tâm Khoa học Tự nhiên và Công Nghệ Quốc gia. Trong những năm gần đây thuốc trừ sâu vi sinh Bacillus thuringiensis gọi tắt là (Bt) đã được ứng dụng an toàn và có hiệu quả để thay thế dần các thuốc trừ sâu hoá học. B. thuringiensis là vi khuẩn gram dương, mang các gen cry sinh tổng hợp bào tử và protein tinh thể độc tố có hiệu quả diệt đối với nhiều loài côn trùng thuộc các bộ cánh vảy, cánh cứng và hai cánh. Các nhà khoa học đã có rất nhiều cố gắng để phân lập vi khuẩn này và thu được nhiều bộ sưu tập các chủng B. thuringiensis rất phong phú. Số các chủng
B. thuringiensis phân lập thì nhiều nhưng mỗi chủng chỉ chứa một số nhóm gen cry gây độc với một số loài côn trùng nhất định. Để sàng lọc các chủng B. thuringiensis có chứa gen cry mong muốn, tạo dòng và xác định trình tự gen độc tố đó là vấn đề rất cần thiết, nó làm cơ sở cho các nghiên cứu đi sâu tiếp theo đối với những gen cry này như: nhằm tạo ra các chủng B. thuringiensis tái tổ hợp mới có phổ diệt sâu rộng, hoạt lực diệt sâu cao hơn đối với nhiều loài côn trùng quan trọng; việc biến nạp các gen độc tố cry thích hợp vào từng loại cây trồng để bảo vệ chúng trước sự tấn công của côn trùng. Chúng tôi đã tiến hành thăm dò sự tồn tại gen cry1Ab của một số chủng B. thuringiensis var. kurstaki phân lập ở Việt Nam, tạo dòng và xác định trình tự đoạn ADN đặc hiệu thuộc gen cry 1Ab đó và so sánh với trình tự cùng đoạn gen này đã được công bố trong Ngân hàng dữ liệu gen Quốc tế. I.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: I.1. Tách chiết ADN tổng số:
Tiến hành theo phương pháp của Sambrook và Maniatis [10]: các chủng B. thuringiensis được lên men lắc trên môi trường LB ở 370C qua đêm. Ly tâm ở 6.000v /phút, thu cặn tế bào. Bổ sung 567l TE(10:1), 30l SDS 10%, 3l proteinaza K, ủ ở 370C trong 1 giờ. Bổ sung 180 l NaCl 5M, ủ ở 650C trong 10 phút. Bổ sung 800l chloroform, ly tâm ở 10000v/10phút, thu 600 l dịch nổi, bổ sung 300l chloroform và 300l phenol, trộn đều rồi ly tâm 10.000v/10phút, thu 600l dịch nổi. Bổ sung 600l chloroform để loại phenol, ly tâm 10000v/10phút, thu 400l dịch nổi. Bổ sung 40l NaOAC và 1ml cồn 100%, ủ ở - 200C sau 4 giờ, ly tâm 14000v/20phút, thu cặn ADN. Rửa lại với 1ml cồn 70% tiếp tục thu cặn bằng ly tâm 14000v/20phút. Sấy khô cặn trong tủ cấy vô trùng, loại RNaza bằng cách bổ sung 20lTE-RNaza và ủ ở 370C/ 1 giờ. Nồng độ ADN được xác định bằng phương pháp đo độ hấp phụ ở bước sóng 260 nm (A260) và được tính bằng biểu thức:
A260 x 50 x hệ số pha loãng = g ADN/ml Sau khi xác định nồng độ, ADN được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%. I.2. Nhân bản đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1Ab bằng kỹ thuật PCR Phản ứng PCR được tiến hành với tổng thể tích 25l đựng trong ống Eppendorf bao gồm các thành phần: nước khử ion 13,6l, dNTP 2,5l, buffer 2,5l, primer 2l, enzim Tag-polymeraza 0,4l, MgCl2: 2l, ADN 2l ( nồng độ 50ng/l). Sử dụng cặp mồi TY6(5’- GGTCGTGGCTATATCCTTCGTGTCACAGC-3’) và TY14(5’-GAATTGCTTTCATAGGCTCCGTC-3’) để nhân bản đoạn ADN đặc hiệu nằm trong gen cry1Ab. Các sản phẩm PCR được phân tích bằng điện di trên gel agarose
1% I.3. Tạo dòng đoạn ADN đặc hiệu thuộc gen cry1Ab. Tạo vectơ tái tổ hợp: tiến hành theo phương pháp của Sambrook và cs [10]: gắn trực tiếp sản phẩm PCR được tạo ra ở mục I.2 vào vectơ tách dòng PCRTM 2.1. Phản ứng gắn gồm: nước khử ion: 3l; Dung dịch đệm gắn: 1l; Sản phẩm PCR:3l; vectơ PCRTM2.1: 2l; T4- ligaza: 1l. Ủ qua đêm ở nhiệt độ 140C. Sau đó biến nạp sản phẩm gắn vào vi khuẩn E. coli chủng DH5. Các khuẩn lạc E. coli chứa vectơ pCRTM 2.1 tái tổ hợp được chọn lọc trên môi trường LB chứa ampixillin, IPTG (Isopropyl- -D- Thiogalactopyranoside) và X-gal. Sau đó tách chiết ADN plasmid từ tế bào vi khuẩn bằng cách xử lý với dung dịch chứa NaOH, SDS để phá vỡ tế bào. Thu dịch nổi chứa ADN plasmid, kết tủa bằng cồn rồi hoà lại cặn trong dung dịch đệm TE, ARN được loại bằng RNaza nồng độ 100g/ml. I.4. Phân tích trình tự đoạn ADN đặc hiệu của gen
cry1Ab. Sau khi tách chiết và tinh sạch vectơ tái tổ hợp từ tế bào chủ, gen được xác định trình tự theo phương pháp enzim học của Sanger nhờ bộ kit của Hãng Amersham-Pharmacia Biotech với máy xác định trình tự ADN tự động ALF- Express của Hãng Pharmacia. Phân tích kết quả được tiến hành với chương trình PC/Gene. II. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN: Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu 10 chủng B. thuringiensis var. kurstaki phân lập ở Việt Nam nhận được từ bộ sưu tập chủng giống B. thuringiensis của Bộ môn Vi sinh, Viện Công Nghệ Sau Thu Hoạch. Các chủng B. thuringiensis này đã được công bố là có hiệu lực diệt đặc hiệu cao 100% đối với các loài sâu ngài gạo, và 90%-100% đối với sâu tơ, sâu keo. Hiệu quả diệt giảm hơn đối với sâu khoang 80-90% và giảm hơn nữa trên đối tượng sâu bông 50-60%.
II.1. Kiểm tra ADN của 10 chủng B. thuringiensis var. kurstaki bằng điện di trên gel agarose 1% ADN tổng số sau khi đã tách chiết từ 10 chủng B. thuringiensis var. kurstaki phân lập được điện di trên gel agarose 1% với đệm TAE, sau đó nhuộm gel với Ethidium bromid (EtBr). Gel được soi dưới ánh sáng tử ngoại, nếu ADN nguyên vẹn sẽ tạo thành một băng sáng tập trung ở vị trí trên cùng của bản gel do chúng có kích thước và trọng lượng phân tử lớn nên chạy chậm và ở vị trí cao nhất. Nếu ADN bị đứt gãy thành các đoạn có kích thước nhỏ hơn thì chúng sẽ chạy nhanh hơn và tạo thành một dải sáng dài gồm nhiều băng phân bố ở các vị trí khác nhau trên bản gel. Dựa vào hình ảnh điện di, chúng ta có thể đánh giá chất lượng của các mẫu ADN được tách chiết.
Hình 1: Điện di trên gel agarose 1% kiểm tra ADN TỔNG SỐ TÁCH TỪ CÁC CHỦNG B. THURINGIENSIS var. kurstaki phân lập: từ kênh (1-10) theo thứ tự (47S, 50S, H22, H15, 29S, T58, H8, H3, 28S, H13 ). Qua ảnh điện di ở hình 1 chúng tôi nhận thấy các mẫu ADN tổng số tách được từ 10 chủng B. thuringiensis kurstaki phân lập đều có một dải băng sáng tập trung rõ nét ở phía trên của bản gel, không có các vạch phụ, các mẫu ADN tách được là nguyên vẹn và không bị đứt gãy, đảm bảo chất lượng cho các nghiên cứu tiếp theo.
II.2. Nhân bản đoạn ADN đặc hiệu thuộc gen cry1Ab từ các chủng B. thuringiensis kurstaki phân lập bằng kỹ thuật PCR: Tiến hành sử dụng cặp mồi: TY6 và TY14 để nhân bản đoạn ADN đặc hiệu thuộc gen cry1Ab của 10 chủng B. thuringiensis var. kurstaki phân lập và hai chủng chuẩn B. thuringiensis var. kurstaki A1 và B. thuringiensis var. aizawai M1. Kết quả thể hiện ở hình 2. Kết quả ở hình 2 cho thấy: sản phẩm PCR thu được rất đặc hiệu, không có sản phẩm phụ. Ở cả 10 chủng B. thuringiensis var. kurstaki phân lập có duy nhất một sản phẩm PCR đặc hiệu vào khoảng 238 bp theo lý thuyết giống với sản phẩm PCR của chủng B. thuringiensis var. kurstaki chuẩn (kênh 2, 4-13). Như vậy cả 10 chủng B. thuringiensis var. kurstaki phân lập đã mang gen cry1Ab. Riêng chủng chuẩn B. thuringiensis aizawai M1 không có sản phẩm PCR đặc hiệu, vì vậy chủng này không chứa gen cry1Ab.
Hình 2. Điện di đồ sản phẩm PCR đặc hiệu của gen cry1Ab của các chủng B. thuringiensis phân lập và chủng B. thuringiensis chuẩn. Chú thích: Kênh (1-2): chủng chuẩn B. thuringiensi var. aizawai M1, B. thuringiensis var. kurstaki A1; Kênh 3: chỉ thị phân tử (ADN  cắt bằng Hind III và EcoR I) từ trên xuống (21226, 5148, 4973, 4277, 3530, 2027, 1904, 1584, 1330, 983, 831, 564 bp); kênh (4-13) các chủng phân lập theo thứ tự (47S, 50S, H22, H15, 29S, T58, H8, H3, 28S, H13 ). II.3. Tạo dòng đoạn ADN đặc hiệu thuộc gen cry1Ab từ chủng B. thuringiensis var. kurstaki phân lập.
Tiến hành gắn sản phẩm PCR đặc hiệu của gen cry1Ab từ chủng B. thuringiensis var. kurstaki H15 phân lập vào vectơ PCRTM2.1 để tạo vectơ tái tổ hợp. Sau đó biến nạp vectơ tái tổ hợp vào vi khuẩn E. coli DH5. Nhờ quá trình nhân lên của vi khuẩn mà vectơ tái tổ hợp cũng được nhân theo. Sau đó tiến hành tách chiết và tinh sạch plasmid tái tổ hợp từ vi khuẩn E. coli đã biến nạp. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng cách cắt với enzim giới hạn EcoR I, sản phẩm cắt được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%. Kết quả được thể hiện ở hình 3. Hình 3. Điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra các plasmid tái tổ hợp mang sản phẩm PCR đặc hiệu của gen cry1Ab cắt bằng EcoR I.
Chú thích: Kênh 1: sản phẩm PCR của đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1Ab; Kênh 2,3,5: Plasmid cắt bằng EcoR I ; Kênh 4: plasmid của khuẩn lạc xanh; Kênh 6: Chỉ thị phân tử (ADN  cắt bằng Hind III và EcoR I , từ trên xuống 21226, 5148, 4973, 4277, 3530, 2027, 1904, 1584, 1330, 983, 831, 564 bp). Kết quả ở hình 3 cho thấy: khi plasmid tái tổ hợp được cắt bởi enzim EcoR I đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1Ab được tách ra khỏi plasmid có kích thước đúng bằng với sản phẩm PCR của đoạn ADN này ( Kênh 1 và 2, 3, 5). Kênh 2 cho thấy plasmid của khuẩn lạc xanh không mang đoạn ADN ngoại lai, và chỉ có một băng duy nhất có kích thước vào khoảng 3,9kb là trọng lượng phân tử của plasmid. Như vậy chúng tôi đã chọn được 3 dòng có đính sản phẩm PCR là đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1Ab và được vi khuẩn E. coli nhân lên theo mong muốn. Tuy nhiên để khẳng định một cách chắc chắn điều này, cần xác định trình tự đoạn ADN đã được gắn vào vectơ.
II.4. Xác định trình tự nucleotid đoạn ADN đặc hiệu của gen cry 1Ab. Kết quả ở hình 4 cho thấy: trình tự đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1Ab tạo dòng từ chủng B. thuringiensis var. kurstaki H15 phân lập được xác định có chiều dài 236 cặp bazơ bao gồm số lượng các nucleotid như sau: 81A, 39 C, 62G, 54T. Hình 4. Trình tự đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1Ab tạo dòng từ chủng B. thuringiensis. kurstaki H15 phân lập, đoạn ADN này dài 236 cặp bazơ. II.5. So sánh trình tự đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1Ab. Chúng tôi đã tiến hành so sánh độ tương đồng giữa trình tự
đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1Ab tạo dòng từ chủng B. thuringiensis var. kurstaki H15 phân lập ở Việt Nam so với trình tự cùng đoạn gen này đã được công bố trong ngân hàng dữ liệu gen Quốc tế, kết quả được thể hiện ở hình 5. Hình 5. So sánh trình tự nucleotid giữa đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1Ab tạo dòng từ chủng B. thuringiensis var. kurstaki H15 phân lập ở Việt Nam (VNCRYIAb) và đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1Ab do Geiser và cs công bố trong Ngân hàng dữ liệu gen Quốc tế (QTCRYIAb). Kết quả ở hình 5 cho thấy trình tự đoạn ADN đặc hiệu của
gen cry1Ab tạo dòng từ chủng B. thuringiensis var. kurstaki H15 phân lập của Việt nam có độ tương đồng cao so với đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1Ab do Geiser và cs công bố năm 1986 trong Ngân hàng dữ liệu gen Quốc tế mã số ACM 15271. Độ tương đồng đạt 98,73%. Chúng chỉ khác nhau bởi 3 nucleotid, đó là các nucleotid ở vị trí thứ 84, 167, 222. II.6. Dịch mã đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1Ab Chúng tôi đã tiến hành dịch mã đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1Ab sang protein nhờ chương trình phần mềm PC/Gene. Kết quả được thể hiện ở hình 6.
Hình 6. Trình tự các axit amin được dịch mã từ đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1Ab tạo dòng từ chủng B. thuringiensis var. kurstaki H15 phân lập ở Việt nam. Kết quả ở hình 6 cho thấy đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1Ab tạo dòng từ chủng B. thuringiensis var. kurstaki H15 phân lập của Việt nam có thể dịch thông sang một đoạn protein có chiều dài 78 axit amin. III. KẾT LUẬN: Đã nhân bản đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1Ab từ 10
chủng B. thuringiensis var. kurstaki phân lập bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi TY6 và TY14. Kết quả cho thấy tất cả 10 chủng B. thuringiensis var. kurstaki phân lập ở Việt Nam đều mang gen cry1Ab. Đã tạo dòng và xác định trình tự đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1Ab từ chủng B. thuringiensis var. kurstaki H15 phân lập, đoạn ADN này có chiều dài 236bp, có thể mã hoá cho một đoạn protein có chiều dài 78 axit amin. Trình tự đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1Ab tạo dòng từ chủng B. thuringiensis var. kurstaki H15 phân lập ở Việt nam có độ tương đồng cao so với đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1Ab do Geiser và cs công bố năm 1986 trong Ngân hàng dữ liệu gen Quốc tế mã số ACM 15271. Độ tương đồng đạt tới 98,73%. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Choi, S. K., B. T. Koo, S. Shin, S. H. Park, J.I. Kim. (1995), “Screening of nested deletion mutants for DNA sequencing by direct electrophoresis of bacterial cultures”. Anal. Biochem. 230, p. 182-183.
2. Chilcott, C. N. and P.J. Wigley. (1992), “Isolation and Toxicity of Bacillus thuringiensis from Soil and Insect Habitats in New Zealand”. Journal of Invertebrate Phathology 61, p. 244-247. 3. Ferre, J., M.D. Real, J. Van Rie, S. Jansens, and M. Peferoen. (1991), “Resistance to the Bacillus thuringiensis bioinsecticide in a field population of Plutella xylostella is due to a change in a midgud membrane receptor”. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, p.5119-5123. 4. Geiser M., S. Schweitzer, C. Grimm. (1986), "The hypervariable region in the genes coding for entomopathogenic crystal proteins of Bacillus thuringiensis: nucleotide sequence of the kurhd1 gene of subsp. kurstaki HD1"; Gene 48, p.109-118. 5. Herman Hoft and H.R. Whiteley. (1989), “Insecticidal Crystal Proteins of Bacillus thuringiensis”. Microbiological Review, p. 242-255. 6. Kalman, S., K. L Kiehne, K. J. Libs, and T. Yamatomo. (1993), “Cloning of a Novel cryIC-Type Gene from a Strain of Bacillus thuringiensis subsp–galleriae”. Applied and Environmental Microbiology, p.1131-1137.
7. Klier A. (1985), Biopestiside opportunities and Challegene for management insect. Parteun International Symposia. 8. Koo, B. T., S. H. Park, S. K. Choi, B. S. Shin, J. I. Kim, J. H. Yu. (1995), “Cloning of a novel crystal protein gen Cry 1 K from Bacillus thuringiensis subsp. Morrisoni”. FEMS Microbiology Letter 134, p.159-164. 9. Kumaraswami N.S., M. Higuchi, T. Maruyama, T. Hayakava. (2001), “Comparative study of proteins and neutral glycoceramides of midgut epithelial cell membrane in Cry1Ac susceptible and highly resistant Diamondback moth”. 4th Pacific Rim Conference on the Biotechnology of Bacillus thuringiensis and its Environmental Impact, p66. 10. Maniatis, T; E.F. Fritisch, and Sambrook. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. 11. Lopez-Meza, J. E. and J. E. Ibarra. (1996), “Characterization of a Novel Strain of Bacillus thuringiensis”. Applied and Environmental Microbiology, p.1306-1310.
12. Lecadet, M. M. at al. (1996), Collection of Bacillus thuringiensis and Bacillus sphaericus. I.E.B.C, catalogue No.1. 13. Park S. H., B. T. Koo, B. S. Shin, S. K. Choi, Y. M. Jeong, J. G Pan, and J. I. Kim. (1997), “Characterization of 1925 Bacillus thuringiensis isolates from plants in Korea”. Kor. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. Vol. 25, No. 2, p.159- 165. 14. Philip F. Entwistle, Jenny S. Cory, Mark J. Bailey and Stephen Higgs. (1993), Bacillus thuringiensis, An Environmental Biopesticides: Theory and Practice. Jon Wiley and Sons, Ltd, Baffins lane, Chichester, West Sussex Po19 1UD, England. SUMMARY Cloning and sequencing specific DNA fragment of cry1Ab gene from some B. thuringiensis var. kurstaki strains isolated in Vietnam Bui Thi Huong, Nguyen Thuy Chau