ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR KHẢO SÁT SƠ BỘ
TẦN SUẤT PHÂN BỐ CÁC ALEN CỦA LOCUS
D7S820 Ở NGƯỜI VIỆT NAM
Nghiêm Xuân Dũng, Trần Minh Đôn,Lương Thị Yến,
Lê thị Bích Trâm.
Cục Kỹ thuật Hóa-Sinh và Tài liệu nghiệp vụ, Tổng cục
KHKT & CN- Bộ Công an
Nhận dạng cá thể bằng kỹ thuật phân tích ADN trong công
tác hình sự là một phương pháp được quan tâm và đi sâu
nghiên cứu từ nhiều năm nay bởi các nhà khoa học ở nhiều
nước trên thế giới. So với các phương pháp trước đây,
phương pháp này có nhiều ưu điểm nổi bật như khắc phục
được tình trạng số lượng mẫu quá ít, mẫu bị suy giảm
nghiêm trọng do tác động của môi trường và sự che dấu của
thủ phạm. Mặt khác, phương pháp phân tích ADN còn cho
kết quả với độ chính xác cao, nếu sử dụng từ 6 đến 9 đoạn
gen sẽ cho một kết quả gần như tuyệt đối [9].
Ở Việt Nam đã có những nghiên cứu về các locus gen đa
hình như D1S80 [1], TH01 [1,4], TPOX [3], D17S5 và
ApoB [1]... Trên thế giới, khoảng 12 locus đã được sử dụng
rộng rãi trong y học hình sự như TH01, TPOX, D5S818,
D7S820... Các locus được lựa chọn này đều mang các alen
có trình tự lặp lại ngắn (kích thước cách nhau 4bp). So với
các đoạn ADN có trình tự lặp lại dài, đoạn lặp lại ngắn có
khả năng ít bị biến tính nên rất có ích lợi trong công tác
giám định.
Tại Phòng Thí nghiệm Sinh học phân tử - Cục Kỹ thuật
Hoá-Sinh và Tài liệu nghiệp vụ-Tổng cục VI-Bộ Công an,
chúng tôi tiến hành nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR
khảo sát sơ bộ tần suất phân bố các alen của locus D7S820
ở một nhóm cá thể người Việt Nam phục vụ công tác nhận
dạng cá thể.
I. Phương pháp nghiên cứu
1. Nguyên liệu:
- Máu tươi của những người khoẻ mạnh không có cùng
quan hệ huyết thống do Viện Quân y 108 cung cấp.
- Hoá chất: Hoá chất cho tách chiết ADN (hãng Sigma);
hoá chất dùng cho quá trình PCR đối với locus D7S820
(mồi đặc hiệu cho locus D7S820 của hãng Pharmacia-Thuỵ
Điển; Taq ADN polymeraza-của Viện Sốt rét Ký sinh trùng
và Côn trùng Trung ương); hoá chất dùng cho điện di và
nhuộm băng ADN (của các hãng Promega, Pharmacia,
Sigma, MERCK).
2. Phương pháp:
a. Tách ADN:
ADN từ máu được tách chiết theo phương pháp chuẩn dùng
phenol và chloroform để tinh sạch [4]. Kết quả tách chiết
thu được ADN có độ tinh sạch khá cao với OD trung bình
1,75 và hàm lượng >50ng/l.
b. Kỹ thuật PCR:
Quá trình PCR với các giai đoạn cơ bản: biến tính, gắn mồi
và tổng hợp. Quá trình được thực hiện với các nhiệt độ gắn
mồi khác nhau được lựa chọn từ 50oC đến 58oC. Sản phẩm
PCR sau đó được kiểm tra trên gel agaroza 2%, nhuộm
ethidium bromide (25g/ml).
c. Kỹ thuật điện di:
Các mẫu sau khi thực hiện quá trình PCR đã được kiểm tra
trên gel agaroza 2% sau đó được điện di trên gel
polyacrylamide 6% sử dụng ure 7M. Băng ADN được phát
hiện bằng phương pháp nhuộm bạc của Bassam, 1991 [6].
d. Phương pháp chọn lọc và xây dựng thang alen
* Đánh số alen theo quy ước riêng: Dựa vào các alen
quan sát được của các mẫu khác nhau trên bản điện di,
chúng tôi chọn ra các mẫu mang các alen khác nhau và
đánh số alen theo thứ tự từ dưới lên trên (đánh số alen từ
băng ADN có trọng lượng phân tử thấp nhất đến băng
ADN có trọng lượng phân tử cao nhất). Việc đánh số ở đây
chỉ mang tính quy ước sao cho mỗi alen xác định được có
ký hiệu riêng, vì đây là quá trình khảo sát ban đầu chưa có
thang alen chuẩn để so sánh.
* Xây dựng thang alen: Trong quá trình đánh số, chúng tôi
đồng thời chọn ra những mẫu mang những alen khác nhau
tập hợp lại để tạo thang alen. Thang alen được tạo bằng
phương pháp trộn mẫu.
* Chuẩn thang alen: ký hiệu lại các alen đã khảo sát
được theo quy ước quốc tế. Alen của locus D7S820 được
ký hiệu từ 6 đến 14 căn cứ vào số đoạn lặp của mỗi alen.
Chúng tôi tiến hành chuẩn thang alen như sau: lấy kết
quả tần suất alen tính được so sánh với tần suất alen đã
khảo sát bằng thang alen chuẩn ở một nhóm người Đông
Nam Á. Chuẩn trước hai alen theo tần suất tương đương
(thường chọn alen có tần suất lớn nhất và nhỏ nhất), từ đó
ký hiệu lại các alen khác theo alen đã chuẩn.