TP CHÍ PHÁT TRIN KH&CN, TP 13, S T3 - 2010
Bn quyn thuc ĐHQG-HCM Trang 67
KH!O SÁT VÀI YU T !NH HƯ(NG ĐN S SINH T+NG H,P TAXOL C)A
CÁC H THNG T BÀO TAXUS WALLICHIANA ZUCC. IN VITRO
Lê Th ThuL Tiên
(1)
, Bùi Trang Vit
(2)
, Nguyn Đc Lưng
(1)
(1) Trưng Đi hc Bách khoa, ĐHQG-HCM
(2) Trưng Đi hc Khoa hc T nhiên, ĐHQG-HCM
(Bài nhn ngày 08 tháng 01 năm 2009, hoàn chnh sa cha ngày 30 tháng 11 năm 2010)
TÓM TT: Mô sPo và dch treo t bào hình thành t( s phân chia ca các t bào nhu mô v
thân cây thông ñ Lâm Đng Taxus wallichiana Zucc. trên môi trưng B5 có b sung 2,4-D và kinetin.
S sinh tng h!p taxol ca các h thng t bào chu nh hưng ca nhiu yu t như thi gian nuôi cy,
nhit ñ, áp sut th.m thu, cht cm ng... S kéo dài thi gian nuôi cy làm gim s tăng trưng ca
mô sPo nhưng làm tăng s tích lu+ taxol trong t bào. Ánh sáng ngăn cn s tăng trưng ca mô sPo
nhưng làm tăng s tng h!p taxol. S gia tăng áp sut th.m thu môi trưng nuôi cy (vi saccharose
60 g/l), s b sung phenylalnine (20 mg/l) vi vai trò là tin cht hu cơ, methyl jasmonate (10 mg/l)
vi vai trò là tác nhân cm ng ñu làm tăng s tích lu+ taxol trong t bào. Hàm lư!ng taxol trong các
h thng t bào ñư!c ñánh giá thông qua tác ñng cn s to phác th) rO ca tr h dip cây m$m ñu
xanh.
T khóa: Mô sPo, dch treo t bào, Taxus wallichiana Zucc., taxol.
1. GI"I THI U
Taxol (paclitaxel), mt alkaloid
diterpenoid t nhiên ñưc thu nh"n t v) cây
thông ñ) Thái Bình Dương (Taxus brevifolia),
ñưc FDA (the Food and Drug Administration)
công nh"n là tác nhân hoá tr hiu qu và quan
trng ñi vi mt s bnh ung thư vào năm
1992 (Woo và cng s, 1994) [22].
Vic cung cp taxol b hn ch do thu
nh"n t cây ngoài t nhiên vi s lưng gii
hn, ñng thi vi nhu c&u s d!ng ñ ñiu tr
ung thư ngày càng tăng. Nhiu phương pháp
thu nh"n taxol ñưc nghiên cu như tng hp
hoá hc, bán tng hp t tin cht là 10-
deacetylbaccatin III, nuôi cy t bào thc v"t...
Các h thng t bào Taxus in vitro ñưc xem
như mt phương tin ñ&y ha h0n ñ sn xut
taxol (Jaziri và cng s, 1996) [10]. Tuy nhiên,
v#n còn mt s hn ch khi ñưa vào sn xut
ph!c v! nhu c&u thương mi do sn lưng thp
và không n ñnh. Vì v"y, ñ có th thương mi
hoá taxol c&n phi có nh+ng dòng t bào tăng
sinh nhanh, có kh năng sn xut cao và n
ñnh. Vic chn dòng t bào kt hp vi ñiu
kin môi trưng ti ưu, cht cm ng thích hp
là yu t quyt ñnh trong sn xut (Collins-
Pavao và cng s, 1996) [5]. Các nhà khoa hc
ñã t"p trung vào nghiên cu vn ñ này và nâng
cao hiu sut theo các hưng: b sung các tin
cht h+u cơ vào môi trưng nuôi cy
(Silvestrini và cng s, 2002) [18], to áp sut
Science & Technology Development, Vol 13, No.T3- 2010
Trang 68 Bn quyn thuc ĐHQG-HCM
th/m thu ca môi trưng nuôi cy (Kim và
cng s, 2001) [11]; s d!ng các cht cm ng
như methyl jasmonate (Luo và cng s, 2003)
[13] … Tt c nh+ng yu t này khi ñưc x lý
ñc l"p vi nhau ñu có th làm tăng sn lưng
taxol trong môi trưng nuôi cy. Các hưng
nghiên cu trên cho thy kh năng nâng cao
quá trình sinh tng hp taxol có th thc hin
ñưc. S sinh tng hp taxol ñưc ñánh giá bi
các phương pháp tiên tin (HPLC) nhưng ñng
thi cũng có th ñánh giá qua kh năng cn s
hình thành phác th r1 t tr! h dip cây m&m
ñ"u xanh (Lê Th Thu2 tiên và cng s, 2010)
[21].
2. VT LI U VÀ PHƯƠNG PHÁP
Vt liu
V"t liu to mô s0o và dch treo t bào là
thân non 3 – 4 tu&n tui trên cây Thông ñ) Lâm
Đng (Taxus wallichiana Zucc.), ñưc cung
cp bi Trung tâm Nghiên cu Lâm sinh Lâm
Đng. V"t liu dùng trong sinh trc nghim s
to phác th r1 là tr! h dip cây m&m ñ"u xanh
(Phaseolus aureus Roxb.) 3 ngày tui.
Phương pháp
● Kho sát các yu t nh hưng lên s
sinh tng h!p taxol
Mô s0o trên môi trưng B5 (Gamborg và
cng s, 1968) [9] b sung 2,4-D 4 mg/l và
kinetin 1 mg/l (Lê Th Thu2 Tiên và cng s,
2006) [19], dch treo t bào trong môi trưng
B5 vi 2,4-D 5 mg/l, kinetin 0,5 mg/l, casein
hydrolysate 750 mg/l và PVP 1000 mg/l (Lê
Th Thu2 Tiên và cng s, 2006) [20] ñưc s
d!ng trong các thí nghim ci tin ñiu kin
môi trưng nuôi cy ñ thúc ñ/y s sinh tng
hp taxol ca t bào. Ch s tăng trưng ca mô
s0o và dch treo t bào ñưc xác ñnh theo Chen
và cng s (2003) [3].
Thi gian nuôi cy
Mô s0o ñưc duy trì trong thi gian 7, 8, 9
và 10 tháng. S cy chuyn ñưc thc hin ñu
ñn sau mi 4 tu&n. Kho sát s tăng trưng và
hot tính taxol ca mô s0o 7, 8, 9 và 10 tháng
tui.
Ánh sáng
Mô s0o và dch treo t bào ñưc duy trì
trong 4 tu&n ñiu kin ti và sáng (cưng ñ
ánh sáng 2800 ± 200 lux, thi gian chiu sáng
16 gi/ngày). Kho sát s tăng trưng và hot
tính taxol ca mô s0o và dch treo t bào.
Nhit ñ
Mô s0o và dch treo t bào ñưc nuôi cy
các ñiu kin nhit ñ khác nhau: 22, 25, 28 và
31
o
C. Kho sát s tăng trưng và hot tính
taxol ca mô s0o và dch treo t bào.
Methyl jasmonate
Methyl jasmonate ñưc b sung vào dch
treo t bào ngày th 14 ca quá trình nuôi cy
vi nng ñ 10, 20, 30 và 40 mg/l. Kho sát s
tăng trưng và hot tính taxol ca dch treo t
bào.
Phenylalanine
Phenylalanine ñưc b sung vào dch treo
t bào ngày th 14 ca quá trình nuôi cy vi
nng ñ 10, 20 và 30 mg/l. Kho sát s tăng
trưng và hot tính taxol ca dch treo t bào.
Saccharose
Dch treo t bào ñưc nuôi trong môi
trưng có saccharose nng ñ 30, 40, 60, 80 và
TP CHÍ PHÁT TRIN KH&CN, TP 13, S T3 - 2010
Bn quyn thuc ĐHQG-HCM Trang 69
100 g/l. Kho sát s tăng trưng và hot tính
taxol ca dch treo t bào.
● Thu nhn taxol t( các h thng t bào
Taxol trong các h thng t bào ñưc ly
trích vi chloroform (Chattopadhyay và cng
s, 2004) [2].
● Xác ñnh hot tính taxol b#ng phương
pháp tr'c nghim s to phác th) rO
Cao chloroform t 1g (trng lưng tươi)
mô s0o hay dch treo t bào ñưc hòa tan trong
1ml cn 5% và b sung vào 10 ml môi trưng
agar vi saccharose 20g/l ñ trc nghim s to
phác th r1 t tr! h dip cây m&m ñ"u xanh.
Hot tính ca taxol trong cao chit t2 l nghch
vi s sai bit v s lưng r1 hình thành trong
ñiu kin chu/n (không có taxol) sau 30 gi x
lý trong ti và ñưc tính bng cách so sánh vi
dung dch taxol tinh khit 1mg/l (Lê Th Thu2
Tiên và cng s, 2010) [21].
3. KT QU!
Enh hưng ca thi gian nuôi cy ñn s
tăng trưng và hot tính taxol ca mô sPo
Mô s0o 7, 8, 9 và 10 tháng tui ñưc s
d!ng làm nguyên liu ñ ly trích và xác ñnh
hot tính ca taxol và các hp cht liên quan.
S tăng trưng ca mô s0o gim theo s kéo
dài thi gian nuôi cy. Thi gian nuôi cy càng
dài, mô s0o càng tăng trưng ch"m và màu sc
ca mô s0o càng ñ"m hơn (nh 1, 2). S gim
tăng trưng ca mô s0o xy ra song song vi s
gia tăng hot tính ca taxol trong t bào. Hot
tính ca taxol cao nht (1,06 mg/l) thu ñưc t
mô s0o 10 tháng tui (bng 1).
!nh 1. Mô s0o 7 tháng tui !nh 2. Mô s0o 9 tháng tui
Bng 1. bnh hưng ca thi gian nuôi cy lên s sinh tng hp taxol ca mô s0o
Thi gian (tháng) Ch s tăng trưng Hot tính ca taxol (mg/l)
7 0,33 ± 0,02
d
0,62 ± 0,03
a
8 0,21 ± 0,01
c
0,78 ± 0,04
b
9 0,09 ± 0,00
b
0,93 ± 0,04
c
10 0,03 ± 0,01
a
1,06 ± 0,03
d
Science & Technology Development, Vol 13, No.T3- 2010
Trang 70 Bn quyn thuc ĐHQG-HCM
Các mu t khác nhau bi)u diOn mc ñ sai bit có ý nghĩa (theo ct) ñ tin cy 95%.
Enh hưng ca nhit ñ ñn hot tính
taxol ca mô sPo và dch treo t bào
Nhit ñ thích hp cho s sinh tng hp
taxol ca mô s0o và dch treo t bào là 28
o
C.
Tuy nhiên, s tăng trưng ca các h thng t
bào này tt hơn 25
o
C. S gim tăng trưng
ca mô s0o và dch treo t bào xy ra cùng vi
s gia tăng tng hp taxol trong t bào. Hot
tính taxol ca mô s0o cao hơn ca dch treo t
bào trong tt c các nghim thc (bng 2).
Bng 2. bnh hưng ca nhit ñ lên s tăng trưng và hot tính taxol ca mô s0o và dch treo t bào
Mô s0o Dch treo t bào
Nhit ñ
(
o
C) Ch s tăng
trưng
Hot tính ca
taxol (mg/l)
Ch s tăng
trưng
Hot tính ca
taxol (mg/l)
22 0,43 ± 0,04
a
0,43 ± 0,02
a
0,28 ± 0,09
ab
0,39 ± 0,04
a
25 0,58 ± 0,05
c
0,59 ± 0,03
b
0,43 ± 0,09
b
0,50 ± 0,09
bc
28 0,31 ± 0,04
ab
0,76 ± 0,03c 0,17 ± 0,06
a
0,59 ± 0,03
c
31 0,25 ± 0,03
a
0,64 ± 0,03
b
0,07 ± 0,01
a
0,42 ± 0,03
ab
Các m#u t khác nhau biu di1n mc ñ sai bit có ý nghĩa (theo ct) ñ tin c"y 95%.
Enh hưng ca ánh sáng ñn hot tính
taxol ca mô sPo và dch treo t bào
Mô s0o trong ñiu kin chiu sáng tăng
trưng ch"m, màu nâu. Mô s0o trong ñiu kin
ti tăng trưng nhanh hơn và có màu vàng nâu
(nh 3). Tương t, s tăng trưng ca dch treo
t bào ñiu kin sáng thp hơn trong ti.
Điu kin chiu sáng kích thích s sinh tng
hp taxol ca mô s0o và dch treo t bào cao
hơn ñiu kin ti (bng 3).
!nh 3. Mô s0o ñưc nuôi trong ñiu kin chiu sáng khác nhau
TP CHÍ PHÁT TRIN KH&CN, TP 13, S T3 - 2010
Bn quyn thuc ĐHQG-HCM Trang 71
Bng 3. bnh hưng ca ánh sáng trên s tăng trưng và hot tính taxol ca mô s0o và dch treo t bào
Mô s0o Dch treo t bào
Điu kin
nuôi cy Ch s tăng
trưng
Hot tính ca
taxol (mg/l)
Ch s tăng
trưng
Hot tính ca
taxol (mg/l)
Sáng 0,220 ± 0,033 0,960 ± 0,075 0,175 ± 0,029 0,620 ± 0,015
Ti 0,789 ± 0,009 0,570 ± 0,021 0,258 ± 0,046 0,430 ± 0,017
Enh hưng ca methyl jasmonate ñn s
tăng trưng và hot tính taxol ca dch treo t
bào
S hin din ca methyl jasmonate trong
môi trưng nuôi cy kích thích s sinh tng
hp taxol ca dch treo t bào, ñc bit vi
methyl jasmonate 10 mg/l (hot tính ca taxol
ương 0,74 mg/l). Tác ñng ca methyl
jasmonate nng ñ 30 và 40 mg/l tương ñương
nhau và h&u như s tăng trưng ca dch treo t
bào không b nh hưng bi methyl jasmonate
(bng 4).
Bng 4. bnh hưng ca methyl jasmonate lên s tăng trưng và hot tính taxol ca dch treo t bào
Methyl jasmonate (mg/l) Ch s tăng trưng Hot tính ca taxol (mg/l)
0 0,23 ± 0,04
a
0,50 ± 0,01
a
10 0,21 ± 0,02
a
0,74 ± 0,03
c
20 0,23 ± 0,03
a
0,67 ± 0,03
bc
30 0,18 ± 0,03
a
0,65 ± 0,03
b
40 0,15 ± 0,01
a
0,65 ± 0,02
b
Các m#u t khác nhau biu di1n mc ñ sai bit có ý nghĩa (theo ct) ñ tin c"y 95%.
Enh hưng ca phenylalanine lên s sinh
tng h!p taxol ca dch treo t bào
Hot tính ca taxol trong dch treo t bào
tăng theo s gia tăng nng ñ phenylalanine
trong môi trưng nuôi cy. Hot tính ca taxol
cao nht vi phenylalanine 20 và 30 mg/l.
Phenylalanine không nh hưng ñn s tăng
trưng ca dch treo t bào (bng 5).
Bng 5. bnh hưng ca phenylalanine lên s tăng trưng và hot tính taxol ca dch treo t bào
Phenylalanine (mg/l) Ch s tăng trưng Hot tính ca taxol (mg/l)
0 0,23 ± 0,04
a
0,50 ± 0,01
a
10 0,28 ± 0,04
a
0,61 ± 0,01
b