Biểu hiện gen Connexin 43 trên phức hợp Cumulus-tế bào trứng heo ở các giai đoạn phát triển khác nhau

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:5

Thêm vào BST

Báo xấu

29
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nghiên cứu này nhằm hiểu rõ hơn sự biểu hiện gen Connexin 43 ở mức độ mRNA trong phức hợp cumulus-oocyte (COC) ở heo theo giai đoạn phát triển của nang noãn, theo giai đoạn nuôi cấy thành thục phức hợp tế bào trứng để làm cơ sở cho các nghiên cứu biểu hiện gen liên quan đến chất lượng tế bào trứng nhằm nâng cao hiệu quả hệ thống nuôi cấy. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Biểu hiện gen Connexin 43 trên phức hợp Cumulus-tế bào trứng heo ở các giai đoạn phát triển khác nhau

DI TRUYỀN - GIỐNG VẬT NUÔI TÀI LIỆU THAM KHẢO Giống vật nuôi. Viện Chăn nuôi 11/2012. Trang 189-96. 8. Quyết định số 1520/QĐ-TTg ngày 06/102020 của Thủ 1. Vũ Đức Cảnh, Phạm Thùy Linh, Nguyễn Quý Khiêm, tướng Chính phủ: Phê duyệt chiến lược phát triển chăn Trần Thị Thu Hằng, Phạm Thị Xuân, Khuất Thị Tuyên, nuôi giai đoạn 2021 - 2030, tầm nhìn 2045. Hoàng Đình Trường, Phùng Duy Độ, Lưu Thị Thủy và Lê Thị Cẩm (2020). Chọn lọc ổn định năng suất 04 dòng 9. Vũ Ngọc Sơn, Phạm Công Thiếu, Đào Đoan Trang và vịt chuyên thịt CT. Báo cáo khoa học năm 2018 - 2020, Ngô Thị Thắm (2013). Bảo tồn và khai thác nguồn gen Phần Di truyền - Giống vật nuôi. Viện Chăn nuôi 11/2020. Ngỗng cỏ. Chuyên khảo bảo tồn và khai thác nuồn gen Trang 216-28. vật nuôi Việt Nam. Nhà xuất bản KH&CN, Hà Nội. Trang 201-05. 2. Phạm Văn Chung (2017). Chọn lọc, lai tạo hai dòng vịt hướng thịt để tạo tổ hợp lai vịt thương phẩm có năng suất 10. Phùng Đức Tiến, Trần Thị Cương, Vũ Thị Thảo, Tạ Thị và chất lượng thịt cao. Luận án Tiến sỹ, Viện Chăn nuôi. Hương Giang, Trần Thị Hà, Nguyễn Thị Kim Cúc và Nguyễn Quyết Thắng (2012). Kết quả chọn lọc một số 3. FAO (2020). Số liệu thống kê năm 2020. http://www.fao. org/faostat. dòng ngan giá trị kinh tế cao thế hệ 4 và 5. Báo cáo khoa học năm 2011, Phần Di truyền – Giống vật nuôi. Viện 4. Lê Thanh Hải, Dương Xuân Tuyển và Lê Văn Trang Chăn nuôi 11/2012. Trang 209-21. (2020). Chọn lọc ổn định năng suất dòng vịt chuyên thịe V27. Báo cáo khoa học năm 2018 - 2020, Phần Di truyền 11. Tổng cục Thống kê (2017). Số liệu thống kê tháng 12 năm - Giống vật nuôi. Viện Chăn nuôi 11/2020. Trang 205-15. 2017. 5. Đỗ Văn Hoan (2015). Thực trạng giống vật nuôi ở Việt Nam 12. Tổng cục Thống kê (2020). Số liệu thống kê tháng 06 năm và định hướng phát triển. Trang 16. https://mard.gov. 2020. vn/_CONTROLS/ESPORTAL/PubAnPhamTTChiTiet/ 13. Nguyễn Đức Trọng, Nguyễn Văn Duy, Vương Thị Lan Service.svc/download/L0FuUGhhbVRUL0xpc3RzL0FuU Anh, Nguyễn Thị Thúy Nghĩa, Lê Thị Mai Hoa, Đặng GhhbVRU/64. Vũ Hòa và Hoàng Văn Tiệu (2012). Chọn lọc ổn định 6. Chu Hoàng Nga, Vương Thị Lan Anh, Nguyễn Văn Duy, năng suất vịt Đại Xuyên PT. Báo cáo khoa học năm 2011, Đặng Vũ Bình, Nguyễn Thanh Sơn và Đặng Vũ Hòa Phần Di truyền - Giống vật nuôi. Viện Chăn nuôi. Trang (2020). Kết quả chọn tạo hai dòng vịt Biển 15 - Đại Xuyên 148-59. sau hai thế hệ. Báo cáo khoa học năm 2018 - 2020, Phần Di 14. Dương Xuân Tuyển, Lê Thanh Hải và Đào Thị Kim Anh truyền - Giống vật nuôi. Viện Chăn nuôi 11/2020. Trang (2012). Ảnh hưởng của phương thức nuôi đến khả năng 239-50. sản xuất của vịt bố mẹ SM. Báo cáo khoa học năm 2011, 7. Nguyễn Thị Thúy Nghĩa, Nguyễn Đức Trọng, Nguyễn Phần Di truyền - Giống vật nuôi. Trang 130-41. Văn Duy, Phạm Văn Chung, Mai Hương Thu, Lương 15. Lý Văn Vỹ và Hoàng Văn Trường (2013). Bảo tồn và khai Thị Bột, Đồng Thị Quyên và Đặng Thị Vui (2012). Đặc thác nguồn gen vịt Mốc Bình Định. Chuyên khảo bảo tồn điểm ngoại hình và khả năng sản xuất của vịt Bầu và và khai thác nuồn gen vật nuôi Việt Nam. Nhà xuất bản vịt Đốm. Báo cáo khoa học năm 2011, Phần Di truyền – Khoa học và Công nghệ, Hà Nội. Trang 172-79. BIỂU HIỆN GEN CONNEXIN 43 TRÊN PHỨC HỢP CUMULUS- TẾ BÀO TRỨNG HEO Ở CÁC GIAI ĐOẠN PHÁT TRIỂN KHÁC NHAU Nguyễn Thị Thạo1 và Nguyễn Ngọc Tấn1* Ngày nhận bài báo: 02/01/2021 - Ngày nhận bài phản biện: 19/01/2021 Ngày bài báo được chấp nhận đăng: 09/02/2021 TÓM TẮT Nghiên cứu nhằm đánh giá sự biểu hiện gen connexin 43 (Cx43) trên phức hợp cumulus-tế bào trứng (cumulus oocyte complexes–COC), trên tế bào trứng hoặc tế bào cumulus theo giai đoạn phát triển của nang noãn và quá trình nuôi thành thục tế bào trứng heo in vitro. Phức hợp COC thu nhận từ nang noãn nhỏ (7mm), hoặc theo thời điểm: 0, 22 và 44 giờ sau nuôi cấy và tế bào trứng hoặc tế bào cumulus thu nhận lúc 22 giờ sau nuôi cấy. Ly trích RNA và áp dụng kỹ thuật one-step RT-PCR để khuyếch đại đoạn gen mục tiêu của Cx43 với kích thước 270bp, sử dụng GAPDH với kích thước 187bp như là đối chứng nội. Sử dụng kỹ thuật bán định lượng mức độ biểu hiện bằng phần mềm ImageJ để xác định điểm ảnh cho băng biểu hiện mRNA của gen Cx43 và GAPDH trên ảnh điện di. Kết quả cho thấy sự biểu hiện Cx43 ở mức 1 Trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh * Tác giả liên hệ: TS. Nguyễn Ngọc Tấn, Giảng viên chính Khoa Khoa học Sinh học - Trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh; Email: nntan@hcmuaf.edu.vn; Điện thoại: 0948 993 338 KHKT Chăn nuôi số 266 - tháng 6 năm 2021 21
DI TRUYỀN - GIỐNG VẬT NUÔI mRNA theo kích thước nang noãn thấp nhất ở COC thu từ nang noãn nhỏ (0,63±0,08), khác biệt có ý nghĩa (P
DI TRUYỀN - GIỐNG VẬT NUÔI cumulus-oocyte (COC) ở heo theo giai đoạn Sodium bicarbonate) bổ sung 10% dịch nang phát triển của nang noãn, theo giai đoạn nuôi noãn, 0,8% BSA (Bovine Serum Albumin), 100 cấy thành thục phức hợp tế bào trứng để làm UI/ml Penicillin G sodium salt và 100 UI/ml cơ sở cho các nghiên cứu biểu hiện gen liên Streptomycin sulfate salt trong 44 giờ ở điều quan đến chất lượng tế bào trứng nhằm nâng kiện 39oC, 5% CO2. Bổ sung 10 UI/ml hCG cao hiệu quả hệ thống nuôi cấy. (human Chorionic Gonadotropin) cho môi 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU trường nuôi cấy trong 22 giờ đầu và không bổ sung hormone cho môi trường nuôi cấy trong 2.1. Vật liệu, địa điểm và thời gian 22 giờ sau (Nguyễn Ngọc Tấn và ctv, 2019a,b). Thu nhận buồng trứng của heo 4-5 2.2.3. Thu nhận mẫu để ly trích RNA, khuyếch tháng tuổi, khối lượng 80-100kg, từ lò mổ địa đại đoạn gen Cx43. phương. Các hóa chất sử dụng trong nghiên COC thu nhận từ nang noãn có kích thước cứu này được nhập từ công ty Sigma–Alrich khác nhau, theo giai đoạn nuôi cấy và thu từ (Hoa Kỳ), ngoại trừ những hóa chất đặc biệt tế bào trứng hoặc tế bào cumulus ở thời điểm sẽ được chỉ ra trong bài viết. 22 giờ sau nuôi cấy được đưa vào ly trích RNA Nghiên cứu được tiến hành tại Phòng Công (Hình 1). Sử dụng kỹ thuật one-step RT-PCR nghệ phôi Động vật, Viện Nghiên cứu Công để khuyếch đại đoạn gen mục tiêu của Cx43 nghệ Sinh học và Môi trường; Khoa Khoa học với kích thước 270bp, sử dụng GAPDH với sinh học, Trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí kích thước 187bp như là đối chứng nội. Thực Minh, từ tháng 4/2020 đến tháng 12/2020. hiện phản ứng RT-PCR bằng bộ kit MyTaq 2.2. Phương pháp One-Step RT-PCR (Bioline) trong một phản 2.2.1. Thu nhận buồng trứng và tế bào trứng ứng gồm 2 giai đoạn. Giai đoạn 1: Phản ứng phiên mã ngược tổng hợp đoạn cDNA; giai Việc thu nhận buồng trứng và tách tế đoạn 2: Phản ứng PCR, tổng hợp DNA từ bào trứng được thực hiện theo quy trình của đoạn cDNA trên. Trình tự primer được sử Nguyễn Ngọc Tấn và ctv (2019a,b). dụng: Cx43 (X86023.1) với primer xuôi là 2.2.2. Nuôi cấy thành thục tế bào trứng (IVM) 5’-CCACTGAGCCCCTCCAAA-3’ và primer Sau khi tách tế bào trứng từ các nang noãn ngược 5’-TGGCTGTCGTCAGGGAAAAT-3’ có kích thước trung bình (3-7mm), các phức hợp và GAPDH (AF017079) với primer xuôi COC có từ 2 lớp tế bào cumulus trở lên, đồng 5’-AGCAATGCCTCCTGTACCAC-3’ primer đều tế bào chất được lựa chọn đưa vào nuôi cấy. ngược 5’-AAGCAGGGATGATGTTCTGG-3’. Môi trường nuôi cấy thành thục tế bào trứng Điện di sản phẩm PCR bằng gel agarose 1,5% là TCM 199 (chứa Earl’s salts, L-glutamine và (Bioline). Hình 1. Hình ảnh đại diện SF: nang noãn nhỏ; MF: nang noãn trung bình; LF: nang noãn lớn. A) tế bào trứng không có tế bào cumulus (DO); B) tế bào cumulus (CC); C) phức hợp COC KHKT Chăn nuôi số 266 - tháng 6 năm 2021 23
DI TRUYỀN - GIỐNG VẬT NUÔI 2.2.4. Nội dung nghiên cứu trên tế bào trứng và/hoặc tế bào cumulus. Nội dung 1. Đánh giá sự biểu hiện gen Cx43 2.3. Xử lý số liệu theo giai đoạn phát triển nang noãn. Phức hợp Số liệu được xử lý theo phương pháp COC được thu nhận từ nang noãn có kích thống kê mô tả và phân tích phương sai một thước khác nhau (Hình 1): nhỏ (7mm). Đánh giá mức dạng Mean±SEM từ ít nhất 3 lần lặp lại. Giá độ biểu hiện của gen Cx43 ở mức độ mRNA. trị điểm ảnh thu được từ gen mục tiêu sau khi Nội dung 2. Đánh giá sự biểu hiện gen Cx43 phân tích bằng phần mềm ImageJ được chuẩn theo giai đoạn nuôi cấy phức hợp COC in vitro. hóa tương ứng qua giá trị của gen GAPDH Phức hợp COC có từ 2 lớp CC trở lên được lựa trước khi đưa vào phân tích. chọn và nuôi cấy thành thục in vitro được sử 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN dụng để đánh giá mức độ biểu hiện của gen Cx43 ở mức độ mRNA. 3.1. Đánh giá sự biểu hiện gen Cx43 theo giai Nội dung 3. Đánh giá sự biểu hiện gen Cx43 đoạn phát triển nang noãn ở tế bào trứng và tế bào cumulus tại thời điểm 22 RNA sau khi ly trích từ COC thu nhận giờ sau nuôi cấy. Phức hợp COC sau khi nuôi từ các nang noãn khác nhau được dùng để cấy 22 giờ được rửa và tách hoàn toàn tế bào khuếch đại gen mục tiêu, kết quả điện di sản cumulus ra khỏi tế bào trứng để đánh giá mức phẩm và mức độ biểu hiện của gen mục tiêu và độ biểu hiện của gen Cx43 ở mức độ mRNA đối chứng nội được trình bày ở Hình 2a và 2b. Hình 2a. Hình ảnh đại diện Hình 2b. Mức độ biểu hiện của gen Cx43 trên (A) điện di của gen Cx43, (B) điện di của gen GAPDH. COC thu từ các nang noãn có kích thước khác M: thang đo 100bp. SF: COC thu từ nang noãn nhỏ SF: nang noãn nhỏ (7mm) bày dưới dạng Mean±SEM từ 3 lần lặp lại; a,b: P
DI TRUYỀN - GIỐNG VẬT NUÔI 22 giờ (1,19±0,29) và có xu hướng giảm dần trình 8,5 giờ đầu IVM (Santiquet và ctv, 2013). khi nuôi cấy đến thời điểm 44 giờ (0,43±0,06). Việc bổ sung gonadotropin vào nuôi trường Kempisty và ctv (2013) cũng cho thấy biểu hiện nuôi cấy có tác động đến thành thục tế bào của Cx43 mRNA trên tế bào trứng tăng trong chất và giãn nở các lớp tế bào cumulus. Trong quá trình nuôi thành thục tế bào trứng (IVM). COC, FSH ở chuột, cừu và heo kích thích sự Khi nghiên cứu sự biểu hiện Cx43 trong suốt mở rộng cumulus (Chen và ctv, 1994). Trong 8,5 giờ đầu IVM kết quả cho thấy rằng sự biểu quá trình phát triển của nang noãn, biểu hiện hiện của Cx43 trên COC tăng ở 4,5 giờ nuôi của Cx43 tăng lên đáp ứng với nồng độ FSH, cấy sau đó có xu hướng giữ ổn định (Santiquet sau đó giảm đi đáp ứng với mức tăng của LH và ctv, 2013). Một số nghiên cứu trước đó đã dẫn đến khởi đầu sự giảm phân và rụng trứng chứng minh rằng, gonadotropin ảnh hưởng (Norris và ctv, 2008). Trong nghiên cứu này, đến khe liên kết nội bào giữa các tế bào hCG đã được bổ sung vào môi trường nuôi cumulus trong suốt IVM. Trong điều kiện nuôi cấy cũng có thể góp phần gia tăng mức biểu cấy có bổ sung eCG hoặc bổ sung cả eCG và hiện mRNA của gen Cx43 ở thời điểm 22 giờ hCG biểu hiện của Cx43 tăng cao ở 4,5 giờ đầu sau nuôi cấy và sau đó giảm do sự giãn nở của IVM và giảm dần ở giai đoạn còn lại của quá tế bào cumulus. Hình 3a. Hình ảnh điện di đại diện Hình 3b. Mức độ biểu hiện của gen (A) gen Cx43, (B) gen GAPDH. M: thang đo 100bp. mẫu Cx43 trên COC thu tại thời điểm 0, COC thu tại thời điểm: 0, 22, 44h sau nuôi cấy 22 và 44 giờ sau nuôi cấy 3.3. Sự biểu hiện gen Cx43 ở tế bào trứng và tế bào cumulus tại thời điểm 22 giờ sau nuôi cấy Hình 4a. Hình ảnh đại diện (A) điện di của gen Cx43, (B) hình điện di của gen Hình 4b. Mức độ biểu hiện của gen GAPDH. M: thang đo 100bp. DO: tế bào trứng không có Cx43 trên COC thu từ DO: tế bào trứng CC, CC: tế bào cumulus không có CC, CC: tế bào cumulus Từ Hình 4a và 4b cho thấy, tại thời điểm Cx43 ở mức mRNA trên tế bào CC cao hơn 22 giờ sau nuôi cấy, tế bào DO có mức biểu trên tế bào trứng (không có CC) ở thời điểm hiện mRNA của Cx43 là 0,67±0,08, thấp 22 giờ sau nuôi cấy. Một số nghiên cứu trước hơn mức biểu hiện ở tế bào CC là 1,07±0,05 đây đã chứng minh biểu hiện của Cx43 được (P