intTypePromotion=1

Bước đầu chuyển gen Bt vào cây mía (Saccharum officinarum L.)

Chia sẻ: Trinhthamhodang Trinhthamhodang | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:10

0
51
lượt xem
2
download

Bước đầu chuyển gen Bt vào cây mía (Saccharum officinarum L.)

Mô tả tài liệu
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

bước đầu chuyển gen bt vào cây mía Nhóm sâu đục thân là một trong những loài sâu hại làm giảm năng suất đáng kể cho mía. Việc phun thuốc bảo vệ mía gặp một số trở ngại do mật độ mía ở ruộng rất dày, lá mía sắc và sâu đục thân lại sống bên trong thân mía. Chuyển gen kháng sâu (Bt- tổng hợp) cry1Ab và cry1B-cry1Ab (gen lai) vào hai giống mía VN 84 4137 và Suphanbury 7 nhằm mong muốn tạo ra các giống mía có khả năng kháng sâu hiệu quả, chủ yếu là sâu đục thân. Hai dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens đã được biến nạp các plasmid mang gen cry1Ab và gen cry1B-cry1Ab dùng để chuyển gen vào thực vật. Khảo sát các điều kiện nuôi cấy mô mía cho thấy, khi nuôi cấy tạo mô sẹo từ mảnh lá non ở lõi ngọn mía ex vitro, tỉ lệ tạo mô sẹo cao nhất của giống VN84 4137 trên môi trường có 2,4-D ở nồng độ 3 mg/l là 93,33%, trong khi của giống Suphanbury 7 ở nồng độ 2 mg/l là 96,67%. Tỉ lệ mô sẹo tái sinh chồi cao nhất trên môi trường có tổ hợp BAP 2 mg/l và NAA 1 mg/l là 100% ở cả hai giống. Bước đầu chuyển gen cry1Ab và cry1Bcry1Ab gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens vào mía đã thu được các khối mô sẹo có biểu hiện GUS và kháng chất chọn lọc phosphinothricin ở nồng độ 3 mg/l, là nồng độ gây chết khi khảo sát khả năng chống chịu phosphinothricin ở mô sẹo không chuyển gen

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Bước đầu chuyển gen Bt vào cây mía (Saccharum officinarum L.)

TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 170-179<br /> <br /> BƯỚC ĐẦU CHUYỂN GEN Bt VÀO CÂY MÍA (Saccharum officinarum L.)<br /> <br /> Phan Tường Lộc*, Hoàng Văn Dương, Mai Trường, Lê Tấn Đức, Trần Thị Ngọc Hà,<br /> Văn Đắc Thành, Phạm Đức Trí, Nguyễn Thị Thanh, Nguyễn Hữu Hổ<br /> Viện Sinh học Nhiệt đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, (*)locphan@itb.ac.vn<br /> <br /> TÓM TẮT: Nhóm sâu đục thân là một trong những loài sâu hại làm giảm năng suất đáng kể cho mía.<br /> Việc phun thuốc bảo vệ mía gặp một số trở ngại do mật độ mía ở ruộng rất dày, lá mía sắc và sâu đục thân<br /> lại sống bên trong thân mía. Chuyển gen kháng sâu (Bt- tổng hợp) cry1Ab và cry1B-cry1Ab (gen lai) vào<br /> hai giống mía VN 84 4137 và Suphanbury 7 nhằm mong muốn tạo ra các giống mía có khả năng kháng<br /> sâu hiệu quả, chủ yếu là sâu đục thân. Hai dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens đã được biến nạp<br /> các plasmid mang gen cry1Ab và gen cry1B-cry1Ab dùng để chuyển gen vào thực vật. Khảo sát các điều<br /> kiện nuôi cấy mô mía cho thấy, khi nuôi cấy tạo mô sẹo từ mảnh lá non ở lõi ngọn mía ex vitro, tỉ lệ tạo<br /> mô sẹo cao nhất của giống VN84 4137 trên môi trường có 2,4-D ở nồng độ 3 mg/l là 93,33%, trong khi<br /> của giống Suphanbury 7 ở nồng độ 2 mg/l là 96,67%. Tỉ lệ mô sẹo tái sinh chồi cao nhất trên môi trường<br /> có tổ hợp BAP 2 mg/l và NAA 1 mg/l là 100% ở cả hai giống. Bước đầu chuyển gen cry1Ab và cry1B-<br /> cry1Ab gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens vào mía đã thu được các khối mô sẹo có biểu<br /> hiện GUS và kháng chất chọn lọc phosphinothricin ở nồng độ 3 mg/l, là nồng độ gây chết khi khảo sát khả<br /> năng chống chịu phosphinothricin ở mô sẹo không chuyển gen.<br /> Từ khóa: Agrobacterium tumefaciens, Bt, chuyển gen, sâu đục thân cây mía.<br /> <br /> MỞ ĐẦU [12]. Tính đặc hiệu và hoạt tính của độc tố Cry<br /> Hơn một thập niên qua, ngành mía đường là kết quả của sự tương tác và ly giải của tiền<br /> Việt Nam vẫn luôn gặp khó khăn do nguồn độc tố bên trong hệ thống tiêu hóa của từng loài<br /> nguyên liệu mía cung cấp không đủ để sản xuất. côn trùng cụ thể [12]. Do biến nạp vào thực vật<br /> Với nhu cầu ngày càng tăng, và theo dự kiến dùng các gen cry đơn, nguyên bản cho biểu hiện<br /> của ngành, đến năm 2020 cả nước sẽ đạt mức độc tố không cao trong giai đoạn ban đầu,<br /> tiêu thụ đường 2 triệu tấn/năm [25], việc bảo nghiên cứu chuyển gen Bt đã có những cải tiến<br /> đảm sản lượng mía đáp ứng đủ và ổn định cho trong giai đoạn sau này. Các gen cry được tổng<br /> sản xuất là vấn đề cần thiết. hợp có nhiều thay đổi trình tự so với nguyên<br /> bản, như giảm các thành phần A, T, tăng tỷ lệ C<br /> Một trong những nguyên nhân làm giảm sản + G, để thích hợp biểu hiện cao ở thực vật [5,<br /> lượng mía là do sâu hại, trong đó, nhóm sâu đục 9]; hoặc áp dụng mô hình hiệu quả quy tụ<br /> thân thuộc bộ Cánh vảy (Lepidoptera) có thể (pyramiding) để tạo hiệu quả kháng sâu cao khi<br /> gây thiệt hại có thể lên đến 30% [14, 24]. Ứng lai các gen cry có tác động khác nhau lại và<br /> dụng chuyển gen Bt là một giải pháp tiềm năng đồng chuyển vào thực vật [9].<br /> để tạo ra được các giống mía có khả năng kháng<br /> các loại sâu đục thân [3, 9, 18, 21], mà tập tính Theo các công bố, gen cry1Ab có tính kháng<br /> sống của chúng thường gây khó khăn cho việc chủ yếu với côn trùng thuộc bộ Lepidoptera [1,<br /> xử lý bằng hóa chất [14]. 2, 6, 12] và cry1B có tính kháng kép trên<br /> Lepidoptera và Coleoptera [5, 12]. Protein lai<br /> Độc tố kháng côn trùng từ Bacillus Cry1B-Cry1Ab có thể tạo hiệu ứng kháng hiệu<br /> thuringiensis (Bt) là các độc tố crystal viết tắt là quả hơn đối với Lepidoptera và cả Coleoptera<br /> Cry do các gen cry mã hóa [20]. Độc tố Cry [4].<br /> được phân loại dựa trên cơ sở đồng dạng của<br /> trình tự amino acid của tiền độc tố. Các protein PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> tiền độc tố với ít hơn 45% sự đồng nhất trình tự<br /> sẽ có hệ số khác nhau trong dãy phân hạng đầu Vật liệu<br /> tiên (ví dụ Cry1, Cry2) và ở mức dưới 78% và Giống mía: Hai giống mía được dùng để<br /> 95% đồng dạng sẽ thiết lập ranh giới cho các chuyển gen là Suphanbury 7 (Thái Lan) và<br /> dãy phân hạng thứ hai và thứ ba (ví dụ Cry1Ab) VN84 4137 (Việt Nam), được cung cấp bởi<br /> <br /> <br /> 170<br /> Phan Tuong Loc et al.<br /> <br /> Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Mía biểu hiện ở thực vật, và gen nptII kháng<br /> Đường, xã Phú An, huyện Bến Cát, tỉnh Bình kanamycin biểu hiện ở vi khuẩn. Gen bar quy<br /> Dương. định tính kháng phosphinothricin (PPT) dùng để<br /> Chủng vi khuẩn: Chủng vi khuẩn E. coli chọn lọc đối tượng chuyển gen (hình 1A).<br /> mang plasmid pCAMBIA3301-cry1Ab và Plasmid pCAMBIA3301-cry1Ab, có kích<br /> chủng E. coli DH5α. Chủng vi khuẩn thước 15,6 kb, từ plasmid pCAMBIA3301 được<br /> Agrobacterium tumefaciens EHA 105 có mang chèn thêm tổ hợp gene Pubi-1/cry1Ab/Tnos<br /> sẵn helper plasmid chứa các gen vir và gen trong TDNA (Pubi : maize ubiquitin-1 (Ubi-1)<br /> kháng kháng sinh rifampicin. promoter, Tnos: nopaline synthase (NOS)<br /> Plasmid: Plasmid pCRY1B-1Ab, kích thước terminator, cry1Ab: gen tổng hợp) (hình 1B).<br /> khoảng 17 kb, mang tổ hợp gen Pubi/cry1B- Các gen cry1Ab, cry1B-cry1Ab có nguồn gốc<br /> cry1Ab/Tnos (cry1B-cry1Ab: gen lai - tổng hợp) từ Altosaar I. (Canada), chương trình trao đổi<br /> và gen chọn lọc P70S/bar/T35S trong T-DNA khoa học.<br /> <br /> A KaR LB T35S bar P70S Tnos cry1Ab cry1B 5'UTR Ubi PUbi<br /> RB<br /> <br /> <br /> <br /> B LB T35S bar P35S PUbi cry1Ab Tnos P35S gus Tnos RB KaR<br /> <br /> <br /> <br /> Hình 1. Sơ đồ plasmid<br /> A. Plasmid pCRY1B-1Ab; B. Plasmid pCAMBIA3301-cry1Ab<br /> <br /> Môi trường Kiểm tra sự hiện diện của các gen cry1Ab và<br /> Môi trường nuôi cấy vi khuẩn gồm môi gen cry1B-cry1Ab bằng phương pháp PCR<br /> trường LB (Luria-Bertani) dùng nuôi cấy và giữ Đối với gen cry1Ab, trình tự mồi xuôi là<br /> giống E. coli và Agrobacterium tumefaciens; (F): 5’-TTC CT T GGA CGA AAT CCC ACC-<br /> môi trường AB (Chilton) dùng để chuyển gen. 3’ và mồi ngược là (R): 5’-GCC AGA ATT<br /> Môi trường nuôi cấy thực vật gồm môi GAA CAC ATG AGC GC-3’ kích thước đoạn<br /> trường khoáng cơ bản MS, vitamin MS, vitamin khuếch đại tương ứng 559 bp. Đối với gen<br /> B5, đường 30 g/l, pH 5,8; chất điều hòa sinh cry1B-cry1Ab, trình tự mồi xuôi là (F): 5’-GAT<br /> trưởng BAP, NAA. AGC AGG ACC TAT CCA AT-3’ và mồi<br /> ngược là (R): 5’-GCC GAA GAG GGA GGC<br /> Phương pháp GTC AA-3’, kích thước đoạn khuếch đại tương<br /> Biến nạp plasmid vào vi khuẩn E. coli bằng ứng là 0,5 kb. Chương trình nhiệt phản ứng<br /> xung điện PCR: 94oC/4 phút (94oC/30 giây, 50-54oC/1<br /> Biến nạp được thực hiện bằng xung điện phút, 72oC/30-90 giây), 72oC/10 phút, với 35<br /> trên máy BTX ECM 830 ở 2500 V, 40 uF, 5 ms, chu kỳ. Hỗn hợp các thành phần của phản ứng<br /> cuvette 2 mm. Vi khuẩn sau khi biến nạp được PCR gồm có 5 l buffer PCR 5X, 0,5 l dNTP<br /> chọn lọc trên môi trường LB có bổ sung 10 mM, 0,25 l taq polymerase 5 U/l, 2 l mồi<br /> kanamycin 100 mg/l và được ly trích plasmid xuôi 1 M, 2 l mồi ngược 1 M, 1 l DNA<br /> để kiểm tra đặc điểm, kích thước bằng enzyme plasmid, thêm nước cất đủ thể tích 25 l [7].<br /> cắt giới hạn HindIII [8, 15]. Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D lên quá trình tạo<br /> Biến nạp plasmid vào vi khuẩn Agrobacterium mô sẹo từ lá non<br /> tumefaciens Phần lõi lá non bên trong ngọn mía, thường<br /> Biến nạp được thực hiện bằng phương pháp ở tình trạng vô trùng, được cắt thành các khoanh<br /> CaCl2 nhiệt. Vi khuẩn sau khi biến nạp được dày 2 mm và tách các lớp lá để nuôi cấy trên<br /> cấy chọn lọc trên môi trường có bổ sung môi trường tạo mô sẹo gồm thành phần khoáng<br /> rifampicin 100 mg/l và kanamycin 100 mg/l. MS, vitamin MS, casein 0,5 g/l và agar 10 g/l,<br /> Theo dõi kết quả sau 24-48 giờ [10, 11, 16]. có bổ sung 2,4-D ở các nồng độ khác nhau<br /> <br /> <br /> 171<br /> TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 170-179<br /> <br /> (0; 1; 2; 3; 4 mg/l) để đánh giá ảnh hưởng của Để có thể lưu giữ và nhân bản, plasmid<br /> 2,4-D lên quá trình tạo mô sẹo của mẫu [19]. pCRY1B-1Ab được biến nạp vào dòng E. coli<br /> Khảo sát ảnh hưởng của BAP và NAA lên quá DH5 bằng phương pháp xung điện. Vi khuẩn<br /> trình tái sinh chồi từ mô sẹo sau khi chuyển gen được cấy trải để chọn lọc<br /> trên môi trường LB rắn có bổ sung kanamycin<br /> Mô sẹo sau thời gian nuôi sẽ được cho tái 100 mg/l. Sau 2 ngày, nhận được khoảng 70<br /> sinh chồi trên môi trường có thành phần khoáng<br /> khuẩn lạc mọc trên đĩa petri nuôi cấy, được giả<br /> MS, vitamin B5, bổ sung tổ hợp chất điều hòa<br /> định đã biến nạp plasmid pCRY1B-1Ab, trong<br /> sinh trưởng BAP (1; 2 mg/l) NAA (0,2; 0,5; 1<br /> khi ở đĩa đối chứng nuôi cấy vi khuẩn E. coli<br /> mg/l) [23].<br /> DH5 không biến nạp, không có khuẩn lạc nào<br /> Khảo sát ảnh hưởng của chất chọn lọc PPT lên xuất hiện.<br /> sự phát triển mô sẹo, cây con in vitro<br /> Các khuẩn lạc giả định biến nạp plasmid<br /> Nuôi cấy tạo mô sẹo và nuôi cấy cây con được chọn và nuôi cấy trong môi trường LB<br /> trên môi trường có bổ sung PPT ở các nồng độ lỏng có bổ sung kanamycin 100 mg/l để tách<br /> khác nhau (0; 1; 2; 3; 4; 5 mg/l) vào môi trường, plasmid và phân tích.<br /> để đánh giá ảnh hưởng của PPT lên sự phát<br /> Plasmid sau khi tách chiết, được cắt bằng<br /> triển của mô sẹo và cây con [13].<br /> enzyme giới hạn HindIII và điện di kiểm tra<br /> Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ vi trên gel agarose, cho thấy có 1 băng DNA 17 kb<br /> khuẩn Agrobacterium tumefaciens và chọn lọc phù hợp với kích thước plasmid pCRY1B-1Ab<br /> mô chuyển gen chứng tỏ các dòng E. coli DH5 đã được biến<br /> Vi khuẩn A. tumefaciens được nuôi cấy lắc nạp plasmid pCRY1B-1Ab (hình 2).<br /> qua đêm ở 28oC trong môi trường LB có bổ<br /> sung kháng sinh kanamycin 100 mg/l và L 1<br /> rifampicin 50 mg/l, sau đó, được ly tâm lấy<br /> sinh khối ở 4000 g, trong 5 phút và chuyển sang 17 kb<br /> nuôi mới trong môi trường AB ở các điều kiện<br /> như trên có bổ sung thêm acetocyringone 200<br /> M trong 1 giờ. Mô sẹo được để khô bớt độ ẩm<br /> trong tủ cấy vô trùng khoảng 30 phút, rồi ngâm<br /> 10 phút trong dịch vi khuẩn ở điều kiện áp suất<br /> thường, sau đó đưa vào điệu kiện chân không -<br /> 50 kPa trong 3 phút rồi đưa trở lại môi trường<br /> áp suất thường 5 phút, trước khi được mang ra<br /> thấm khô và chuyển sang ủ chung với vi khuẩn<br /> trên môi trường tạo mô sẹo, khoảng 2-3 ngày. Hình 2. Kiểm tra plasmid cry1B-cry1Ab sau khi<br /> Mô sẹo sau đó được rửa sạch bằng dung biến nạp vào dòng vi khuẩn E.coli DH5<br /> dịch kháng sinh cefotaxime 500 mg/l để diệt L. Thang chuẩn DNA -HindIII; 1. Plasmid kiểm tra<br /> khuẩn Agrobacterium tumefaciens, rồi chuyển được cắt bằng enzyme HindIII có kích thước khoảng<br /> sang chọn lọc mô chuyển gen trên môi trường 17 kb.<br /> tạo mô sẹo, có bổ sung cefotaxime ở nồng độ<br /> 500 mg/l và PPT ở nồng độ ngưỡng gây chết Biến nạp tạo dòng vi khuẩn Agrobacterium<br /> [17]. tumefaciens mang plasmid pCAMBIA3301-<br /> cry1Ab và dòngvi khuẩn A. tumefaciens<br /> Khảo sát sự biểu hiện của gen chỉ thị gus bằng<br /> mang plasmid pCRY1B-1Ab<br /> kỹ thuật hóa mô [13]<br /> Hai dòng E. coli mang plasmid<br /> KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN pCAMBIA3301-cry1Ab và pCRY1B-1Ab được<br /> Biến nạp tạo chủng vi khuẩn E. coli chứa nhân lên và tách plasmid. Biến nạp plasmid<br /> vector plasmid pCRY1B-1Ab pCAMBIA3301-cry1Ab và pCRY1B-1Ab vào<br /> <br /> <br /> 172<br /> Phan Tuong Loc et al.<br /> <br /> vi khuẩn Agrobacterium tumefacien EHA 105 khuếch đại từ vi khuẩn A. tumefaciens biến nạp<br /> được thực hiện bằng phương pháp xử lý nhiệt pCAMBIA3301-cry1Ab; 2. Băng DNA 559 bp được<br /> với CaCl2. khuếch đại từ vi khuẩn A. tumefaciens biến nạp<br /> pCRY1B1Ab.<br /> Vi khuẩn sau khi biến nạp được cấy chọn<br /> lọc trên môi trường LB rắn có bổ sung L PC H2O 1<br /> kanamycin 100 mg/l và rifampicin 100 mg/l (hệ 2<br /> thống binary vector) ở 28oC. Sau 2 ngày, trên<br /> các đĩa nuôi cấy xuất hiện khoảng 20 khuẩn lạc<br /> Agrobacterium tumefaciens EHA 105 giả định<br /> đã biến nạp plasmid.<br /> Tách khuẩn lạc và kiểm tra sự có mặt của<br /> các gen cry1Ab và cry1B-cry1Ab trong cấu trúc<br /> bằng phương pháp PCR với các mồi đặc hiệu. 559 bp<br /> Kết quả biểu hiện trên gel agarose với marker<br /> 1 kb cho thấy, ở dòng A. tumefaciens biến<br /> nạp plasmid pCAMBIA-Cry1Ab và dòng<br /> A. tumefaciens biến nạp plasmid pCRY1B-1Ab,<br /> sản phẩm PCR từ các plasmid được tách đều có<br /> Hình 4. Kết quả kiểm tra bằng PCR sự hiện diện<br /> băng khuếch đại của gen cry1Ab giống với đối<br /> của gen cry1B-cry1Ab trên plasmid của vi<br /> chứng dương (được khuếch đại từ<br /> khuẩn A. tumefaciens bằng PCR.<br /> pCAMBIA3301-cry1Ab của E. coli), phù hợp<br /> với trình tự mục tiêu là 559 bp (hình 3). Trong L. Thang chuẩn DNA 1 kb; PC. Băng DNA 0,5 Kb<br /> khi đó ở dòng A. tumefaciens biến nạp được khuếch đại từ vi khuẩn E. coli mang pCRY1B-<br /> Ab; 1. Băng DNA 0,5 Kb được khuếch đại từ vi<br /> pCRY1B-1Ab còn có thêm băng khuếch đại<br /> khuẩn A. tumefaciens biến nạp pCRY1B-1Ab.<br /> trình tự đặc hiệu của đoạn DNA cry1B-cry1Ab<br /> giống với đối chứng dương (được khuếch đại từ Như vậy, dòng vi khuẩn A. tumefaciens EHA<br /> pCRY1B-1Ab của E. coli) phù hợp với trình tự 105 biến nạp plasmid pCAMBIA3301-cry1Ab<br /> mục tiêu là khoảng 0,5 kb (hình 4). và dòng vi khuẩn A. tumefaciens EHA 105 biến<br /> nạp plasmid pCRY1B-1Ab đã được thực hiện<br /> L PC H2O 1<br /> thành công và có thể dùng để chuyển gen vào<br /> thực vật.<br /> Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D lên quá trình<br /> tạo mô sẹo của mô lá<br /> Mô lá non mía được nuôi cấy trên môi<br /> trường tạo mô sẹo có bổ sung chất điều hòa sinh<br /> trưởng 2,4-D ở các nồng độ khác nhau. Mô sẹo<br /> 500 bp<br /> bắt đầu hình thành sau 12 ngày ở các mép mô.<br /> Mô sẹo của giống Suphanbury 7 mềm và ướt<br /> hơn ở giai đoạn đầu, màu sắc khối mô vàng nhạt<br /> hơn so với giống VN84 4137 (hình 5). Sau 28<br /> ngày, tỉ lệ mô sẹo hình thành khác biệt rõ rệt<br /> Hình 3. Kết quả kiểm tra bằng PCR sự hiện diện nhất giữa các công thức. Công thức với nồng độ<br /> gen cry1Ab trên các plasmid của vi khuẩn 2,4-D 3 mg/l cho tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo cao nhất<br /> Agrobacterium tumefaciens. ở giống VN84 4137 và 2,4-D 2 mg/l ở giống<br /> L. Thang chuẩn DNA 1 kb; PC. Băng DNA 559 bp<br /> Suphanbury 7 (bảng 1). Tiếp tục nuôi cấy<br /> được khuếch đại từ vi khuẩn E. coli mang khoảng 1,5 tháng, mô sẹo phát triển thành các<br /> pCAMBIA3301-cry1Ab; 1. Băng DNA 559 bp được khối mô chắc, có bề mặt căng láng (hình 6).<br /> <br /> <br /> 173<br /> TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 170-179<br /> <br /> Bảng 1. Kết quả tạo mô sẹo của giống VN84 4137 và giống Suphanbury 7 trên môi trường MS có<br /> bổ sung nồng độ 2,4-D khác nhau<br /> Công thức Tỷ lệ mẫu hình thành mô sẹo Tỷ lệ mẫu hình thành mô sẹo ở<br /> 2,4-D (mg/l)<br /> thí nghiệm ở giống VN84 4137 (%) giống Suphanbury 7 (%)<br /> 1 0 0a 0 a<br /> 2 1 40 b 76,66 bd<br /> 3 2 76,67 c 96,67 c<br /> 4 3 93,33 d 80 bd<br /> 5 4 63,33 e 66,67 bde<br /> Các giá trị trung bình không theo cùng nhóm có mẫu chữ giống nhau có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở<br /> mức p = 0,01 dựa theo kiểm định thống kê LSD.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Giống VN84 4137 Giống Suphanbury 7<br /> Hình 6. Mô sẹo phát triển hình thành<br /> Hình 5. Khối mô sẹo phát sinh từ mô lá non mía sau các khối tế bào có khả năng tái sinh<br /> khoảng 20 ngày nuôi cấy<br /> <br /> Các khối mô này được mang đi tái sinh trên công thức gồm tổ hợp NAA 1 mg/l và BAP 2<br /> môi trường MS có bổ sung các tổ hợp chất điều mg/l có 100% mẫu tạo chồi ở cả hai giống mía,<br /> hòa sinh trưởng BAP và NAA khác nhau. Sau 1 số lượng chồi trên mẫu nhiều, chồi có hình dạng<br /> tuần, chồi có dấu hiệu hình thành. Số liệu được bình thường. Các công thức khác cũng hình<br /> lấy ở các công thức đạt tỷ lệ tạo chồi tuyệt đối thành chồi nhưng chậm hơn, số lượng ít hơn và<br /> sau 21 ngày. các chồi có hình dạng không đồng đều trên cùng<br /> Kết quả kiểm tra ở ngày 21 cho thấy, ở khối mô hoặc dị dạng (bảng 2, hình 7).<br /> <br /> Bảng 2. Kết quả tái sinh chồi của giống mía VN84 4137 và giống Suphanbury 7 trên môi trường<br /> MS có bổ sung các tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng BAP và NAA khác nhau<br /> Công Tỷ lệ mô sẹo hình thành chồi Tỷ lệ mô sẹo hình thành chồi trên<br /> BAP NAA<br /> thức trên một nghiệm thức ở giống một nghiệm thức ở giống<br /> (mg/l) (mg/l)<br /> TN VN84 4137 (%) Suphanbury 7 (%)<br /> 1 0 0 13,33 a 0 a<br /> 2 1 0,2 80,00 cd 60,00 c<br /> 3 1 0,5 86,67 de 73,33 cd<br /> 4 1 1 53,33 b 40,00 b<br /> 5 2 0,2 80,00 cd 80,00 d<br /> 6 2 0,5 66,67 bc 86,67 de<br /> 7 2 1 100 e 100 e<br /> Các giá trị trung bình không theo cùng nhóm có mẫu chữ giống nhau có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở<br /> mức p = 0,01 dựa theo kiểm định thống kê Duncan.<br /> <br /> <br /> 174<br /> Phan Tuong Loc et al.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> VN84 4137 Suphanbury 7<br /> Hình 7. Chồi giống VN84 4137 và Suphanbury 7 hình thành từ mô sẹo<br /> trên môi trường có các tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng BAP 2 mg/l và NAA 1 mg/l<br /> <br /> Nghiên cứu ảnh hưởng của PPT lên khả năng hai giống mía sau một tháng, trong khi ở các<br /> phát triển mô sẹo, cây con in vitro nồng độ cao hơn thời gian chết trong khoảng 1-<br /> Mô sẹo sau một tháng nuôi cấy của cả hai 2 tuần (hình 8).<br /> giống mía VN84 4137 và Suphanbury 7 được Các cây mía con in vitro của cả hai giống<br /> chuyển sang môi trường có bổ sung PPT ở các mía VN84 4137 và Suphanbury 7 được nuôi<br /> nồng khác nhau. Từ nồng độ 1 mg/l các khối cấy trên môi trường MS có bổ sung PPT ở các<br /> mô sẹo bắt đầu chuyển sang màu vàng đậm hơn nồng độ khác nhau như trên. Sau 10 ngày, ở<br /> do tích tụ ammonia sau 2 tuần. Ở nồng độ 3 nồng độ PPT từ 3 mg/l, các cây con đều vàng lá<br /> mg/l tất cả các mô sẹo hóa nâu đen và chết ở cả và chết dần (hình 9).<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> VN84 4137 Suphanbury 7<br /> Hình 8. Ảnh hưởng của PPT ở nồng độ 3 mg/l gây chết mô sẹo<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> PPT 2 mg/l PPT 3 mg/l<br /> Hình 9. Ảnh hưởng của PPT ở các nồng độ khác nhau<br /> đối với sự phát triển của cây mía con VN84 4137 in vitro<br /> <br /> <br /> 175<br /> TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 170-179<br /> <br /> Bước đầu chuyển gen mô sẹo mía thông qua tuần chuyển gen, nhuộm sơ bộ một số cụm mô<br /> vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens chuyển gen với plasmid pCAMBIA3301-<br /> cry1Ab trong dung dịch X-Gluc thu được các<br /> Mô sẹo mía sau 1 tháng nuôi cấy trên môi mô có màu xanh dương đậm đặc trưng, có thể<br /> trường có 2,4-D ở 3 mg/l cho giống VN84 4137 giả định các mô này đã được chuyển gen và có<br /> và 2 mg/l cho giống Suphanbury 7 có hình thái biểu hiện GUS (hình 10). Sau 4 tuần hầu hết các<br /> đồng nhất sẽ được xử lý chuyển gen với hai mô sẹo nâu hóa và chết, một số cụm mô nhỏ có<br /> dòng vi khuẩn A.tumefaciens mang plamid khả năng sống trên PPT ở nồng độ 3 mg/l tiếp<br /> pCAMBIA3301-cry1Ab và pCRY1B-1Ab. Các tục phát triển mô mới. Số lượng mô kháng được<br /> mô sẹo được tiếp tục nuôi cấy chọn lọc trên môi PPT 3 mg/l khoảng từ 2-4% mẫu chuyển gen<br /> trường tạo mô sẹo có bổ sung PPT 3 mg/l. Sau 2 (bảng 3, hình 11).<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> VN84 4137 Suphanbury 7<br /> Hình 10. Mô sẹo chuyển gen plasmid pCAMBIA3301-cry1Ab biểu hiện<br /> gen gus khi nhuộm trong dung dịch X-Gluc<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Giống VN84 4137 pCAMBIA3301-cry1Ab Giống Suphanbury 7 pCAMBIA3301-cry1Ab<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Giống Suphanbury 7 pCRY1B-1Ab Giống VN84 4137 pCRY1B-1Ab<br /> Hình 11. Mô sẹo chuyển gen được chọn lọc trên môi trường tạo mô sẹo<br /> <br /> 176<br /> Phan Tuong Loc et al.<br /> <br /> Bảng 3. Tỷ lệ mô sẹo phát triển trên môi trường chọn lọc PPT 3 mg/l sau 4 tuần chuyển gen<br /> pCAMBIA3301-cry1Ab pCRY1B-1Ab<br /> Giống VN84 4137 2% 3%<br /> Giống Suphanbury 7 4% 3%<br /> <br /> Thảo luận cảm ứng tạo mô sẹo ở giống mía VN84 4137 là<br /> Suphanbury 7 và VN84 4137 là hai giống 3 mg/l, Suphanbury 7 là 2 mg/l. Tổ hợp chất<br /> mía có năng suất và hàm lượng đường cao, CCS điều hòa sinh trưởng cho tỉ lệ tái sinh chồi<br /> trên 11% đang được trồng nhiều trong các vùng 100% từ mô sẹo ở hai giống mía VN84 4137 và<br /> nguyên liệu mía. Việc có thể thích hợp nuôi cấy Suphanbury 7 cao nhất là BAP 2 mg/l, NAA 1<br /> in vitro, làm cơ sở cho các ứng dụng công nghệ mg/l.<br /> sinh học đối với hai giống mía này, mang ý Xác định được nồng độ PPT gây chết mô<br /> nghĩa thực tiễn cao. sẹo và cây con có thể dùng làm nồng độ bắt đầu<br /> Mô lá non tạo mô sẹo 93,33-96,67% trên chọn lọc các đối tượng chuyển gen trong điều<br /> môi trường có bổ sung 2,4-D ở nồng độ 2-3 kiện in vitro là 3 mg/l.<br /> mg/l tương tự với nghiên cứu của một số tác giả Bước đầu thu được 2-4% mô sẹo chuyển<br /> trước đây [2, 19, 23], các mẫu mô sẹo tái sinh gen giả định có biểu hiện gen gus và phát triển<br /> chồi đạt tỉ lệ 100% trên môi trường có bổ sung tốt trên môi trường chọn lọc với PPT 3 mg/l.<br /> BAP 2 mg/l và NAA 1 mg/l là các điều kiện Các mô chuyển gen giả định sẽ được tiếp<br /> thuận lợi để ứng dụng chuyển gen. tục chọn lọc trên môi trường có bổ sung PPT ở<br /> Mô sẹo và cây mía con khá nhạy cảm với nồng độ cao hơn (5 mg/l) để chọn lọc mô và tái<br /> PPT, là một chất chọn lọc mạnh, bị ức chế sinh sinh cây thuần. Cây chuyển gen sẽ được phân<br /> trưởng và chết ở nồng độ 3 mg/l, Điều này giúp tích bằng các kỹ thuật sinh học phân tử để xác<br /> khả năng chọn lọc cây thuần cao, tuy nhiên, sẽ định đặc điểm di truyền và biểu hiện gen.<br /> khó nhân mô và tái sinh cây trong quá trình Lời cảm ơn: Các tác giả xin chân thành cảm ơn<br /> chọn lọc. Bộ Khoa học và Công nghệ, Viện Khoa học và<br /> Các dòng Agrobacterium tumefaciens sau Công nghệ Việt Nam đã hỗ trợ về kinh phí cho<br /> khi được biến nạp plasmid pCAMBIA3301- công trình này.<br /> cry1Ab và pCRY1B-1Ab được dùng để chuyển<br /> gen vào hai giống mía. Kết quả bước đầu nhận TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> được các mô sẹo biểu hiện GUS ở hai giống mía 1. Arvinth S., Selvakesavan R. K.,<br /> chuyển gen với plasmid pCAMBIA3301- Subramonian N., Premachandran M. N.,<br /> cry1Ab và các mô sẹo chuyển gen từ cả hai 2009. Transmission and expression of<br /> plasmid pCAMBIA3301-cry1Ab và pCRY1B- transgenes in progeny of sugarcane clones<br /> 1Ab có khả năng chống chịu và tiếp tục phát with cry1Ab and aprotinin genes, Sug Tech,<br /> triển trên môi trường có bổ sung PPT 3 mg/l, 11(3): 290-295.<br /> điều này cho thấy, biến nạp gen từ<br /> 2. Arvinth S., Arun S., Selvakesavan R. K.,<br /> Agrobacterium vào mô sẹo mía đã được thực<br /> Srikanth J., Mukunthan N., Ananda Kumar<br /> hiện. Các mô sẹo chuyển gen sẽ được tiếp tục<br /> P., Premachandran M. N., Subramonian N.,<br /> chọn lọc và cho tái sinh thành cây hoàn chỉnh.<br /> 2010. Genetic transformation and<br /> KẾT LUẬN pyramiding of aprotinin-expressing<br /> sugarcane with cry1Ab for shoot borer<br /> Tạo được hai chủng Agrobacterium (Chilo infuscatellus) resistance, Plant Cell<br /> tumefaciens dùng để chuyển gen mía, gồm Rep., 29: 383-395.<br /> chủng chứa plasmid pCRY1B-1Ab và chủng<br /> 3. Arencibia A. D., Vaquez R. I., Prieto D.,<br /> chứa plasmid pCAMBIA3301-cry1Ab.<br /> Tellez P., Carmona E. R., Coego A.,<br /> Xác định được nồng độ 2,4-D thích hợp Hernandez L., de La Riva G. A., Housein G.<br /> <br /> 177<br /> TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 170-179<br /> <br /> S., 1997. Transgenic sugarcane plants 2001. How Bacillus thuringiensis has<br /> resistant to stem borer attack. Mol. Breed, 3: evolved specific toxins to colonize the<br /> 247-255. insect world. TRENDS in Genetics, 17(4):<br /> 4. Bano-Maqbool S., Riazuddin S., Loc N. T., 193-199.<br /> Gatehouse A. M. R., Gatehouse J. A., 13. Enriquez-Obregon G. A., 1998. Herbicide-<br /> Christou P., 2001. Expression of multiple resistant sugarcane (Saccharum offcinarum<br /> insecticidal genes confers broad resistance L.) plants by Agrobacterium-mediated<br /> against a range of different rice pests. Mol. transformation. Planta, 206: 20-27.<br /> Breed, 7: 85-93. 14. Fauconnier R., 1993. Sugar cane,<br /> 5. Bohorova N., Frutos R., Royer M., Estanol Macmillan Press Ltd, London, UK.<br /> P., Pacheco M., Rascon Q., Mclean S., 15. Fiedler S., Wirth R., 1988. Transformation<br /> Hoisington D., 2001. Novel synthetic of bacteria with plasmid DNA by<br /> Bacillus thuringiensis cry1B gene and the electroporation. Anal. Biochem., 170: 38-<br /> cry1B-cry1Ab translational fusion confer 44.<br /> resistance to southwestern corn borer,<br /> sugarcane borer and fall armyworm in 16. Hanahan D., 1983. Studies on the<br /> transgenic tropical maize. Theor. Appl. transformation of Escherichia coli with<br /> Genet., 103: 817-826. plasmids. J. Mol. Biol., 166: 557-580.<br /> 6. Braga D. P. V., Arrigoni E. D. P., Silvia- 17. Joyce P., Kuwahata M., Turner N.,<br /> Filho M. C., Ulian E. C., 2003. Expression Lakshmanan P., 2010. Selection system and<br /> of the Cry1Ab protein in genetically co-cultivation medium are important<br /> modified sugarcane for the control of determinants of Agrobacterium-mediated<br /> Diatraea saccharalis (Lepidoptera: transformation of sugarcane. Plant Cell<br /> Crambidae). J. New Seeds, 5: 209-222. Rep., 29: 173-183.<br /> 7. Casali N., Preston A., 2003. Methods in 18. Kim S., Kim C., Li W., Kim T., Li Y., Zaidi<br /> molecular Biology. E.coli plasmid vector. M. A., Altosaar I., 2008. Inheritance and<br /> Methods and applications, Humana Press, field performance of transgenic Korean Bt<br /> 235: 316. rice lines resistant to rice yellow stem borer.<br /> Euphytica, 164: 829-839.<br /> 8. Chassy B.M. and Flickinger J.L., 1987.<br /> Transformation of Lacobacillus casei by 19. Rashid H., Khan S. A., Zia M., Chaudhary<br /> electroporation. FEMS Microbiol Lett, 44: M. F., Hanif Z., Chaudary Z., 2009. Callus<br /> 173-177. induction and regeneration in elite<br /> 9. Christou P., Capell T., Kohli A., Gatehouse sugarcane cultivar hsf-240. Pak. J. Bot.,<br /> J. A., Gatehouse A. M. R., 2006. Recent 41(4): 1645-1649.<br /> developments and future prospects in insect 20. Schnepf H. E., Crickmore N., Van Rie N.,<br /> pest control in transgenic crops. TRENDS Dereclus J., Baum J., Feitelson J., Zeigler<br /> in Plant Science, 11(6): 302-308. D.R., Dean D. H., 1998. Bacillus<br /> 10. Cohen S. N., Chang A. C. Y., Hsu L., 1972. thuringiensis and its pesticidal crystal<br /> Nonchromosomal antibiotic resistance in proteins. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 62:<br /> bacteria: genetic transformation of 775-806.<br /> Escherichia coli by R-factor DNA. Proc.<br /> 21. Valderrama A. M., Velasquez N., Rodriguez<br /> Natl. Acad. Sci. USA, 69: 2110-2114.<br /> E., Zapata A., Zaidi M. A., Altosaar I.,<br /> 11. Dagert M., Erlich S. D., 1979. Prolonged Arango R., 2007. Resistance to Tecia<br /> incubation in calcium chloride improves the solanivora (Lepidoptera : Gelechiidae) in<br /> competence of Escherichia coli cells. Gene, three transgenic Andean varieties of potato<br /> 6: 23-28. expressing Bacillus thuringiensis Cry1Ac<br /> 12. de Maagd R. A., Bravo A., Crickmore N., protein. J. Econ. Entomol., 100: 172-179.<br /> <br /> <br /> 178<br /> Phan Tuong Loc et al.<br /> <br /> 22. Weng L. X., Deng H., Xu J. L., Wang L. H., transgenic sugarcane (var. badila)<br /> Jiang Z., Zhang H. B., Li Q., Zhang L. H., transformed with RS gene. Sugar Tech,<br /> 2006. Regeneration of sugarcane elite 10(2): 128-132.<br /> breeding lines and engineering of stem borer<br /> 24. Http://www.baodongnai.com.vn/tuvan/2012<br /> resistance. Pest Manage Sci., 62:178-187.<br /> 04/Phong-tru-sau-benh-hai-mia-2150229/.<br /> 23. Xu L. P., Que Y. X., Xu J. S., Fang S. R.,<br /> Zhang M. Q., Chen Y. Q., Chen R. K., 25. Http: //www.thesaigontimes.vn/Home/<br /> 2008. Establishment of genetic kinhdoanh/dautu/45285/10-nam-i-ach-1-<br /> transformation system and obtaining trieu-tan-duong.html.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> PRELIMINARY TRANSFORMATION OF Saccharum officinarum L.<br /> WITH Bt GENE<br /> <br /> Phan Tuong Loc, Hoang Van Duong, Mai Truong, Le Tan Duc, Tran Thi Ngoc Ha,<br /> Van Dac Thanh, Pham Duc Tri, Nguyen Thi Thanh, Nguyen Huu Ho<br /> Institute of Tropcial Biology, VAST<br /> <br /> <br /> SUMMARY<br /> <br /> Borer is one of the major pests of sugarcane that can cause a loss of crop yield. Spraying pesticides for<br /> the control of borer faces obstacles because the pest lives inside sugarcane stem and sugarcanes with sharp<br /> leaves are planted at high density in fields. Transformation of two sugarcane varieties, VN 84 4137 and<br /> Suphabury 7, with synthetic Bt genes, cry1Ab and hybrid cry1B-cry1Ab, aims to provide effective resistance<br /> against pests, mainly borer. Two strains of Agrobacterium tumefaciens were transformed with plasmids<br /> containing cry1Ab gene or cry1B-cry1Ab gene for plant transformation. Sugarcanes were investigated in vitro<br /> conditions of cultivation, which indicated that the highest calli formation from the young leaf rolls was<br /> obtained on the medium with 3 mg/l 2,4-D for VN84 4137 at 93.33% and 2 mg/l 2,4-D for Suphanbury 7 at<br /> 96.67%. The highest number of calli forming shoots was achieved on the medium with the combination of 2<br /> mg/l BAP and 1 mg/l NAA at 100% for two varieties. Preliminary Agrobacterium-mediated transformation of<br /> sugarcane was obtained with calli expressing GUS and/or resistant to phosphinothricin at 3 mg/l, which was<br /> the lethal threshold for wild-type callus and in vitro young plants.<br /> Keywords: Agrobacterium tumefaciens, Bt, sugarcane, gen-transformation.<br /> <br /> Ngày nhận bài: 21-6-2012<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 179<br />
ADSENSE
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2