intTypePromotion=3

Bước đầu tinh sạch carrageenan thu nhận từ rong sụn (Kappaphycus alvarezii) nuôi trồng tại Cam Ranh, Khánh Hòa

Chia sẻ: Danh Tuong Vi | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:6

0
3
lượt xem
1
download

Bước đầu tinh sạch carrageenan thu nhận từ rong sụn (Kappaphycus alvarezii) nuôi trồng tại Cam Ranh, Khánh Hòa

Mô tả tài liệu
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Carrageenan là một polysaccharid được thu nhận từ rong sụn, có thành phần cấu tạo chủ yếu từ các gốc D-galactose và 3-6 anhydro galactose liên kết nhau bằng liên kết βD (1-4) và αD (1-3) galactosid luân phiên nhau. Đáng chú ý, trong gốc D-galactose được sulphate hóa, dựa vào số nhóm sulphate và vị trí đính trên mạch carbon mà phân ra các loại tồn tại trong tự nhiên như: làm da, iota, kappa.

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Bước đầu tinh sạch carrageenan thu nhận từ rong sụn (Kappaphycus alvarezii) nuôi trồng tại Cam Ranh, Khánh Hòa

Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản - số 04/2008<br /> VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU<br /> <br /> BƯỚC ĐẦU TINH SẠCH CARRAGEENAN THU NHẬN TỪ RONG SỤN<br /> (Kappaphycus alvarezii) NUÔI TRỒNG TẠI CAM RANH, KHÁNH HÒA<br /> INITIAL RESEARCH ON PURIFYING CARRAGEENAN EXTRACTED FROM Kappaphycus<br /> alvarezii SEAWEAD IN CAM RANH, KHANH HOA<br /> <br /> 1<br /> <br /> Vũ Ngọc Bội1, Nguyễn Văn Ninh2<br /> Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại học Nha Trang<br /> 2<br /> Đại học Công nghiệp TP. Hồ Chí Minh<br /> <br /> Tóm tắt<br /> Carrageenan là một polysaccharid được thu nhận từ rong sụn, có thành phần cấu tạo chủ yếu từ<br /> các gốc D-galactose và 3-6 anhydro galactose liên kết nhau bằng liên kết βD (1-4) và αD (1-3)<br /> galactosid luân phiên nhau [1]. Đáng chú ý, trong gốc D-galactose được sulphate hóa, dựa vào số<br /> nhóm sulphate và vị trí đính trên mạch carbon mà phân ra các loại tồn tại trong tự nhiên như: làm da,<br /> iota, kappa. Sử dụng phương pháp sắc ký cột trao đổi ion để tinh sạch carrageenan theo phân đoạn.<br /> Sau khi giữ carrageenan trên cột dùng dung dịch NaCl 3mol rửa giải thu phân đoạn có hàm lượng<br /> carrageenan cao nhất.<br /> Abstract<br /> Carrageenan is a linear polysaccharide extracted from Kappaphycus alvarezii seawead.<br /> Carrageenan is a large molecule being made up of 3.6-anhydro-D-galactose and D-galactose<br /> residues linked with alternating (1 3) linkages and (1 4) linkages. In addition, sulfate ester<br /> groups may be present on some or all galactose units. Depending on the position and the amount of<br /> sulfate ester groups, carrageenans can be classified according to Kappa, iota, or lambda<br /> carrageenans. Carrageenans can be purified by ion exchange chromatography. Carrageenans in the<br /> ion exchange column can be released by eluting the column with 3M NaCl solution.<br /> I. MỞ ĐẦU<br /> Rong sụn (Kappaphycus alvarezii Maxwell<br /> <br /> rong sụn được dùng làm nguyên liệu để thu<br /> nhận carrageenan. Carrageenan là polysaccharid<br /> <br /> Doty, 1972) được du trồng vào Việt Nam từ<br /> những năm 1993[1]. Hiện nay, rong sụn được<br /> <br /> được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như trong<br /> chế biến thực phẩm, mỹ phẩm, … và đặc biệt là<br /> <br /> nuôi trồng tại các tỉnh ven biển Việt Nam từ Đà<br /> Nẵng đến Kiên Giang; tại Khánh Hòa rong sụn<br /> <br /> dùng trong dược phẩm. Để có thể sử dụng<br /> carrageenan trong dược phẩm người ta đòi hỏi<br /> <br /> được nuôi trồng nhiều ở Cam Ranh, vịnh Vân<br /> <br /> carrageenan phải có độ tinh sạch cao. Tuy vậy,<br /> <br /> Phong, Ninh Hòa và xung quanh đảo Trường<br /> Sa. Rong sụn thường được trồng theo mô hình<br /> <br /> với phương pháp xử lý, nấu chiết thông thường,<br /> carrageenan thu được thường chứa nhiều tạp<br /> <br /> kết hợp với nuôi các loài thủy sản khác, đây là<br /> dạng mô hình nuôi trồng kết hợp đang được<br /> <br /> chất như các lọai glucid khác, khoáng và có thể<br /> còn chứa cả một số tạp chất vật lý. Do vậy việc<br /> <br /> quan tâm phát triển ở nước ta hiện nay. Sản<br /> lượng rong sụn ở nước ta vào khoảng 300.000<br /> <br /> nghiên cứu tinh chế carrageenan nhằm loại bỏ<br /> các tạp chất để thu nhận carrageenan có độ tinh<br /> <br /> tấn/năm, phần lớn rong sụn được phơi khô và<br /> <br /> khiết cao là rất cần thiết trong công nghệ.<br /> <br /> xuất khẩu dạng nguyên liệu thô. Trên thế giới<br /> <br /> 30<br /> <br /> Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản - số 04/2008<br /> Trong bài báo này chúng tôi chỉ trình bày một<br /> phần nghiên cứu của chúng tôi về quá trình tinh sạch<br /> <br /> 2.2.2. Phương pháp tinh sạch carrageenan<br /> <br /> carrageenan để sử dụng cho lĩnh vực dược phẩm.<br /> II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> <br /> sephadex G50, ngâm làm trương nở trong nước<br /> cất, nhồi lên cột kích thước 60 x1,5cm và tiến<br /> <br /> 2.1. Đối tượng nghiên cứu<br /> <br /> hành cân bằng cột [2][4][6][5].<br /> Cân 5g carrageenan thô hòa tan trong<br /> <br /> Chuẩn bị cột trao đổi ion: Cân 5g DEAE<br /> <br /> Đối tượng nghiên cứu là carrageenan thu<br /> nhận từ rong sụn (Kappaphycus alvarezii<br /> <br /> 100ml nước cất, lọc thu dịch trong và tiến hành<br /> <br /> Maxwell Doty, 1972) nuôi trồng tại Khánh Hòa.<br /> Carrageenan thu nhận từ rong sụn theo quy<br /> <br /> bơm mẫu carrageenan lên cột. Đẩy<br /> carrageenan ra khỏi cột trao đổi bằng dung dịch<br /> <br /> trình nầu chiết như sau: Rong nguyên liệu →<br /> Rửa sạch → Xử lý KOH → Trung hòa bằng acid<br /> <br /> rửa giải có nồng độ NaCl thay đổi từ 0,5 – 5<br /> mol, tốc độ chạy cột 4ml/phút. Tách<br /> <br /> acetic → Rửa lại → Nấu chiết → Lọc → Kết tủa<br /> bằng cồn → Sấy khô → Bao gói. Carrageenan<br /> <br /> carrageenan theo 10 phân đoạn, chọn phân<br /> đoạn có hàm lượng carrageenan cao nhất để<br /> <br /> khô thu được (Hình 1) dùng làm nguyên liệu cho<br /> <br /> phân tích hàm lượng sulphate và hàm lượng 3-<br /> <br /> quá trình tinh sạch sau này.<br /> <br /> 6 anhydro – galactose có trong carrageenan.<br /> Loại muối ra khỏi carrageenan tinh sạch bằng<br /> cách kết tủa bằng ethanol 96%; Rửa tủa<br /> carrageenan bằng aceton.<br /> 2.2.3. Phương pháp xác định hàm lượng<br /> carrageenan<br /> Lấy 1ml mẫu thử thêm 0,5ml dung dịch<br /> thuốc thử toluidine blue 0,01mg/ml để 30 phút<br /> và so màu ở bước sóng 620nm. Dựa vào<br /> <br /> Hình 1. Hình ảnh về carrageenan<br /> 2.2. Phương pháp nghiên cứu<br /> 2.2.1. Phương pháp phân tích hoá học<br /> - Xác định hàm lượng tro tổng số bằng<br /> phương pháp nung theo tiêu chuẩn TCVN 510590 [3].<br /> - Xác định ni tơ tổng số theo phương pháp<br /> Kjeldal theo tiêu chuẩn TCVN 3705-90 [3].<br /> - Xác định hàm lượng protein theo phương<br /> pháp Lowry [3].<br /> 2+<br /> - Định lượng hàm lượng ion kim loại: Fe ,<br /> 2+<br /> <br /> Cu ,… bằng máy quang phổ hấp phụ nguyên<br /> tử (AAS) [9].<br /> <br /> đường chuẩn tính hàm lượng carrageenan có<br /> trong mẫu [4].<br /> 2.2.4. Phương pháp xác định hàm lượng<br /> sulphate có trong carrageenan<br /> Lấy 10ml dung dịch thử, thêm 1ml dung<br /> dịch HCl 6M, tiếp tục thêm 5ml sorbitol 70%,<br /> sau đó thêm 1mg BaCl2 tinh thể và lắc đều, để<br /> khoảng 2 phút và so màu ở bước sóng 470 nm.<br /> Dựa vào đường chuẩn carrageenan để tính<br /> hàm lượng carrageenan có trong mẫu và đường<br /> chuẩn K2SO4 để tính hàm lượng SO4 có nồng<br /> độ từ 10-50µg/ml [4], [6].<br /> 2.2.5. Phương pháp xác định hàm lượng 3-6<br /> anhydro- galactose có trong carrageenan.<br /> Lấy 1ml dung dịch thử và 10ml recorcinol –<br /> o<br /> acetan, lắc đều và giữ ở 20 C trong 4 phút. Sau<br /> o<br /> <br /> - Xác định hàm lượng galactose tổng số<br /> <br /> đó tiếp tục nâng nhiệt của hỗn hợp lên 80 C,<br /> trong khoảng 10 phút. Làm lạnh để đưa hỗn<br /> <br /> theo phương pháp Duebois (1956) so màu ở<br /> bước sóng 484 - 490nm, trên máy so mầu UV-<br /> <br /> hợp về 50 C và so màu trên máy UV-VIS ở<br /> <br /> Vis [4].<br /> <br /> o<br /> <br /> bước sóng 555nm [4]. Dựng đường chuẩn<br /> galactose trong khoảng 10 - 50µg galactose /ml.<br /> <br /> 31<br /> <br /> Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản - số 04/2008<br /> Dựa vào đường chuẩn galactose để xác định<br /> hàm lượng 3-6 anhydro- galactose có trong<br /> <br /> NaCl thay đổi từ 0,5 ÷ 3M hàm lượng<br /> carrageenan đẩy ra khỏi cột trao đổi ion tăng<br /> <br /> carrageenan.<br /> III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN<br /> <br /> theo nồng độ NaCl, tại nồng độ NaCl 3M hàm<br /> lượng carrageenan đẩy ra khỏi cột đạt giá trị<br /> <br /> 3.1. Kết quả tinh sạch carrageenan qua cột<br /> trao đổi ion DEAE sephadex<br /> <br /> cực đại, tiếp tục tăng nồng độ NaCl từ 3,5 ÷<br /> 5mol hàm lượng carrageenan tách ra khỏi cột<br /> <br /> Tiến hành tách carrageenan qua cột trao<br /> <br /> giảm xuống rất nhanh.<br /> <br /> đổi ion DEAE sephadex G50 cột 60 x1,5cm,<br /> o<br /> nhiệt độ tách 60 C. Sau khi nạp carrageenan<br /> <br /> Như vậy nồng độ NaCl thích hợp cho quá<br /> trình rửa giải carrageenan ra khỏi cột cột trao<br /> <br /> lên cột, tiến hành rửa trôi các tạp chất không<br /> gắn trên cột như các ion kim loại, một số tạp<br /> <br /> đổi ion DEAE sephadex G50 (cột 60 x1,5cm) là<br /> 3M.<br /> <br /> chất khác bằng nước cất. Sau đó rửa giải<br /> carrageenan ra khỏi cột bằng dung dịch rửa giải<br /> có nồng độ NaCl thay đổi từ 0,5 – 5 mol, tốc độ<br /> chạy cột 4ml/phút, thu 10 phân đoạn. Kết quả<br /> tinh sạch carrageenan được biểu diễn ở hình 2.<br /> Từ hình 2 cho thấy, khi dùng nồng độ NaCl<br /> rửa giải thay đổi tuyến tính từ 0,5 ÷ 5M, lần lượt<br /> hàm lượng carrageenan được tách ra biến đổi<br /> tương ứng với 10 đỉnh. Khi gradient nồng độ<br /> <br /> 0 ,2 3<br /> <br /> H à m l ư ợ n g (m g / m l )<br /> <br /> C a rra g e e n a n<br /> <br /> 4 ,5<br /> 4 ,0<br /> 3 ,5<br /> <br /> 0 ,2 2<br /> <br /> 3 ,0<br /> 2 ,5<br /> 2 ,0<br /> <br /> 0 ,2 2<br /> 0 ,2 1<br /> <br /> N ồng độ N aC l<br /> (m o l )<br /> <br /> NaCl<br /> <br /> 0 ,2 3<br /> <br /> 5 ,5<br /> 5 ,0<br /> <br /> 1 ,5<br /> 1 ,0<br /> 0 ,5<br /> 0 ,0<br /> <br /> 0 ,2 1<br /> 0 ,2 0<br /> <br /> 1<br /> <br /> 2<br /> <br /> 3<br /> <br /> 4<br /> <br /> 5<br /> <br /> 6<br /> <br /> 7<br /> <br /> 8<br /> <br /> 9<br /> <br /> 10<br /> <br /> P hân đ oạn<br /> Hình 2. Sắc ký đồ quá trình tinh sạch carrageenan<br /> trên cột trao đổi ion DEAE sephadex G50 (cột 60 x1,5cm)<br /> <br /> 3.2. Xác định hàm lượng sunfat trong<br /> carrageenan tinh chế<br /> Tính chất đặc biệt của carrageenan thể<br /> -<br /> <br /> hiện ở nhóm chức sulphate (OSO3 ), đây là<br /> nhóm gắn liền trên mạch carbon của phân tử<br /> <br /> 32<br /> <br /> carrageenan. Kết quả phân tích hàm lượng<br /> sulphate trong carrageenan tinh sạch qua cột<br /> trao đổi ion DEAE sephadex G50 được biểu<br /> diễn trên hình 3.<br /> <br /> 70<br /> <br /> 6<br /> <br /> NaCl<br /> <br /> 60<br /> <br /> Sulphate<br /> <br /> 5<br /> <br /> 50<br /> <br /> 4<br /> <br /> 40<br /> 3<br /> <br /> Nồng độ NaCl (mol)<br /> <br /> Hàm lượng(microgam/ml)<br /> <br /> Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản - số 04/2008<br /> <br /> 30<br /> 2<br /> <br /> 20<br /> <br /> 1<br /> <br /> 10<br /> 0<br /> <br /> 0<br /> 1<br /> <br /> 2<br /> <br /> 3<br /> <br /> 4<br /> <br /> 5<br /> <br /> 6<br /> <br /> 7<br /> <br /> 8<br /> <br /> 9<br /> <br /> 10<br /> <br /> Hình 3. Sự biến đổi hàm lượng sulphate trong carrageenan<br /> tinh sạch qua cột trao đổi ion DEAE sephadex G50 (cột 60 x1,5cm)<br /> tăng nồng độ muối lên 3,5-5 mol thì hàm lượng<br /> <br /> dùng muối NaCl để rửa giải carrageenan qua<br /> <br /> sulphate giảm mạnh. Nhìn chung, trong 3 phân<br /> <br /> cột trao đổi ion, tương ứng với sự thay đổi của<br /> hàm lượng carrageenan tách ra khỏi khỏi cột thì<br /> <br /> đoạn đầu hàm lượng sulphate biến đổi có khác<br /> biệt với sự tăng hàm lượng carrageenan, nhưng<br /> <br /> hàm lượng sulphate trong carrageenan cũng có<br /> sự khác biệt ở một số phân đoạn. Trong các<br /> phân đoạn tách ra qua cột tương ứng với nồng<br /> độ NaCl rửa giải từ 0,5-1M, hàm lượng sulphate<br /> <br /> về sau biến đổi tương ứng với hàm lượng<br /> carrageenan.<br /> 3.3. Xác định hàm lượng 3-6 anhydro trong<br /> chế phẩm carrageenan<br /> <br /> trong carrageenan cũng có sự biến đổi chút ít.<br /> <br /> Tính chất tạo gel của carrageenan thể hiện<br /> <br /> Tuy vậy, tại phân đoạn tương ứng với nồng độ<br /> NaCl rửa giải 3M carrageenan có hàm lượng<br /> <br /> ở nhóm chức anhydro (-OH), đây là nhóm gắn<br /> trên mạch carbon tại vị trí số 03 và 06 của phân<br /> <br /> sulphate cao nhất, tương ứng với hàm lượng<br /> carrageenan tách ra cao nhất, đồng thời tiếp tục<br /> <br /> tử carrageenan. Kết quả nghiên cứu được biểu<br /> diễn ở hình 4.<br /> <br /> Hàm lượng(mg/ml)<br /> <br /> 0,04<br /> <br /> 6<br /> <br /> NaCl<br /> <br /> 0,04<br /> <br /> 3-6 anhydro<br /> 5<br /> <br /> 0,03<br /> 4<br /> <br /> 0,03<br /> 0,02<br /> <br /> 3<br /> <br /> 0,02<br /> <br /> Nồng độ NaCl (mol)<br /> <br /> Từ kết quả phân tích ở hình 3 cho thấy, khi<br /> <br /> 2<br /> <br /> 0,01<br /> 1<br /> <br /> 0,01<br /> 0,00<br /> <br /> 0<br /> <br /> 1<br /> <br /> 2<br /> <br /> 3<br /> <br /> 4<br /> <br /> 5<br /> <br /> 6<br /> <br /> 7<br /> <br /> 8<br /> <br /> 9<br /> <br /> 10<br /> <br /> Phân đọan<br /> Hình 4. Sự biến đổi hàm lượng 3-6 anhydro trong carrageenan tinh sạch qua cột trao đổi<br /> ion DEAE sephadex G50 (cột 60 x1,5cm)<br /> <br /> 33<br /> <br /> Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản - số 04/2008<br /> Từ hình 4 cho thấy, hàm lượng 3-6<br /> anhydro tăng theo chiều tăng hàm lượng<br /> <br /> 3.4. Đánh giá độ sạch của chế phẩm<br /> carrageenan sau khi tinh sạch qua cột trao<br /> <br /> carrageenan được đẩy ra, tại phân đoạn thứ 6,<br /> tức phân đoạn đoạn tương ứng với nồng độ<br /> <br /> đội ion DEAE sephadex G50<br /> <br /> NaCl rửa giải 3M, hàm lượng carrageenan<br /> được tách ra nhiều nhất, tương ứng với hàm<br /> <br /> galactose mạch thẳng với mức độ sulphat hóa<br /> khác nhau nên thành phần monosaccharid trong<br /> <br /> lượng sulphate và hàm lượng 3-6 anhydro cao<br /> <br /> carrageenan chủ yếu là galactose. Kết quả phân<br /> <br /> nhất.<br /> Nhìn vậy sự biến đổi hàm lượng 3-6<br /> <br /> tích hàm lượng monosaccharid, hàm lượng các<br /> ion kim loại, và các tạp chất khác của<br /> <br /> anhydro trong carrageenan tỷ lệ với sự biến đổi<br /> của hàm lượng carrageenan tinh sạch qua cột<br /> <br /> carrageenan tinh sạch qua cột trao đổi ion<br /> DEAE sephadex G50 được trình bày ở bảng 1<br /> <br /> trao đổi ion DEAE sephadex G50 (cột 60<br /> x1,5cm).<br /> <br /> và hình 5.<br /> <br /> Carrageenan được tạo thành từ các<br /> <br /> Bảng 1. Kết quả xác định hàm lượng các tạp chất trong carrageenan tinh chế<br /> Hàm lượng<br /> protein (µg/g)<br /> Vết<br /> <br /> Hàm lượng<br /> nitơ tổng số<br /> 0<br /> <br /> Mn<br /> <br /> 2+<br /> <br /> (µg/g)<br /> <br /> Pb<br /> <br /> Vết<br /> <br /> 2+<br /> <br /> 2+<br /> <br /> (µg/g)<br /> <br /> Vết<br /> <br /> 2+<br /> <br /> Zn (µg/g)<br /> <br /> Hg (µg/g)<br /> <br /> Vết<br /> <br /> Vết<br /> <br /> galactose<br /> glucose<br /> <br /> xylose<br /> <br /> 500<br /> <br /> 6-methyl galactose<br /> <br /> 3,6-anhydro galactose<br /> <br /> 1000<br /> <br /> 0<br /> 5<br /> <br /> 10<br /> <br /> 15<br /> <br /> 20<br /> min<br /> <br /> Hình 5. Hàm lượng đường tổng số trong chế phẩm carrageenan tinh<br /> Nhận xét và thảo luận<br /> <br /> sạch cao không chứa các tạp chất chứa nitơ và<br /> <br /> Kết quả phân tích thành phần các chất<br /> trong carrageenan tách ra ở bảng 1 và hình 5<br /> <br /> các ion kim loại. Mặt khác, thành phần chủ yếu<br /> chế phẩm carrageenan chính là các loại đường<br /> <br /> cho thấy carrageenan sau khi tinh chế có độ tinh<br /> <br /> galactose và các dẫn xuất của galactose như 6<br /> <br /> 34<br /> <br />

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

Đồng bộ tài khoản