Các quá trình và thiết bị công nghệ sinh học : MÁY ĐIỆN DI part 1

Chia sẻ: Safskj Aksjd | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:6

Thêm vào BST

Báo xấu

115
lượt xem 14
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

MÁY ĐIỆN DI Máy điện di dùng để phát hiện và xác định ADN trong tế bào vi sinh vật, thực vật và động vật. 15.1. AXIT DEOXYRIBONUCLEIC (ADN) VÀ NGUYÊN TẮC XÁC ĐỊNH Gen là đơn vị di truyền cơ bản. Nó là một đoạn ADN (đôi khi ARN) mã hoá thông tin cho việc tổng hợp sản phẩm sinh học xác định (chủ yếu là protein). Những nghiên cứu hiện đại về cấu trúc và chức năng của nguyên sinh chất đã mở ra những hiểu biết mới về cấu tạo và chức năng hoạt động của tế bào...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Các quá trình và thiết bị công nghệ sinh học : MÁY ĐIỆN DI part 1

Chæång 15 MAÏY ÂIÃÛN DI Maïy âiãûn di duìng âãø phaït hiãûn vaì xaïc âënh ADN trong tãú baìo vi sinh váût, thæûc váût vaì âäüng váût. 15.1. AXIT DEOXYRIBONUCLEIC (ADN) VAÌ NGUYÃN TÀÕC XAÏC ÂËNH Gen laì âån vë di truyãön cå baín. Noï laì mäüt âoaûn ADN (âäi khi ARN) maî hoaï thäng tin cho viãûc täøng håüp saín pháøm sinh hoüc xaïc âënh (chuí yãúu laì protein). Nhæîng nghiãn cæïu hiãûn âaûi vãö cáúu truïc vaì chæïc nàng cuía nguyãn sinh cháút âaî måí ra nhæîng hiãøu biãút måïi vãö cáúu taûo vaì chæïc nàng hoaût âäüng cuía tãú baìo. Cáúu truïc ADN cho pheïp giaíi thêch taûi sao laûi coï khaí nàng taìng træî vaì di truyãön thäng tin tæì thãú hãû naìy sang thãú hãû khaïc mäüt caïch äøn âënh vaì bàòng caïch naìo noï thäng tin di tuyãön åí daûng thæï tæû sàõp xãúp caïc gäúc nucleotit laûi chuyãøn hoaï thaình phán tæí protein chæïc nàng. Näüi dung nãu trãn liãn quan âãún giaïo lyï trung tám cuía di truyãön phán tæí gäöm 3 âiãøm chênh: sao cheïp thäng tin di truyãön tæì ADN bäú meû sang ADN con caïi, chuyãøn âäøi maî di truyãön tæì ADN sang ARN - quaï trçnh phiãn maî (transcription) vaì dëch maî di truyãön (translation) - thäng tin di truyãön tæì mARN âæåüc chuyãøn sang trçnh tæû sàõp xãúp âàûc hiãûu cuía axit amin trong phán tæí protein. Cäng nghãû ADN taïi täø håüp - hiãûn laì nãön taíng cho sæû phaït triãøn nhæ vuî baîo cuía ngaình cäng nghãû sinh hoüc hiãûn âaûi. Caïc phæång phaïp phán têch vaì täøng håüp hiãûn âaûi laì taïch DNA, xaïc âënh thæï tæû, täøng håüp, gàõn xen noï vaìo vë trê nháút âënh bãn trong såüi ADN khaïc âãø nhán lãn, vaì räöi laûi taïch ra. Hiãûn nay hoaìn toaìn coï thãø nháûn biãút chênh xaïc nhæîng âoaûn ADN âàûc hiãûu qua cháøn âoaïn caïc bãûnh âàûc biãût. Âäúi våïi caïc bãûnh khi caïc gel chæa âæåüc xaïc âënh thç viãûc cháøn âoaïn keïm chênh xaïc. Mäüt bäü doì tçm âån giaín chè laì mäüt khuïc ADN (hoàûc ARN) coï thãø tçm khuïc bäø sung våïi noï bàòng caïch lai (hybridization). Coï thãø phaït hiãûn sæû bàõt càûp naìy bàòng nhiãöu caïch, nhæng phäø biãún nháút laì sæí duûng phæång phaïp tæû chuûp phoïng xaû våïi bäü doì tçm coï 32p (hçnh 15.1). 321
Viãûc lai bäü doì tçm ADN våïi âoaûn ADN taïch råìi goüi laì Southern Blotting âæåüc mä taí trãn hçnh 15.1. Caïc âoaûn ADN hçnh thaình sau khi ADN bë endonucleaza restrictaza càõt seî âæåüc taïch råìi ra bàòng phæång phaïp âiãûn di trãn gel agaroza. Khoaíng caïch di chuyãøn phuû thuäüc vaìo kêch thæåïc âoaûn. Caìng nhoí chaûy caìng nhanh. Sau khi âaî taïch råìi, ngæåìi ta duìng kiãöm âãø laìm biãún tênh caïc âoaûn âoï vaì chuyãøn chuïng lãn maìng nylon. Táúm maìng naìy âæåüc uí våïi dung dëch coï cháút doì tçm cháút phoïng xaû, noï chè lai våïi caïc âoaûn ADN naìo chæïa thæï tæû bäø sung. Viãûc xaïc âënh thæï tæû ARN (vê duû mARN) cuîng coï thãø theo trçnh tæû taïch bàòng âiãûn di ARN trãn gel, chuyãøn lãn maìng nylon vaì cho lai våïi ADN probe âàûc hiãûu. Phæång phaïp naìy goüi laì Northern Blotting. Nhæîng âoaûn ADN sau khi càõt bàòng endonucleasa Taïch âiãûn di trãn gel agarosa Caïc âoaûn ADN taïch ra theo kêch thæåïc Biãún tênh bàòng kiãöm âãø taïch såüi trung hoaì Âënh vë ADN bàòng tia UV Vë trê âoaûn ADN chæïa thæ tæû tæång Ræía vaì UÍ vãût coï ADN Phuí bàòng âäöng probe nhán sæû chuûp nhán doìng såüi maìng nylon doìng phoïng xaûû âån vaì coï gàõn phoïng xaû Hçnh 15.1. Lai “bäü doì tçm” våïi âoaûn ADN, taïch ra bàòng âiãûn di vaì chuyãøn sang táúm nylon (Southern blotting) 15.2. CÁÚU TRUÏC CUÍA MAÏY ÂIÃÛN DI Maïy âiãûn di gäöm ba bäü pháûn cå baín: khay váûn haình (hçnh 15.2), nàõp coï âiãûn thãú cao vaì buäöng giaím xäúc. 322
Khay váûn haình bao gäöm khuän âuïc gel, khay di âäüng UV khay di trong suäút vaì boüt âãûm bàòng âäüng trong suäút caosu. Chuáøn bë khuän gel nhæ sau: loït miãúng boüt âãûm vaìo âaïy khay di âäüng vaì sau âoï áún maûnh miãúng âãûm vaìo caûnh khay (eïp Khuän âuïc gel cho âaïy khay di âäüng loüt hoaìn Miãúng boüt âãûm toaìn vaìo khay khuän træåïc khi Hçnh 15.2. Khay váûn haình haìn kên vaìo miãúng boüt). Trãn nàõp coï âáöu ra cuía maî maìu, âæåüc näúi våïi nguäön âiãûn qua âiãûn cæûc trãn âãú maïy (hçnh 15.3). Buäöng giaím xäúc coï äúng näúi âiãûn cæûc, buûc di chuyãøn vaì läù naûp etylen glycol / næåïc våïi tyí lãû 50/50 (hçnh 15.4). Maî maìu âáöu ra näúi âiãûn cæûc trãn âãú maïy våïi nguäön âiãûn Nàõp thiãút bë Hçnh 15.3. Nàõp coï âiãûn thãú cao ÄÚng näúi âiãûn cæûc Buûc di chuyãøn Nåi (läù) naûp 50/50 etylen (häù tråü khay váûn haình) glycol / næåïc vaìo Hçnh 15.4. Buäöng giaím xäúc 323
15.3. CÁÚU TRUÏC VÁÛN HAÌNH 15.3.1. Chuáøn bë dung dëch - Chuáøn bë 250 ml dung dëch âãûm. Hai dung dëch âãûm âæåüc sæí duûng phäø biãún cho âiãûn di ADN âæåüc chuáøn bë theo cäng thæïc pha chãú dæåïi âáy. 1. 10X Tris- borate-EDTA. Nguäön cung cáúp cháút âãûm: (0,89 M tris; 0,89 M axit boric; 20 mM EDTA; pH- 8,2; 1000 ml) Tris base(FW 121.1): 0,89 M 108, 0g Axit boric (FW61.8): 0,89M 55,0 g Dung dëch EDTA: (0,5M; pH 8,0) 0,02M 40,0 ml Næåïc âaî âæåüc khæí ion hoaï: 1000,0 ml pH luän luän giæî åí 8,2 Træåïc khi sæí duûng våïi dung dëch loaîng 0,5 X våïi 45 mM base tris; 45 mM axit boric vaì 1 mM EDTA thæåìng duìng pha loaîng båíi vç næåïc coï nhiãût âäü tháúp 1X våïi 89 mM base tris; 89 mM axit boric vaì 2 mM EDTA. 2. 10X Tris- acetate -EDTA Cung cáúp cho cháút âãûm (0,4 M tris; 0,2 M axit axetic; 10 mM EDTA; pH- 8,4; 1000 ml) Tris base(FW 121.1): 0,40 M 48,8 g Axit axetic (99,5%): 0,20 M 114,1 ml Dung dëch EDTA (0,5M; pH 0,8): 0,01M 20,0 ml Næåïc âaî âæåüc khæí ion hoaï: 1000,0 ml Khuáúy âãöu âæìng laìm giaím pH. Pha loaîng tåïi 1X træåïc khi sæí duûng tåïi 40 mM base tris; 20 mM axit axetic vaì 1 mM EDTA. 3. Dung dëch EDTA (etylen diamin tetraaxetic axit): (0,5M; pH 8,0; 100 ml) Na2EDTA.2H2O; (FW 372,2) 0,5 M 18,6 g Næåïc âaî âæåüc khæí ion hoaï: 70,0 ml NaOH (10M) tåïi pH 8,0 5,0 ml Næåïc âaî âæåüc khæí ion hoaï: 100,0 ml - Chuáøn bë bäü âãûm taíi máùu. Âãø chuáøn bë bäü âãûm máùu cáön chuáøn bë máùu âãûm thæí (dung dëch máùu) vaì bäü læåüc coï dung têch khaïc nhau. Máùu âãûm thæí Dung dëch máùu (5X; 25% ficoll 400; 25% phenol bromua xanh; 10 ml) 324
Næåïc âaî âæåüc khæí ion hoaï: 7,0 ml Ficoll 400: 2,5 mg Phenol bromua xanh (F 691,9): 25,0 mg Næåïc âaî âæåüc khæí ion hoaï: 10,0 ml Chuï yï 1: Sucroza vaì glyxerol coï thãø sæí duûng âãø thay thãú cho ficoll 400. Chuï yï 2: Xylen cyanol (0,25 %) maì di chuyãøn cháûm hån phenol bromua xanh, thç coï thãø tàng thãm mäüt læåüng nãúu mong muäún, sæû cä caûn dung dëch agaroza âæåüc xaïc âënh khi thãm vaìo coï liãn quan âãún polynucleotit. Thãø têch bãøø Baíng 15.1. Nhæîng loaûi læåüc Bãö daìy, Âäü räüng, Dung têch Maî säú læåüc mm mm Âäü sáu 44/6* 80 - 6051 - 88 1 prep/2 ref 1,0 44/6 66/9* 80 - 6052 - 07 1 prep/2 ref 1,5 44/6 80 - 6051 - 50 8 1,0 6,5 6,5 80 - 6051 - 69 8 1,5 6,5 9,7 80 - 6050 - 74 12 1,0 3,9 3,9 80 - 6050 - 93 12 1,5 3,9 5,8 80 - 6051 - 12 16 1,0 2,6 2,6 80 - 6050 - 31 16 1,5 2,6 3,9 - Chuáøn bë khoaíng 7 ml dung dëch agaroza æïng våïi mäùi mililit chiãöu daìy gel (vê duû 1 gel 3 mm cáön 0,3×7×10 = 21 ml). Hoaì tan agaroza trong dung dëch âãûm , âiãöu chènh nhiãût âäü häùn håüp. Cho pheïp laìm maït dung dëch âãún 500C træåïc khi roït vaìo khuän. Âãø quan saït sæû phán ly trong hiãûn tæåüng âiãûn chuyãøn thæåìng thãm 0,5 mg/ml etydi bromua vaìo dung dëch gel. 15.3.2. Âuïc gel - Thiãút bë âàût khay di âäüng: Mäüt tay giæî chàût khuän âuïc, tay kia âàût âáöu khay di âäüng aïp vaìo miãûng boüt âãûm vaì sau âoï haû tháúp räöi âàût lãn âoaûn cuäúi cuía khuän âuïc. Âàût âáöu coìn laûi cuía khay aïp saït miãûng boüt âãûm. - Chuáøn bë læåüc: Làõp hai raînh trong læåüc vaìo giæîa nhæîng âáöu äúc vaì màût sau læåüc. Siãút chàût äúc. Âàût læåüc vaìo meïp khuän vaì chènh pháön cuäúi cuía læåüc âãø caïch khay di âäüng khoaíng 1 mm. Siãút chàût äúc âãø giæî chàõc læåüc. - Di chuyãøn læåüc: Âàût khuän làõp raïp lãn màût phàóng nàòm ngang. Âàût äúng nivä lãn khay di âäüng, noï nhæ thiãút bë kiãøm tra xem khuän coï âuïng vë trê nàòm ngang khäng. 325
Hçnh 15.5. Màût sau læåüc, làõp trãn vaình cuía khuän âuïc, vë trê læåüc trong gel. Hai äúc hiãûu chènh læåüc. Âãø taûo hai raînh, âàût læåüc thæï hai vaìo giæîa gel Læåüc Màût sau læåüc ÄÚc (2) - Âäø dung dëch agaroza (âæåüc laìm laûnh âãún 500C) vaìo khuän âuïc. Âënh hæåïng læåüc âãø caïc bãö màût læåüc gáön miãúng âãûm boüt nháút vaì âàût noï lãn caûnh khay. Læåüc luän luän åí vaìo vë trê thàóng âæïng âãø traïnh sæû vàûn veûo hçnh daûng. Âãø chaûy læåüng máùu gáúp 2 láön, âàût læåüc thæï hai vaìo chênh giæîa khay. Cho pheïp thåìi gian täúi thiãøu âãø gel âàûc laûi laì 30 phuït. - Khi gel âaî kãút laûi, láön læåüt thaïo læåüc cáøn tháûn. Nháúc mäüt pháön vaì nghiãng nheû mäüt âáöu cuía læåüc, sau âoï ruït tæì tæì ra khoíi gel (keïo thàóng læåüc, taûo ra mäüt khoaíng khäng âãø coï thãø nháúc gel ra khoíi khay). - Thaïo khay di âäüng vaì gel bàòng caïch nàõm láúy tay cáöm cuía khay, áún âáöu aïp vaìo miãúng boüt âãûm. Khi khay âaî saûch âãûm thç nháúc ra. Chuyãøn khay vaì gel tåïi chäù maït. 15.3.3. Váûn haình âiãûn di 1. Laìm laûnh nãön træåïc khi tiãún haình, âàûc biãût khi duìng âiãûn aïp cao hån hoàûc khi sæû phán ly quy âënh trãn 30 phuït. Chuï yïï: Âãø tiãún haình phán ly, hoàûc laì thãm 0,5 mg/ml etydi bromua vaìo dung dëch âãûm hoàûc thãm 50 mg/ml etydi bromua vaìo bäü âãûm máùu. Âãø quan saït, haîy càõt âiãûn, thaïo pháön nàõp vaì giæî âeìn cæûc têm gáön gel. Thãm tæì tæì etydi bromua vaìo dung dëch âãûm hay âãûm máùu. Phaït hiãûn bàòng phæång phaïp naìy khäng nhaûy bàòng caïch nhuäüm maìu vaì nhçn qua thiãút bë soi. 2. Âäø dung dëch vaìo caïc khoang sao cho âãún khi âãûm cao hån gel khoaíng 1 mm (khoaíng 220 ml). 3. Naûp máùu. Thãm máùu vaìo 5X bäü âãûm taíi máùu vaì träün (1/5 thãø têch laì âãûm naûp vaìo). Sæí duûng micropipet âãø naûp máùu, chuï yï traïnh âám thuíng hoàûc taûo nãn nhiãöu bong boïng. 4. Âàût nàõp âãø catot (−, dáy âen) åí âoaûn cuäúi gáön máùu nháút. (Máùu axit nucleic di chuyãøn vãö phêa anät, +, dáy âoí). Näúi caïc dáy maìu (âoí våïi âoí, âen våïi âen) tåïi caïc nguäön âiãûn, nhæ laì ESP 2A200. Âàût mæïc âiãûn aïp vaì thiãút bë báúm giåì (nãúu coï sàôn) theo mæïc âäü phán ly. 326