Cải biến và thiết kế vector biểu hiện các gen cry1Ia có hoạt tính kháng sâu đục quả đậu tương etiella zinkenella

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:12

Thêm vào BST

Báo xấu

23
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Trong nghiên cứu này, đã cải biến thành công gen cry1Ia đồng thời thiết kế các cấu trúc vector biểu hiện gen cry1Ia dạng dại và cải biến từ chủng Bacillus thuringiensis TH19 phân lập ở Việt Nam. Nghiên cứu này cung cấp các vật liệu phục vụ cho việc chuyển gen cry1Ia dạng dại và cải biến vào cây đậu tương nhằm tăng khả năng kháng sâu đục quả Etiella zinkenella. Mời các bạn tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Cải biến và thiết kế vector biểu hiện các gen cry1Ia có hoạt tính kháng sâu đục quả đậu tương etiella zinkenella

KHOA HỌC CÔNG NGHỆ CẢI BIẾN VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN CÁC GEN cry1Ia CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG SÂU ĐỤC QUẢ ĐẬU TƯƠNG Etiella zinkenella Nguyễn Hữu Kiên1, Nguyễn Thị Hòa1, Lê Thị Mai Hương1, Nguyễn Trung Anh1, Nguyễn Tuấn Minh1, Đinh Thị Mai Thu1, Tống Thị Hường1, Đinh Thị Thu Ngần1, Nguyễn Nhất Linh1, Nguyễn Anh Vũ1, Lê Thị Thu Hiền2, Nguyễn Văn Đồng1* TÓM TẮT Đậu tương (Glycine max L.) là một trong những cây trồng quan trọng có giá trị kinh tế cao. Tuy nhiên, năng suất và chất lượng đậu tương bị ảnh hưởng nghiêm trọng bởi sự gây hại của sâu đục quả Etiella zinkenella Treitschke. Hiện nay, mặc dù có nhiều nghiên cứu đã đánh giá ảnh hưởng của độc tố Cry tới sâu đục quả trên nhiều đối tượng cây trồng khác nhau, nhưng trên cây đậu tương còn hạn chế. Trong nghiên cứu này, đã cải biến thành công gen cry1Ia đồng thời thiết kế các cấu trúc vector biểu hiện gen cry1Ia dạng dại và cải biến từ chủng Bacillus thuringiensis TH19 phân lập ở Việt Nam. Nghiên cứu này cung cấp các vật liệu phục vụ cho việc chuyển gen cry1Ia dạng dại và cải biến vào cây đậu tương nhằm tăng khả năng kháng sâu đục quả Etiella zinkenella. Từ khóa: Bacillus thuringiensis, cry1Ia, đậu tương, Etiella zinkenella, vector pZY101-Asc. 1. ĐẶT VẤN ĐỀ 4 đậu tương non là nguồn thức ăn ưa thích của chúng (Berg et al., 1998). Đậu tương ( Glycine max L.) là cây trồng ngắn ngày có giá trị kinh tế cao. Hạt đậu tương có Để đối phó với sâu đục quả gây hại trên cây trồng, hàm lượng dầu và protein cao là nguồn cung cấp các phương pháp phòng trừ sâu hại như sử dụng thuốc nguyên liệu cho công nghiệp chế biến thực phẩm và trừ sâu hóa học, sinh học và côn trùng thiên địch được thức ăn chăn nuôi. Ngoài ra, cây đậu tương còn có áp dụng phổ biến trên thế giới (Kumar et al., 2008; khả năng cải tạo đất hiệu quả nên được ưu tiên trong Tabata et al., 2008; USDA, 2012). Trong đó, việc tạo ra các công thức luân canh với các cây trồng khác các giống cây trồng mới có khả năng kháng sâu nói (Erickson, 2008; Morrison et al., 2017; Mourtzinis et chung và kháng sâu đục quả nói riêng bằng các kỹ al., 2017). Tại Việt Nam, đậu tương là cây thực phẩm thuật di truyền và chuyển gen thực vật đã và đang có vai trò quan trọng nhưng năng suất còn thấp, chưa được đặc biệt quan tâm nhằm nâng cao năng suất, chất thể đáp ứng được nhu cầu tiêu dùng trong nước. lượng hạt và giảm mức độ thiệt hại do côn trùng; đồng Những năm gần đây, diện tích cũng như sản lượng thời khắc phục được những hạn chế khi sử dụng các đậu tương của nước ta có xu hướng giảm mạnh biện pháp trừ sâu hóa học cũng như các biện pháp sinh (Gain, 2018; FAOSTAT, 2019). Một trong những học truyền thống. nguyên nhân làm ảnh hưởng đến năng suất và chất Hiện nay, có rất nhiều các gen kháng sâu có giá trị lượng đậu tương là do sự phá hoại của sâu, bệnh hại. để chuyển vào cây trồng có nguồn gốc từ động vật, thực Trong đó, sâu đục quả Etiella zinkenella Treitschke là vật và vi sinh vật. Trong đó, các gen cry được phân lập từ côn trùng thuộc bộ cánh vảy (Lepidoptera) được biết các chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) là đối tới là đối tượng phân bố rộng khắp trên thế giới và gây tượng được nghiên cứu nhiều nhất trong số các tác nhân hại trên nhiều loài cây trồng khác nhau, đặc biệt quả gây độc tố đối với côn trùng. Nhóm các gen cry1 mã hóa cho protein Cry1 được biết tới là một trong 6 nhóm gen cry chính có hoạt tính diệt côn trùng bộ cánh vảy 1 Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Khoa học Nông nghiệp (Crickmore et al., 2013). Việt Nam Kết quả nghiên cứu của chúng tôi (số liệu chưa 2 Viện Nghiên cứu Hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và công bố) đã chỉ ra rằng, protein Cry1Ia thu được khi Công nghệ Việt Nam Email: dongjircas@yahoo.com biểu hiện gen cry1Ia trong vi khuẩn Escherichia coli N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 1 - TH¸NG 11/2020 29
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ (E. coli) có khả năng diệt sâu đục quả đậu tương ở điều 2.2.1. Cải biến gen cry1Ia kiện nhân tạo. Trên cơ sở đó, nghiên cứu này đã tiến Tỷ lệ phần trăm các bộ ba mã hóa tối ưu cho các hành sửa đổi gen cry1Ia dạng dại nhằm tạo sự tương gen trong cây đậu tương trên trang web thích với hệ gen của cây đậu tương và thiết kế các cấu (http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi- trúc vector biểu hiện thực vật mang gen cry1Ia dạng bin/showcodon.cgi?species=3847) được sử dụng cho dại và cải biến để phục vụ cho việc tạo cây chuyển gen sửa đổi các bộ ba mã hóa của gen cry1Ia trên công cụ đậu tương có khả năng kháng sâu đục quả bằng OPTIMIZER chuyển gen vào thực vật thông qua vi khuẩn (http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/). Agrobacterium tumefaciens. 2.2.2. Tổng hợp nhân tạo và tách dòng gen 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU cry1Ia cải biến 2.1. Vật liệu nghiên cứu Gen cry1Ia cải biến có kích thước 2160 bp được chia thành những đoạn ngắn ~75 nucleotide và được tổng hợp trên nền frit tổng hợp gen theo công nghệ của Công ty Sinh hóa Phù Sa (Cần Thơ, Việt Nam). Tiếp theo, đoạn DNA của gen cry1Ia cải biến được khuếch đại bằng PCR sử dụng cặp mồi 1Iacb-Syt- F/1Iacb-Syt-R trong đó có 25 nucleotide tương đồng với 2 đầu biên của vector pUC19 (Bảng 1) bằng enzyme Phusion™TM High-Fidelity DNA Polymerase (Thermo Fisher Scientific, Hoa Kỳ) với điều kiện Hình 1. Các vector sử dụng phản ứng và chu trình nhiệt theo hướng dẫn của nhà Chú thích: A, Cấu trúc vector pRTL2; B, Cấu trúc sản xuất. Sản phẩm PCR được tinh sạch trực tiếp vector biểu hiện thực vật pZY101-Asc bằng kít PCR Purification (Jena Bioscience, Đức) và sử dụng cho phản ứng nối vào vector pUC19 (đã xử Gen cry1Ia dạng dại được nhóm nghiên cứu của lý bằng enzyme giới hạn SmaI trước đó) theo quy Viện Nghiên cứu Hệ gen phân lập từ chủng vi khuẩn trình eClone của Công ty Sinh hóa Phù Sa, với thành Bt TH19 của Việt Nam và nhân dòng trong vector phần phản ứng: Vector pUC19 100 ng, sản phẩm PCR pJET1.2. Vector pRTL2 và pZY101-Asc (Hình 1) do 300 ng, dung dịch đệm eClone 1,5 µlL enzyme Trung tâm Quốc gia Công nghệ sinh học – Trường eClone 1,0 µL và nước cất 2 lần với tổng thể tích 15 Đại học Missouri, Hoa Kỳ cung cấp. Các cấu trúc µL. Phản ứng được ủ ở 37oC 15 phút và đặt trên đá để vector tách dòng, vector biểu hiện và chủng vi khuẩn sử dụng cho biến nạp vào vi khuẩn E. coli Top10 theo E. coli Top10 được lưu giữ tại Phòng thí nghiệm phương pháp sốc nhiệt đã được trình bày trước đó Trọng điểm Công nghệ tế bào thực vật – Viện Di (Froger và Hall, 2007). truyền nông nghiệp. 2.2. Phương pháp nghiên cứu Bảng 1. Trình tự các mồi sử dụng trong nghiên cứu STT Tên mồi Trình tự (5’-3’) Vai trò 1 1Iacb-Syt-F CCAGTGAATTCGAGCTCGGTACCCTAATAGCGG Cặp mồi sử dụng cho tổng hợp gen CCGCATGAAGCTTAAGA cry1Aa cải biến 2 1Iacb-Syt-R TGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCATAACTCG AGCTACATATTTCTTTCTATGTGT 3 pUC19-F CAAGGCGATTAAGTTGGGTAAC Cặp mồi của vector tách dòng 4 pUC19-R ATTTCACACAGGAAACAGCTATGA pUC19 5 1Iacb-Seq GCGTCCATTTTTGGCAAAGAATG Mồi sử dụng cho giải trình tự của gen cry1Ia cải biến 6 1Iawt-NcoI-F GTGCAG CCATGG ATGAAACTAAAGAATC Cặp mồi cho tách dòng gen cry1Ia 7 1Iawt-SmaI-R ATATT CCCGGG CTACATGTTACGCTC dạng dại 8 1Iacb-NcoI-F AATA CCATGG ATGAAGCTTAAGAATC Cặp mồi cho tách dòng gen cry1Ia 30 N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 1 - TH¸NG 11/2020
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 9 1Iacb-SmaI-R AA CCCGGG CTACATATTTCTTTCTATG cải biến 10 35S-F CTTCGCAAGACCCTTCCTC Mồi xuôi từ vùng promoter 35S và 11 pRTL2-R ACTGGTGATTTTTGCGGACT mồi ngược từ vùng kết thúc pRTL2 được sử dụng cho giải trình tự 12 Seq_1Iawt-R TTCGCATTGCTAGAAAAACTTTGATGCTTA Cặp mồi cho giải trình tự gen cry1Ia 13 Seq_1Iawt-F ATAGTTAAATACGCGAAGCAACTCCA dạng dại 14 Seq_1Iacb-R GCGTTAGAGGAAAAACTCTGATGTTTATCTTGA Cặp mồi cho giải trình tự gen cry1Ia 15 Seq_1Iacb-F AAGTACGCGAAGCAACTACACATAGAA cải biến Sau đó, dịch khuẩn được cấy trải lên đĩa môi 2.2.3.2. Chọn lọc các dòng tế bào tái tổ hợp mang trường LB đặc có bổ sung 100 mg/L kháng sinh gen cry1Ia dạng dại và cải biến bằng PCR Ampicillin và nuôi qua đêm ở 37oC. Các khuẩn lạc Sản phẩm của phản ứng ghép nối được sử dụng của vector tái tổ hợp pUC19:cry1Ia cải biến mọc trên để biến nạp vào vi khuẩn E. coli Top10 bằng phương đĩa môi trường có chứa kháng sinh được lựa chọn để pháp sốc nhiệt. Tiếp theo, dịch khuẩn được cấy trải kiểm tra bằng PCR bằng cặp mồi pUC19-F/R (Bảng lên đĩa môi trường LB đặc có bổ sung 100 mg/L 1) sử dụng kít PCR EZ mix-tracking dye (Công ty kháng sinh Ampicillin và nuôi ở 37oC qua đêm. Các Sinh hóa Phù Sa, Việt Nam) theo hướng dẫn nhà sản khuẩn lạc của vector tái tổ hợp pRTL2:cry1Aa dạng xuất. Các khuẩn lạc dương tính với PCR được lựa dại và cải biến mọc trên đĩa môi trường có chứa chọn đem nuôi tăng sinh khối trong môi trường LB kháng sinh được lựa chọn để kiểm tra trực tiếp bằng lỏng có bổ sung 100 mg/L Ampicillin ở 37oC qua PCR với các cặp mồi đặc hiệu cho gen cry1Ia dạng đêm và tách chiết DNA plasmid sử dụng kít Fast-n- dại (1Iawt-NcoI-F/1Iawt-SmaI-R) và cải biến (1Iacb- Easy Plasmid Mini-Prep (Jena Bioscience, Đức). NcoI-F/1Iacb-SmaI-R) (Bảng 1) sử dụng kit PCR EZ DNA plasmid của các khuẩn lạc được sử dụng để giải mix-tracking dye. Sản phẩm PCR được chạy điện di trình tự với các mồi pUC19-F/R và 1Iacb-Seq (Bảng kiểm tra trên gel agarose 1  . 1). 2.2.3.3 Giải trình tự gen 2.2.3. Tạo vector biểu hiện thực vật mang gen Các khuẩn lạc dương tính với các cặp mồi đặc cry1Ia dạng dại và cải biến hiệu cho gen cry1Ia dạng dại và cải biến được lựa 2.2.3.1. Gắn đoạn gen cry1Ia dạng dại và cải biến chọn đem nuôi tăng sinh khối trong môi trường LB vào vector pRTL2 lỏng có bổ sung 100 mg/L Ampicillin ở 37oC qua Để tiến hành thiết kế vector chuyển gen mang đêm và tách chiết DNA plasmid sử dụng kit Fast-n- gen cry1Ia dạng dại và cải biến quan tâm, các đoạn Easy Plasmid Mini-Prep. DNA plasmid của các cấu gen cry1Ia dạng dại và cải biến được nhân lên bằng trúc vector tái tổ hợp pRTL2:cry1Ia dạng dại và cải PCR từ DNA plasmid của các vector tách dòng có biến được sử dụng giải trình tự với cặp mồi 35S- chứa các đoạn gen Cry1Ia quan tâm sử dụng F/pRTL2-R; thêm vào đó, đối với cấu trúc của dạng PhusionTM High-Fidelity DNA Polymerase với các dại sử dụng thêm cặp mồi Seq_1Iawt-F/Seq_1Iawt-R cặp mồi đặc hiệu cho gen cry1Ia dạng dại 1Iawt- và dạng cải biến sử dụng cặp mồi Seq_1Iacb-F/ NcoI-F/1Iawt-SmaI-R và cải biến 1Iacb-NcoI-F/1Iacb- Seq_1Iacb-R (Bảng 1). SmaI-R (Bảng 1) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. 2.2.3.4. Gắn đoạn gen cry1Ia dạng dại vào vector Sản phẩm PCR được cắt với 2 enzyme giới hạn NcoI biểu hiện thực vật pZY101-Asc và SmaI (Thermo Fisher Scientific, Hoa Kỳ) và kiểm DNA plasmid của vector pRTL2: cry1Ia dạng dại tra bằng điện di trên gel agarose 1 , sau đó được tinh và cải biến sau khi giải trình tự kiểm tra được cắt với sạch bằng kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen, enzyme giới hạn HindIII. Sản phẩm cắt của cấu trúc Đức). Sản phẩm tinh sạch của các đoạn gen cry1Ia 35S:cry1Ia dạng dại và cải biến được xử lý tạo đầu dạng dại và dạng cải biến được sử dụng cho phản bằng với T4 DNA polymerase. Tiếp theo, sản phẩm ứng ghép nối với vector pRTL2 (đã xử lý với 2 tinh sạch của các cấu trúc 35S:cry1Ia dạng dại và cải enzyme giới hạn NcoI và SmaI) bằng T4 DNA ligase biến được sử dụng cho phản ứng ghép nối với vector (Thermo Fisher Scientific, Hoa Kỳ) theo hướng dẫn pZY101-Asc (đã được cắt với enzyme giới hạn HindIII của nhà sản xuất. và xử lý đầu bằng) bằng enzyme T4 DNA ligase. Sản phẩm ghép nối của vector pZY101-Asc và các đoạn N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 1 - TH¸NG 11/2020 31
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 35S:cry1Ia dạng dại và cải biến được sử dụng để biến thể khác nhau đáng kể giữa các sinh vật. Điều này nạp vào vi khuẩn E. coli Top10 bằng phương pháp thực tế là do các bộ ba ưa thích có liên quan tới sự dư sốc nhiệt. Dịch khuẩn được cấy trải lên đĩa môi thừa của các tRNA nhận diện có sẵn trong tế bào. trường LB đặc có bổ sung kháng sinh Spectinomycin Khi một gen ngoại lai được biểu hiện trong một sinh 50 mg/L và Streptomycin 50 mg/L và nuôi ở 37oC vật không phải là vật chủ, các trình tự có thể chứa qua đêm. Các khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp các yếu tố hạn chế sự biểu hiện và các bộ ba có tần pZY101:35S:cry1Ia dạng dại và cải biến mọc trên đĩa suất thấp trong sinh vật sẽ bị loại bỏ. Có một mối môi trường LB có chứa kháng sinh được lựa chọn để tương quan nhất định giữa tần số của các bộ ba hiếm kiểm tra trực tiếp bằng PCR với các cặp mồi đặc hiệu và mức độ biểu hiện protein ngoại lai. Do đó, chúng cho gen cry1Ia dạng dại (1Iawt-NcoI-F/1Iawt-SmaI- ta có thể hiểu rằng sự xuất các bộ ba hiếm, đặc biệt R) và cải biến (1Iacb-NcoI-F/1Iacb-SmaI-R) (Bảng 1) tại đầu N- của protein nên được tránh trong việc thiết sử dụng kít PCR EZ mix-tracking dye. Cuối cùng, sản kế các gen ngoại lai. Như vậy, một gen quan tâm có phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel thể được tổng hợp bằng cách thay thế các bộ ba agarose 1 . không được sử dụng thường xuyên bằng các bộ ba 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN được ưa thích trong cây đậu tương mà không làm thay đổi trình tự axit amin của protein chức năng 3.1. Cải biến gen cry1Ia (Hudson et al., 2011; Murray et al., 1989; Zhang et al., Trên thực tế, việc biểu hiện một protein chức 2011). năng ở bên ngoài vật chủ tự nhiên của nó gặp rất Trong nghiên cứu này, để có thể cải biến gen nhiều trở ngại. Trong đó, thông tin di truyền được cry1Ia thích hợp cho việc chuyển gen vào cây đậu mã hóa trong khung đọc mở không đơn giản chỉ là tương, đã sử dụng công cụ OPTIMIZER thứ tự của các axit amin trong protein và các sinh vật (http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/) kết hợp với khác nhau thường thể hiện sự ưa thích đặc biệt với tỷ lệ phần trăm các bộ ba mã hóa tối ưu cho các gen một số bộ ba khác nhau mã hóa cho cùng một axit trong cây đậu tương amin khi tạo ra protein chức năng. Hiện tượng này (http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi- gọi là sự sai lệch về bộ ba mã hóa và được xác định là bin/showcodon.cgi?species=3847) để tiến hành một yếu tố quan trọng trong biểu hiện gen. Mức độ chỉnh sửa gen cry1Ia dạng dại ban đầu. các bộ ba nhất định xuất hiện trong mã di truyền có Bảng 2. Kết quả cải biến gen cry1Ia 32 N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 1 - TH¸NG 11/2020
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 1 - TH¸NG 11/2020 33
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 34 N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 1 - TH¸NG 11/2020
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ (Chú thích: *: thay đổi Purines Pyrimidines; #: thay đổi Purine Purine hoặc Pyrimidine Pyrimidine; aa: amino acid; 1Ia-wt: cry1Ia dạng dại; 1Ia-cb: cry1Ia cải biến) Kết quả cho thấy, gen cry1Ia cải biến có sự thay của gen cry1Ia cải biến tăng lên 43,9  so với 36,6  đổi về nucleotide ở một số bộ ba mã hóa axit amin của gen cry1Ia dạng dại ban đầu (Bảng 2). trong chuỗi trình tự DNA nhưng không có sự thay Sự thay đổi về các nucleotide của các bộ ba mã đổi về chiều dài trình tự DNA so với gen cry1Ia dạng hóa đã dẫn tới sự thay đổi về số lượng các bộ ba mã dại (2160 bp) và cùng mã hóa cho 720 axit amin hóa giữa gen cry1Ia cải biến so với dạng dại ban đầu giống nhau. Cụ thể, gen cry1Ia cải biến đã có 264 sự trong tổng số 64 bộ ba mã hóa cho 20 axit amin. Cụ tráo đổi vị trí của Purines cho Pyrimidines và ngược thể, bộ ba CTC mã hóa cho Leucine (L) đã tăng lại so với dạng dại, trong khi đó có 255 sự thay đổi nhiều nhất với 15 lần, từ có 3 ở cry1Ia dạng dại lên 18 giữa các Purine với Purine hoặc Pyrimidine với ở cải biến, ngược lại bộ ba GTA mã hóa cho Valine Pyrimidine với nhau ở gen cry1Ia cải biến so với (V) giảm nhiều nhất với 20 lần từ có 22 ở dạng dại dạng dại ban đầu. Sự thay đổi này diễn ra ở tất cả các xuống 2 ở cải biến; trong khi đó, có bộ ba ATG mã vị trí của bộ ba (vị trí nucleotide đầu tiên, thứ hai, hóa cho Methionine (M), GGG mã hóa cho Glycine hoặc thứ ba); ngoài ra, có trường hợp sự thay đổi (G), TGG mã hóa cho Trytophan (W) và bộ ba kết nucleotide xảy ra ở cả 2 hoặc 3 vị trí của bộ ba mã thúc TAG là không có sự thay đổi giữa dạng dại và hóa. Chính sự thay đổi này, đã dẫn đến tỷ lệ   GC cải biến (Bảng 3). Bảng 3. Các bộ ba mã hóa cho gen cry1Ia ở dạng dại và cải biến Các bộ Các bộ ba cry1I cry1I Các bộ ba cry1 cry1Ia- Các bộ ba cry1 cry1Ia- cry1Ia cry1Ia- ba mã mã hóa a-wt a-cb mã hóa Ia-wt cb mã hóa Ia-wt cb -wt cb hóa GCA (A) 22 10 GCC (A) 6 12 GCG (A) 4 5 GCT (A) 12 17 TGC (C) 0 1 TGT (C) 2 1 GAC (D) 8 13 GAT (D) 26 21 GAA (E) 28 25 GAG (E) 15 18 TTC (F) 13 19 TTT (F) 24 18 GGT GGA (G) 21 10 GGC (G) 2 12 GGG (G) 7 7 14 15 (G) CAC (H) 0 9 CAT (H) 19 10 ATA (I) 12 11 ATC (I) 7 11 ATT (I) 23 20 AAA (K) 23 21 AAG (K) 8 10 TTA (L) 27 8 N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 1 - TH¸NG 11/2020 35
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ TTG (L) 8 10 CTA (L) 14 8 CTC (L) 3 18 CTG (L) 3 5 CTT (L) 7 13 ATG (M) 11 11 AAC (N) 10 21 AAT (N) 37 26 CCA (P) 14 9 CCC (P) 0 8 CCG (P) 7 3 CCT (P) 8 9 CAA (Q) 24 18 CAG (Q) 5 11 AGA (R) 13 12 AGG (R) 6 10 CGA (R) 8 4 CGC (R) 2 4 CGG (R) 0 2 CGT (R) 6 3 AGC (S) 7 6 AGT (S) 14 14 TCA (S) 17 8 TCC (S) 1 11 TCG (S) 2 7 TCT (S) 20 15 ACA (T) 31 18 ACC (T) 4 16 ACG (T) 8 4 ACT (T) 15 20 GTA (V) 22 2 GTC (V) 5 11 GTG (V) 6 16 GTT (V) 14 18 TGG (W) 12 12 TAC (Y) 3 13 TAT (Y) 29 19 TAA (.) 0 0 TGA (.) 0 0 TAG (.) 1 1 Ngoài ra, khi phân tích các vùng bảo thủ dạng dại và cải biến tuy có sự sai khác về các bộ ba (conserved domains) của cả gen cry1Ia dạng dại và mã hóa nhưng trình tự và đặc tính của protein cry1Ia cải biến đều cho thấy sự tương đồng về vùng bảo thủ không thay đổi. Gen cry1Ia dạng dại và cải biến được endotoxin_N, endotoxin_M, và delta_endotoxin_C sử dụng để thiết kế các vector biểu hiện thực vật của chúng (Hình 2). Điều này cho thấy, gen cry1Ia phục vụ công tác chuyển gen vào cây đậu tương. Hình 2. Kết quả phân tích các vùng bảo thủ của gen cry1Ia dạng dại và cải biến 3.2. Tổng hợp nhân tạo và tách dòng gen cry1Ia lần lượt vào phía trước đầu 5’ và 3’ được tổng hợp cải biến nhân tạo theo quy trình và phương pháp của Công ty Sinh hóa Phù Sa. Sản phẩm khuếch đại của gen cry1Ia cải biến sau khi tổng hợp nhân tạo được gắn vào vector pUC19. Tiếp theo, vector tách dòng pUC19 có chứa đoạn gen cry1Ia cải biến được biến nạp vào E. coli. Các khuẩn lạc mọc trên đĩa môi trường LB đặc có chứa 100 mg/L kháng sinh Ampicillin được lựa chọn để kiểm tra bằng PCR với cặp mồi pUC19-F/R (Bảng 1). Kết quả PCR khuẩn lạc cho thấy, trong tổng số 12 khuẩn lạc đã được lựa chọn có 3 khuẩn lạc cho kết Hình 3. Kết quả tách dòng gen cry1Ia cải biến quả dương tính với cặp mồi của vector pUC19 và có Chú thích: (A) Kết quả PCR khuẩn lạc của kích thước khoảng 2100 bp tương ứng với kích thước vector tách dòng pUC19 chứa gen cry1Ia cải biến. M, dựa đoán của gen cry1Ia cải biến ban đầu (Hình 3). PSA DNA Ladder; 1-12: sản phẩm PCR của 12 khuẩn Các khuẩn lạc dương tính với PCR được sử dụng để lạc giải trình tự. Kết quả cho thấy, cả 3 khuẩn lạc có chứa plasmid tái tổ hợp với vùng trình tự hoàn toàn Gen cry1Ia sau khi cải biến thành công và bổ sung thêm vị trí của enzyme giới hạn NcoI và SmaI 36 N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 1 - TH¸NG 11/2020
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ chính xác của gen cry1Ia cải biến đã thiết kế ban đầu PCR gen cry1Ia cải biến từ DNA plasmid (Bảng 2). pUC19:cry1Ia cải biến. (C) Kết quả cắt vector pRTL2 3.3. Thiết kế vector biểu hiện mang gen cry1Ia bằng 2 enzyme giới hạn NcoI và SmaI. (D) Kết quả dạng dại và cải biến PCR gen cry1Ia dạng dại từ khuẩn lạc của vector pRTL2:cry1Ia dạng dại. (E) Kết quả PCR gen cry1Ia Để thiết kế vector biểu hiện mang các gen cải biến từ khuẩn lạc của vector pRTL2:cry1Ia cải biến. cry1Ia quan tâm, đoạn gen cry1Ia dạng dại và cải (F) Cấu trúc cassette của 35S:cry1Ia dạng dại và cải biến được nhân lên bằng kỹ thuật PCR từ DNA biến. p1, DNA plasmid của vector pJET1.2:cry1Ia dạng plasmid của vector tách dòng có chứa các đoạn gen dại; -, đối chứng âm H2O; M1, GeneRuler 1kb DNA tương ứng. Sản phẩm PCR của các đoạn gen cry1Ia ladder; M2, 1Kb DNA Ladder; p2, DNA plasmid của dạng dại và cải biến được xử lý với enzyme giới hạn vector pUC19:cry1Ia cải biến; p3, Vector pRTL2; 1-4, NcoI và SmaI và ghép nối vào vector pRLT2 (đã được Khuẩn lạc của vector pRTL2:cry1Ia dạng dại; +1, Đối xử lý với enzyme giới hạn tương ứng) (Hình 1A và chứng dương từ DNA plasmid của vector 4B). Sản phẩm của vector tái tổ hợp pRTL2:cry1Ia pJET1.2:cry1Ia dạng dại; +2, Đối chứng dương từ DNA dạng dại và cải biến được biến nạp vào E. coli và nuôi plasmid của vector pUC19:cry1Ia cải biến; 5-8, Khuẩn qua đêm ở 37oC trên đĩa môi trường LB có bổ sung lạc của vector pRTL:cry1Ia cải biến. 100 mg/L kháng sinh Ampicillin. Các khuẩn lạc mọc trên đĩa LB được lựa chọn để kiểm tra PCR với các Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy, các cặp mồi đặc hiệu cho gen cry1Ia dạng dại và cải biến khuẩn lạc đều cho kết quả dương tính với gen cry1Ia (Bảng 1). dạng dại và cải biến (Hình 4D-E). Như vậy, việc nối đoạn gen cry1Ia dạng dại và cải biến vào vector pRTL2 bước đầu đã thành công. Để kiểm tra lại sản phẩm ghép nối vào vector pRTL2, các khuẩn lạc dương tính được nuôi tăng sinh khối, tách chiết DNA plasmid và giải trình tự. Kết quả giải trình tự các khuẩn lạc của vector tái tổ hợp pRTL2:cry1Ia dạng dại và cải biến cho thấy, trình tự của gen cry1Ia dạng dại và cải biến hoàn toàn không có sự sai khác so với trình tự ban đầu và các gen này cùng chiều và được điều khiển bởi promoter 35S (Bảng 2; hình 4F). Hình 5. Kết quả thiết kế vector pZY101:35S:cry1Ia dạng dại và cải biến Hình 4. Kết quả khuếch đại gen cry1Ia dạng dại và cải Chú thích: (A) Kết quả cắt vector pZY101-Asc biển và xử lý vector pRLT2 bằng enzyme giới hạn bằng enzyme giới hạn HindIII. (B) Kết quả PCR gen Chú thích: (A) Kết quả PCR gen cry1Ia dạng dại cry1Ia dạng dại từ khuẩn lạc của vector từ DNA plasmid pJET1.2:cry1Ia dạng dại. (B) Kết quả pZY101:35S:cry1Ia dạng dại. (C) Kết quả PCR gen N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 1 - TH¸NG 11/2020 37
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ cry1Ia cải biến từ khuẩn lạc của vector biểu hiện của gen cry1Ia trong cây bông chuyển gen pZY101:35S:cry1Ia cải biến. M, GeneRuler 1kb DNA đã giúp cho chúng có khả năng tiêu diệt một số loài ladder; P, vector pZY101-Asc cắt; (-), Đối chứng âm sâu bọ cánh cứng đục quả và sâu keo mùa thu trên H2O; 1, Đối chứng dương từ DNA plasmid của vector cây bông (de-Oliveira et al., 2016; Silva et al., 2016; pJET1.2:cry1Ia dạng dại; 2-5, Khuẩn lạc của vector pZY101:35S:cry1Ia dạng dại; 6, Đối chứng dương từ Tounsi et al., 2003). Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu DNA plasmid của vector pUC19:cry1Ia cải biến; 7-10, đánh giá chức năng của độc tố do gen cry1Ia mã hóa Khuẩn lạc của vector pZY101:35S:cry1Ia cải biến. trên đối tượng sâu đục quả ở cây đậu tương. Do vậy, Sau khi chuyển thành công đoạn gen cry1Ia trong nghiên cứu này đã tiến hành cải biến gen dạng dại và cải biến vào vector pRTL2, các cấu trúc cry1Ia từ dạng dại ban đầu được phân lập từ chủng 35S:cry1Ia dạng dại và cải biến được cắt từ từ vector Bt TH19 ở Việt Nam và thiết kế thành công các tái tổ hợp pRTL2:cry1Ia dạng dại và cải biến bằng vector biểu hiện pZY101:35S:cry1Ia dạng dại và cải enzyme giới hạn HindIII và ghép nối vào vector biểu biến. Với việc thiết kế thành công vector biểu hiện hiện thực vật pZY101-Asc (cũng đã cắt mở vòng và pZY101:35S:cry1Ia dạng dại và cải biến này, hy vọng xử lý ở cùng vị trí enzyme giới hạn) (Hình 1B và 5A) rằng có thể sử dụng các cấu trúc véc tơ này để tạo bằng enzyme T4 DNA ligase. Sản phẩm nối của các giống đậu tương chuyển gen không chỉ được vector tái tổ hợp pZY101:35S:cry1Ia dạng dại và cải tăng cường khả năng tiêu diệt sâu đục quả mà còn cả biến được biến nạp vào chủng vi khuẩn E. coli Top10 với các đối tượng sâu hại khác. và nuôi qua đêm trên đĩa môi trường LB có bổ sung 4. KẾT LUẬN kháng sinh Spectinomycin 50 mg/L và Streptomycin Các kết quả trong nghiên cứu cho thấy, gen 50 mg/L ở 37oC. Các khuẩn lạc mọc trên môi trường cry1Ia dạng dại đã được cải biến bằng việc chỉnh sửa LB có bổ sung kháng sinh được lựa chọn để kiểm tra các bộ ba mã hóa của các axit amin nhưng không bằng PCR với các cặp mồi đặc hiệu 1Iawt-NcoI- làm thay đổi cấu trúc và chức năng của protein F/1Iawt-SmaI-R và 1Iacb-NcoI-F/1Iacb-SmaI-R cho Cry1Ia dạng dại ban đầu. Các cấu trúc vector biểu gen cry1Ia dạng dại và cải biến (Bảng 1). hiện pZY101:35S:cry1Ia dạng dại và cải biến đã được Kết quả cho thấy, hầu hết các khuẩn lạc đều cho thiết kế thành công sẽ thích hợp cho biến nạp gen kết quả dương tính với các cặp mồi đặc hiệu của gen vào cây đậu tương nhằm tăng cường khả năng diệt cry1Ia dạng dại và cải biến (Hình 5B-C). Như vậy, đã sâu đục quả. bước đầu thiết kế thành công vector biểu hiện LỜI CẢM ƠN pZY101:35S:cry1Ia dạng dại và cải biến. Sau đó, các vector tái tổ hợp này tiếp tục được kiểm tra và biến Công trình nghiên cứu được thực hiện trong nạp vào các chủng vi khuẩn A. tumefaciens nhằm khuôn khổ đề tài “Phân lập thiết kế gen kháng sâu phục vụ cho công tác chuyển gen vào đậu tương. tạo giống đậu tương biến đổi gen” theo Quyết định số 4495/QĐ-BNN-KHCN ngày 31/10/2016 của Bộ Hiện nay, sâu đục quả được biết tới là một trong trưởng Bộ Nông nghiệp và PTNT về việc Phê duyệt những loại côn trùng gây hại ảnh hưởng nghiêm danh mục các nhiệm vụ khoa học và công nghệ thực trọng tới các cây trồng quan trọng nói chung và cây hiện từ năm 2017 thuộc Chương trình CNSH Nông đậu tương nói riêng. Để đối phó với tình hình sâu hại nghiệp – Thủy sản. này, cho đến nay đã có nhiều các công trình nghiên TÀI LIỆU THAM KHẢO cứu cho thấy các gen được phân lập từ các chủng vi khuẩn Bt có khả năng diệt được loại sâu tương đối đa 1. Berg V. D., Shepard B. M., Nasikin (1998). dạng. Trong đó, một số nghiên cứu chỉ ra rằng, sự Response of soybean to attack by stemfly 38 N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 1 - TH¸NG 11/2020
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ Melagagromyza sofiae in farmers’ fields in Indonesia. environment friendly insectpest management Journal of Applied Ecology, 35: 514-522. strategy. J Environ Biol, 29(5):64-153. 2. Crickmore N., Zeigler D. R., Schnepf E., van 10. Morrison M. J., Cober E. R., Gregorich E. G., Rie J., Lereclus D., Baum J., Bravo A., Dean D. H. Voldeng H. D., Ma B., Topp G. C. (2017). Tillage and (2013). Bacillus thuringiensis Toxin Nomenclature. crop rotation effects on the yield of corn, soybean, Available online: http://www.lifesci. and wheat in eastern Canada. Can. J. Plant Sci, 98: sussex.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/. 183-191. 3. de-Oliveira R. S., Oliveira-Neto O. B., Moura 11. Mourtzinis S., Marburger D., Gaska J., Diallo H. F., de Macedo L. L., Arraes F. B., Lucena W. A., T., Lauer J. G., Conley S. (2017). Corn, soybean, and Lourenco-Tessutti I. T., de Deus Barbosa A. A., da wheat yield response to crop rotation, nitrogen rates, Silva M. C., Grossi-de-Sa M. F. (2016). Transgenic and foliar fungicide application. Crop Sci, 57: 983-992. Cotton Plants Expressing Cry1Ia12 Toxin Confer 12. Murray E. E., Lotzer J., Eberle M. (1989). Resistance to Fall Armyworm (Spodoptera Codon usage in plant genes. Nucleic Acids Res, frugiperda) and Cotton Boll Weevil (Anthonomus 17(2): 477-498. grandis). Front Plant Sci, 7: 165. 13. Silva C. R., Monnerat R., Lima L. M., Martins 4. Erickson B (2008). Corn/soybean rotation E. S., Melo Filho P. A., Pinheiro M. P., Santos R. C. literature summary. Purdue Univ West Lafayetter IN. (2016). Stable integration and expression of a cry1Ia 5. FAOSTAT (2019). Food and agriculture gene conferring resistance to fall armyworm and boll organization of the United Nations (FAO) statistical weevil in cotton plants. Pest Manag Sci, 72(8): 1549- databases, Available at: http://www.fao.org, 1557. Retrieved 10 august 2019. 14. Tabata J., Yokosuka T., Hattori M., Ohashi 6. Froger A. and Hall J. E (2007). M., Noguchi H., Sugie H. (2008). Sex attractant Transformation of plasmid DNA into E. coli using the pheromone of the limabean pod borer, Etiella heat shock method. Journal of visualized zinckenella (Treitschke) (Lepidoptera: Pyralidae), in experiments, JoVE(6): 253-253. Japan. Appl. Entomol. Zool, 43 (3): 351–358. 7. Gain U (2018). Vietnam—oilseeds and 15. Tounsi S., Zouari N., Jaoua S. (2003). Cloning products annual 2018, Global agricultural and study of the expression of a novel cry1Ia-type information network (Gain) report VM8018, USDA gene from Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki. J Gain, Hanoi, Vietnam. Appl Microbiol, 95(1): 23-28. 8. Hudson L., Bost K., Piller K. (2011). 16. USDA (2012). Field Release of Aphelinus Optimizing Recombinant Protein Expression in glycinis (Hymenoptera: Aphelinidae) for Biological Soybean, Soybean - Molecular Aspects of Breeding, Control of the Soybean Aphid, Aphis glycines Aleksandra Sudaric, IntechOpen, DOI: (Hemiptera: Aphididae), in the Continental United 10.5772/15111. Available from: States. Environmental Assessment. https://www.intechopen.com/books/soybean- 17. Zhang L., Guo Y., Luo L., Wang Y. P., Dong molecular-aspects-of-breeding/optimizing- Z. M., Sun S. H., Qiu L. J. (2011). Analysis of Nuclear recombinant-protein-expression-in-soybean Gene Codon Bias on Soybean Genome and 9. Kumar S., Chandra A., Pandey K. C. (2008). Transcriptome. Acta Agronomica Sinica, 37(6): 965- Bacillus thuringiensis (Bt) transgenic crop: an 974. N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 1 - TH¸NG 11/2020 39
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ MODIFICATION AND CONSTRUCTION OF EXPRESSION VECTOR CARRYING cry1Ia GENES CONFERRING RESISTANCE TO SOYBEAN POD BORER Etiella zinkenella Nguyen Huu Kien1, Nguyen Thi Hoa1 , Le Thi Mai Huong1, Nguyen Trung Anh1, Nguyen Tuan Minh1, Dinh Thi Mai Thu1, Tong Thi Huong1, Dinh Thi Thu Ngan1 , Nguyen Nhat Linh1, Nguyen Anh Vu1, Le Thi Thu Hien2 , Nguyen Van Dong1* 1 Agricultural Genetics Institute, Vietnam Academy of Agricultural Sciences 2 Institute of Genome Research, Vietnam Academy of Science and Technology Email: dongjircas@yahoo.com Summary Soybean (Glycine max L.) is one of the most economically important crops. However, the yield and quality of soybean are seriously affected by the infestation of pod borer Etiella zinkenella Treitschke. Recently, numerous studies have evaluated effects of Cry toxin on pod borer Etiella zinkenella on different crops but studying on soybean is still limited. In this study, we modified the cry1Ia gene and constructed the expression vectors carrying the wild- and modified-cry1Ia genes from the isolated Bacillus thuringiensis strain TH19 in Vietnam. Our present study provides materials for transforming the wild- and modified- cry1Ia genes into soybean to increase resistance to pod borer Etiella zinkenella. Keywords: Bacillus thuringiensis, cry1Ia, Etiella zinkenella, pZY101-Asc vector, soybean. Người phản biện: PGS.TS. Hà Viết Cường Ngày nhận bài: 19/5/2020 Ngày thông qua phản biện: 19/6/2020 Ngày duyệt đăng: 26/6/2020 40 N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 1 - TH¸NG 11/2020