Cấy phôi ở bò Bos Indicus
Nguồn: Enhancing tropical beef cattle genetics, reproduction and animal breeding skills,
Queensland, ausralia, 2001
(Trang web, 20/6/2002-Người dịch: Nguyễn Văn Lý)
1. Giới thiệu
Cấy phôi ở bò Bos Indicus không giống như bò Bos taurus. Điều này chủ yếu do
sự khác biệt về giải phẫu và sinh lý của hệ thống sinh sản giữa 2 loại bò này. Cổ tử cung
ở một số bò Bos indicus dài, xoắn và việc này làm cho khó dẫn tinh và thu phôi. Động
dục ở loại bò này ngắn hơn, độ mẫn cảm thấp hơn, và ở một số trường hợp, động dục
xuất hiện chủ yếu vào ban đêm. Thời gian rụng trứng sớm hơn so với động dục. Những
điều này đã làm cho việc thu phôi kém hơn, tỷ lệ thụ tinh kém hơn và các vấn đề khác đi
cùng với chương trình cấy phôi ở bò Bos indicus.
Trước khi bắt đầu gây rụng trứng nhiều ở một bò cái cho phôi Bos indicus, cần
phải bảo đảm chắc chắn rằng cổ tử cung có thể dẫn tinh và rửa thu phôi được. Cổ tử cung
bị xoắn thường xuất hiện ở bò già nhiều hơn so với bò còn ít tuổi hay bò hậu bị. Những
bò cái cho phôi có cổ tử cung xoắn nhiều có thể rửa thu phôi bằng phẫu thuật.
Bình thường bò Bos indicus được coi là giống bò nhút nhát. Tuy nhiên, việc này
có thể vượt qua được bằng cách thường xuyên nuôi giữ chúng trong sân chuồng, sử dụng
đực thiến có buộc dụng cụ đánh dấu và sử dụng cụ phát hiện động dục ở bò cho phôi.
2.Gây động dục đồng pha ở bò cho phôi để gây rụng trứng nhiều
Nếu trong chương trình cấy phôi có nhiều bò cho phôi, thì cần phải gây động dục
đồng pha những con bò này. Những bò cho phôi đang ở Ngày 8-14 của chu kỳ động dục
có thể nhóm lại với nhau và bắt đầu điều trị gây rụng trứng nhiều. Các phương pháp sau
đây thường được sử dụng:
Chu kỳ tự nhiên: Phải nhận biết được động dục của tất cả bò cho phôi và lựa chọn những
con ở giữa Ngày 8-Ngày 14 của chu kỳ để đưa vào chương trình cấy phôi.
Tiêm một liều Prostaglandin: Phải nhận biết được động dục của tất cả bò cho phôi, lựa
chọn những con ở ngày 3-4 của của kỳ và tiêm cho tất cả những con còn lại bằng một liều
PG để gây đồng pha.
Tiêm 2 liều Prostaglandin: Tiêm tất cả bò cho bằng một liều PG ở Ngày 1. 11 ngày sau
tiêm PG lần 2. Quan sát động dục trong 4-5 ngày. Bắt đầu gây rụng trứng nhiều 10 ngày
sau khi động dục của đa số bò cho phôi.
Synchromate-B: Đặt SMB ở Ngày 1, prostaglandin vào sáng Ngày 9 và rút SMB vào
chiều cùng ngày. Quan sát động dục trong 3 ngày. Đưa tất cả bò động dục vào chương
trình cấy phôi.
2. Sờ khám buồng trứng để gây rụng trứng nhiều
Điều quan trọng là phải sờ khám buồng trứng của bò cho phôi một ngày trước khi
bắt đầu điều trị gây rụng trứng nhiều để đảm bảo chắc chắn sự có mặt của thể vàng vì
một số gia súc, mặc dầu có biểu hiện tất cả các triệu chứng động dục, nhưng không rụng
trứng. Hiện tượng này phổ biến ở bò Bos indicus hơn so với ở bò Bos Taurus. Gây rụng
trứng nhiều ở những gia súc kém như thế sẽ dẫn đến không rụng trứng, tỷ lệ thu phôi kém
và chất lượng phôi kém.
3. Các loại hocmôn dùng để gây rụng trứng nhiều:
Folltropin:
Bò già Bò ít tuổi Bò hậu bị
Ngày 1
Ngày 2
Ngày 3
Ngày 4
3,0ml sáng/chiều
2,5ml sáng/chiều
2,0ml sáng/chiều
1,5ml sáng/chiều
2,5ml sáng/chiều
2,0ml sáng/chiều
1,5ml sáng/chiều
1,0ml sáng/chièu
2,0 hay 1,8ml sáng/chiều
1,5 hay 1,3ml sáng/chiều
1,0 hay 0,8 ml sáng/chiều
0,5 hay 0,3ml sáng/chiều
Prostaglandin được tiêm vào Ngày 3 hay Ngày 4 vào buổi sáng và buổi chiều.
Bò cho phôi được phối giống 12, 24 và 36 giờ sau khi động dục.
Thu phôi 6-7 ngày sau khi động dục.
4. Đông lạnh và giải đông phôi
10% Glycerol (1,4M) và Ethylene Glycol (E.G) đều được dùng làm chất bảo vệ
lạnh.
Cả hai loại chất bảo vệ lạnh này đều được đóng trong lọ thuỷ tinh có nút cao xu
trong EMCARE (môi trường không đệm phosphate) hay môi trường nuôi cấy trứng
(OCM-môi trường đệm phosphate). Cả hai loại đều được bổ xung 0,4% BSA và kháng
sinh (Kanamycin).
(Nghiên cứu gần đây ở RuaKura, New Zealand đã chứng minh rằng EMCARE, một
hệ thống đệm ZWITTERION tốt hơn so với Các hệ thống đệm PHOSPHATE đối với
môi trường nuôi giữ phôi trong thời gian vừa phải, và vì thế nhiều loại môi trường
EMCARE được khuyến cáo).
5. Đông lạnh và giải đông trong Glycerol
(i) Đông lạnh trong Glycerol
Tổng thời gian phôi cần phải ở trong 10% Glycerol trước khi đưa vào đông lạnh ở
-5,5-6,50C là 15-30 phút ở nhiệt độ 20-250C. (Độc tính có liên quan đến nhiệt độ, do đó
nhiệt độ càng cao thì thời gian cân bằng càng ít hơn. Một điều nữa là cân bằng không nên
thực hiện ở nhiệt độ dưới 200C).
Hãy cài đặt máy đông lạnh, và cọng rạ được dán nhãn trước khi hút phôi từ môi
trường giữ phôi vào môi trường đông lạnh.
Đưa phôi vào 10% glycerol, và bắt đầu đặt đồng hồ (hay chú ý đến thời gian). Đưa phôi
vào cọng rạ như đã mô tả ở trên. Sau một thời gian tối thiểu 15 phút và tối đa 20-30 phút
(phụ thuộc vào nhiệt độ), đặt cọng rạ vào máy đông lạnh ở –5,50-6,50C. Tạo đá sau 1
phút (thời gian không quan trọng, nhưng thời gian cần thiết phải đủ để đủ lạnh để tạo đá).
Tạo đá phía trên cột có phôi bởi vì đá không tạo bóng khí.
Một số cọng rạ có thể tự tạo đá trong một số máy đông lạnh nhưng đừng tin tưởng vào
điều này- thường xuyên phải kiểm tra bằng tay nếu nghi ngờ. Rất dễ nhìn thấy sự hình
thành đá (môi trường biến thành màu trắng) nếu có đủ ánh sáng-hãy sử dụng ngọn nến nếu
thấy cần thiết.
Giữ trong 10 phút.
Khi sử dụng glycerol làm chất bảo vệ lạnh, tốc độ làm lạnh từ -0,30C/phút -
0,50C/phút đến -340C và -350C sẽ cho kết quả tương tự.
Tốc độ làm lạnh -0,50C/phút đến -300C cho kết quả tốt trong glycerol.
Nhúng vào ni tơ lỏng ở nhiệt độ -300C đến -350C.
Đưa phôi vào cọng rạ để đông lạnh và cấy chuyển gián tiếp (ví dụ trong Glycerol)
Ghi nhà sản xuất
Nút
ch
ận
Không
khí
FM (7cm)
FM (0.5cm)
Cột môi trường
đông lạnh nhỏ
(FM) 0.5-1 cm Phôi
Không
khí
Nếu sử dụng PVC
để gắn thì phải có
một lư
ợng nhỏ dung
dịch ở đây để làm
ướt PVC
Nếu gắn
bằng nhiệt
thì để trống
chỗ này để
gắn
Phải đưa phôi vào cọng rạ làm sao cho phôi ở vị trí ít nhất là 1/3 cọng rạ kể từ phí
dưới (khi cọng rạ được để đứng trong máy đông lạnh), do đó phôi không chìm xuống
phía dưới và không bị đông lạnh ở trong phần bóng khí. Phôi phải ở phần giữa cột môi
trường do đó không được tạo đá trực tiếp lên phôi.
Có thể nhìn thấy phôi trong cọng rạ bằng mắt thường nếu góc chiếu sáng phí sau
cọng rạ đúng vị trí. Điều này đã tiết kiệm thời gian khi xem xét vị trí của phôi có đúng
không, và vị trí của phôi rất quan trọng để cho những kết quả thống nhất. Nếu phôi không
ở đúng vị trí, hãy giữ cọng rạ thẳng đứng (hay lộn ngược xuống) và điều đó cho phép
phôi rơi xuống đúng vị trí.
(ii) Giải đông phôi đông lạnh trong glycerol
Giải đông cũng phải được thực hiện ở nhiệt độ 20-300C. Tuy nhhiên, khi không
thể thì hãy nhớ rằng pha loãng chất bảo vệ lạnh chậm hơn ở nhiệt độ thấp hơn, và pha
loãng nhanh hơn ở nhiệt độ cao hơn.
Đĩa giải đông (môi trường đặc biệt) Đĩa rửa (Môi trưòng giữ phôi)
1
2
Đĩa giải đông
Lỗ A 5% glycerol, 0,5M Sucrose* 6 phút 30 giây (ở nhhiệt độ 20-250C)
Lỗ B 0% glycerol, 0,5M Sucrose** 6 phút 30 giây (ở nhhiệt độ 20-250C)
*Trộn một nửa và một nửa (Ví dụ 2ml và 2ml) 1M Sucrose và 10% Glycerol.
** Trộn một nửa và một nửa (Ví dụ 2ml và 2ml) 1M Sucrose và môi trường giữ phôi.
Khi trộn lẫn hãy bảo đảm để sử dụng phôi bằng syringe an toàn, và trộn kỹ.
Giải đông
Lấy ra khỏi ni tơ lỏng, giữ 10 giây và sau đó 300C trong 15-20 giây. Hãy cẩn thận
lau sạch nước khỏi cọng rạ.
Khi giải đông, nếu cọng rạ được gắn bằng bột PVC, hãy bảo đảm rằng không có bột, hay
dung dịch bị tiếp xúc với bột, được tiếp xúc với phôi. Bột PVC rất độc đối với phôi.
Hẫy đẩy dung dịch trong cọng rạ vào một đĩa sạch 35mm, hẫy định vị phôi và đặt vào lỗ
A 6 phút, 30 giây, sau đó trong lỗ B 6 phút, 30 giây (ở nhiệt độ 20-25C) sau đó đưa vào
đĩa rửa.
Đĩa rửa
Khoảng 2ml môi trường giữ phôi trong mỗi lỗ.
Rửa khoảng 15 giây trong mỗi lỗ, sau đó giữ trong lỗ 4 và đưa vào cọng rạ.
Thay thế cọng rạ và dung dịch rửa sau khi mỗi đĩa đã sử lý khoảng 8 phôi.
Đưa phôi vào cọng rạ để cấy sau khi giải đông
Rửa mỗi cọng rạ 2 lần với môi trường giữ phôi và kiểm tra đầu cuối của cọng rạ
(vì phôi có thể bị mắc kẹt ở đó).
Nhà sản xuất
Không kh
í Phôi Không khí
Nút chận
Cắt 2-4mm nếu cần
thiết ~5cm ~3cm ~2cm
Hút khoảng 5cm môi trường, sau đó khoảng 3-4mm bóng khí, sau đó phôi ở trong cột
khoảng 3cm, 3-4mm bóng khí khác, và sau đó hút đầy môi trường vào cọng rạ. Cắt
khoảng 3-4mm phần cuối của cọng rạ nếu thấy cần (một số súng đòi hỏi cọng rạ ngắn
hơn).
Hãy kiểm tra vị trí của phôi trong cọng rạ, và đưa vào súng cấy phôi có cả vỏ súng cấy
phôi và vỏ nilon để giữ vệ sinh.
Hãy giữa nằm ngang (do đó phôi không bị rơi vào bóng khí) trong găng tay dẫn tinh sạch
và tránh ánh sáng chiếu trực tiếp vào phôi.
1. Đông lạnh và giải đông trong Ethylene Glycol (E.G.)
(i) Đông lạnh trong Ethylene Glycol
Ethylene Glycol (E.G.) có phân tử nhỏ hơn glycerol, do đó nó di chuyển vào
trong tế bào phôi nhanh hơn. Vì điều này mà nó được coi là độc hơn.
Chỉ nên giữ phôi trong E.G tối đa là 10 phút trước khi đưa vào máy đông lạnh ở nhiệt độ
-5,5 đến -6,50C.
Giữ 5-10 phút sau khi tạo đá sau đó đông lạnh với tốc độ -0,50C-0,60C/phút đến -
300C đến -320C sau đó nhúng vào ni tơ lỏng.
(Hãy nhớ rằng một khi phôi đã được đặt vào máy đông lạnh ở khoảng -6,00C và
đã tạo đá, độc tính củat chất bảo vệ lạnh bị giảm xuống rất nhiều, do đó hãy sử dụng