Chiến lược sử dụng kháng thể để định tỷ lệ phần trăm TCD4, TCD8 một cách chính xác và rẻ tiền

Chia sẻ: Sunshine_6 Sunshine_6 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:6

Thêm vào BST

Báo xấu

91
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nghiên cứu nhằm xây dựng cho Labo miễn dịch một chiến lược dùng kháng thể để định tỷ lệ % TCD4, % TCD8 một cách chính xác và rẻ tiền. Mẫu của 38 người được chia thành 2 nhóm: nhóm có mẫu bình thường: thấy rõ 3 nhóm tế bào lympho, mono, bạch cầu hạt trên cửa sổ FSC, SSC. Và nhóm có mẫu bất thường: không thấy rõ 3 nhóm tế bào như trên. Hai bộ kháng thể được sử dụng: Với phương pháp 4 màu: CD3 (FITC)/CD8 (PE)/CD45 (PerCP)/CD4 (APC) và với phương pháp 3 màu: CD4 (FITC)/CD3...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Chiến lược sử dụng kháng thể để định tỷ lệ phần trăm TCD4, TCD8 một cách chính xác và rẻ tiền

ChiÕn l−îc sö dông kh¸ng thÓ ®Ó ®Þnh tû lÖ phÇn tr¨m TCD4, TCD8 mét c¸ch chÝnh x¸c vµ rÎ tiÒn TrÇn Khiªn Hïng Phßng MiÔn dÞch tÕ bµo, ViÖn Pasteur tp Hå ChÝ Minh Nghiên cứu nhằm xây dựng cho Labo miễn dịch một chiến lược dùng kháng thể để định tỷ lệ % TCD4, % TCD8 một cách chính xác và rẻ tiền. Mẫu của 38 người được chia thành 2 nhóm: nhóm có mẫu bình thường: thấy rõ 3 nhóm tế bào lympho, mono, bạch cầu hạt trên cửa sổ FSC, SSC. Và nhóm có mẫu bất thường: không thấy rõ 3 nhóm tế bào như trên. Hai bộ kháng thể được sử dụng: Với phương pháp 4 màu: CD3 (FITC)/CD8 (PE)/CD45 (PerCP)/CD4 (APC) và với phương pháp 3 màu: CD4 (FITC)/CD3 (PE)/CD8 (PerCP). Giá trị % TCD4, %TCD8 của từng mẫu được ghi nhận ở cả 2 phương pháp. Dùng phần mềm Excell để xác định hệ số tương quan ở cả 2 phương pháp của các mẫu nghiên cứu. Kết quả: + Trong nhóm tế bào bình thường hệ số tương quan giữa PP 4 màu và PP 3 màu đối với: * TCD4: r = 0.96. * TCD8: r = 0.87. + Trong nhóm có tế bào bất thường hệ số tương quan giữa PP 4 màu và PP 3 màu đối với * TCD4: r = 0.66. * TCD8: r = 0.57. Với nhóm tế bào bình thường có sự tương quan tốt giữa hai phương pháp 3 và 4 màu và chúng ta có thể xử dụng phương pháp 3 màu để định tỷ lệ % TCD4, % TCD8 với độ chính xác không kém gì đối với phương pháp 4 màu. Điều này dẫn chóng tôi đến một chiến lược: Trước tiên dùng phương pháp 3 màu. Nếu có gì bất thường xảy ra lúc xử lý mẫu (còn nhiều hồng cầu sau khi ly giải), lúc chạy mẫu (thấy nhiều mảnh vụn) thì mới chuyển sang phương pháp 4 màu. I. ĐẶT VẤN ĐỀ + Đối với bệnh nhân ghép cơ quan thì Trong lâm sàng việc đánh giá tỷ lệ % việc theo dõi định kỳ các tỷ lệ này giúp ta của lympho TCD4, TCD8 có một giá trị thực dự báo đến tình trạng thải ghép [2]… tiễn vì đối với HIV/AIDS thì nó giúp xác định Trong thực tế để làm được việc này, bệnh nhân nhiễm HIV đang ở giai đoạn chúng ta có nhiều chọn lựa khác nhau về nào? Có chỉ định dùng thuốc ức chế men cách thức xử lý mẫu, loại kháng thể sử sao chép ngược chưa? Hiệu quả của việc dụng, cách thức phân tích …, tuy nhiên điều trị bằng thuốc hay những liệu pháp trong phạm vi nghiên cứu này chúng tôi tập khác như thế nào? [1]. 51
trung vào việc lựa chọn kháng thể để làm 1. Vật liệu và đối tượng nghiên cứu: xét nghiệm. - Ống chống đông bằng EDTA- TRI K Với 2 loại kháng thể sau tương ứng với cung cấp bởi LMD Paris. phương pháp 4 màu, 3 màu. - Ống nghiệm 5ml, cỡ 12 x 75mm do + CD3 (FITC)/CD8 (PE)/CD45 hãng BD cung cấp. (PerCP)/CD4 (APC) {4 màu} - Kháng thể của BD: + CD4 (FITC)/CD3 (PE)/CD8 (PerCP) {3 + PP 4 màu: CD3 (FITC)/CD8 màu} (PE)/CD45 (PerCP)/CD4 (APC). Thì độ chính xác của thử nghiệm và giá + PP 3 màu: CD4 (FITC)/CD3 cả cũng khác nhau. (PE)/CD8 (PerCP). Loại đầu tiên giá cho mỗi mẫu thử là - Dung dịch ly giải hồng cầu. 19.12 USD (theo khuyến cáo xử dụng của - Máy FASCalibur của BD. hãng- báo giá ngày 21- 05- 2002) và nó chính xác hơn loại kế tiếp nếu được kết - Phần mềm Cellquest, Excel hợp với phương pháp phân tích đúng…(1) - Mẫu nghiên cứu gồm 38 người lấy từ Loại thứ hai thì giá tiền cho mỗi mẫu thử những người thấy rõ 3 nhóm quần thể chỉ có 6.44 USD nhưng kém tin cậy hơn. lympho, mono, bạch cầu hạt ở cửa sổ FSC, Mục đích nghiên cứu là nhằm đưa ra được SSC theo quy định của chúng tôi, trong chiến lược xử dụng kháng thể như thế nghiên cứu này gọi là nhóm bình thường và nào để đảm bảo tính chính xác và rẻ tiền ngược lại là nhóm bất thường. trong việc xác định tỷ lệ % CD4, CD8. II. VËt liÖu vµ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU A. B. C. BC HAT MONO LYMPHO Hình 1: Nhóm bình thường và nhóm bất thường. A. Nhóm bình thường thấy rõ 3 nhóm cũng phân biệt các nhóm quần thể tế bào dân số lympho, mono, bạch cầu hạt ở cửa như ở hình 1- A. sổ FSC, SSC. 2. Ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu: B. Nhóm quần thể bất thường không thể +Xử lý mẫu: xác định chính xác vị trí các nhóm. *1 ml máu tươi chống đông bằng EDTA C. Cũng là mẫu của nhóm quần thể bất được xử lý trong vòng 4 giờ. thường nhưng được ủ với loại kháng thể 4 màu và dùng cách xử lý khác. Nên sau đó 52
*Với PP 4 màu: ủ 5 µl kháng thể CD3 - Đỏ: cung cấp ánh sánh ở bước sóng (FITC)/CD8 (PE)/CD45 (PerCP)/CD4 (APC) 620 nm. với 100 µl máu toàn phần. *Có 6 cảm thụ quan nhận cảm ánh sáng *Với PP 3 màu: ủ 9 µl kháng thể (3 µl phát xạ và những cảm thụ quan này cho ta cho mỗi loại) CD4 (FITC)/CD3 (PE)/CD8 biết được: (PerCP) với 100 µl máu toàn phần. - FSC: hình thái của tế bào. *Hồng cầu bị ly giải bằng 1 ml dung dịch - SSC: cấu trúc của tế bào. ly. - Fl1:bắt màu huỳnh quang FITC. *Trung hòa bằng 1ml dung dịch PBS. - Fl2:bắt màu huỳnh quang PE. *Ly tâm 2000 rpm/1’ trong vòng 4 phút. - Fl3:bắt màu huỳnh quang PerCP. Bỏ dịch nổi, thêm vào 500 µl dung dịch - Fl4:bắt màu huỳnh quang APC. PBS, lắc đều và các tế bào được phân tích + Mẫu được phân tích bằng sơ đồ chạy sau đó bằng máy FASC. trong chương trình Cellquest. +Mẫu được chạy bằng máy FASCalibur, % TCD4, TCD8 được xác định như sau: sản phẩm của hãng BD (Hoa Kỳ). + Đối với phương pháp 4 màu CD3 *Máy có 2 đèn laser. (FITC)/CD8 (PE)/CD45 (PerCP)/CD4 (APC) - Xanh: cung cấp ánh sáng ở bước sóng 488 nm. A. B. R1 LYMPHO R2 C. D. UL UR UL UR LR LR Hình 2: Xác định tỷ lệ % TCD4, TCD8 bằng phương pháp 4 màu. 53
A. Dùng cửa sổ (x=SSC, y=Fl3:CD45) quần thể T CD8 ( CD3+, CD8+) và phối giới hạn bạch cầu trong khu vực R1. Loại hợp với phần mềm thống kê. Biết được tỷ trừ tất cả những yếu tố gây nhiễu như hồng lệ % T CD8 trong vùng UR của cửa sổ. cầu, xác tế bào… ra khỏi khu vực phân D. Cửa sổ (x=fl1:CD3, y=fl4:CD4) bắt tích. nguồn từ hội vùng R1 và R2 để biết được B. Cửa sổ (x=FSC, y=SSC) bắt nguồn quần thể T CD4 ( CD3+, CD4+) và phối từ vùng R1. Thấy rõ 3 nhóm dân số và giới hợp với phần mềm thống kê. Biết được tỷ hạn vùng lympho trong khu vực R2. lệ % T CD4 trong vùng UR của cửa sổ. C. Cửa sổ (x=fl1:CD3, y=fl2:CD8) bắt + Đối với phương pháp 3 màu CD4 nguồn từ hội vùng R1 và R2 để biết được (FITC)/CD3 (PE)/CD8 (PerCP): A. B. UR R1 C. D. Sample ID: 210802/42856 UR Acquisition Date: 21-Aug-02 Gated Events: 10102 Total Events: 55255 Quad Events % Gated % Total UL 1356 13.42 2.45 UR 3450 34.15 6.24 LL 2707 26.80 4.90 LR 2589 25.63 4.69 Hình 3: Xác định tỷ lệ % TCD4, TCD8 bằng phương pháp 3 màu. A. Dùng cửa sổ (x=FSC, y=SSC) để C. Cửa sổ (x=fl2:CD3, fl3:CD8) bắt phân biệt 3 nhóm quần thể và giới hạn nguồn từ vùng R1 để biết được quần thể lympho trong vùng R1. TCD8 (CD3+, CD8+) và phối hợp với phần B. Cửa sổ (x=fl1:CD4, y=fl2:CD3) bắt mềm thống kê. Biết được tỷ lệ % TCD8 nguồn từ vùng R1 để biết được quần thể T trong vùng UR của cửa sổ. CD4 (CD3+, CD4+) và phối hợp với phần D. Giới thiệu kết quả truy xuất của phần mềm thống kê. Biết được tỷ lệ % TCD4 mềm thống kê. % gated của vùng UR là trong vùng UR của cửa sổ. phần chúng ta quan tâm. Mỗi một cửa sổ sẽ có một kết quả truy xuất thích hợp. 54
3. Phương pháp thống kê: Một yếu tố rất quan trọng, theo thống kê + Giá trị % TCD4, TCD8 của từng mẫu của chúng tôi tại viện Pasteur TP.HCM từ được ghi nhận ở cả 2 phương pháp 3, 4 4- 2002 đến 2- 2003. Có khoảng 1581 màu. trường hợp làm % TCD4, %TCD8, trong đó chỉ có 8 trường hợp bất thường (với tỷ lệ + Đối tượng nghiên cứu được chia tương ứng < 0.51%, một tỷ lệ rất thấp). Bất thành 2 nhóm: thường có nghĩa là hồng cầu không ly giải *Nhóm bình thường (hình 1- A). hoàn toàn, còn nhiều mảnh vở tế bào… *Nhóm bất thường (hình 1- B). trong mẫu cần phân tích. Chúng tôi đã thử +Dùng phần mềm Excell để xác định hệ bằng nhiều cách như tăng thể tích dung số tương quan ở cả 2 phương pháp cho 2 dịch ly giải, ly giải lập đi lập lại nhiều lần… nhóm đối tượng. đều không thể loại trừ được hết hồng cầu III. KẾT QUẢ ra khỏi mẫu. + Trong nhóm đối tượng bình thường hệ Trong những trường hợp bất thường số tương quan giữa phương pháp 4 màu như thế, xử dụng phương pháp 4 màu và và phương pháp 3 màu đối với: dùng CD 45 để loại trừ hồng cầu, mảnh vở tế bào để định tỷ lệ % TCD4, TCD8 thì chính * TCD4: r = 0.96. xác hơn phương pháp 3 màu. Vì với * TCD8: r = 0.87. phương pháp 3 màu chúng ta không thể + Trong nhóm đối tượng bất thường hệ nào loại trừ được các yếu tố gây nhiễu kể số tương quan giữa phương pháp 4 màu trên. và phương pháp 3 màu đối với: Từ nghiên cứu trên, hiện nay chúng tôi * TCD4: r = 0.66. có chiến lược dùng kháng thể như sau: * TCD8: r = 0.57. Trước tiên dùng phương pháp 3 màu. IV. BÀN LUẬN Nếu có gì bất thường xảy ra lúc xử lý mẫu (còn nhiều hồng cầu sau khi ly giải), lúc Trong nhóm dân số bình thường, có sự chạy mẫu (thấy nhiều mảnh vụn)… thì lập tương quan tốt giữa 2 phương pháp. Đặc tức chúng tôi chuyển sang phương pháp 4 biệt tốt đối với quần thể T CD4, điều này dễ màu. hiểu vì thực chất quần thể TCD4 là quần thể tách biệt rõ giữa nhóm dân số âm tính V. KÕt luËn (không có CD4 ở bề mặt tế bào) và nhóm KÕt qu¶ nghiªn cøu cho chóng t«i cã c¸c dân số dương tính (có CD4 ở bề mặt tế kÕt luËn vÒ chiÕn l−îc sö dông kh¸ng thÓ bào). Trái lại với quần thể T CD8 lại là quần trong viÖc x¸c ®Þnh tû lÖ % TCD4 vµ TCD8. thể liên tục, khó thấy ranh giới giữa 2 nhóm §Çu tiªn chØ cÇn dïng ph−¬ng ph¸p 3 mÇu dân số âm và dương. Vì thế trong phân tích víi bé kh¸ng thÓ CD4/CD3/CD8. NÕu cã tÕ đối với dân số TCD8, chúng ta khó loại trừ bµo bÊt th−êng míi chuyÓn sang ph−¬ng hết những tín hiệu nhiễu do đó sẽ có sai số ph¸p 4 mµu víi bé kh¸ng thÓ giữa 2 phương pháp [1]. CD3/CD8/CD45/CD4. Tû lÖ ®èi t−îng cã tÕ Còn trong nhóm bất thường thì sự bµo bÊt th−êng cña chóng t«i thÊp tương quan kém hơn nhiều. (
2.Carl A Burtis, Edward R Ashwood; Tietz W B Saunders Company; p1338. Textbook of Clinical Chemistry, Part 3; Summary The strategy use antibodies for quantity the percentage of lympho TCD4, TCD8 accurately and low- cost The samples were obtained from the 38 peoples that can be divided in two groups: + Normal samples group: can see clearly three populations (lymphocyte, monocyte, granulocyte) on the window SSC, FSC. + Abnormal samples group: can’t difference those populations. There are two types of antibodies used for each method. + 4 colors method: CD3 (FITC)/CD8 (PE)/CD45 (PerCP)/CD4 (APC). + 3 colors method: CD4 (FITC)/CD3 (PE)/CD8 (PerCP). Obtained results: shown that the correlation coeficients of the % TCD4 and TCD8 between two methods were: + With normal samples: * TCD4: r = 0.96. * TCD8: r = 0.87. + And with abnormal samples: * TCD4: r = 0.66. * TCD8: r = 0.57. It means that we can use 3 colors method to quantify a accurately the % of TCD4 and TCD8. 56