Đề tài: Công nghệ sản xuất Insulin

CÔNG NGH Ệ S N XU T INSULIN

Ả

Ấ

GVHD : PGS.TS Nguy n ễ Thúy H ngươ SVTH : Ph m Ng c Xuân

ạ

ọ

Ph m Ng c Thiên

ạ

ọ

Tr n Đ c Thi n

ứ

ệ

ầ

Đ ng Minh Châu

ặ

Hà

Thanh Trúc

L p :

ớ

HC07SH2

Năm h c : ọ

2010-2011

N i dung chính

ộ

I . L i m đ u

ở ầ

ờ

Đôi nét v b nh ti u đ ề ệ

ể ườ

II. M t s lo i insulin trên th tr

ộ ố ạ

ị ườ

III. C s khoa h c c a công ngh s n xu t insulin

ọ ủ

ệ ả

ơ ở

ấ

1. C u trúc phân t

insulin

ấ

ử

2. T ng h p insulin trong c th

ơ ể

ổ

ợ

3. Vai trò sinh h c c a insulin

ọ ủ

IV. Công ngh s n xu t insulin. ệ ả

ấ

1.S n xu t insulin tách chi

t t

ả

ấ

ế ừ ộ

đ ng v t ậ

2.S n xu t insulin t

th c v t chuy n gen

ả

ấ

ừ ự ậ

ể

3.S n xu t insulin t

đ i t

ng vi sinh v t chuy n

ả

ấ

ừ ố ượ

ể

ậ

gen

4. K t lu n

ế

ậ

I. L i m đ u ở ầ

ờ

ệ

i m c b nh ti u

ng s kéo theo s gia tăng

ệ

i do b nh ti u đ

ố ườ ử ụ

ể i ố ườ ự ư ầ vong i t ng liên t c gia ỏ

ề

ế ậ

• B nh ti u đ ng là m t trong nh ng căn b nh ộ ữ ể ườ i s c kho con đe d a nghiêm tr ng t ọ ẻ ớ ứ ọ i s ng i.Trên th gi ng ắ ệ ế ớ ố ườ ườ đ ng ngày càng tăng, s gia tăng s ng ự ườ m c b nh ti u đ ể ườ ẽ ắ ệ các bi n ch ng c a căn b nh này nh th n ủ ứ ế kinh, x v a đ ng m ch… S ng ơ ữ ộ ạ trên th gi ệ ế ớ ể ườ tăng trong nh ng năm g n đây. Đi u đó đòi h i ầ ph i tìm ra nh ng h ng ti p c n m i cho vi c ngăn ng a và đi u tr căn b nh

ữ ữ ừ

ướ ề

ả ệ

ị

ớ ệ này.

ườ ầ

t su t đ

i đ u c insulin năm

ữ ấ ượ

ế

Best và Banting- nh ng ng tiên đã chi 1921

ườ ầ

ữ

ấ

Collip và MacLeod- nh ng ng dùng insulin chi ế ti u đ

i đ u tiên t su t đó đ đi u tr b nh ị ệ ể ề ng type 1 cho Leonard Thomson

ể ườ

t gì v b nh ti u đ

ng ?

V y b n bi ậ ạ

ế

ề ệ

ể ườ

Vài nét v b nh ti u đ ề ệ

ể ườ

1. Khái ni mệ

2. Phân lo iạ

v b nh ti u đ ng hi n ự ế ề ệ ể ườ ệ

3. Tình hình th c t nay

1. Khái ni mệ

• B nh đái tháo đ

ọ ệ ể

ệ ườ ườ ộ ệ ể ạ

ơ ể

• B nh ti u đ

ng, còn g i là B nh ti u đ ng, là m t b nh do r i lo n chuy n hóa ố cacbohydrat khi hoóc môn insulin c a t y b ủ ụ ị thi u hay gi m tác đ ng trong c th , bi u ể ộ ng trong máu luôn cao hi n b ng m c đ ả ứ ườ ế ệ ằ

ệ ữ

ể ườ ủ

ề ạ ệ

ạ ng, ho i ế t d ệ ươ ậ

ng là m t trong nh ng nguyên ộ nhân chính c a nhi u b nh hi m nghèo, đi n ể ể ệ hình là b nh tim m ch vành, tai bi n m ch máu não, mù m t, suy th n, li ạ ắ th , v.vư

2. Phân lo iạ

• Ti u đ

ể ườ

ng ph thu c ộ ụ i tr ) chi m ế

• Nguyên nhân b nh: c ch t

(ti u đ ng lo i 1: ể ườ ạ ng ng insulin hay ti u đ ở ườ ẻ ể ườ kho ng 5-10% t ng s b nh nhân ố ệ ổ ả

ệ ễ

ơ ế ự ủ ở

ả

mi n (tuy n ế t y b t n công và phá h y b i chính c th , ơ ể ụ ị ấ làm cho tuy n t y không còn kh năng s n ả ế ụ xu t insulin n a) ữ ấ

• Nh ng tri u ch ng đi n hình: ti u nhi u, u ng nhi u, đôi khi ăn nhi u, m m t, d ị

ữ ứ ể ề

ể ờ ắ ệ ề ề ố

c m và s t cân, tr em ch m phát tri n và d ụ ẻ ể ễ ả ậ

b nhi m trùng. ễ ị

ể ườ

ổ

ng, th

ể ườ

ổ

ng không ph thu c insulin hay ti u ể ộ ụ ng thành) chi m kho ng 90-95% trong t ng s ả ế ố l a tu i trên 40, nh ng ng g p ặ ở ứ ườ l a tu i 30, th m chí c l a ậ ổ

ư ả ứ

ề ở ứ

ệ

ng lo i 2 ạ : ( ti u đ • Ti u đ ể ườ i tr ng đ ng ở ườ ưở ườ b nh nhân b nh ti u đ ệ ệ g n đây xu t hi n ngày càng nhi u ấ ầ tu i thanh thi u niên. ổ

ế

ườ ệ

i b nh v n còn kh năng s n xu t insulin, nh ng không ả

ẫ

ả

ấ

• T y ng ụ đ . ủ

•

ườ

ứ

ệ

ệ ế

ng ch đ ơ

ệ ở ạ

ế

ặ

ồ

c phát hi n tình c khi đi xét nghi m máu tr

c phát hi n b i các tri u ch ng Ít có tri u ch ng và th ỉ ượ c a bi n ch ng(nh i máu c tim, tai bi n m ch máu não), ho c ch ủ ỉ đ ượ

c khi m . ổ

ứ ứ ệ

ướ

ệ

ờ

• T l

ng tăng theo tu i, y u t

ế ố

ề

ổ quan tr ng. Có m i liên quan tr c ti p gi a béo phì và ti u đ

di truy n cũng đóng vai trò ng ữ

ti u đ ỷ ệ ể ườ ọ

ể ườ

ự ế

ố

lo i 2.ạ

ộ ố ạ

ắ ầ

ờ

ế

tr

II. M t s lo i insulin trên th ị ngườ

Lo i insulin

ạ

Màu s cắ

Ngu n g c ồ ố

Th i gian b t đ u ờ có tác d ngụ

Th i gian h t tác d ngụ

ụ

i ườ

trong

8 giờ

(tiêm d

i da)

30 phút ướ

Tác d ng nhanh - Insulin Actrapid HM. - Insulinum maxirapid.

L n ợ

ụ

1 gi

đ cụ

ờ

20 gi ờ 18 giờ

Tác d ng bán ch m ậ - Insulatard HM. - Insulin Lente.

iườ L n ợ

ạ

ộ

30 phút

đ c ụ

i ườ

20 giờ

Lo i pha tr n - Mixtard HM 30/70.

ụ

ấ

Bò

đ c ụ

4 giờ

30 giờ

Tác d ng r t ch m ậ - Utra - Lente

ơ ở

III. C s khoa h c c a ọ ủ công ngh s n xu t ấ ệ ả nsulin

1. C u trúc phân t

insulin

ấ

ử

i la môt

ườ

̣ polypeptide

Insulin ng o Bao gôm:

• Chuôi ̃ A 21 acid amin • Chuôi ̃ B 30 acid amin • Co môt

́ ̀ ́

trong ̣ câu nôi disulfur chuôi A va 2 câu nôi disufur nôi gi a hai chuôi A va B.

ữ

̃ ̀ ̀ ́ ́

o Công th c hóa h c: ứ

ọ

ng phân t

̃ ̀

C257H383N65O77S6 : o Tr ng l ọ

ượ

ử 5808

C u trúc hóa h c c a insulin

ọ ủ

ấ

2. T ng h p insulin trong c th

ơ ể

ổ

ợ

ỗ

ế

ổ

• Preproinsulin: là chu i peptid dài 110 bào acid amine, t ng h p trong các t ợ β c a đao Langerhans cua tuyên tuy.

ủ

ế ớ

̉ ̉ ́ ̣

̣ ́

ướ

̀ ̀

• Proinsulin: Khi Preproinsulin ti n t i nôi chât, m t protease chuyên l ộ ướ bi t s c t b đo n peptide tín hi u ệ ạ ệ ẽ ắ ỏ t o proinsulin. Proinsulin hinh thanh ạ i nôi chât, câu nôi disulfur trong l hinh thanh câu truc bâc ba.

̀ ́ ̣ ́

•

ờ

̀ ̀ ́ ́ ̣

ắ ữ

́ ̃ ̀ ̀

Insulin: Hình thành qua quá trình phân c t nh enzyme PC1/3 tai liên kêt gi a chuôi B va C va enzyme PC2 ngay vi tri liên kêt gi a chuôi A va C.

ữ

̣ ́ ́ ̃ ̀

3. Vai trò sinh h c c a insulin

ọ ủ

v Insulin và trao đ i hydratcacbon

ổ

vInsulin và trao đ i lipit

ổ

vNh ng tác đ ng khác c a insulin

ữ

ủ

ộ

Năng l

ng trao đ i

ượ

ổ

T bào h p thu glucose

ế

ấ

Gia tăng tu n hoàn ầ insulin

ấ

ch tấ T ng h p ch t béo ợ ổ T ng h p Glycogen ợ ổ

ế ụ

ế

ng Glucose còn l

ượ

ạ

Kích thích tuy n t y ti ra insulin

ượ

ng Glucose

Gi m l ả

ượ

Glucose trong máu

trong máu

ng Tăng l Glucose trong máu

ấ

ế

H p thu Glucose vào máu

Kích thích tuy n t y ti ế ụ ra Glucagon

ầ

Glycogen chuy n thành

Gia tăng tu n hoàn Glucagon

Glucose

ể ganở

S đ bi u hi n s đi u hòa hàm l

ng glucose

ệ ự ề

ơ ồ ể

ượ

máu

Nh ng tác đ ng khác c a insulin

ữ

ủ

ộ

ụ ủ

ấ

Insulin làm tăng tính th m các ion kali, magie và photphat vô cơ

ệ

- Insulin làm tăng tính h p th c a ấ các axitamin. - Insulin làm tăng tính th m các ion ấ kali, magie và photphat vô c ơ t o đi u ki n cho ề ạ quá trình photphoryl hoá và

s d ng glucoz. ử ụ

IV. Công ngh ệ s n xu t insulin ấ ả

T đ ng v t ậ

ừ ộ

T th c v t ự ậ

ừ

T vi sinh v t ậ

ừ

Insulin

1.S n xu t insulin tách chi

t t

ấ

ả

ế ừ ộ

đ ng v t ậ

• T nh ng th p niên 1920 cho đ n nh ng năm đ u c a th p

ừ ữ

ầ ủ

ữ

ế

ậ

c tao ra băng cach cô lâp t

ậ tuyên tuy

ượ

̣ ừ

c tinh s ch

niên 1980, insulin đ cua đông vât nh heo va bo và đ ư

ượ

ạ

̣ ̀ ́ ́ ̣

ng pháp

ế ằ

ươ

• Ngày nay lo i insulin này đ ạ s c ký đ t đ tinh khi ạ ộ ắ

c tinh ch b ng ph ượ t hóa r t cao. ấ

ế

̉ ̣ ̣ ̀ ̀

Chu i A các v trí

Chu i B các v trí

Ch ng lo i ạ

ủ

ỗ

ị

ỗ

ị

8 9 10

Thr-Ser-ILe

Thr

iườ

Heo,chó,tinh d ch cá voi

Thr-Ser-ILe

Ala

ị

Thr-Ser-ILe

Ser

Thỏ

Gia súc(trâu, bò ng a, dê

Ala-Ser- Val

Ala

ự

Ala-Gly- Val

Ala

c uừ

Thr-Gly-Leu

Ala

Ng aự

Sei whale

Ala-Ser-Thr

Ala

S thay đ i chu i c u trúc amino acid c a các loài đ ng v t so v i

ỗ ấ

ự

ủ

ớ

ộ

ổ

ậ

con ng

iườ

(Source W.F ganong, 2004)

S n xu t insulin t ấ

ả

bào g c đ tr ố ể ị

t ừ ế b nh ti u đ ể ườ ệ

ế

ố ừ ấ

• Nh ng t ữ ả ấ ấ

ủ

ế

ệ

dây r n có bào g c t ố kh năng s n xu t m t h p ộ ợ ả ch t có tên là C-peptide (m t ộ ch t protein ti n thân c a ề insulin và ch hi n di n khi t ỉ ệ bào s n xu t ra insulin). ấ

ả

ệ

ỹ

ấ ở ế

ọ c insulin t

ượ

ộ c ượ c ố ượ bào t y

ụ

t h Các nhà khoa h c Anh và M cho bi ế ọ bào g c l y t đã SX đ ố ấ ừ dây r n tr s sinh đ đi u tr b nh ti u ể ị ệ

ố đ

t ừ ế ể ề ẻ ơ ng. ( nh: www.neonet.ch) Ả

ườ

• S hi n di n C-pep  đã có m t ng insulin nh t đ nh đ ấ ị bào g c đ ế ặ ị

ự ệ l ượ s n xu t b i t ả dùng thay th cho t ế t ng đã h h i ho c b phá h y ủ . ư ạ ạ

ượ

c đi m ể

•

Insulin ĐV có c u trúc không hoàn toàn gi ng ấ ố

• Ho t đ ng ch c năng trong c th kém h n

insulin ng iườ

ơ ể ạ ộ ứ ơ

• Kh năng h p th kém

insulin ng iườ

• Có th gây ra các ph n ng mi n d ch trong

ụ ả ấ

ả ứ ể ễ ị

• Trong quá trình tách chi

c thơ ể

t không th lo i b ế ể ạ ỏ

• Qui trình tách chi

đ c h t các tác nhân gây b nh ĐV ượ ế ệ ở

• Chi phí đ t (c n l

t đòi h i k thu t cao ế ỏ ỹ ậ

ng l n t y đ SX) giá ầ ượ ắ ớ ụ ể

• Khó SX l

thành cao

ng l n v i quy mô công nghi p ượ ệ ớ ớ

ả

ể

ị ệ hoa rum

ng t

S n xu t Insulin tr b nh ti u ừ

ấ ườ

ộ

ọ

ấ

ẽ ắ

ố

• Các nhà khoa h c ĐH Calgary đã c y m t gen Insulin nhân t o vào cây hoa rum. Khi ạ gen này đi vào ho t đ ng, hoa rum s b t ạ ộ đ u s n sinh ra Insulin nhanh h n các ả ơ ầ c ti n ng pháp truy n th ng đ ph ế ượ ề ươ hành trên l n, bò, men hay vi khu n. ẩ

ợ

ẽ

ả ượ

Cây hoa rum dùng đ chi

t su t insulin

ể

ế

ấ

ườ

ng 4.000m2 hoa s có s n l • Kho ng ả ớ ầ 1kg Insulin  6.475 ha hoa rum i g n lên t t xu t đ Insulin cho toàn b là có th chi ấ ủ ế ộ ể ng trên i m c b nh ti u đ nh ng ng ể ệ ắ ườ ữ i. th gi ế ớ

ể ườ

Tr b nh ti u đ ị ệ insulin t ừ

ặ

ng b ng ằ rau di p ho c cây ế thu c láố

c th c hi n b i giáo s Henry ở ng Đ i h c Central Florida, và

ượ ườ

ự ệ ạ ọ

• Nghiên c u này đ ứ Daniell, thu c Tr ộ các c ng s . ự ộ

• Nhóm nghiên c u đ a các t

ế

ự ậ

ứ ư

ộ

ứ ệ

ế

ể

ướ ạ ườ ẩ

ắ ộ

ẽ

ố

bào và insulin thoát ra s đ

ế

ư

bào th c v t đông khô i d ng b t vào c th chu t có ch a insulin d ơ ể ộ bào này ti n vào ng. Khi các t m c b nh ti u đ ế đó s phân h y ru t chu t, vi khu n đang s ng ủ ở ộ c đ a d n các thành t ẽ ượ ư ầ d n vào máu. ầ

Giáo s Henry Daniell (ĐH Central Florida)

•

ầ

ệ

ễ ử

ướ

ể

ứ

ế

c insulin

th nghi m, các chuyên gia nh n ậ c ti u chu t đã tr ở ộ bào beta trong tuy n t y ế ụ m c đ c n ở ứ ộ ầ

ấ ượ

ộ

t cho c th .

Sau 8 tu n l th y [glucose] trong máu và n ấ i m c an toàn, và các t l ạ c a chu t đã s n xu t đ ả ủ thi ơ ể

ế

3. Công ngh ệ s n xu t insulin ấ ả T vi sinh v t ậ ừ

•

ề ả ấ

ng pháp s n xu t insulin ươ h p d a trên các ch ng vi sinh v t bi n đ i ậ ủ ế ổ

ẩ

• Có 2 nhóm ph

Hi n nay, có nhi u ph ệ tái t ổ ợ ự gen, ch y u là vi khu n (E.coli, Bacillus ủ ế brevis…) ho c n m men (Saccharomyces ặ ấ cerevisiae , Pichia pastoris…)

ổ ả

ng pháp s n xu t Insulin tái t ươ ủ ế

ng pháp ấ ổ ng pháp 2 chu i và nhóm ph ươ ỗ

h p trong các ch ng VSV bi n đ i gen là : nhóm ợ ph ươ miniproinsulin.

Ph ươ tái t

ng pháp 1: Sinh t ng h p insulin ợ ổ ng pháp 2 chu i h p theo ph ỗ ổ ợ

ươ

• Nh

c đi m : Hi u su t t o Insulin ho t tính không cao.

ượ

ấ ạ

ể

ệ

ạ

ươ

ng pháp 2: Sinh t ng h p Insulin tái t ổ

ổ ợ ng pháp miniproinsulin (MPI)

Ph h p theo ph ợ

ươ

H ng nghiên c u m i:

ướ

ứ

ớ

̀ ́ ̣ ́ ́ ̀ ̀ ̉ ̉ ̣

ử ́ ̣ ́

ừ ̣ ́ ̀ ̣ ̣ ̀ ̉

c ̣ ́ ́ ́ ̀

̣ ̀ ́ ́ ̃ ́ ̃

quy mô san xuât công ở ̀ ́ ̣ ̉ ́

̀ E. coli va nâm men. Gân ̣ ̀ ́ ̀ ́ ̀

i ta đ a ra môt hê thông biêu hiên ườ ư ̣ ̣ ́ ̉ ̣

• Nói vê cac hê thông tê bao dung đê biêu hiên insulin tai tô h p, ng i ta s dung rât đa ̉ ợ ườ dang t vi sinh vât t i tê bao đông vât va ca ̣ ớ th c vât. Trong sô đo, tê bao vi sinh vât đ ̣ ượ ự s dung nhiêu nhât do chung dê thao tac, dê ử đ a vao ap dung ư nghiêp, nhiêu nhât la đây, ng khac cho cac loai protein tai tô h p – đo la ̀ Pichia pastoris.

̉ ợ ́ ́ ̣ ́ ́

c s d ng r ng rãi

ậ

ượ ử ụ

ộ

ể

• H n 3 th p niên qua, E.coli đ bào ch cho bi u hi n protein. Tuy nhiên, ệ ủ

ệ

ể eukaryote còn b h n ch do

ố ừ

ồ

ị ạ ệ

ể ự

ế

ộ

ơ nh t ư ế vi c ng d ng E.coli trong quá trình bi u hi n các ụ ệ ứ protein có ngu n g c t ế E.coli thi u các b máy n i bào đ th c hi n các quá trình bi n đ i sau d ch mã. ị ổ

ế

• T bào E.coli khi bi u hi n protein có khuynh

ể

ệ

ị

ủ

ệ ạ

l ữ ạ ng t ị ộ

ể ự

ấ

ng gi ưở ễ ấ ấ ố

ờ

ữ

ề ử ụ

ệ ố

ấ

ả

ế i đuôi Met, đuôi amino acid này có th h ể ướ i s n đ nh c a protein và gây đáp nh h ớ ự ổ ả ng mi n d ch, sau khi bi u hi n, vi c t o ra đi u ề ệ ể ứ ki n g p cu n cho protein r t khó khăn đ th c ệ hi n, r t t n th i gian và quá trình này không ph i ả ệ lúc nào cũng thành công. Nh ng đi u này làm tăng giá thành s n xu t protein khi s d ng h th ng t ế bào E.coli

Nh ng thu n l

i c a h th ng Pichia pastoris

ậ ợ ủ ệ ố

ữ

ư ấ

• Cũng nh n m men S.cerevisiae, P.pastoris là vi sinh v t đ n bào d nuôi c y, d thao tác an ễ ậ ơ toàn đ i v i con ng i. ườ ố ớ

ễ ấ

ộ

ị ổ ấ ư ả ộ

ố ầ

ể ệ

ệ ố ướ ạ ề ẩ

• P.pastoris là m t eukaryote, có các quá trình bi n ế đ i sau d ch mã nh kh năng g p cu n, hình thành c u n i disulfide, và glycosyl hóa. Do đó, nhi u protein khi bi u hi n trong h th ng vi khu n b b t ho t do hình thành d ạ ị ấ vùi nh ng l ọ ạ ạ hi n trong P.pastoris.

i d ng th ể i có ho t tính sinh h c cao khi bi u ể ư

• Có m t promoter m nh, s d ng ch t c m ng

ệ

ộ ấ ả ứ ạ

• Có kh năng phát tri n

ử ụ là methanol r ti n h n so v i t bào E.coli ẻ ề ớ ế ơ

pH t 37 do đó có th ể ở ả ừ ể

đi u ch nh pH đ gi m thi u t i đa ho t đ ng ể ả ể ố ề ỉ ạ ộ

c a protease đ i v i protein ti t ra ố ớ ủ ế

• Có th phát tri n v i m t đ t ể nhi u l n so v i S.cerevisiae ớ

bào cao h n ậ ộ ế ớ ơ

ể ề ầ

• Có th bi u hi n protein v i hàm l ệ

ng t ừ ớ

ượ ứ ả

i gram c trong nghiên c u phòng ấ ẫ

ể ể miligram t ớ thí nghi m l n trong s n xu t quy mô công ả ệ nghi pệ

t ế

ượ ườ ấ

ậ

• Các protein c a b n thân P.pastoris đ ượ ủ ả ng v i hàm l ấ ớ ạ ẽ ấ ễ

c ti ng r t th p nên ra môi tr quá trình tinh s ch và thu nh n protein m c ụ tiêu v sau s r t d dàng. ề

ng nuôi c y đ n gi n, ầ

• Thành ph n môi tr ườ ấ ả ơ ng pháp s ấ ươ ử ng m i hóa, ch ng và các ủ

chi phí lên men th p, các ph d ng đ c th ươ ượ ụ ạ

• H n ch đ

vector bi u hi n có s n trên th tr ng ị ườ ệ ể ẵ

c s nhi m trong quá trình lên ế ượ ự ễ ạ

• Quá trình lên men có th th c hi n nhanh

men

ể ự ệ

chóng

Ể

Ạ

3.2. T O DÒNG VÀ BI U HI N Ệ I ƯỜ GEN MÃ HÓA INSULIN NG Ệ Ố

Ế

TRÊN H TH NG T BÀO PICHIA PASTORIS

a. Ch ng vi sinh v t và plasmid

ủ

ậ

Ø pPIC9K

Plasmid (Invitrogen) ậ ủ

Ø TOPO pCR2.1

Ch ng vi sinh v t: ØPichia pastoris ØE.Coli

Ø Ch ng Pichia pastoris th

ng đ

c s d ng nhi u nh t là

ủ

ườ

ượ ử ụ

ề

ấ

ế

ả

ợ

c trên methanol

t ng h p histidine; ch a ứ m c ở ứ

ự ổ ể ượ

GS115 (his4), có gene mã hóa cho histidinol dehydrogenease b ị đ t bi n nên không có kh năng t ộ gene AOX1 và AOX2, phát tri n đ ngang b ng v i ch ng hoang d i.

ủ

ằ

ạ

ớ

Ch ng E.coli DH5α hoang d i (Nanogen Biopharma)

ủ

ạ

Vector nhân dòng pCR2.1

• Kích th

c 3,931 ướ

• Trình t

sao chép f1 ự

Topo pCR2.1 3,931 bp

• Gen kháng ampicillin

• Gen kháng kanamycin

• …..

ệ

ể

Vector bi u hi n pPIC9K (invitrogen)

Thi

t k và t ng h p gene mã hóa cho hMPI

ế ế

ổ

ợ

• Trong nghiên c u này, trình t

ự ế

ứ ườ ớ ượ ự

ể ằ ả

ả ấ ạ

gene mã hóa cho insulin ng i đã đ c bi n đ i m t s ộ ố ổ công b trên NCBI acid amin so v i trình t ố nh m làm tăng kh năng bi u hi n protein, ệ tăng hi u qu g p cu n, và tăng ho t tính ộ ệ sinh h c.ọ

c thi ứ ượ

• Trong nghiên c u này, hMPI đ ỗ

ồ

ỗ ấ

ỗ ể ạ

ộ ượ ắ ỏ ằ ưở

ị ằ

ể ị ỗ

t. ProB28 đ c t k ế ế bao g m 53 amino acid: chu i B 29 amino acid; mini C 3 amino acid (Asp-Gly-Lys), chu i A 21 amino acid. Sau quá trình g p cu n, 3 amino acid n i 2 chu i A và B s ẽ ố c c t b b ng trypsin đ t o ra insulin đ tr ng thành. Trong c u trúc insulin, v trí ấ LysB29 có th b phân c t khi x lý b ng tripsin nên chu i B đ ượ amino acid, ThrB30 đ ượ quá trình x lý tripsin hoàn t ử ắ ử t k ch có 29 c thi ế ế ỉ c thêm vào sau khi ượ ấ

thay th b ng AspB28, HisB10 đ c thay th ế ằ ượ ế

b ng AspB10 ằ

• Do có nhi u thay th trong trình t

ề ự

ổ

ằ ươ ng pháp PCR v i khuôn m u t ớ

ồ ặ ớ ặ ườ ư

i nh ng v trí c n thi ị ế ạ ộ

ng pháp t ng h p hóa ế ầ ổ t, ế ợ

amino ế acid c a insulin, nên thay vì t ng h p gene ợ ủ b ng ph ẫ ừ i và v i c p m i đ c tr ng cho mRNA ng gene mã hóa cho insulin, sau đó ti n hành t o ạ đ t bi n đi m t ữ ể chúng tôi s d ng ph ươ ử ụ h cọ

• Hai chu i oligonucleotide mã hóa cho hMPI

ỗ ượ ổ ợ

ả ứ ự

ệ ủ

ạ ạ

c t ng h p hóa h c v i ph n overlap dài đ ọ ớ ầ c th c hi n 20 nucleotide. Ph n ng PCR đ ệ ượ v i s hi n di n c a enzyme Klenow nh m ằ ớ ự ệ thành trình kéo dài 2 đo n oligonucleotide t DNA m ch đôi hoàn ch nh. t ự ạ ỉ

ạ

ế

bào E.coli DH5α mang T o dòng t plasmid pCR2.1 ch a gen mã hóa cho ứ hMPI ạ

ớ ụ ữ ư ế

c ệ

ể ẩ ở

• V i m c đích khu ch đ i và l u tr gen hMPI cho các thí nghi m ti p theo, TA cloning kit đ ượ ế dùng đ dòng hóa gen hMPI vào pCR2.1 (t l ỉ ệ 160C qua đêm có s n ph m PCR:plasmid ~3:1) ả s hi n di n c a T4 ligase. Quá trình n i này s ẽ ố ệ ủ ự ệ t o plasmid pCR2.1 tái t h p mang gen ạ hMPI(pCR2.1/hMPI).

• Plasmid này đ

ổ ợ

ượ ế

c đi n bi n n p vào E.coli ạ ứ ệ ng LB ch a ampicillin (50 ườ

DH5α. Trên môi tr μg/ml) có b sung X-gal (80 μg/ml) và IPTG ổ

• Các khu n l c mang plasmid tái t

(1mM).

h p có màu ẩ ạ ổ ợ

tr ng và ki m tra l i b ng ph ng pháp PCR ể ắ ạ ằ ươ

khu n l c v i c p m i thông d ng M13-F/R cho ẩ ạ ớ ặ ụ ồ

• Nh ng khu n l c cho k t qu d

vector pCR2.1.

ng tính đ c ẩ ạ ả ươ ữ ế ượ

tách chi t plasmid, và kh ng đ nh l i l n n a ế ẳ ị ạ ầ ữ

b ng ph n ng c t gi i h n v i EcoRI và NotI. ả ứ ằ ắ ớ ạ ớ

T o dòng t bào E.coli DH5α mang plasmid ạ ế

pCR 2.1 ch a gene mã hóa cho hMPI ứ

ạ

ế

bào E.coli DH5α mang T o dòng t plasmid pPIC9k ch a gen mã hóa cho ứ hMPI

• Plasmid tái t

ổ ợ

ừ ả

ượ ắ ở ạ ượ ổ ợ ẩ ố

• Plasmid tái t

h p pPIC9K/hMPI. h p pCR2.1/hMPI và plasmid c c t b i EcoRI và Not I. pPIC9K cùng đ s n ph m c tinh s ch t gene m c tiêu đ ụ c t plasmid tái t h p pCR2.1/hMPI và n i ắ vào plasmid pPIC9K b ng enzyme T4 ligase ằ đ t o plasmid tái t ổ ợ ể ạ

h p pPIC9K/hMPI đ ổ ợ ượ

ạ ả

ạ

ế ườ 370C.các khu n l c đ c đi n ệ bi n n p vào E.coli DH5α và tr i trên môi tr ng th ch LB ch a 50μg/ml ampicillin, ủ ứ c ki m tra b ng ẩ ạ ượ ở ể ằ

ph ng pháp PCR v i c p m i AOX1-F/R ươ ớ ặ ồ

• Đ ng th i vector này đ

đ c tr ng cho vector pPIC9K ư ặ

c đi gi i trình t đ ồ ờ ượ ả ự ể

ch c ch n gen mã hóa cho hMPI không có gì ắ ắ

thay đ i so v i khi thi t k ớ ổ ế ế

Plasmid tái t

h p ổ ợ pCR2.1/hMPI

Plasmid pPIC9K

EcoRI và NotI

pPIC9K/hMPI

E.Coli DH5α

ườ

-50 μg/ml Amp 370C -

ủ ở

Môi tr th ch LB ạ

-AOX1-F: 5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’ - AOX1-R:5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’

Ki m tra khu n ể ẩ l c b ng PCR ạ ằ

v i c p

ự ớ ặ

i trình t ả m i AOX1-F/R ồ

Kh ng đ nh gen mã ị ẳ hóa cho hMPI

ạ

ượ ắ ằ

bào n m men 3.3 T o dòng t ấ ế P.pastoris mang gen mã hóa cho hMPI h p pPIC9K/hMPI đ i v trí HIS4 t o ra plasmid d ng th ng và đi n

c c t b ng Sal ẳ

ổ ợ ệ ạ ạ bào P.pastoris. Sau khi bi n n p,

ế

ạ ng đ ng s di n ra gi a ẽ ễ

ế h p t ổ ợ ươ

ồ ủ ấ

ữ ữ h p đ ổ ợ ượ ng ườ ng ế ưỡ

ế

ộ

• Plasmid tái t I t ạ ị bi n n p vào t ạ ế quá tình tái t pPIC9K/hMPI và genome c a n m men. Nh ng bào có ch a pPIC9K/hMPI tái t dòng t ứ ế ng MD. Đây là môi tr sàng l c trên môi tr ườ ọ ch n l c cho các ch ng đ t bi n khuy t d ủ ọ ọ hisdidine.

ệ ể ứ

ả ể ổ

ợ ề ủ

ả

bào có s tái t ỉ ữ ữ h p t ổ ợ ươ ự ồ

• Vector bi u hi n pPIC9K/hMPI có ch a các gene HIS4 có kh năng đi u khi n sinh t ng h p histidine trong khi ch ng P.pastoris GS115 không có kh năng này, do đó, ch nh ng dòng t ế pPIC9K/hMPI và genome c a P.pastoris m i có kh năng m c đ

ng đ ng gi a ủ ớ

c trên môi tr ng này. ọ ượ ườ ả

• Các khu n l c m c đ ẩ ạ ế

ườ

ượ ể ằ

ctrên môi tr ng MD ọ ượ c ti n hành tách chi đ t genomic DNA đ ể ế ki m tra s hi n di n c a gene hMPI b ng ệ ủ ự ệ PCR v i c p m i AOX1-F/R. ớ ặ ồ

Plasmid pPIC9K/hMPI đ

c c t b ng SalI t

ượ ắ ằ

ạ

v trí HIS4 ị

Plasmid d ng th ng ạ

ẳ

Đi n bi n n p ạ ế

ệ

h p t ổ ợ ươ

Tb P.Pastoris

ng đ ng Tái t ồ gi a pPIC9K và genone ữ c a n m men ủ ấ

Sàng l c trên mt MD

ọ

T bào P.Pastoris tái t ổ ế h p có mang gen mã hóa ợ cho hMPI

Tách chi

ự ệ

ể

ệ

C p m i AOX1-F/R

ặ

ồ

t DNA và ki m tra s hi n di n ế c a gen hMPI b ng PCR ằ ủ

3.4 Sàng l c dòng t

ọ

ế

bào n m men ấ ể

ệ

P.pastoris có kh năng bi u hi n ả hMPI cao ế ng tính ụ ng YPD

ả ượ

• Các khu n l c cho k t ẩ ạ qu PCR d ươ c nuôi c y liên t c đ ấ trên môi tr ườ v i n ng đ kháng sinh ộ ớ ồ G418 tăng d n (1,2,4,6 ầ mg/ml) nh m sàng l c ằ nh ng ch ng P.pastoris ủ ữ tái t h p có mang ổ ợ nhi u b n sao c a gen ả ề

ọ

ủ

mã hóa cho hMPI.

ượ

c nuôi c y trên môi ự ế ườ

•Các dòng này sau đó đ ng MM. Màng nitrocellulose đ ề ặ ấ

•Khi đó, hMPI đ

ấ c áp tr c ti p tr ượ lên b m t n m men và ti p t c nuôi c y qua đêm. ế ụ ấ

ế t ra s bám ẽ

c n m men ti ệ

ệ ươ ứ ấ ủ ừ

ả

ượ ấ trên màng. Kháng th đ c hi u kháng ể ặ c s d ng đ phát tín hi u hMPI(Abcam) đ ể ượ ử ụ hMPI trên màng; tùy thu c đ đ m nh t c a tín ộ ộ ậ ng ng v i kh năng bi u hi n cao hay hi u t ể ả ớ th p c a t ng dòng P.pasrstoris tái t ọ l c đ c dòng P.pastoris có mang nhi u b n sao ọ ượ gen m c tiêu và có kh năng bi u hi n hMPI cao. ụ ệ ạ ủ ệ h p  ch n ổ ợ ề ệ ể ả

ế

ể ấ ẩ ạ

ằ

ể

ớ

ễ ữ ể

K t qu ki m tra kh năng bi u hi n mini- ả ể ả ệ bào n m men Pichia proinsulin c a các dòng t ủ pastoris b ng áp màng trên khu n l c lai mi n d ch v i kháng th đa dòng kháng insulin. Nh ng ị bào có kh năng bi u mũi tên đ ỏ ch các dòng t ả ế

hi n mini-proinsulin cao.

ỉ ệ

quy mô nuôi

ể

ệ

• Ch ng P.pastoris tái t

h p có ch a gene mã hóa cho hMPI (RPPI02)

ổ ợ

c tăng sinh qua đêm trong môi tr

ớ

ạ

ở

ậ

ng BMGY ở ố ấ ể

3.5 Bi u hi n hMPI ở c y l c ấ ắ ứ 280C, l c 250 ắ ườ i khi OD600 đ t 5-6. Sinh kh i n m men đ ượ 6000 vòng/phút, và chuy n sang môi tr ườ

ỉ ố

ầ

ạ

ả ứ

ệ

ế

ấ c duy trì

ể

ả

ệ ượ ệ

ấ

c thêm

nh t đ 200C nh m gi m thi u kh ả ằ bào n m men, tăng % ế ấ

ớ

ng nuôi c y đ n n ng đ cu i là 1% cho t ể ể

ộ ố ỗ

ệ

ủ đ ượ c thu vòng/phút cho t ng nh n b ng ly tâm ằ BMMY sao cho OD600 đ t 1. Đây là ch s OD ban đ u thích h p cho ợ quá trình c m ng MeOH và bi u hi n hMPI. Bình nuôi c y đ c đ y ấ ượ ậ ể 250 vòng/phút đ tăng (đã qua kh o sát), l c b ng kh u trang y t ể ẩ ằ ắ ở ả i đa đ thoáng khí cho n m men trong su t quá trình bi u hi n. Quá t ệ ể ố ộ ố tình bi u hi n đ ể ở ệ ộ năng bi u hi n các protein t p c a chính t ạ ủ ể hMPI trong protein t ng s . Sau 24h nuôi c y, MeOH 100% đ ố ổ vào môi tr ườ ế ồ quá trình bi u hi n. m u đ ể bào n m men trong môi tr

ượ i khi k thúc ế c thu sau m i 24h đ ki m tra m t đ t ậ ộ ế ng nuôi c y.

ấ ẫ ượ ườ

ấ

Ch ng RPPI02

ủ

ng BMGY

ườ

Tăng sinh

Môi tr T0 C=280 C L c 250 vòng/phút

ắ

OD600 đ t 5-ạ 6

Thu nh n sinh kh i ố

ậ

Ly tâm 6000 vòng/phút T=15 phút

ng BMMY

ườ

Nuôi c yấ

Môi tr T0 C=200 C L c 250 vòng/phut Đ y b ng kh u trang y t

ắ ậ

ằ

ẩ

ế

OD600 đ t ạ 1

ỗ

C m ng và bi u hi n hMPI ể

ả ứ

ệ

Thêm MeOH sau m i 24h nuôi c yấ

ể

Ki m tra hàm l

ng protein

ể

ượ

Ly tâm thu d ch n i ổ ị Ki m tra b ng pp Bradford ằ và phân tích trên tricine SDS-PAGE 15%

ể

3.6 Bi u hi n hMPI trên quy mô ệ fermentor

ấ

ượ ng YPD ở c tăng sinh b ng nuôi c y ằ t đ 280C, ệ ộ

nhi ả

ố ượ ườ

c chuy n vào 2L môi tr ổ

ế ụ

ng c a P.pastoris đ c theo dõi ưở ủ

• Ch ng RPPI02 đ ủ l c v i môi tr ườ ắ ớ l c 250 vòng /phút trong kho ng 18-20h. sinh ắ ng kh i sau đó đ ể BM trong fermentoe 5L có b sung PTM1,đ ể ti p t c tăng sinh trên fermentor v i c ch t ớ ơ ấ là glycerol. Trong quá trình lên men, t c đ ố ộ tăng tr ượ thông qua s gia tăng sinh kh i ố ướ gian, l ụ

t theo th i ự ờ

ng O2 cung c p liên t c 6L/h. ấ ượ

3.7 Thu nh n và tinh s ch hMPI

ậ

ạ

3.8 Chuy n hóa hMPI thành hI

ể

• hMPI sau khi đ

c c t c tinh s ch s đ ạ

ượ ể ạ ỏ ỗ

• Ph

ẽ ượ ắ b ng tripsin đ lo i b chu i C-peptide; đ ng th i g n thêm ThrB30 đ t o thành hI. ờ ắ ể ạ ằ ồ

c hòa trong 0.1 ượ

ợ ng pháp: 20mg hMPI đ ươ ỗ

ướ

ượ ở

ml h n h p 34.3% acid acetic và 42.2% N,N c. 0.2ml 2M dimethylformamide trong n Thr-Obut trong N,N dimethylformamide đ c thêm vào ph n ng và duy trì 120C. ả ứ 2mg trypsin pha trong 0.05ml 0.05M calcium c b sung vào h n h p ph n ng. acetate đ ượ ổ ả ứ ợ ỗ

Sau 96h 120C, protein đ c t a v i 4ml ủ ở ượ ủ ớ

actetone đã làm l nh s n, c n protein đ c ẵ ặ ạ ượ

thu nh n b ng ly tâm 13000v/p trong 15p ằ ậ ở

40C.

Th nghi m ho t tính hI trên

ạ

ệ ử chu t ti u đ

ng type I

ộ ể ườ

1. Xây d ng mô hình chu t ti u đ

ng type I

ộ ể ườ

ự

c tiêm i.p streptozotocin

b ng STZ ằ ộ ượ

ơ ế

bào β tuy n

• C ch : Khi chu t đ ể

ủ ế

ế

(STZ) đ kích thích quá trình phá h y t t y.ụ

• Đ i t

ng : Chu t nh t tr ng cái 5 tu n tu i.

ố ượ

ắ ắ

ầ

ộ

ổ

• Chia làm 6 nhóm, 5 con/nhóm.

Nhóm1

Nhóm 2-6

SCB

STZ + SCB

Xây d ng mô hình chu t ti u

ộ ể

ng type I b ng STZ

ằ

ự ườ

Tiêm STZ l n 2ầ

B đóiỏ

Tiêm STZ l n1ầ

Ngày 0

Ngày 1

Ngày 2

Ngày 3

Ngày 4

Ngày 5

-4h

Ki m tra n ng đ glucose trong máu h ng ngày

ể

ằ

ộ

ồ

2. Th nghi m ho t tính hI tái t

h p in

ệ

ử

ổ ợ

ạ vivo Th nghi m trên 4 nhóm: 1 nhóm chu t bình th

ệ

Chu t ộ kh eỏ

Chu t ộ b nhệ

PBS

Insulin (NOVO)

Ch ng âm

ứ

ng, 3 nhóm chu t ti u đ ộ ng (5con/nhóm) ộ ể ườ ử ườ

2. Th nghi m ho t tính hI tái t

ử

ệ

h p ổ ợ

ạ in vivo

Tiêm insulin

B đói

ỏ

1,5h

4,5h

7,5h

Ki m tra n ng đ glucose trong máu (1,5h/l n)

ể

ầ

ộ

ồ

S đ quá trình theo dõi tác đ ng nhanh c a hI lên mô

ơ ồ

ủ ng typeI STZ

hình chu t ti u đ

ộ ộ ể ườ

3. K t qu th nghi m ả ử

ế

ệ

Tác đ ng nhanh c a hI : ủ ộ

ứ ượ

Ø) Nhóm đ i ch ng: đ ố ế ườ

ng huy t tăng theo th i gian trong ng đ c tiêm PBS có hàm ờ

l ượ su t 7,5h ố

Ø) Nhóm tiêm insulin (NOVO) l

ng đ ượ ườ

ế ng đ i tăng lên, trong 4,5h sau khi ạ ng l ạ

ng đ ng huy t v n duy ế ẫ ườ

Ø) Nhóm đ

ng huy t gi m m nh sau 1,5h. Sau đó, hàm ả l ườ ượ tiêm insulin hàm l i ng trì d ượ ng 250mg/dl. ướ ưỡ

ượ c tiêm hI tác đ ng c a insulin ộ ủ

(cid:222)) hI có tác d ng làm gi m l

t ng t nh insulin (NOVO). ươ ự ư

ng đ ng huy t ụ ả ượ ườ ế

c a chu t ti u đ ng Type I STZ t ng t ộ ể ườ ủ ươ ự

nh insuin(NOVO) ư

b) Tác d ng lâu dài c a hI:

ủ ụ

ẫ

ộ ế ổ ườ ố ị

Ø)Nhóm ch ng âm (chu t kh e) v n duy ỏ ng huy t n đ nh, kh i ầ

ng chu t tăng d n và 100% chu t duy trì ứ ng đ ượ ộ ộ

trì hàm l l ượ s ng sót. ố

ượ

ộ ể ườ ườ ượ

ở ứ

Ø)Nhóm chu t ti u đ ng đ insulin có hàm l theo ngày, sau 10 ngày l m c cao ( 500mg/dl) kh i l luôn th gi m m nh. Sau 12 ngày 100% chu t ch t.ế

ng không tiêm ng huy t tăng d n ầ ế ng huy t ng đ ế ườ ng c ơ ố ượ ộ ể ả ạ

c tiêm hI và insulin (NOVO)

Ø)Nhóm đ ế

cho k t qu di n bi n b nh t ng t nhau. ượ ả ễ ệ ế ươ ự

100% chu t s ng sau 15 ngày quan sát, hàm ộ ố

l ng đ ng huy t duy trì n đ nh. Bên ượ ườ ế ổ ị

c nh đó kh i l ng c th chu t tăng d n. ố ượ ạ ơ ể ầ ộ

 hI có tác d ng t ng đ ng insulin ụ ươ ươ

(NOVO) trong quá trình c i thi n tình tr ng ệ ả ạ

b nh chu t ti u đ ng TypeI STZ ệ ở ộ ể ườ

4. K t lu n ậ ế

• V i nh ng k t qu đ t đ

c đã thi t l p thành ớ ế ế ậ

ả ạ ượ bào P.pastoris dùng cho bi u hi n ế ể ệ

ấ ắ

ng protein đ t 150 μg/l và ạ ớ

• Ph

ữ công h th ng t ệ ố hMPI trên quy mô nuôi c y l c và quy mô fermenter v i hàm l ượ 1g/l.

ươ ằ

ủ ạ ọ

ắ ấ ượ ự ế

ng pháp t a protein sau lên men b ng (NH4 ) 2SO4 và tinh s ch protein b ng s c ký l c gel ằ cũng đ c xây d ng v i hi u su t cao lên đ n ệ ớ 90%.

• hI đã th hi n hoat tính t ể ệ

ng v i s n ng đ ươ ớ ả

• Ch n Pichia pastoris là h th ng phù h p đ bi u

ph m insulin th t, t ố ươ ng m i c a NOVO ạ ủ ẩ ươ

ệ ố ể ể ợ ọ

hi n protein ng i v a cho năng su t cao, chi phí ệ ườ ừ ấ

lên men th p, trong khi protein đ c bi u hi n có ấ ượ ể ệ

ho t tính t t khi th nghi m ạ ố ệ in vivo. ử