Link xem tivi trực tuyến nhanh nhất xem tivi trực tuyến nhanh nhất xem phim mới 2023 hay nhất xem phim chiếu rạp mới nhất phim chiếu rạp mới xem phim chiếu rạp xem phim lẻ hay 2022, 2023 xem phim lẻ hay xem phim hay nhất trang xem phim hay xem phim hay nhất phim mới hay xem phim mới link phim mới

Link xem tivi trực tuyến nhanh nhất xem tivi trực tuyến nhanh nhất xem phim mới 2023 hay nhất xem phim chiếu rạp mới nhất phim chiếu rạp mới xem phim chiếu rạp xem phim lẻ hay 2022, 2023 xem phim lẻ hay xem phim hay nhất trang xem phim hay xem phim hay nhất phim mới hay xem phim mới link phim mới

intTypePromotion=1
ADSENSE

Công nghệ tế bào động vật ứng dụng: Phần 1 - Trường ĐH Thủ Dầu Một

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:93

11
lượt xem
2
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Tài liệu "Công nghệ tế bào động vật ứng dụng" cung cấp những kiến thức cơ bản về các kỹ thuật sinh học, khả năng ứng dụng, các kỹ thuật tác động trên tế bào và các thành phần tế bào phục vụ thực tiễn trong quy trình sản xuất. Đồng thời giới thiệu một số phương pháp giải quyết các vấn đề tạo giống động vật, chữa bệnh, giải quyết thức ăn sinh học trong chăn nuôi...Mời các bạn cùng tham khảo nội dung phần 1 dưới đây.

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Công nghệ tế bào động vật ứng dụng: Phần 1 - Trường ĐH Thủ Dầu Một

  1. UBND TỈNH BÌNH DƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT CÔNG NGHỆ TẾ BÀO ĐỘNG VẬT ỨNG DỤNG TS. Nguyễn Thanh Bình
  2. LỜI NÓI ĐẦU Hiện nay công nghệ sinh học đóng một vai trò khá lớn trong việc kết hợp các quy trình và thiết bị kỹ thuật ở mức độ tế bào vi sinh vật, tế bào động thực vật để sản xuất ở quy mô công nghiệp các sản phẩm sinh học có chất lượng cao, phục vụ cho lợi ích, nhu cầu của con người, phát triển kinh tế - xã hội và đồng thời góp phần vào bảo vệ môi trường sống. Sự thay đổi về điều kiện sống qua biến đổi khí hậu toàn cầu, sự gia tăng về dân số đã thách thức khoa học công nghệ, nhất là công nghệ sinh học ứng dụng, để giải quyết việc tăng nguồn lương thực có nguồn gốc từ động thực vật, giải quyết các vấn đề về y tế, đồng thời giảm những tác động tiêu cực đến môi trường do những hoạt động nông nghiệp gây ra. Nội dung trong quyển sách đã được tổng hợp từ nhiều nguồn sách, tạp chí khoa học có uy tín trên thế giới, và một số công trình nghiên cứu của tác giả sách được công bố trong và ngoài nước. Quyển sách cung cấp những kiến thức cơ bản về các kỹ thuật sinh học, khả năng ứng dụng, các kỹ thuật tác động trên tế bào và các thành phần tế bào phục vụ thực tiển trong quy trình sản xuất. Đồng thời giới thiệu một số phương pháp giải quyết các vấn đề tạo giống động vật, chữa bệnh, giải quyết thức ăn sinh học trong chăn nuôi... bằng những tác động đến kỹ thuật sinh học ở mức độ tế bào mà hiện nay ở Việt Nam còn thiếu những tài liệu chuyên ngành bằng tiếng việt. Xin trân trọng giới thiệu cùng bạn đọc và hy vọng sẽ là nguồn tài liệu tham khảo, học tập, nghiên cứu và ứng dụng trong sản xuất. Trân trọng cám ơn Quý giáo sư, đồng nghiệp, các chuyên gia trong lĩnh vực nghiên cứu; GS. TS. Masahi Miyake- Nguyên Hiệu trưởng Trường Đào tạo Sau đại học Đại học Kobe - Nhật Bản đã tạo điều kiện, động viên, cung cấp tài liệu để tác giả hoàn thành cuốn sách này. Tác giả TS. Nguyễn Thanh Bình 1
  3. MỤC LỤC CHƯƠNG I: ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RECOMBINANT DNA VÀ TẠO DÒNG GENE ĐỂ ĐIỀU CHẾ CÁC SẢN PHẨM SINH HỌC ........................... 9 PHẦN 1. Giới thiệu ................................................................................................. 9 PHẦN 2. Tổng quan ................................................................................................ 9 1.1. Lịch sử ra đời của kỹ thuật DNA tái tổ hợp ....................................................... 9 1.2. Kỹ thuật DNA tái tổ hợp (Recombinant DNA) và tạo dòng (Gene cloning) .... 10 1.2.1. Kỹ thuật DNA tái tổ hợp .............................................................................. 10 1.2.2. Tạo dòng gene.............................................................................................. 10 1.2.3. Các bước thực hiện ...................................................................................... 11 1.2.4. Các enzyme chủ yếu dùng trong kỹ thuật DNA tái tổ hợp ............................ 12 1.2.4.1. Các enzyme giới hạn ................................................................................. 12 1.2.4.2. Các enzyme polymerase ............................................................................ 13 1.2.4.3. Các enzyme nối (Ligase) ........................................................................... 13 1.2.4.4. Các nuclease ............................................................................................. 14 1.2.5. Các vector sử dụng trong DNA tái tổ hợp .................................................... 14 1.2.5.1. Các vector plasmid .................................................................................... 15 1.2.5.2. Các vector phage ....................................................................................... 16 1.2.5.3. Cosmid vector ........................................................................................... 16 1.2.5.4. Các vector khác ......................................................................................... 17 1.2.6. Các loại tế bào chủ ....................................................................................... 17 1.2.6.1. Tế bào chủ nhân sơ ................................................................................... 17 1.2.6.2. Tế bào chủ nhân chuẩn .............................................................................. 18 1.2.7. Tạo, tách và chọn lọc dòng rDNA ............................................................... 19 1.2.7.1. Tạo plasmid tái tổ hợp ............................................................................... 19 1.2.7.2. Tách dòng DNA tái tổ hợp ........................................................................ 19 1.2.7.3. Chọn lọc dòng DNA đặc hiệu và biểu hiện gene ....................................... 20 1.3. Một số ứng dụng của công nghệ DNA tái tổ hợp và cloning gene trong điều chế sản phẩm y sinh học............................................................................................... 20 1.3.1. Human alpha antitrypsin .............................................................................. 20 1.3.1.1. Sơ lược về bệnh thiếu men Alpha -1- Antitrypsin (AAT) .......................... 20 1.3.1.2. Sản xuất AAT bằng cách sử dụng cừu biến đổi gene ................................. 21 1.3.2. rBST (recombinant Bovine somatotrobin)/ rBGH (recombinant bovine growth hormone) .................................................................................................... 22 1.3.2.1. Giới thiệu về rBGH/rBST ......................................................................... 23 1.3.2.2. Ứng dụng công nghệ sinh học trong sản xuất rBST ................................... 23 1.3.2.4. Ảnh hưởng của rBST đến khả năng sản xuất sữa ở bò ............................... 24 1.3.2.5. Lợi ích và rủi ro khi sử dụng BST ............................................................. 25 PHẦN 3. Kết luận.................................................................................................. 25 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 27 CHƯƠNG II: MÔ DA DÙNG TRONG DÒNG HÓA ....................................... 29 2
  4. Phần A: MÔ DA DÙNG TRONG DÒNG HÓA ................................................ 29 PHẦN 1. Giới thiệu ............................................................................................... 29 PHẦN 2. Nội dung ................................................................................................ 29 2.1. Các lớp tế bào ở da ......................................................................................... 29 2.1.1. Lớp biểu bì................................................................................................... 30 2.1.1.1. Lớp đáy (stratum basale) hay lớp mầm (stratum germinativum) ................ 30 2.1.1.2. Lớp gai (stratum spinosum) ....................................................................... 31 2.1.1.3. Lớp hạt (Stratum granulosum)................................................................... 31 2.1.1.4. Lớp bóng (Stratum lucidum) ..................................................................... 31 2.1.1.5. Lớp sừng (Stratum corneum)..................................................................... 31 2.1.2. Lớp bì .......................................................................................................... 32 2.1.3. Lớp hạ bì...................................................................................................... 32 2.2. Tế bào gốc da.................................................................................................. 32 2.2.1. Tế bào gốc da ở lớp biểu bì .......................................................................... 33 2.2.1.1. Các yếu tố quyết định sự phân chia tế bào gốc biểu bì ............................... 36 2.2.2. Nang lông tóc............................................................................................... 40 2.2.2.1. Sự hình thành nang lông............................................................................ 40 2.2.2.2. Chu kỳ lông tóc và các tế bào gốc ở nang lông .......................................... 41 2.2.2.3. Các yếu tố quyết định sự phân chia tế bào gốc nang .................................. 42 2.2.3. Tuyến nhờn (SG) ......................................................................................... 45 2.3. Vai trò của tế bào gốc ở da .............................................................................. 46 PHẦN 3. Kết luận.................................................................................................. 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 49 Phần B: DÒNG HÓA BÒ .................................................................................... 50 PHẦN 1. Mở đầu ................................................................................................... 50 PHẦN 2. Nội dung ................................................................................................ 50 2.1. Những nghiên cứu cơ bản trong dòng hóa bò .................................................. 50 2.2. Kỹ thuật dòng hóa ........................................................................................... 52 2.2.1. Bước 1: Chuẩn bị tế bào chất nhận ............................................................... 52 2.2.2. Bước 2: Xử lý tế bào cho ............................................................................. 53 2.2.3. Bước 3: Tái kết cấu ...................................................................................... 54 2.2.4. Bước 4: Nuôi cấy in vitro noãn tái kết cấu ................................................... 54 2.2.5. Bước 5: Cấy phôi vào tử cung "mẹ nuôi" để cho phát triển thành bào thai 55 2.3. Dòng hóa từ tế bào thai ................................................................................... 55 2.3.1. Tế bào phôi lấy từ thai ................................................................................. 55 2.3.2. Tế bào sinh dưỡng lấy từ thai ....................................................................... 55 2.4. Dòng hóa từ tế bào sinh dưỡng trưởng thành................................................... 55 2.4.1. Chiến lược chuyển nhân tế bào sinh dưỡng và chu kỳ tế bào ........................ 55 2.4.2. Đồng pha của tế bào cho .............................................................................. 56 2.4.3. Các loại tế bào sinh dưỡng được sử dụng ..................................................... 56 2.5. Hiệu quả của dòng hóa bò ............................................................................... 56 2.5.1. Dòng hóa từ phôi ......................................................................................... 56 3
  5. 2.5.1.1. Phát triển in vitro ...................................................................................... 56 2.5.1.2. Phát triển in vivo ....................................................................................... 57 2.5.1.3. Hiệu quả chung ......................................................................................... 57 2.5.1.4. Những yếu tố giới hạn ............................................................................... 57 2.5.2. Hiệu quả của dòng hóa từ tế bào sinh dưỡng ................................................ 58 2.5.2.1. Phát triển in vitro ...................................................................................... 58 2.5.2.2. Phát triển trước khi sanh............................................................................ 58 2.5.2.3. Sức sống của bò dòng hóa ......................................................................... 59 PHẦN 3. Kết luận.................................................................................................. 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 61 Phần C: TÁI LẬP TRÌNH NHÂN ...................................................................... 62 2.1. Khái niệm tái lập trình nhân ............................................................................ 62 2.2.Tái lập trình nhân của tế bào sinh dưỡng ........................................................... 62 2.2.1.Tái lập trình nhân bằng chuyển nhân ............................................................. 62 2.2.2.Tái lập trình nhân bằng dung hợp tế bào ....................................................... 64 2.2.3.Tái lập trình nhân bằng dịch chiết tế bào ....................................................... 66 2.2.4.Cấy ghép tế bào ............................................................................................ 66 2.2.5.Tái lập trình nhân bởi các phân tử nhỏ .......................................................... 67 2.3.Các yếu tố kiểm soát quá trình tái lập trình nhân .............................................. 68 2.3.1.Các yếu tố ngoài tế bào ................................................................................. 69 2.3.2.Các nhân tố bên trong ................................................................................... 71 2.4.Giới hạn về sinh học và kỹ thuật trong tái lập trình nhân .................................. 74 2.4.1.Sự bất hoạt NST X ........................................................................................ 74 2.4.2.Dị ty thể (Mitochondrial heteroplasmy) ........................................................ 75 2.4.3.Sự ngắn dần của telomere ............................................................................. 75 2.4.4.Sự đột biến .................................................................................................... 76 2.4.5.Thất bại trong quá trình in dấu bộ gene ......................................................... 76 2.4.6.Sai sót về mặt kỹ thuật .................................................................................. 76 2.5.Khiếm khuyết của động vật tạo dòng vô tính ................................................... 77 Kết luận ................................................................................................................. 77 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 78 Phần D: ỨNG DỤNG CHUYỂN NHÂN Ở HEO ............................................... 80 PHẦN 1. Mở đầu ................................................................................................... 80 PHẦN 2. Nội dung ................................................................................................ 80 2.1. Những nghiên cứu bước đầu ........................................................................... 80 2.2. Những sự kiện phân tử của tái lập trình nhân trên heo ..................................... 81 2.2.1. Định nghĩa chung ......................................................................................... 81 2.2.2. Tái lập trình nhân trên heo ........................................................................... 81 2.2.2.1. Sự phồng lên của nhân chuyển .................................................................. 81 2.2.2.2. Sự tổng hợp mRNA.................................................................................. 82 2.2.2.3. Một số gene tham gia quá trình tái lập trình .............................................. 84 2.3. Hoạt hóa trứng ................................................................................................ 86 4
  6. 2.3.1. Chu kỳ tế bào ............................................................................................... 86 2.3.2. Cơ chế hoạt hóa trứng .................................................................................. 86 2.4. Sự phát triển in vitro của phôi chuyển nhân .................................................... 87 2.5. Vấn đề sản xuất heo chuyển nhân ................................................................... 88 2.6. Ứng dụng tạo đời con bằng kỹ thuật chuyển nhân ........................................... 89 PHẦN 3. Kết luận.................................................................................................. 91 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 92 CHƯƠNG III: LẬP TRÌNH CỦA DI TRUYỀN NGOÀI NHÂN DNA (EPIGENETIC) ................................................................................................... 93 3.1.Định nghĩa epigenetic ...................................................................................... 93 3.2.Cơ sở phân tử của epigenetic ........................................................................... 93 3.3.Các yếu tố epigenetic ảnh hưởng đến biểu hiện gene ....................................... 95 3.4.Các vấn đề cần quan tâm.................................................................................. 97 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 98 CHƯƠNG IV: XÁC ĐỊNH TÍNH ĐA NĂNG CỦA TẾ BÀO ........................... 99 4.1. Khái niệm ....................................................................................................... 99 4.2. Phân loại tế bào gốc ........................................................................................ 99 4.3. Đặc điểm sinh học......................................................................................... 101 4.3.1. Tính vạn năng ............................................................................................ 101 4.3.2. Tính tự làm mới ......................................................................................... 101 4.3.3. Tính mềm dẻo ............................................................................................ 101 4.4. Những ứng dụng tính đa năng của tế bào ...................................................... 101 4.4.1. Trong nghiên cứu cơ bản............................................................................ 101 4.4.2. Ghép tế bào gốc trị liệu (stem cell therapy) ................................................ 102 4.5. Phương pháp thu nhận tế bào gốc.................................................................. 103 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 104 CHƯƠNG V: CƠ CHẾ DI TRUYỀN PHÂN TỬ TRONG VIỆC TẠO CÁC LOẠI TẾ BÀO CHUYÊN BIỆT ....................................................................... 106 5.1. Protein điều hòa ............................................................................................ 106 5.2. Methyl hóa DNA .......................................................................................... 109 5.3. Đoạn DNA giàu CG (vùng CpG (CG) hoặc đảo CpG) .................................. 113 5.4. Sự in dấu di truyền và biểu hiện gene theo nguồn gốc ................................... 114 5.5. Kiểm soát sau phiên mã (post-transcription control) ..................................... 116 5.5.1. Biến đổi sau phiên mã ở đầu 5’ và 3’ của tiền mRNA (pre-mRNA) ........... 116 5.5.2. Quá trình trưởng thành của tiền mRNA...................................................... 118 5.5.3. Sự vận chuyển mRNA trưởng thành ra khỏi nhân – Đời sống mRNA, phân hủy mRNA .......................................................................................................... 120 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 122 CHƯƠNG VI: KỸ THUẬT SINH HỌC TRONG CẢI TIẾN TỶ LỆ SINH SẢN VÀ CHẤT LƯỢNG THƯƠNG PHẨM ............................................................ 123 6.1. Cấy truyền phôi và bảo quản phôi ................................................................. 123 6.1.1. Lịch sử phát triển công nghệ cấy truyền phôi (CTP)................................... 123 5
  7. 6.1.2. Cấy truyền phôi (Embryo Transfer - ET).................................................... 124 6.1.3. Kỹ thuật cấy truyền phôi trên bò ................................................................ 125 6.1.4. Bảo quản phôi ............................................................................................ 126 6.1.5. Ý nghĩa của công nghệ bảo quản và chuyển cấy phôi ................................. 127 6.1.6. Ứng dụng chuyển cấy và bảo quản phôi trong chăn nuôi ............................ 128 6.2. Công nghệ thụ tinh nhân tạo (Artificial Insemination - AI) ........................... 128 6.3. Kỹ thuật PCR trong xác định giới tính phôi .................................................. 129 6.3.1. PCR ........................................................................................................... 129 6.3.2. Nguyên tắc của PCR .................................................................................. 130 6.3.3. Kỹ thuật xác định giới tính phôi bò bằng PCR ........................................... 130 6.3.4. Ý nghĩa xác định giới tính trong chăn nuôi ................................................. 131 6.4. Đánh giá chất lượng tinh trùng bằng kỹ thuật Hypoosmotic swelling test (HOST)................................................................................................................ 133 6.4.1. Định nghĩa ................................................................................................. 133 6.4.2. Phương pháp .............................................................................................. 133 6.4.3. Ứng dụng ................................................................................................... 133 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 135 CHƯƠNG VII: KỸ THUẬT TẠO THÚ BIẾN ĐỔI GENE VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN PHẨM THUỐC VÀ Y SINH HỌC ........................................... 136 7.1. Khái niệm chung ........................................................................................... 136 7.1.1. Sinh vật biến đổi gene ................................................................................ 136 7.1.2. Sự phát triển của khoa học chuyển gene ở động vật ................................... 137 7.2. Công nghệ tạo động vật chuyển gene ............................................................ 137 7.2.1. Tách chiết, phân lập gene mong muốn và tạo tổ hợp gene biểu hiện trong tế bào động vật ........................................................................................................ 138 7.2.1.1. Tách chiết, phân lập gene mong muốn .................................................... 138 7.2.1.2. Tạo tổ hợp gene chuyển biểu hiện trong tế bào động vật ......................... 139 7.2.2. Tạo cơ sở vật liệu biến nạp gene ................................................................ 139 7.2.3. Chuyển gene vào động vật ......................................................................... 140 7.2.3.1. Phương pháp vi tiêm ............................................................................... 140 7.2.3.2. Phương pháp xung điện ........................................................................... 141 7.2.3.3. Phương pháp tiêm trực tiếp ..................................................................... 142 7.2.3.4. Phương pháp lây nhiễm retrovirus ........................................................... 142 7.2.3.5. Sử dụng súng bắn gene............................................................................ 142 7.2.3.6. Sử dụng tế bào gốc phôi .......................................................................... 143 7.2.3.7. Đóng gói DNA ngoại lai trong liposome chuyển vào tế bào hay phôi ...... 144 7.2.4. Nuôi cấy phôi trong ống nghiệm ................................................................ 144 7.2.5. Kiểm tra động vật được sinh ra từ phôi chuyển gene .................................. 144 7.2.5.1. Phương pháp thẩm tách DNA.................................................................. 145 7.2.5.2. Phương pháp PCR ................................................................................... 145 7.2.6. Tạo nguồn động vật chuyển gene một cách liên tục.................................... 145 7.3. Một số thành tựu trong lĩnh vực tạo động vật chuyển gene............................ 146 6
  8. 7.3.1. Chuột chuyển gene ..................................................................................... 146 7.3.2. Heo chuyển gene ........................................................................................ 146 7.3.3. Gà chuyển gene.......................................................................................... 147 7.3.4. Dê biến đổi gene ........................................................................................ 148 7.3.5. Chống sốt rét bằng muỗi biến đổi gene ...................................................... 148 7.3.6. Điều trị thành công liệu pháp gene cho người mù ...................................... 148 Kết luận ............................................................................................................... 148 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 149 PHẦN THAM KHẢO ....................................................................................... 150 CHƯƠNG I: L-LYSINE TRONG TỔ HỢP KHẨU PHẦN THỨC ĂN ......... 150 PHẦN 1. Mở đầu ................................................................................................. 150 PHẦN 2. Tổng quan về L-lysine .......................................................................... 150 1.1. Giới thiệu chung ........................................................................................... 150 1.2. Vai trò của lysine .......................................................................................... 151 1.3. Cơ chế hoạt động của lysine.......................................................................... 151 1.4. Các trường hợp cần bổ sung lysine trong khẩu phần thức ăn ......................... 152 1.4.1. Trên người: Thực phẩm chức năng, điều trị bệnh. ...................................... 152 1.4.2. Vật nuôi: Bổ sung vào thức ăn cho gia súc, gia cầm ................................... 153 1.5. Sản xuất lysine .............................................................................................. 155 1.5.1. Lịch sử quá trình sản xuất lysine ................................................................ 155 1.5.2. Phương pháp sản xuất L-lysine .................................................................. 155 PHẦN 3. Kết luận................................................................................................ 159 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 160 CHƯƠNG II: DÒNG VI KHUẨN LACTOBACILLUS TẠO CHẤT BỔ SUNG TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI VÀ BACTERIOCIN KHÁNG KHUẨN . 161 2.1. Biến đổi dòng vi khuẩn ................................................................................. 161 2.2. Bacteriocin.................................................................................................... 161 2.2.1. Khái niệm về Bacteriocin ........................................................................... 161 2.2.2. Hoạt động của Bacteriocin ......................................................................... 162 2.2.3. Cơ chế hoạt động ....................................................................................... 162 2.2.4. Ứng dụng ................................................................................................... 162 2.2.4.1. Bảo quản lương thực – thực phẩm ........................................................... 162 2.2.4.2. Bacteriocin trong chăn nuôi..................................................................... 166 2.2.4.3. Một số sản phẩm trên thị trường .............................................................. 166 2.3 Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic .............................................................. 169 2.4. Lên men lactic .............................................................................................. 170 2.5. Ứng dụng lactobacillus ................................................................................. 172 2.5.1. Sản xuất probiotic ...................................................................................... 172 2.5.2. Sản xuất ACIDIFIER ................................................................................. 176 KẾT LUẬN ......................................................................................................... 178 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 178 CHƯƠNG III: CHUẨN ĐOÁN BỆNH VIÊM VÚ Ở BÒ SỮA ....................... 179 7
  9. 3.1. Bệnh leukocyte trên bò sữa Holstein Friesian............................................... 179 3.1.1. Khái niệm bệnh leukocyte .......................................................................... 179 3.1.2. Kỹ thuật sinh học chẩn đoán bệnh leukocyte .............................................. 180 3.1.2.1. Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) .............................................. 180 3.1.2.2. Kỹ thuật lai phân tử Southern blot ........................................................... 185 3.2. Bệnh viêm vú trên bò sữa.............................................................................. 187 3.2.1. Khái niệm bệnh viêm vú ............................................................................ 187 3.2.2. Kỹ thuật sinh học chẩn đoán bệnh viêm vú ................................................ 188 3.2.2.1. Phương pháp thử viêm vú CMT (California Mastitis Test) ...................... 188 3.2.2.2. Máy đếm tế bào (flow cytometer)............................................................ 190 3.2.2.3. Kỹ thuật ELISA (Enzymee-linked immunosorbent assay) ....................... 192 3.2.2.4. Một số phương pháp khác chẩn đoán viêm vú tiềm ẩn bò sữa ................. 196 Kết luận ............................................................................................................... 196 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 197 8
  10. CHƯƠNG I ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RECOMBINANT DNA VÀ TẠO DÒNG GENE ĐỂ ĐIỀU CHẾ CÁC SẢN PHẨM SINH HỌC PHẦN 1. Giới thiệu Những cố gắng không ngừng của con người trong việc nâng cao sức khỏe, trong đó có sự đóng góp những tiến bộ của khoa học hiện đại. Trong đó bao gồm các lĩnh vực như công nghệ gene và công nghệ chuyển gene đã phát hiện ra những liệu pháp gene mới dựa trên việc sản xuất protein tái tổ hợp (sữa của bò chuyển gene cung cấp một nguồn protein an toàn, có giá trị cao hoặc các chế phẩm khác có thể điều trị bệnh cho người như sản xuất men Alpha antitrypsin từ cừu biến đổi gene...). Kể từ những năm 1970, các nhà khoa học đã có thể chuyển một gene lạ vào vi khuẩn và bắt nó biểu hiện gene. Tuy nhiên, có những protein phục vụ cho nhu cầu của con người ngày càng đòi hỏi phức tạp và cơ thể vi khuẩn không biểu hiện được và cần đến động vật chuyển gene. Sản phẩm thành công đầu tiên của con người về sản xuất sản phẩm sinh học thông qua chuyển gene là Insulin và hoocmon sinh trưởng vào vi khuẩn E. coli. PHẦN 2. Tổng quan 1.1. Lịch sử ra đời của kỹ thuật DNA tái tổ hợp Năm 1972, các phân tử DNA tái tổ hợp đầu tiên được tạo ra tại trường Đại học Stanford (Mỹ) do nhà khoa học Paul Berg và các cộng sự thực hiện bằng cách sử dụng đặc tính cắt của enzyme giới hạn (Restriction enzyme) và khả năng nối các mạch DNA với nhau của enzyme nối ligase. Nhờ kỹ thuật này vật chất di truyền thường là một hay vài gene có thể lắp ghép vào phân tử DNA có nguồn gốc khác (Ví dụ: lắp ghép gene của động vật, thực vật vào plasmid của vi khuẩn hoặc vào phage  ) để hình thành DNA tái tổ hợp. Khi các cơ thể DNA tái tổ hợp được tạo thành có thể được chuyển từ cơ thể này (cơ thể cho) sang cơ thể hoặc tế bào khác (cơ thể nhận hoặc tế bào nhận). Điều cơ bản và quan trọng là các gene tái tổ hợp này vẫn duy trì chức năng cũ của nó trong cơ thể, hoặc tế bào nhận. Năm 1973, các nhà khoa học đã nối nhiều đoạn DNA vào plasmid được tách ra từ vi khuẩn Escherichia coli (E. coli). Plasmid này có thể hoạt động, tự sao chép khi đưa vào tế bào vi khuẩn E. coli, từ đó tạo ra công nghệ quan trọng trong công nghệ di truyền là tách dòng gene. Thành tựu đầu tiên của kỹ thuật DNA tái tổ hợp là việc sản xuất ra kích thích tố sinh trưởng người (hGH-human growth hoocmon) nhờ vi sinh vật nhận là E. coli. Các nhà khoa học đưa được gene mã hóa hGH vào E. coli. E. coli có DNA tái tổ hợp đã sản sinh ra một lượng rất lớn kích thích tố sinh trưởng người và được sử dụng vào thực tiễn y học. Tiếp đó, vào những năm đầu của thập kỷ 80 thế kỷ XX, nhờ kỹ thuật DNA tái tổ hợp, người ta đã sản xuất được interferol, sản xuất protein chống đông máu… 9
  11. 1.2. Kỹ thuật DNA tái tổ hợp (Recombinant DNA) và tạo dòng gene (Gene cloning) 1.2.1. Kỹ thuật DNA tái tổ hợp DNA tái tổ hợp (còn gọi là kỹ thuật di truyền hay kỹ thuật gene) là DNA được tạo ra từ hai hay nhiều nguồn vật liệu di truyền khác nhau. Phân tử DNA tái tổ hợp được tạo ra nhờ kỹ thuật ghép nối các đoạn DNA của các cá thể khác nhau trong cùng một loài, hoặc của các loài khác nhau. Các kỹ thuật này còn được gọi là tạo dòng gene (cloning gene) do nó có thể sản xuất ra một số lượng lớn gene xác định. Công nghệ DNA tái tổ hợp (DNA recombinant technology). Hệ thống các phương pháp phòng thí nghiệm cho phép cắt đoạn DNA từ một sinh vật để ghép nối vào DNA của một sinh vật khác tạo ra phân tử DNA tái tổ hợp. Phân tử này được đưa vào các sinh vật khác nhau để tạo ra những giống chủng vi sinh vật, thực vật và động vật mới có những phẩm chất đặc biệt, đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của sản xuất và đời sống con người. Công nghệ này có ứng dụng rộng rãi trong y học, dược học, nông nghiệp và nhiều ngành công nghiệp khác. Ngày nay, nhờ công nghệ DNA tái tổ hợp người ta đã tạo ra các đối tượng sản xuất thích hợp hơn, có thể thay đổi cả về lượng và chất so với công nghệ sinh học truyền thống trước đây bằng cách thay đổi gene của chúng và mở ra những triển vọng to lớn cho các lĩnh vực hoạt động của công nghệ sinh học. 1.2.2. Tạo dòng gene Gene là đơn vị cơ sở của thông tin di truyền nằm trên nhiễm sắc thể của tế bào. Các nhiễm sắc thể là các cấu trúc sợi dài và mảnh nằm trong nhân, bao gồm chủ yếu là DNA. Thông tin di truyền được bảo quản trong một chuỗi trình tự của các base nucleotide gồm có một đoạn DNA. Trong kỹ thuật gene, tạo dòng gene là một bước rất quan trọng vì tách chiết được một gene có thể giúp đánh giá trình tự nucleotide của nó. Từ đó có thể xác định được những giới hạn bên trong một gene. Không chỉ vậy, với nguồn gene có được, nhà khoa học có thể so sánh trình tự DNA giữa các gene để làm rõ hơn tiến hóa của gene hoặc dịch mã trình tự DNA của một gene thành trình tự amino acid nhờ vào bảng mã di truyền qua đó có thể dự đoán được cấu trúc của protein được mã hóa cũng như chức năng của gene đó. Bên cạnh đó, nhờ kỹ thuật gene, nhà khoa học có thể chuyển gene mục tiêu vào một cá thể tạo ra cá thể chuyển gene. Cá thể chuyển gene được dùng cả trong nghiên cứu về các tiến trình sinh học ở phòng thí nghiệm cũng như ứng dụng trong phát triển. Có thể hiểu tạo dòng gene (còn gọi là nhân dòng, tách dòng hay dòng hóa) là sự sản sinh nhiều bản sao của một phân tử DNA, thường là phân tử DNA tái tổ hợp trong plasmid vector, bằng cách sao chép phân tử đó trong một vật chủ thích hợp chẳng hạn như vi khuẩn E. coli. 10
  12. 1.2.3. Các bước thực hiện Kỹ thuật tái tổ hợp DNA hay còn gọi là kỹ thuật tạo dòng gene được thực hiện qua nhiều công đoạn phức tạp, tinh vi. Thực chất là một công nghệ gồm các bước chủ yếu sau: Bước 1: Nuôi tế bào cho plasmid để tạo vector chuyển gene và nuôi tế bào cho (Ví dụ: tế bào của người) để cung cấp DNA. Bước 2: Tách chiết DNA plasmid và DNA tế bào cho. Bước này còn được gọi là phân lập gene. Bước 3: Cắt cả hai loại DNA (DNA plasmid và DNA tế bào cho) bằng cùng một loại enzyme giới hạn (restriction enzyme-RE). Ví dụ: sử dụng enzyme giới hạn endonuclease EcoRI tạo ra các đầu so le. Bước 4: Trộn chung DNA plasmid đã bị cắt với DNA tế bào cho cũng đã bị cắt bởi một loại enzyme giới hạn như đã nêu trên. Bước 5: Bổ sung enzyme để tạo ra DNA tái tổ hợp hoàn chỉnh. Bước 6: Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ (ví dụ vi khuẩn E. coli) và nhân dòng. Bước 7: Chọn lọc và tạo dòng tế bào chủ (vi khuẩn) mang DNA tái tổ hợp và theo dõi hoạt động, biểu hiện của gene thông qua sản phẩm của gene lấy từ tế bào cho. 11
  13. Hình 1.1. Các bước tái tổ hợp DNA (Nguồn http://thuviensinhhoc.com/ebook/sinh-hoc) 1.2.4. Các enzyme chủ yếu dùng trong kỹ thuật DNA tái tổ hợp 1.2.4.1. Các enzyme giới hạn Trong công nghệ di truyền muốn tạo ra DNA tái tổ hợp để đưa vào tế bào chủ cần phải có công cụ cắt plasmid hình vòng và đoạn DNA của tế bào rồi cho chúng nối lại với nhau. Công cụ cắt DNA là các enzyme giới hạn.  Khái niệm về enzyme giới hạn Enzyme giới hạn là enzyme có khả năng nhận biết những đoạn trình tự DNA nhất định và cắt DNA ở ngay thời điểm này hay ở điểm kế cận. Tùy theo phương thức cắt và nguồn gốc của enzyme giới hạn mà người ta phân loại và đặt tên cho các enzyme giới hạn đó.  Phân loại enzyme giới hạn Các enzyme giới hạn được phân thành 3 kiểu I, II và III. Các enzyme giới hạn thường dùng phổ biến trong công nghệ DNA tái tổ hợp, công nghệ di truyền thuộc kiểu II. Các enzyme này cắt bên trong mạch DNA (không phân hủy từ 2 đầu của DNA) nên còn được gọi là enzyme endonuclease. Enzyme giới hạn kiểu II thực chất là endonuclease giới hạn kiểu II. 12
  14. Các enzyme giới hạn kiểu II: Cách gọi tên các enzyme giới hạn kiểu II cũng như các enzyme giới hạn khác dựa trên quy ước chung. Tên enzyme giới hạn được ghép bởi chữ cái đầu tiên là tên chi và hai chữ tiếp theo là hai chữ cái tên loài của vi sinh vật mà enzyme được tách chiết. Những chữ và số La Mã tiếp theo là tên của chủng và dòng của loài sinh vật cụ thể đã tách chiết enzyme: Ví dụ: E.coRI (thuộc chi Escherichia, loài coli, chủng Ry 13) Một số loại khác như E. coRV, BamHI, HaeIII, Smal… 1.2.4.2. Các enzyme polymerase Các enzyme polymerase xúc tác cho quá trình sao chép các acid nucleic (DNA, hoặc RNA) được sử dụng nhiều trong công nghệ di truyền. Các DNA polymerase (Enzyme DNA polymerase I, enzyme T4 DNA polymerase, enzyme Taq polymerase…). Hiện nay còn có nhiều loại DNA polymerase khác lưu hành trên thị trường như T7 DNA polymerase, Vent DNA polymerase… Các enzyme RNA polymerase: có ba loại enzyme RNA polymerase thường được dùng trong thực tế: SP6 RNA polymerase, T3 RNA polymerase và T7 RNA polymerase. Enzyme phiên mã ngược (Reverse transcriptase): có khả năng tổng hợp DNA một mạch gọi là DNA bổ trợ (cDNA) từ khuôn mRNA, hoặc từ một đoạn polynucleotite được tổng hợp bằng con đường hóa học. Nhờ có con đường phiên mã ngược này mà có thể tổng hợp được hầu hết các gene riêng biệt nào đó nếu như có mặt mRNA của gene đó. Các cDNA mạch đơn có thể biến thành mạch kép nhờ DNA polymerase và được gọi là cDNA mạch kép (c-DNA duplex). Đoạn cDNA mạch kép có thể gắn vào plasmid rồi biến nạp vào vi khuẩn, từ đó tạo dòng c-DNA. Nếu cDNA có nguồn gốc từ một gene thì ta tạo được dòng gene. Trong trường hợp mRNA trưởng thành khi đã ở ngoài nhân thì ta sẽ thu được dòng gene chỉ chứa những đoạn mã hóa (exon). Không có đoạn không mã hóa (intron). 1.2.4.3. Các enzyme nối (Ligase) Enzyme ligase là enzyme nối quan trọng trong tế bào. Các enzyme này xúc tác hình thành các liên kết phosphodiester để nối các đoạn acid nucleic với nhau. DNA ligase xúc tác nối hai đoạn DNA với nhau, RNA ligase là enzyme chủ yếu được sử dụng rộng rãi. Có một số loại enzyme nối khác nhau, nhưng enzyme T4 DNA ligase là enzyme chủ yếu được sử dụng rộng rãi nhất trong các phòng thí nghiệm về công nghệ di truyền. Có 3 loại enzyme nối thường dùng trong công nghệ di truyền. Enzyme E. coli DNA ligase được tách chiết từ vi khuẩn E. coli, xúc tác phản ứng nối hai đoạn trình tự DNA có đầu so le. Enzyme T4 DNA ligase được tách chiết từ phage T4 xâm nhiễm vào E. coli, có chức năng giống như E. coli DNA ligase nhưng lại có khả năng nối hai đoạn trình tự DNA có đầu bằng và là enzyme nối được ưa chuộng nhất hiện nay. Enzyme T4 RNA ligase tách chiết từ phage T4 xâm nhiễm E. coli, có khả năng nối hai trình tự RNA bằng các liên kết phosphodiester. 13
  15. Ngoài các loại enzyme nối kể trên, hiện nay người ta còn sử dụng các đoạn nối (đầu dính–adaptor) cho các enzyme cắt đầu bằng. Adaptor xúc tác nối các đoạn DNA do có các enzyme giới hạn cắt đầu bằng từ đó tạo nên đầu so le. Mỗi đoạn enzyme cắt đầu bằng đều có các loại adaptor đặc trưng riêng. 1.2.4.4. Các nuclease Các enzyme nuclease phân hủy các acid nucleic bằng cách làm đứt các liên kết phosphodieste là liên kết nối các nucleotit cùng một mạch với nhau. Ngoài các enzyme giới hạn đã nêu ở trên còn có các loại nuclease chủ yếu sau: Enzyme DNAase I (endonuclease) tách chiết từ tụy của bò, xúc tác phản ứng thủy phân các liên kết ngay sau một bazơ nitơ ở cả mạch đơn và mạch kép hoàn toàn ngẫu nhiên. Enzyme S1 nuclease (endonuclease) là enzyme tách chiết từ nấm mốc Aspegillus oryzae. S1 nuclease BAL 3 (endonuclease) phân cắt cả 2 đầu 5’ và 3’ của DNA và không có khả năng cắt nội liên kết. Enzyme exonuclease III là một 3’ exonuclease cắt đầu 3’ của mạch đơn và tạo thành các đoạn DNA có đầu 5’ nhô ra. Enzyme ARNase tách chiết từ tụy bò. Enzyme này thường được sử dụng để loại bỏ RNA trong hỗn hợp DNA và RNA. Enzyme ARNase H dùng để loại bỏ RNA trong các phân tử lai DNA-RNA, nhất là sau phản ứng phiên mã ngược để hình thành mạch thứ hai của cDNA, từ đó tạo nên phân tử cDNA kép. 1.2.5. Các vector sử dụng trong DNA tái tổ hợp Muốn chuyển được gene mong muốn từ thể cho sang vật chủ nhận (thể nhận), hoặc tách dòng gene, điều cơ bản là cần phải có vật chuyển gene (vector chuyển gene). Vector chuyển gene là phân tử DNA nhỏ có khả năng mang được gene cần thiết. Vector chuyển gene phải có các đặc điểm quan trọng cần thiết sau: - Có điểm khởi đầu sao chép (origin of replication – ori) để tự sao chép mà tồn tại độc lập trong tế bào. - Có các đoạn trình tự nhận biết cho enzyme giới hạn cắt rồi để hở tạo nơi lắp ráp các đoạn gene lạ. - Có trình tự khởi điểm (promoter). - Có dấu chuẩn chọn lọc cho phép dễ dàng phát hiện nhận biết chúng trong tế bào chủ nhận. Thông thường dấu chuẩn chọn lọc là các gene kháng chất kháng sinh, hoặc gene tổng hợp chất màu. Để đảm bảo cho được tính bền vững của DNA tái tổ hợp, ngoài các đặc điểm trên vector chuyển gene cũng cần có những đặc tính khác để cho việc tạo, tách dòng dễ thực hiện như: 14
  16. - Chứa các gene vô hiệu hóa các đoạn DNA không mong muốn bị gắn nhầm vào. - Có khả năng tạo nhiều bản sao để khi tách khỏi tế bào được số lượng lớn, đảm bảo sự khuếch đại của gene lạ mong muốn được gắn vào. Giá trị của các vector chuyển gene ở chỗ nó được cấu tạo thuận tiện cho mục đích sử dụng. Hiện tại chưa có loại vector chuyển gene toàn năng, mà cần phải lựa chọn vector chuyển gene cho từng đối tượng và tùy thuộc và kích thước của đoạn gene cần được chuyển. Các vector chuyển gene có các ứng dụng chủ yếu:  Tạo dòng, nhân dòng các đoạn trình tự, hoặc gene để tạo nhiều bản sao giống nhau.  Nghiên cứu sự biểu hiện của một đoạn trình tự DNA hoặc một gene.  Chuyển gene vào tế bào vi sinh vật khác (vật chủ nhận).  Sản xuất các RNA.  Sản xuất protein được tổng hợp từ gene đã được tạo dòng. Do tính chất quan trọng và nhiều ứng dụng nên các vector chuyển gene ngày càng được khám phá, hoàn thiện không ngừng. Từ những vector chuyển gene sẵn có trong tự nhiên như plasmid ở vi khuẩn, ngày nay người ta đã tạo ra nhiều loại vector phức tạp ứng dụng vào nhiều mục đích khác nhau, thậm chí tạo ra cả nhiễm sắc thể nhân tạo. 1.2.5.1. Các vector plasmid Mỗi tế bào vi khuẩn có trung bình khoảng 20 plasmid. Các plasmid có thể chia thành 2 nhóm:  Tiếp hợp  Không tiếp hợp Các plasmid tiếp hợp có thể tự truyền từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác thông qua quá trình tiếp hợp. Quá trình này đòi hỏi các chức năng của các đoạn đặc thù như tra (transfer) và mob (mobilising) nằm trên plasmid. Các plasmid không tiếp hợp thì không tự truyền đi được để vào vật nhận. Plasmid không tiếp hợp thường nhỏ, sao chép một cách thoải mái và tồn tại trong tế bào với số bản sao lớn hơn so với plasmid tiếp hợp. Các plasmid luôn được cải biến để ngày càng hoàn thiện hơn qua nhiều thế hệ, thuận tiện cho công nghệ DNA tái tổ hợp. Plasmid thế hệ thứ nhất là những plasmid đầu tiên được sử dụng để tách dòng như pSC1001, ColE1… Plasmid thế hệ thứ 2 được tạo ra bằng cách kết hợp các đặc tính quý của nhiều plasmid tự nhiên, gắn thêm gene chỉ thị để tạo nên một plasmid mới. Điển hình cho plasmid thế hệ thứ hai và cũng là một trong những plasmid được sử dụng rộng rãi nhất trong công nghệ di truyền, đó là plasmid pBR322. Plasmid nhân tạo thế hệ thứ 3 rất mạnh, có kích thước nhỏ và có một đoạn đa liên kết (polylinker), hoặc điểm đa tách dòng (multiple cloning site). Đoạn đa liên kết là 15
  17. đoạn polynucleotite tổng hợp, mang một chuỗi các vị trí nhận biết của nhiều loại enzyme giới hạn. Nhóm plasmid này là các plasmid pUC và điển hình là pUC18. Plasmid pUC18 được cải tiến từ pBR322 có kích thước là 2688 bp. Plasmid pUC18 có điểm khởi đầu sao chép (ori) mang gene kháng sinh ampicilline (Ampr). Ngoài ra nó còn có gene ức chế lac (lacI), đoạn đa liên kết (MCS) và gene lacZ’. Đoạn đa liên kết gồm nhiều vị trí nhận biết của các enzyme giới hạn. 1.2.5.2. Các vector phage Các phage (virus của vi khuẩn) được dùng làm vector chuyển gene do khả năng thực hiện việc mang gene từ tế bào vi khuẩn cho sang tế bào chủ nhận (tải nạp). Các phage sử dụng làm vector tách dòng hiện nay phần lớn bắt nguồn từ phage lamda (phage  ) có nhiều loại phage như: EMBL3, EMBL4,  GEM11, phage M13… Phage M13 thường được sử dụng làm vector tách dòng nó có DNA sợi đơn chứa 10 gene, có kích thước khoảng 6400 bp, chỉ xâm nhiễm vào E. coli. Hình 1.2. Vector chuyển gene (Nguồn http://www.slideshare.net) 1.2.5.3. Cosmid vector Cosmid vector được thiết kế để nhân dòng những đoạn DNA lớn (khoảng 40-45 kb). Đây là loại vector nhân tạo kết hợp các thuộc tính của plasmid với phage. Cosmid vector có chứa đầu cos (đầu dính) của phage giúp DNA của phage từ dạng thẳng nối lại thành vòng tròn nên có thể gói bọc dễ dàng trong phần đầu của phage. Mặt khác cosmid vector lại có phần gốc plasmid. Do vậy, chúng có khả năng tự nhân đôi như những plasmid của vi khuẩn. Do hầu như toàn bộ phần DNA của phage đã được cắt bỏ, nên chúng có khả năng mang đoạn DNA ngoại lai có kích thước lớn. Khi đoạn DNA ngoại lai được ghép nối, các cosmid tái tổ hợp sẽ được gói bọc trong phage. 16
  18. Phage mang DNA tái tổ hợp không tự nhân lên được vì phần DNA phage đã bị loại bỏ nhưng chúng vẫn có khả năng lây nhiễm vào vi khuẩn. Tuy nhiên sau khi vào vi khuẩn, chúng lại có khả năng tự nhân lên do bản thân trong vi khuẩn đã có plasmid bình thường. Cosmid mang đoạn gene lạ có thể dài đến 45 kb dùng để lập thư viện gene ở ruồi giấm, chuột, thậm chí cả ở người. 1.2.5.4. Các vector khác  Plasmid Ti Được sử dụng rộng dãi trong việc chuyển gene ở thực vật. Plasmid Ti bắt nguồn từ vi khuẩn trong đất, loài Agrobacterium tumifaciens gây bệnh tạo khối u (tumor) ở thực vật.  Vector nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men YAC Nấm men là đối tượng quan trọng trong công nghệ di truyền. Các plasmid có nguồn gốc từ vi khuẩn đưa vào nấm men hoạt động thường không hiệu quả. Ngược lại plasmid có nguồn gốc nấm men đưa vào tế bào vi khuẩn lại không hoạt động. Cho tới nay ở vi sinh vật nhân chuẩn (eukaryote) mới chỉ tìm được một loại plasmid duy nhất, đó là plasmid hình vòng có kích thước khoảng 2 micromet, có nhiều trong tế bào nấm men Sacchromyces cerevisiae.  Vector là virus của tế bào eukaryote Các vector virus thường được sử dụng là các loại virus SV40 (Smian virus) adenovirus, retrovirus, baculovirus, virus herpes,… Các vector nhóm này được sử dụng trong tách dòng gene và chuyển gene ở tế bào động thực vật bậc cao. Nhìn chung có nhiều loại vector khác nhau được dùng trong công nghệ di truyền. Mỗi loại vector có tế bào chủ đặc trưng và khả năng xen đoạn DNA có kích thước khác nhau. 1.2.6. Các loại tế bào chủ Nhiều loại tế bào chủ khác nhau được sử dụng phụ thuộc vào mục đích sử dụng như:  Nuôi số lượng lớn để tách plasmid cho thí nghiệm tạo dòng. Hệ thống tế bào chủ này cần đơn giản, dễ sử dụng.  Dùng để biểu hiện gene, đặc biệt ở sinh vật nhân chuẩn bậc cao như động vật, thực vật. Hệ thống tế bào chủ này cần mang tính đặc thù.  Dùng để sản xuất protein tái tổ hợp.  Tùy theo mục đích sử dụng mà chọn một tế bào chủ thích hợp. Các tế bào chủ có thể chia làm hai hệ thống chính, đó là tế bào chủ nhân sơ và tế bào chủ nhân chuẩn. 1.2.6.1. Tế bào chủ nhân sơ Một loại tế bào chủ lý tưởng là tế bào cần phải dễ nuôi cấy, dễ giữ và nhân giống, lại chấp nhận được nhiều loại vector. Vi khuẩn E. coli đáp ứng các yêu cầu của tế bào 17
  19. chủ lý tưởng và được sử dụng nhiều trong kỹ thuật tạo và tách dòng gene. Do tính chất đặc biệt của tế bào chủ lý tưởng nên E. coli được nghiên cứu tỉ mỉ về cơ chế di truyền, phân lập và tạo nên nhiều chủng khác nhau. Các nghiên cứu đó là cơ sở cho kỹ thuật DNA tái tổ hợp và công nghệ di truyền. Ngoài E. coli một số vi khuẩn khác cũng được dùng làm tế bào chủ cho các thí nghiệm tách dòng gene như: Bacillus, Pseudomonas và Streptomyces… tuy nhiên những tế bào chủ này có những hạn chế nhất định. Những tế bào chủ này cần đòi hỏi những vector thích hợp, nên việc đưa các DNA tái tổ hợp vào chúng gặp nhiều khó khăn. 1.2.6.2. Tế bào chủ nhân chuẩn Một trong những nhược điểm cơ bản khi sử dụng E. coli làm tế bào chủ để tách dòng gene vì nó là sinh vật nhân sơ không có màng nhân bao bọc nhiễm sắc thể. Do vậy các gene ở sinh vật nhân chuẩn không thể được biểu hiện được trong E. coli vì môi trường khác với môi trường bình thường của sinh vật nhân chuẩn. Như vậy, nếu chúng ta muốn sản xuất một loại protein nhân chuẩn trong một thí nghiệm tách dòng thì khó có thể tin rằng E. coli mang DNA tái tổ hợp có thể sản sinh ra protein có chức năng đầy đủ như protein nhân chuẩn mong muốn. Các tế bào chủ nhân chuẩn có phổ tồn tại rất rộng từ các vi sinh vật nhân chuẩn bậc thấp như nấm men, nấm mốc, tảo cho đến các tế bào sinh vật đa bào phức tạp như động vật, thực vật.  Tế bào nấm men (Saccharomyces cerevisiae) Nấm men S. cerevisiae là vi sinh vật nhân chuẩn đơn bào (kích thước khoảng 5 micromet) dễ nuôi cấy với quy mô lớn, có điểm khởi đầu (promotor) mạnh và có plasmid dùng làm vector YAC biểu hiện gene,… Loài S. cerevisiae có rất nhiều đặc điểm phù hợp để người ta chọn làm tế bào chủ phù hợp nhất. Ngoài ra các nấm men khác cũng được dùng làm tế bào chủ trong các thí nghiệm tạo dòng gene như nấm mốc Aspergillus nidulans, Neurospora crassa hoặc Pechia pastoris.  Tế bào thực vật Một số loại tế bào thực vật được sử dụng làm tế bào chủ thực vật trong các phòng thí nghiệm thao tác gene. Tảo đơn bào, ví dụ như loài Chramydomonas rainhardii có tất cả những đặc tính ưu việt của vi sinh vật cộng với cấu trúc và chức năng của tế bào thực vật. Do vậy tảo đơn bào được sử dụng ngày càng nhiều trong các thí nghiệm thao tác di truyền, trong công nghệ di truyền. Tuy nhiên, người ta cũng còn dùng các tế bào thực vật nuôi cấy trong những môi trường thích hợp có thể dùng làm tế bào chủ.  Các tế bào chủ động vật 18
  20. Các tế bào động vật nuôi rất phức tạp, nhưng trong những điều kiện cần thiết cho sự biểu hiện ra các protein có hoạt tính sinh học, người ta vẫn sử dụng tế bào chủ động vật. Các loại tế bào chủ động vật bao gồm:  Tế bào thận của khỉ xanh châu Phi.  Tế bào thận chuột đồng nhỏ.  Tế bào thận phôi người.  Tế bào tử cung chuột bạch.  Tế bào côn trùng để nuôi Baculovirus biểu hiện protein người.  Tế bào tuyến côn trùng Caenorhabditis elegans. 1.2.7. Tạo, tách và chọn lọc dòng rDNA Hai yếu tố quan trọng trong công nghệ DNA tái tổ hợp là: khả năng sử dụng các enzyme để cắt nối các phân tử DNA in vitro và hệ thống các tế bào vật chủ để đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ nhằm nhân lên với một số lượng lớn bản sao trong tế bào chủ. Mỗi tế bào chủ khi phân bào tạo nên một dòng tế bào chứa bản sao của một gene cần thiết, đó là tách dòng gene (gene cloning). 1.2.7.1. Tạo plasmid tái tổ hợp  Tạo nguồn gene Bước đầu của việc tạo plasmid tái tổ hợp là cần phải thu được nguồn gene. Có ba phương pháp khác nhau để thu nhận gene:  Thu nhận DNA từ hệ gene (thư viện DNA).  Tổng hợp gene bằng phương pháp hóa học.  Lập ngân hàng DNA bổ trợ (cDNA).  Tạo plasmid tái tổ hợp Khi có các đoạn DNA hay cDNA mong muốn. Bước tiếp theo là gắn chúng vào vector chuyển gene để tạo ra plasmid tái tổ hợp. Có nhiều phương pháp gắn các đoạn DNA, hoặc cDNA vào plasmid, hoặc các vector chuyển gene khác.  Phương pháp dùng đầu dính.  Phương pháp dùng đoạn nối (linkers).  Phương pháp dùng enzyme terminal transferase 1.2.7.2. Tách dòng DNA tái tổ hợp Sau khi plasmid tái tổ hợp hoặc vector tái tổ hợp được tạo thành, bước tiếp theo là biến nạp chúng vào tế bào chưa mang plasmid chứa gene lạ, ví dụ biến nạp vào E. coli. Biến nạp được thực hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau. 19
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2