Đặc điểm phân tử chủng enterovirus 71 phân lập ở Đắk Lắk

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> <br /> ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ CHỦNG ENTEROVIRUS 71<br /> PHÂN LẬP Ở ĐẮK LẮK<br /> Lê Văn Tuấn, Nguyễn Thị Tuyết Vân, Nguyễn Hoàng Quân,<br /> Trần Lệ Thiên Hương, Trịnh Thị Hồng Hạnh, Phạm Thọ Dược<br /> Viện Vệ sinh Dịch tễ Tây Nguyên<br /> Enterovirus 71 là tác nhân chính gây bệnh tay chân miệng và có thể gây ra các bệnh thần kinh nặng như<br /> viêm não và bại liệt. Nghiên cứu nhằm mô tả một số đặc điểm phân tử dựa trên trình tự vùng gen VP1 (891<br /> nucleotide) từ 11 chủng Enterovirus 71 phân lập ở Đắk Lắk năm 2014. Kết quả cho thấy trình tự nucleotide<br /> và acid amino vùng gen VP1 của chủng Enterovirus 71 trong nghiên cứu này có tỷ lệ tương đồng rất cao khi<br /> so sánh với các chủng Enterovirus 71 lưu hành trước đây ở Việt Nam, tỷ lệ tương đồng nucleotide từ 99,5 99,9% và acid amin từ 98,0 - 99,7%. Phân tích trình tự acid amin cho thấy các chủng Enterovirus 71 lưu<br /> hành ở Đắk Lắk xuất hiện đột biến tại các vị trí N31D; T79A; E98K; R121K; G145E; S241L và A289T. Kết<br /> quả phân tích cây phả hệ cho thấy các chủng Enterovirus 71 trong nghiên cứu này thuộc kiểu gen B5 và có<br /> mối quan hệ gần với các chủng Enterovirus 71 lưu hành ở Hồ Chí Minh, An Giang và Hà Nội.<br /> Từ khoá: Bệnh tay chân miệng, Enterovirus 71, gen VP1, cây phả hệ<br /> <br /> I. ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Bệnh tay chân miệng là bệnh truyền nhiễm<br /> cấp tính, lây truyền qua đường tiêu hóa do<br /> một nhóm virus đường ruột (enterovirus) gây<br /> nên. Enterovirus 71 có kích thước khoảng<br /> 30nm, không có bao, gồm có một sợi đơn<br /> dương RNA, có chiều dài 7,5kb. Bộ gen bao<br /> gồm một khung đọc mở duy nhất, với vùng<br /> không mã hóa (UTR) tại đầu 5’ và 3’. Khung<br /> đọc mở (ORF) được phân chia thành 3 vùng<br /> <br /> Dựa trên trình tự vùng gen VP1, Enterovirus<br /> 71 được xác định có 4 nhóm gen A, B, C và<br /> D. Trong đó, nhóm gen A và D chỉ có một kiểu<br /> gen, nhóm gen B và C được chia thành 5 kiểu<br /> gen từ B1 - B5 và C1 - C5 [1].<br /> Enterovirus 71 được phát hiện đầu tiên tại<br /> California - Hoa Kỳ năm 1969 (nhóm gen A),<br /> cho đến nay Enterovirus 71 đã có những biến<br /> đổi, phát sinh chủng mới với nhóm gen B<br /> <br /> P1 đến P3 và mã hóa cho một chuỗi protein<br /> gồm 2194 acid amin. Chuỗi protein được phân<br /> <br /> (gồm 5 kiểu gen từ B1 đến B5) và C (gồm 5<br /> <br /> cắt bởi protease sinh ra các protein cấu trúc<br /> và không cấu trúc. Vùng P1 mã hóa cho các<br /> <br /> quốc gia trong khu vực Châu Á Thái Bình<br /> <br /> protein cấu trúc VP1 đến VP4. 60 đơn vị giống<br /> <br /> Nhật Bản, Singapore, Đài Loan và Việt Nam<br /> <br /> nhau, mỗi đơn vị gồm 4 protein capsid, tạo<br /> thành cấu trúc khối 20 mặt (icosahedral) được<br /> <br /> [3; 4].<br /> <br /> biết như là lớp vỏ capsid của vi rút. VP1, VP2<br /> và VP3 gồm từ 240 đến 290 acid amin [1; 2].<br /> <br /> Enterovirus 71 được phát hiện và phân lập<br /> <br /> kiểu gen từ C1 đến C5) được phát hiện ở các<br /> Dương như: Trung Quốc, Malaysia, Thái Lan,<br /> <br /> Tại Việt Nam, bệnh tay chân miệng do<br /> đầu tiên vào năm 2003 tại thành phố Hồ Chí<br /> Minh với hơn 1.000 trẻ mắc, 20 trường hợp tử<br /> <br /> Địa chỉ liên hệ: Lê Văn Tuấn, Viện Vệ sinh Dịch tễ<br /> Tây Nguyên<br /> Email: levantuan_tihe@yahoo.com<br /> Ngày nhận: 24/1/2018<br /> Ngày được chấp thuận: 5/6/2018<br /> <br /> 8<br /> <br /> vong. Vụ dịch tay chân miệng tại thành phố<br /> Hồ Chí Minh năm 2005 có 173 trẻ mắc bệnh<br /> và 3 trường hợp tử vong [5]. Trong những<br /> năm từ 2008 - 2010, số ca mắc tay chân<br /> <br /> TCNCYH 112 (3) - 2018<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> miệng tại khu vực miền Nam trung bình<br /> khoảng 10.500 ca/năm với số tử vong trung<br /> bình là 18 ca [6].<br /> Kết quả nghiên cứu gần đây của một số<br /> tác giả cho thấy tác nhân Enterovirus 71 gây<br /> bệnh trong các vụ dịch tay chân miệng đã có<br /> sự thay đổi di truyền. Chủng có kiểu gen phụ<br /> C4, C5 lưu hành gây dịch ở khu vực miền<br /> Nam và miền Bắc giai đoạn 2003 - 2012. Tuy<br /> nhiên, có sự thay đổi kiểu gen phụ từ C4 sang<br /> B5 gây bệnh tay chân miệng ở cả hai miền<br /> Nam, Bắc giai đoạn 2013 - 2014 [7 - 10].<br /> <br /> 2. Phương pháp<br /> - Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả<br /> cắt ngang.<br /> - Kỹ thuật thực hiện:<br /> + Tách chiết RNA: Chủng Enterovirus 71<br /> được tách chiết RNA virus bằng bộ sinh phẩm<br /> QIAGEN.<br /> + Thực hiện phản ứng RT - PCR: RNA<br /> sau khi tách chiết sẽ thực hiện phản ứng RTPCR với cặp mồi đặc hiệu trên vùng gen VP1<br /> với cặp mồi 2349F và 3393R. Chu trình nhiệt:<br /> 48oC/45 phút, 94oC/2 phút, lặp lại 35 chu kỳ<br /> <br /> Tại Đắk Lắk, bệnh tay chân miệng đã trở<br /> <br /> gồm 3 bước: 94oC/10 giây, 50oC/10 giây,<br /> <br /> thành dịch lưu hành, trong đó Enterovirus 71<br /> <br /> 65oC/1 phút; tiếp theo 65oC/5 phút và giữ ở<br /> <br /> là tác nhân gây bệnh trong giai đoạn từ 2011<br /> <br /> 4oC.<br /> <br /> đến 2014 và là tác nhân chính gây nhiều ca<br /> bệnh nặng. Mỗi kiểu gen phụ của Enterovirus<br /> 71 có độc lực khác nhau. Hiện nay, xu hướng<br /> thay đổi giữa các kiểu gen phụ của các<br /> Enterovirus 71 gây bệnh tay chân miệng nặng<br /> và tử vong là vấn đề cần được quan tâm. Các<br /> nghiên cứu chỉ ra rằng các thời điểm thay đổi<br /> kiểu gen phụ nổi trội của Enterovirus 71 tương<br /> ứng với những năm xảy ra nhiều ca mắc bệnh<br /> tay chân miệng ở nước ta (2005, 2011, 20132014) [9 - 10; 16]. Điều này có mối tương<br /> quan giữa việc thay đổi kiểu gen phụ nổi trội<br /> của Enterovirus 71 với việc bùng phát dịch<br /> bệnh tay chân miệng vì trẻ em chưa có kháng<br /> thể kháng kiểu gen phụ của virus đó. Mục tiêu<br /> của nghiên cứu nhằm xác định và phân tích<br /> <br /> + Giải trình tự gen vùng VP1: Sản phẩm<br /> RT-PCR được tinh sạch bằng bộ sinh phẩm<br /> QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN) để<br /> làm khuân mẫu cho phản ứng giải trình tự gen<br /> sử dụng cặp mồi đặc trưng cho vùng VP1 của<br /> Enterovirus 71 với bộ sinh phẩm BigDye<br /> Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Applied<br /> Biosystems) theo chu trình nhiệt: thực hiện 30<br /> chu kỳ gồm 960C/20 giây, 500C/20 giây,<br /> 600C/4 phút. Tinh sạch sản phẩm PCR giải<br /> trình tự bằng bộ sinh phẩm Dye EX của<br /> QIAGEN. Đọc trình tự nucleotid bằng máy<br /> phân tích ABI 3130XL (Applied Biosystem).<br /> Phân tích trình tự nucleotid và acid amin bằng<br /> phần mềm BioEdit version 7.0.<br /> <br /> đặc điểm phân tử kiểu gen phụ của các chủng<br /> <br /> + Phân tích cây chủng loại phát sinh<br /> <br /> Enterovirus 71 lưu hành ở Đắk Lắk năm 2014.<br /> <br /> (Phylogeny): Các trình tự gen vùng VP1 của<br /> Enterovirus 71 được sắp xếp và phân tích trên<br /> <br /> II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> 1. Đối tượng<br /> <br /> phần mềm MEGA6.0 để xác định đa dạng di<br /> truyền và mối quan hệ di truyền với các chủng<br /> Enterovirus 71 khác từ ngân hàng gen<br /> <br /> 11 chủng Enterovirus 71 phân lập từ mẫu<br /> <br /> (GenBank). Cây chủng loại phát sinh được<br /> <br /> bệnh phẩm từ bệnh nhân mắc bệnh tay chân<br /> <br /> xây dựng dựa trên phương pháp Neighbor-<br /> <br /> miệng ở Đắk Lắk năm 2014.<br /> TCNCYH 112 (3) - 2018<br /> <br /> 9<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> Joining với giá trị lặp lại giữa các khoảng cách tin cậy 1000 lần, sử dụng mô hình Kimura 2 thông<br /> số trong phần mềm MEGA6.0.<br /> 3. Đạo đức nghiên cứu<br /> Nghiên cứu được thực hiện trên đối tượng là các chủng virus và được sự cho phép của Khoa<br /> Virus, Viện Vệ sinh Dịch tễ Tây Nguyên, không có tác động can thiệp nào tới bệnh nhân.<br /> <br /> III. KẾT QUẢ<br /> Bảng 1. Thông tin các chủng Enterovirus 71 sử dụng cho giải trình tự gen vùng VP1<br /> Tên chủng<br /> <br /> Năm phân lập<br /> <br /> Số truy cập trên ngân hàng gen<br /> <br /> BD14-04_DakLak-14<br /> <br /> 2014<br /> <br /> MF001386<br /> <br /> BD14-30_DakLak-14<br /> <br /> 2014<br /> <br /> MF001387<br /> <br /> BD14-34_DakLak-14<br /> <br /> 2014<br /> <br /> MF001388<br /> <br /> HSS14-40_DakLak-14<br /> <br /> 2014<br /> <br /> MF001420<br /> <br /> HSS14-49_DakLak-14<br /> <br /> 2014<br /> <br /> MF001421<br /> <br /> HSS14-111_DakLak-14<br /> <br /> 2014<br /> <br /> MF001422<br /> <br /> HSS14-125_DakLak-14<br /> <br /> 2014<br /> <br /> MF001423<br /> <br /> HSS14-133_DakLak-14<br /> <br /> 2014<br /> <br /> MF001424<br /> <br /> HSS14-185_DakLak-14<br /> <br /> 2014<br /> <br /> MF001425<br /> <br /> HSS14-213_DakLak-14<br /> <br /> 2014<br /> <br /> MF001426<br /> <br /> HSS14-256_DakLak-14<br /> <br /> 2014<br /> <br /> MF001427<br /> <br /> Bảng 2. Tỷ lệ (%) tương đồng về thành phần nucleotid (dưới đường chéo) và amino acid<br /> (trên đường chéo) của vùng gen VP1 các chủng Enterovirus 71 trong nghiên cứu này với<br /> nhau và với chủng Enterovirus 71 tham chiếu<br /> 1<br /> 1<br /> <br /> 2<br /> <br /> 3<br /> <br /> 4<br /> <br /> 5<br /> <br /> 6<br /> <br /> 7<br /> <br /> 8<br /> <br /> 9<br /> <br /> 10<br /> <br /> 11<br /> <br /> 12<br /> <br /> 13<br /> <br /> 14<br /> <br /> 100<br /> <br /> 100<br /> <br /> 98,7<br /> <br /> 99,0<br /> <br /> 99,7<br /> <br /> 99,7<br /> <br /> 100<br /> <br /> 99,7<br /> <br /> 99,7<br /> <br /> 99,7<br /> <br /> 99,3<br /> <br /> 99,7<br /> <br /> 99,7<br /> <br /> 100<br /> <br /> 98,7<br /> <br /> 99,0<br /> <br /> 99,7<br /> <br /> 99,7<br /> <br /> 100<br /> <br /> 99,7<br /> <br /> 99,7<br /> <br /> 99,7<br /> <br /> 99,3<br /> <br /> 99,7<br /> <br /> 99,7<br /> <br /> 98,7<br /> <br /> 99,0<br /> <br /> 99,7<br /> <br /> 99,7<br /> <br /> 100<br /> <br /> 99,7<br /> <br /> 99,7<br /> <br /> 99,7<br /> <br /> 99,3<br /> <br /> 99,7<br /> <br /> 99,7<br /> <br /> 97,6<br /> <br /> 98,3<br /> <br /> 98,3<br /> <br /> 98,7<br /> <br /> 98,3<br /> <br /> 98,3<br /> <br /> 98,3<br /> <br /> 98,0<br /> <br /> 98,3<br /> <br /> 98,3<br /> <br /> 99,3<br /> <br /> 99,3<br /> <br /> 99,0<br /> <br /> 99,0<br /> <br /> 99,3<br /> <br /> 99,3<br /> <br /> 99,0<br /> <br /> 98,7<br /> <br /> 98,7<br /> <br /> 100<br /> <br /> 99,7<br /> <br /> 99,7<br /> <br /> 100<br /> <br /> 100<br /> <br /> 99,7<br /> <br /> 99,3<br /> <br /> 99,3<br /> <br /> 2<br /> <br /> 100<br /> <br /> 3<br /> <br /> 100<br /> <br /> 100<br /> <br /> 4<br /> <br /> 99,6<br /> <br /> 99,6<br /> <br /> 99,6<br /> <br /> 5<br /> <br /> 99,6<br /> <br /> 99,6<br /> <br /> 99,6<br /> <br /> 99,5<br /> <br /> 6<br /> <br /> 99,6<br /> <br /> 99,6<br /> <br /> 99,6<br /> <br /> 99,5<br /> <br /> 10<br /> <br /> 99,8<br /> <br /> TCNCYH 112 (3) - 2018<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> 1<br /> <br /> 2<br /> <br /> 3<br /> <br /> 4<br /> <br /> 5<br /> <br /> 6<br /> <br /> 7<br /> <br /> 8<br /> <br /> 9<br /> <br /> 10<br /> <br /> 11<br /> <br /> 12<br /> <br /> 13<br /> <br /> 14<br /> <br /> 7<br /> <br /> 99,6<br /> <br /> 99,6<br /> <br /> 99,6<br /> <br /> 99,5<br /> <br /> 99,8<br /> <br /> 99,9<br /> <br /> 99,7<br /> <br /> 99,7<br /> <br /> 100<br /> <br /> 100<br /> <br /> 99,7<br /> <br /> 99,3<br /> <br /> 99,3<br /> <br /> 8<br /> <br /> 99,6<br /> <br /> 99,6<br /> <br /> 99,6<br /> <br /> 99,5<br /> <br /> 99,8<br /> <br /> 99,9<br /> <br /> 99,9<br /> <br /> 99,7<br /> <br /> 99,7<br /> <br /> 99,7<br /> <br /> 99,3<br /> <br /> 99,7<br /> <br /> 99,7<br /> <br /> 9<br /> <br /> 99,5<br /> <br /> 99,5<br /> <br /> 99,5<br /> <br /> 99,4<br /> <br /> 99,9<br /> <br /> 99,7<br /> <br /> 99,8<br /> <br /> 99,8<br /> <br /> 99,7<br /> <br /> 99,7<br /> <br /> 99,3<br /> <br /> 99,3<br /> <br /> 99,3<br /> <br /> 10<br /> <br /> 99,6<br /> <br /> 99,6<br /> <br /> 99,6<br /> <br /> 99,5<br /> <br /> 99,8<br /> <br /> 99,9<br /> <br /> 99,9<br /> <br /> 99,9<br /> <br /> 99,8<br /> <br /> 100<br /> <br /> 99,7<br /> <br /> 99,3<br /> <br /> 99,3<br /> <br /> 11<br /> <br /> 99,6<br /> <br /> 99,6<br /> <br /> 99,6<br /> <br /> 99,5<br /> <br /> 99,8<br /> <br /> 99,9<br /> <br /> 99,9<br /> <br /> 99,9<br /> <br /> 99,8<br /> <br /> 99,9<br /> <br /> 99,7<br /> <br /> 99,3<br /> <br /> 99,3<br /> <br /> 12<br /> <br /> 99,8<br /> <br /> 99,8<br /> <br /> 99,8<br /> <br /> 99,7<br /> <br /> 99,6<br /> <br /> 99,6<br /> <br /> 99,7<br /> <br /> 99,7<br /> <br /> 99,6<br /> <br /> 99,7<br /> <br /> 99,7<br /> <br /> 99,7<br /> <br /> 99,7<br /> <br /> 13<br /> <br /> 99,7<br /> <br /> 99,7<br /> <br /> 99,7<br /> <br /> 99,6<br /> <br /> 99,6<br /> <br /> 99,6<br /> <br /> 99,6<br /> <br /> 99,6<br /> <br /> 99,5<br /> <br /> 99,6<br /> <br /> 99,6<br /> <br /> 99,9<br /> <br /> 14<br /> <br /> 99,9<br /> <br /> 99,9<br /> <br /> 99,9<br /> <br /> 99,6<br /> <br /> 99,5<br /> <br /> 99,6<br /> <br /> 99,6<br /> <br /> 99,6<br /> <br /> 99,5<br /> <br /> 99,6<br /> <br /> 99,6<br /> <br /> 99,8<br /> <br /> 100<br /> 99,7<br /> <br /> Ghi chú:<br /> 1 BD14-04_DakLak-14<br /> <br /> 6<br /> <br /> HSS14-111_DakLak-14<br /> <br /> 11<br /> <br /> HSS14-256_DakLak-14<br /> <br /> 2 BD14-30_DakLak-14<br /> <br /> 7<br /> <br /> HSS14-125_DakLak-14<br /> <br /> 12<br /> <br /> ND-17_VNM:Hanoi-12<br /> <br /> 3 BD14-34_DakLak-14<br /> <br /> 8<br /> <br /> HSS14-133_DakLak-14<br /> <br /> 13<br /> <br /> 278N_VNM:HoChiMinh-13<br /> <br /> 4 HSS14-40_DakLak-14<br /> <br /> 9<br /> <br /> HSS14-185_DakLak-14<br /> <br /> 14<br /> <br /> 714P_VNM:AnGiang-13<br /> <br /> 5 HSS14-49_DakLak-14<br /> <br /> 10<br /> <br /> HSS14213_DakLak-14<br /> <br /> Bảng 2 cho thấy tỷ lệ tương đồng trình tự nucleotid và acid amin tại vùng gen VP1 (891 nucleotide – 297 acid amin) trên 11 chủng Enterovirus 71. Kết quả cho thấy độ tượng đồng về<br /> nucleotid giữa các chủng Enterovirus 71 trong nghiên cứu rất cao dao động từ 99,5% đến 100%<br /> và acid amin có độ tương đồng duy trì ở mức 97,6% đến 100%. Khi so sánh với chủng<br /> Enterovirus 71 lưu hành ở Hà Nội năm 2012 (mã số truy cập ngân hàng GenBank: KU159454),<br /> An Giang (mã số truy cập ngân hàng GenBank: KU887974) và Thành phố Hồ Chí Minh (mã số<br /> truy cập ngân hàng GenBank: KU888143) năm 2013 cho thấy mức độ tương đồng trình tự<br /> nucleotid từ 99,5% đến 99,9% và acid amin có độ tương đồng từ 98,0% đến 99,7%.<br /> Kết quả phân tích trình tự nucleotid của VP1 cho thấy Enterovirus 71 lưu hành ở Đắk Lắk năm<br /> 2014 có sự tương đồng với nhau cao (trên 99,5%). Đột biến nucleotid từ T ↔ C xuất hiện 8/11<br /> (72,72%) virus tại vị trí 123, 282, 330, 576, 735 và 870; xuất hiện 7/11 (63,63%) virus tại các vị trí<br /> 324, 384, 411, 441, 618, 739, 819, 828 và 834; xuất hiện từ 4 - 6/11 virus tại các vị trí 246 và 711.<br /> Đột biến nucleotid từ A ↔ G xuất hiện 8/11 (72,72%) virus tại các vị trí 351, 561, 630 và 816; xuất<br /> hiện ở 7/11 (63,63%) virus tại vị trí 648; xuất hiện 6/11 (54,54%) virus tại các vị trí 434 và 588. Khi<br /> so sánh trình tự gen VP1 chủng Enterovirus 71 phân lập ở Đắk Lắk với các chủng Enterovirus 71<br /> phân lập ở khu vực miền Bắc (Hà Nội) năm 2012 và khu vực miền Nam (An Giang và Thành phố<br /> Hồ Chí Minh) năm 2013 cho thấy mức độ tương đồng về trình tự gen cũng tương đối cao (từ<br /> 99,5%). Có sự khác biệt tại vị trí 229 khi tất cả các chủng Enterovirus 71 phân lập ở Đắk Lắk là A,<br /> tuy nhiên các chủng Enterovirus 71 phân lập ở Hà Nội, An Giang và Thành phố Hồ Chí Minh là G<br /> (bảng 2 và hình 1).<br /> TCNCYH 112 (3) - 2018<br /> <br /> 11<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> <br /> Hình 1. So sánh trình tự nucleotid của gen VP1 giữa các chủng Enterovirus 71 trong<br /> nghiên cứu này với nhau và với các chủng Enterovirus 71 tham chiếu khác<br /> 12<br /> <br /> TCNCYH 112 (3) - 2018<br /> <br />