intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE
 » 
 » 

Đặc trưng di truyền của chủng IHHNV phân lập tôm nuôi ở đồng bằng sông Cửu Long

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:13

Thêm vào BST
Báo xấu
13
lượt xem 3
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Sự đa dạng di truyền của chủng IHHNV đã được xác định trên nhiều vùng địa lý khác nhau trên thế giới. Trong nghiên cứu này, khi phân tích và giải trình tự gen IHHNV trên những mẫu tôm sú nuôi ở Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) cho thấy đã có sự hiện diện chủng virus IHHN type A không lây bệnh, đoạn gen khuếch đại 1100 bp của chủng này có độ tương đồng rất cao với đoạn gen chủng IHHNV type A phân lập ở Úc và Mandagasca là 100%.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Đặc trưng di truyền của chủng IHHNV phân lập tôm nuôi ở đồng bằng sông Cửu Long

  1. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 ĐẶC TRƯNG DI TRUYỀN CỦA CHỦNG IHHNV PHÂN LẬP TÔM NUÔI Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG Cao Thành Trung1, Nguyễn Thị Kim Mỹ2 và Phạm Hùng Vân3 TÓM TẮT Sự đa dạng di truyền của chủng IHHNV đã được xác định trên nhiều vùng địa lý khác nhau trên thế giới. Trong nghiên cứu này, khi phân tích và giải trình tự gen IHHNV trên những mẫu tôm sú nuôi ở Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) cho thấy đã có sự hiện diện chủng virus IHHN type A không lây bệnh, đoạn gen khuếch đại 1100 bp của chủng này có độ tương đồng rất cao với đoạn gen chủng IHHNV type A phân lập ở Úc và Mandagasca là 100%. Đồng thời, chủng virus IHHN type lây nhiễm cũng đã được xác định hiện diện trên tôm sú nuôi vùng này. Phân tích trình tự cho thấy chủng có kí hiệu KG phân lập tại tôm nuôi ở Kiên Giang và chủng kí hiệu ST phân lập trên tôm con ở Bình Thuận nhưng nuôi Sóc Trăng mất đi một đoạn khoảng 79 nucleotide, tuy nhiên sự mất này không ảnh hưởng đến các vùng đọc mở của bộ gen để mã hóa protein của virus. Phân tích trình tự của chủng IHHNV KG có sự tương đồng rất cao với các chủng IHHNV ở Hawaii, Mexico, Đài Loan C và Ecuador, độ tương đồng bộ gen trên 95%. Và một chủng IHHNV type lây nhiễm khác có kí hiệu ST, phân tích trình tự chủng này cho thấy có độ tương đồng thấp đối với chủng có kí hiệu KG và chủng IHHNV phân lập ở Hawaai, nhưng có độ tương đồng cao với chủng IHHNV phân lập ở Đài Loan A, B và Thái Lan. Trình tự bộ gen của 2 chủng KG và ST có kích thước khoảng 3824 bp. Kết quả nghiên cứu cho thấy, tôm sú nuôi ở ĐBSCL có sự hiện diện 2 chủng IHHNV type lây nhiễm và chủng IHHNV type A không lây nhiễm. Từ khóa: Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL), virus IHHN, tôm sú P. monodon. I. ĐẶT VẤN ĐỀ xanh L. stylirostris có tỷ lệ chết lên đến 90%. Bệnh do virus là vấn đề rất nghiêm trọng Tôm thẻ chân trắng và tôm sú nuôi khi nhiễm đối với ngành công nghiệp nuôi tôm trên toàn vi virus này có hiện tượng dị hình và chậm lớn cầu. Hàng loạt các dịch bệnh bùng phát đã gây (Rai và ctv., 2013). thiệt hại kinh tế đến người dân nuôi tôm. Bệnh IHHNV là virus có kích thước nhỏ nhất hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu được phát hiện trên tôm he. Virus này chỉ có mô do virus có tên infectious hypodermal and đường kính 22nm, cấu trúc khối cầu đa diện hemotopoietic necrosis virus (IHHNV), đây là và không có vỏ ngoài. Dựa trên kích thước, một trong số bệnh nguy hiểm trên tôm xanh hình thái học và hóa sinh, IHHNV được xếp Litopenaeus stylirostris. Bệnh IHHN lần đầu vào họ Parvoviridae và có thể là thành viên tiên được mô tả trên hệ thống nuôi siêu thâm của giống Brevidensovirus (Bonami, 1990). canh tôm xanh L. stylirostris tại Hawaii năm Virus này mang một phân tử DNA mạch đơn, 1981 (Lightner, 1983). Khi mắc bệnh này, tôm kích thước bộ gen 4,1kb chứa trình tự 3 ORF 1 Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trường và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thủy Sản Khu Vực Nam Bộ - Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2. Email: thanhtrung77@yahoo.com 2 Trường Đại học khoa học Tự Nhiên Tp. Hồ Chí Minh 3 Công Ty TNHH Dịch Vụ Và Thương Mại Nam Khoa TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 1 - THAÙNG 7/2013 49
  2. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 (1, 2 và 3) (Nunan và ctv. 2000, Shike và ctv. độ tương đồng cao nhất 98% với chủng IHHNV 2000). Trong đó, ORF1 có kích thước khoảng phân lập ở Đài Loan, 97% với chủng IHHNV 2001 bp chiếm 50% trình tự bộ gen và được dự Thái Lan (An và ctv., 2009). Tuy nhiên, do sự du đoán có thể mã hóa cho một chuỗi peptide 666 nhập tôm bố mẹ từ nhiều nguồn khác nhau nên amino acid với trọng lượng phân tử là 75.77 có thể có sự đa dạng về di truyền của các chủng kDa, trên cơ sở tương đồng trình tự với 2 virus IHHNV truyền nhiễm hiện diện tại ĐBSCL là rất Brevidensoviruses trên muỗi, trình tự amino cao. Do vậy, việc phân lập IHHNV nhiều chủng acid này được dự đoán là protein giả định 1 và giải trình tự sẽ cho biết được cấu trúc vật liệu (non-structural protein 1 - NS1). ORF2 có kích di truyền các chủng IHHNV tại Việt Nam và mối thước khoảng 1092 bp bắt đầu từ nucleotide thứ quan hệ di truyền với các chủng trên thế giới. Qua 56 nằm ngay phía trước của ORF1 và giao trình đó hiểu rõ hơn về đặc tính di truyền cũng như tự với ORF1, vùng ORF2 có khả năng mã hóa đột biến dẫn đến ảnh hưởng độc lực của chủng cho một chuỗi peptide mang 343 amino acid và IHHNV và sự tiến hóa trong di truyền của chủng được gọi là non-structural protein 2 (NS2). Cuối IHHNV phân lập trên tôm sú nuôi ở ĐBSCL, để cùng, ORF3 có kích thước khoảng 990 bp cũng tìm ra những kỹ thuật chẩn đoán phù hợp nhằm giao trình tự với ORF2 (56 nucleotide) và có thể phát hiện hiệu quả bệnh này. Đây là một yêu cầu mã hóa cho một chuỗi peptide chứa 329 amino cấp thiết trong nghiên cứu và phòng ngừa bệnh acid. Có ít nhất 4 protein khác nhau được phát do IHHNV cho tôm nuôi cũng như cung cấp hiện từ thể virus IHHN nguyên vẹn và chúng thông tin về đặc tính di truyền của chúng cho nhà có trọng lượng phân tử 74, 47, 39, và 37.5 kDa. quản lý để kiểm soát sự lan rộng của IHHNV trên Trong đó protein có kích thước 47 kDa đã được tôm nuôi ở Việt Nam. xác định là có nguồn gốc từ ORF3. Trong nghiên cứu này, chúng tôi phân lập và Có rất nhiều nghiên cứu về đặc tính di truyền giải trình tự di truyền của chủng IHHNV phân chủng IHHNV nhiễm trên tôm nuôi đã công bố nhiễm trên tôm sú nuôi ở ĐBSCL. Giải trình tự bộ trên thế giới. Chủng IHHNV phân lập từ tôm L. gen IHHNV type lây nhiễm và đoạn gen IHHNV stylirostris nuôi siêu thâm canh tại Hawaii năm type A/B không gây bệnh từ mẫu phân lập trên 1981 đã được phân lập và trình tự bộ gen của tôm nuôi ở ĐBSCL. Đánh giá sự tương đồng về chúng được công bố trên ngân hàng gen (genbank trình tự gen IHHNV type lây nhiễm, type A/B No. AF218226). Sau đó, có rất nhiều nghiên cứu của Việt Nam so với trình tự gen IHHNV của các cho thấy có ít nhất có 4 type IHHNV bao gồm: nước khác đã công bố trên genbank. IHHNV Type 1 có nguồn gốc ở Mỹ và Đông II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Á; IHHNV Type 2 có nguồn gốc từ Đông Nam 2.1. Địa điểm và thời gian thực hiện Á; IHHNV type 3A có nguồn gốc từ Đông Phi, Ấn Độ và Úc có chiều dài 4655 bp nucleotide Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm (Genbank DQ228358.1) (Krabsetsve và ctv., sinh học phân tử thuộc Trung Tâm Quốc Gia 2004; Tang và ctv., 2003); cuối cùng là IHHNV Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trường Và Phòng type 3B với trình tự vật liệu di truyền dài 2935 Ngừa Dịch Bệnh Thủy Sản Khu Vực Nam Bộ, bp (Genbank AY123937) có nguồn gốc ở khu Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II. vực western Indo-Pacific bao gồm Madagascar, 2.2. Phương pháp nghiên cứu Mauritius và Tanzania (Tang và ctv, 2003). Các 2.2.1. Khảo sát, thu mẫu tôm sú và sàng lọc nhà khoa học của Việt Nam đã được giải trình mẫu tôm nhiễm IHHNV tự bộ gen chủng IHHNV phân lập từ mẫu tôm Mẫu tôm sú nuôi ở các tỉnh ĐBSCL ở tất cả ở Cần Thơ, kết quả cho thấy bộ gen IHHNV từ các giai đoạn (tôm post, tôm nuôi thương phẩm mẫu nghiên cứu này có kích thước 3815 bp, có 50 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 1 - THAÙNG 7/2013
  3. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 và tôm bố mẹ) được thu từ cuối tháng 12 năm và 0,5 µl MG831R (50 µM), 0,25 µl Go Taq 2010 đến tháng 11 năm 2011. Tôm sau khi thu Flexi polymerase 5 U/µl (Promega, Mỹ), thêm sẽ được bảo quản trong cồn 95% và chuyển về H20 khử ion cho đủ 48 µl, 2 µl mẫu DNA. Chu phòng thí nghiệm để làm nguồn vật liệu trong kì luân nhiệt cho phản ứng như sau: 1 chu kì nghiên cứu. Do IHHNV có type lây nhiễm và gồm: 94°C trong 5 phút; 30 chu kì gồm: 94°C type A/B không lây nhiễm nên sàng lọc mẫu trong 30 giây, 56°C trong 45 giây, 72°C trong 45 cần sử dụng nhiều cặp mồi khác nhau đã được giây; 1 chu kì: 72°C trong 7 phút, 4°C cho đến nghiên cứu, đặc hiệu cho mỗi type. Dựa vào các khi sử dụng. Quy trình chẩn đoán IHHNV type điều kiện đã tối ưu và chu trình luân nhiệt của lây nhiễm của OIE (2009) với cặp mồi IHHNV các cặp mồi đã được công bố chúng tôi thiết lập 77012F/77353R và IHHNV 309F/R. lại phản ứng PCR với hóa chất hiện có tại phòng Quy trình chẩn đoán IHHNV type lây thí nghiệm. nhiễm với cặp mồi IHHNV 279F/940R của Các mẫu tôm sẽ được ly trích DNA và sàng Saksmerprome và ctv (2010). Các điều kiện phản lọc mẫu tôm có nhiễm IHHNV bằng các quy ứng như sau: tổng thể tích 50 µl hỗn hợp phản ứng trình PCR chẩn đoán IHHNV type A/B của PCR, thành phần cho mỗi phản ứng và chu trình Tang và ctv (2007) với cặp mồi MG831F/R, dựa luân nhiệt cũng giống với quy trình MG 831F/R theo công bố của tác giả chúng tôi sử dụng cặp nhưng sử dụng 0,5 µl cho mỗi mồi IHHNV 279F mồi MG831F và MG831R để thực hiện PCR (50 µM) và IHHNV 940R (50 µM). với các điều kiện phản ứng của quy trình: tổng Các quy trình ở trên được ứng dụng để thể tích 50 µl hỗn hợp phản ứng PCR, thành sàng lọc mẫu nhiễm IHHNV typeA/B trên các phần cho mỗi phản ứng như sau: 10 µl Buffer mẫu tôm sú đã được thu thập ttừ các tỉnh của Flexi 5X, 3 µl MgCl2 (25 mM), 1 µl dNTP (10 ĐBSCL. Phương pháp sàng lọc theo bảng 1. mM) (Promega, Mỹ), 0,5 µl MG831F (50 µM) Bảng 1. Giả định kết quả sàng lọc mẫu nhiễm IHHNV type A/B Kết quả giả IHHNV IHHNV IHHNV IHHNV Chọn mẫu MG831F/R định 77012F/77353R 279F/940R 309F/R ABF/R giải trình tự Mẫu nhiễm IHHNV type (+) (+) (+) (-) (-) √ lây nhiễm Mẫu nhiễm IHHNV type (-) (-) (-) (+) (+) √ A/B Sau phản ứng PCR, chọn những mẫu không đã chọn trên. Ngược lại, các mẫu DNA thỏa nhiễm virus IHHN type lây nhiễm (xác nhận âm điều kiện sàng lọc ở trên sẽ được nhân dòng tính với IHHNV type lây nhiễm bằng phương và giải trình tự. Những mẫu nhiễm IHHNV pháp PCR với với cặp mồi IHHNV 279F/940R type lây nhiễm (xác nhận dương tính với với hoặc IHHNV 77012F/77353R đặc hiệu cho cặp mồi IHHNV 279F/940R hoặc IHHNV virus IHHN gây bệnh). Sau đó sử dụng phương 77012F/77353R) sẽ được chọn đi giải trình tự pháp PCR với cặp mồi MG831F/MG831R để gen cho chủng IHHNV lây nhiễm. xác định sự hiện diện IHHNV type A/B trong 2.2.2. Dòng hóa và giải trình tự những mẫu nghi nhiễm IHHNV type A/B Đối với virus IHHN type A/B TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 1 - THAÙNG 7/2013 51
  4. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 Khuếch đại đoạn DNA IHHNV type A/B Đối với virus IHHN type lây nhiễm trên mẫu tôm bằng phương pháp PCR với cặp Sau khi sàng lọc các mẫu tôm nhiễm mồi IHHNV ABF và IHHNV ABR (Tang và IHHNV bằng các quy trình PCR chẩn đoán ctv., 2001) với enzyme DNA polymerase Pfu IHHNV type lây nhiễm của OIE (2009) với (Invitrogen, Mỹ) để sửa sai trong quá trình tổng cặp mồi IHHNV 77012F/77353R, IHHNV hợp DNA. Sau đó gắn đuôi poly A vào sản phẩm 309F/R cùng quy trình của Saksmerprome và khuếch đại sẽ được nối với vector pGEM T-easy. ctv (2010) với cặp mồi IHHNV 279F/940R và Vector tái tổ hợp pGEM T-easy-IHHNV type A/B khẳng định mẫu tôm không nhiễm virus IHHN được biến nạp vào tế bào vi khuẩn E. coli JM type A/B bằng cặp mồi MG831F/MG831R. 109. Tế bào vi khuẩn mang gen tái tổ hợp được Tiến hành gửi mẫu cho công ty Nam Khoa nhân sinh và tinh sạch bằng Kit Wizard®Plus SV giải trình tự bằng các cặp mồi genome walking Miniprep DNA purification system (Promega, bảng 2. Phân tích giải trình tự các đoạn DNA Mỹ) từ sinh khối nói trên. Vector pGEM T-easy của IHHNV đã tinh sạch trên máy 313xl Ge- chứa đoạn sản phẩm khuếch đại sau đó sẽ được netic Anzyzer với bộ kít BigDye® Terminator ly trích bằng bộ hóa chất SV Winzad miniprep V3.1 Cycle Sequencing. Sau khi giải trình tự, (Promega, Mỹ) và giải trình tự trên cả 2 mạch dùng phần mềm BioEdit nối các trình tự này bằng mồi trên vector pGEM T-easy (thực hiện lại thành bộ gen hoàn chỉnh. giải trình tự tại Cty Nam Khoa). Bảng 2. Trình tự từng cặp mồi để khuếch đại gen IHHNV trong quá trình giải trình tự Kích thước Số thứ tự Tên mồi Trình tự mồi (5’-3’) khuếch đại IHHNV9-5F GCTTCGCAGGAAACCGTTAC 1 691bp IHHNV9-696R GGGTGAGAAGGCTTGGAGAAA IHHNV10-643F AACGCACGAACGAAACTCACT 2 635bp IHHNV10-1297R GGTTTTTCTCTGATGACGAAGGTG IHHNV11-1223F GCGACTGGAAGAGAGTGAGATTG 3 627bp IHHNV11-1870R AGTTGGCTTTGGTTTGACTTTTT IHHNV12-1838F CAACAACAAGAAAAAGTCAAACCA 4 662bp IHHNV12-2520R GGTTGTCTATGATGTCGTCGATTT IHHNV13-2456F CAGCGACGACTTCCTAGGACTC 5 631bp IHHNV13-3107R TGTTGGATTGGGTCTTCATAGTTT IHHNV14-2936F AGACTCTCACATTTACAGACACCCC 6 600bp IHHNV14-3556R GGTAAAAGCTGGATATAATCGGGT IHHNV15-3316F ATGAGAATGTCACCAATCAAAGG 7 495bp IHHNV15-3830R CAGAAACCGTTAACTTAATATGTGA 2.2.3. Phân tích trình tự DNA tương đồng của chủng phân lập được từ ĐBSCL Trình tự DNA của đoạn gen IHHNV type bằng chương trình Clustal W 2.1 của phần mềm A/B và bộ gen IHHNV type lây nhiễm phân lập DNASTAR Lasergene V7.1.0. Để khẳng định trên các tỉnh sẽ được phân tích trên nhiều phần trình tự chủng IHHNV phân lập được sử dụng mềm trên máy tính và trang web, so sánh độ chương trình phân tích, so sánh Basic local 52 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 1 - THAÙNG 7/2013
  5. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 alignment search tool (BLAST) (http://www. thu được trên các ao tôm sú nuôi ở ĐBSCL. ncbi.nlm.nih.gov) và tìm kiếm khung đọc mở mã Hai mẫu tôm được xác định là nhiễm IHHNV hóa protein (ORF) trên bộ gen virus IHHN phân type lây nhiễm ở ao tôm nuôi của hai tỉnh là Sóc lập bằng chương trình (http://www.ncbi.nlm.nih. Trăng và Kiên Giang. Hai mẫu này có ký hiệu gov/gorf/gorf.html). Chương trình mã hóa cho lần lược là ST và KG. Mẫu tôm nhiễm IHHNV trình tự DNA của bộ gen thành amino acid giả type A cũng được xác định trên ao nuôi tôm sú định ExPASy (http://us.expasy.org) được dùng ở Sóc Trăng và có kí hiệu 6419. để phân tích tương đồng trình tự amino acid trên 3.2. Dòng hóa và giải trình tự IHHNV các đoạn ORF đã được mã hóa thành protein. type A/B Xác định các mối quan hệ và tiến hóa di 3.2.1. Xác định mẫu nhiễm IHHNV type A/B truyền giữa các chủng IHHNV phân lập ở Sau khi sàng lọc và kiểm tra, mẫu tôm ĐBSCL thu được trong nghiên cứu này được so nuôi thương phẩm (ký hiệu 6419) ở Trần Đề, sánh với các chủng IHHNV trong khu đã công Sóc Trăng cho kết quả âm tính đối với quy trình bố trên ngân hàng gen thế giới. So sánh trình tự PCR chẩn đoán IHHNV type lây nhiễm hình bộ gen 2 chủng IHHNV phân lập từ tôm sú (P. 3.1A. và cho kết quả dương tính đối với quy monodon) với nhau, hoặc so sánh với các bộ gen trình chẩn đoán IHHNV type A/B của Tang và IHHNV đã công bố trên thế giới (AY124937, ctv (2007) và quy trình PCR với cặp mồi MG DQ228358, AY102034, AY355306, AY355308, 831F/R. Kết quả điện di sản phẩm trên gel AY355307, AY362547, EU675312, GQ411199, agarose 1,5 %, mẫu tôm sú nuôi có ký hiệu 6419 AY362548, EF633688, AY218266). ở Sóc Trăng xuất hiện băng sản phẩm khuếch III. KẾT QUẢ đại có kích thước đặc trưng cho virus IHHN 3.1. Thu mẫu và sàng lọc mẫu type A/B (hình 3.1). Chúng tôi tiến hành sàng lọc các mẫu đã Hình 3.1. Kết quả điện di sàng lọc mẫu phòng thí nghiệm, chúng tôi thấy mẫu (có ký không nhiễm virus IHHN type lây nhiễm với hiệu 6419) ở Sóc Trăng đạt yêu cầu, mẫu này quy trình của 3 cặp mồi IHHNV 309F/309R, được chọn để nhân dòng và giải trình tự. IHHNV 77012F/77353R, IHHNV 279F/940R 3.2.2. Dòng hóa và giải trình tự và kết quả sàng lọc mẫu nhiễm IHHNV type Sử dụng cặp mồi IHHNV ABF/R và A/B với 2 quy trình của 2 cặp mồi MG831F/R, enzyme DNA polymerase Pfu để khuếch đại IHHNV ABF/R; giếng 6419: mẫu nghi nhiễm mẫu kí hiệu 6419. Sau đó gắn đuôi poly A IHHNV type A/B; giếng M: thang DNA 100 bp; vào sản phẩm khuếch đại. Tinh sạch sản phẩm giếng (+): mẫu DNA IHHNV type lây nhiễm; khuếch đại dự đoán từ gel với kích thước 1200 giếng (-): mẫu nước cất. bp. Dòng hóa vào vector pGEM T-easy. Sản Qua kết quả sàng lọc bằng các quy trình phẩm được dòng hóa và nhân lên trong vi khuẩn PCR đã được công bố với hóa chất hiện có tại E. coli JM 109. Sau đó chọn 2 khuẩn lạc tiến TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 1 - THAÙNG 7/2013 53
  6. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 hành phản ứng PCR với quy trình đã sử dụng plasmid pGEM T-easy-IHHNV type A/B sau để khuếch đại DNA ban đầu, nhằm mục đích khi tinh sạch. kiểm tra dòng tế bào E. coli JM 109 chứa vector Theo hình 3.2 plasmid sau khi điện di cho pGEM T-easy-DNA IHHNV type A/B. tín hiệu 1 vạch với kích thước tương đương Tách chiết, thu plasmid tái tổ hợp 4215 bp so với thang DNA 1 kb, đúng với kích pGEM T-easy-IHHNV type A/B từ dòng tế bào thước plasmid pGEM T- easy - IHHNV type E. coli JM 109 đã nhân dòng trên. Điện di kiểm A/B. Vậy chúng tôi đã tạo dòng thành công tra sự hiện diện của plasmid tái tổ hợp pGEM và thu được plasmid pGEM T-easy - IHHNV T-easy - IHHNV type A/B trong dịch tách chiết type A/B tinh sạch. Plasmid vừa thu nhận được trên gel 1%. giải trình tự bằng trên máy 3130xl Gennetic Hình 3.2. Analyzer với bộ kít BigDye®Ternminator v3.1 Kết quả điện di Cycle Sequencing tại công ty Nam Khoa (Việt kiểm tra plasmid Nam). Kết quả phân tích và giải trình tự đoạn 4215 bp sau khi tinh sạch. gen của chủng IHHNV type A/B trên tôm sú M: thang DNA 1 nuôi ở ĐBSCL (hình 3.3) kb; giếng 1: dịch Hình 3.3. Trình tự nucleotide một phần gen 3.3. Giải trình tự và phân tích bộ gen IHHNV type A từ mẫu phân lập ở ĐBSCL/Việt IHHNV Nam Mẫu tôm sau khi sàng lọc bằng PCR với Sau khi giải trình tự, chúng tôi đem phân các cặp mồi đã công bố (OIE, 2009; Tang và tích và đối chiếu trình tự gen IHHNV type ctv., 2007) để khẳng định mẫu tôm nhiễm A/B vừa thu nhận với trình tự của IHHNV đã IHNNV. Mẫu tôm sẽ được ly trích DNA tổng được công bố trên ngân hàng gen bằng chương số và được gửi cho công ty Nam Khoa giải trình trình NCBI BLAST. Kết quả phân tích cho tự bằng các cặp mồi genome walking. Phân tích thấy trình tự vừa thu nhận được là của chủng giải trình tự các đoạn DNA của IHHNV đã tinh IHHNV type A. sạch trên máy 313xl Genetic Anzyzer với bộ kít 54 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 1 - THAÙNG 7/2013
  7. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 BigDye® Terminator V3.1 Cycle Sequencing. AF218266 (hình 3.4 và hình 3.5). Cấu trúc Sau khi giải trình tự dùng phần mềm BioEdit của bộ gen phân lập trên chủng IHHNV có nối các trình tự này lại thành bộ gen hoàn chỉnh. kí hiệu ST là A (36,27%), G (19,35%), T Sử dụng phần mềm DNASTAR Lasergene (20,55%), C (23,82%) và A+T (56,83 V7.1.0, với chương trình phân tích đa trình tự %), C+G (43,17%) và chủng IHHNV có MegaAli (Clustalw). Kết quả phân tích trình kí hiệu KG là A (36,17%), G (19,06%), T tự DNA trên mẫu IHHNV kí hiệu ST, KG (20,87%), C (23,90%) và A+T (57,03 %), và chủng IHHNV phân lập Hawaii genbank C+G (42,97%). Hình 3.4. Kết quả phân tích so sánh trình tự các chủng IHHNV phân lập tại các tỉnh ở ĐBSCL Hình 3.5. Cây di truyền so sách với nhau khoảng 96.3%, và tương đồng cao so với chủng giữa các chủng IHHNV phân lập tại các tỉnh ở IHHNV phân lập ở Hawaii trên 98.8%. Khi ĐBSCL và chủng IHHNV phân lập ở Hawaii phân tích bộ gen của chủng IHHNV phân lập So sánh trình tự 2 bộ gen của chủng có kí hiệu KG, ST cho thấy bộ gen của 2 chủng IHHNV phân lập trên ĐBSCL với trình tự bộ này có rất nhiều nucleotide ở các vị trí trên bộ gen IHHNV phân lập tại Hawaii (AF28266), hai gen có sự khác biệt so với chủng IHHNV phân chủng virus IHHN phân lập ở ĐBSCL đều mất lập ở Hawaii. Kích thước và trình tự sắp xếp một đoạn 79 nucleotide so với bộ gen IHHNV vị trí nucleotide của chủng IHHNV phân lập phân lập ở Hawaii từ vị trí đầu tiên 1-78 từ 2 chủng ở ĐBSCL cho thấy tương đồng rất nuclotide. Tuy nhiên, sự thay đổi này không ảnh cao với các chủng phân lập ở các khu vực khác hưởng đến quá trình mã hóa đến chuỗi amino trên thế giới. Rõ nhất là trình tự nucleotide của acid ở các chủng phân lập ở ĐBSCL. Kết quả ORF1 mã hóa cho protein giả định NS1 chiếm phân tích cho thấy chủng virus IHHN phân lập rất lớn trong 3 đoạn đọc mở ORF, chiếm khoảng có kí hiệu KG với chủng có kí hiệu ST thì trình 50% bộ gen của virus với kích thước khoảng tự tương đồng chủng có độ tương đồng thấp 2001 bp đối với chủng các phân lập được trên thế giới. TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 1 - THAÙNG 7/2013 55
  8. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 Bảng 2: Trình tự tương đồng nucleotide trên bộ gen của các chủng phân lập ở ĐBSCL với một số chủng ở các nước khác trên thế giới. Phân tích trình tự bộ gen của hai chủng phân mối quan hệ di truyền của IHHNV type A phân lập được cho thấy, chủng IHHNV có kí hiệu ST lập ở tôm sú nuôi ở ĐBSCL với trình tự IHHNV có độ tương độ rất cao 99.4% và rất gần với type lây nhiễm và type A/B ở các khu vực như chủng phân lập ở Đài Loan A (AY355306), Đài type lây nhiễm của Ecuador (AY362548), Thái Lan Loan B (AY355306) và Thái Lan (AY102034) (AY362547), Phúc Kiến-Trung Quốc (EF633688), lên trên 99.3%. Đối với chủng IHHNV kí hiệu type B của Tanzania (AY124937) và type A của Úc, KG, mặc dù trình tự bộ gen của chủng này Madagascar (DQ228358). Sau khi so sánh trình không tương đồng cao với các chủng phân lập tự IHHNV type A được phân lập từ ĐBSCL với có kí hiệu ST (96,2%), nhưng khi đó so sánh trình tự IHHNV của các nước: Ecuador, Thái trình tự của chủng này với các chủng khác trên Lan, Phúc Kiến-Trung Quốc, Tanzania và Úc, thế giới (bảng 2 và hình 3.7) thì chủng này có Madagascar cho thấy trình tự IHHNV type A trình tự nucleotide tương đồng cao so với chủng của Việt Nam có sự tương đồng khá cao so với phân lập ở Hawaii AF218266 (98,8%), Đài trình tự gen IHHNV type A ở Úc, Madagascar Loan C AY355308 (98,7%), Mexico AY273215 (DQ228358) do Tang và ctv công bố (2006). Độ (98,6%), và Trung Quốc EF633688 (98,6%). Vì tương đồng cao nhất với trình tự IHHNV type A vậy, chủng IHHNV lây nhiễm phân lập có kí của Việt Nam là 100% với chủng IHHNV type hiệu KG có quan hệ gần với chủng IHHNV phân A phân lập ở Úc. Sự tương đồng cao này có thể lập ở Hawaii và Đài Loan C và xa với chủng do IHHNV type A của Việt Nam có nguồn gốc IHHNV Úc 86,1% (EU675312), Tanzania từ Úc, Châu phi (Madagascar) vì tôm bố mẹ của AY124937 (91,7%), Ấn Độ GQ411199 (93,5%) Việt Nam được nhập từ nhiều nước trong đó có và Úc GQ475529 (94,3%). Úc và Châu Phi. Trái lại thì trình tự IHHNV type IV. THẢO LUẬN A của Việt Nam có độ tương đồng thấp với trình tự IHHNV type B của Tanzania AY124937 chỉ Trình tự gen IHHNV type A/B nhiễm trên 86%. Ngoài ra chúng tôi thiết lập cây di truyền so tôm sú nuôi đã được nhiều nhà nghiên cứu phân sánh trình tự IHHNV type A tại Việt nam với các tích và giải trình tự (Tang và ctv., 2006). Trên khu vực trên ngân hàng gen như hình 3.6. cơ sở đó chúng tôi tiến hành so sánh trình tự và 56 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 1 - THAÙNG 7/2013
  9. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 Hình 3.6. Kết quả cây di truyền IHHNV type trong việc chẩn đoán IHHNV. Khuyến cáo các A từ mẫu phân lập ở ĐBSCL/VN với các chủng trung tâm, các phòng thí nghiệm nghiên cứu và ở Ecuador (AY362548), Thái Lan (AY362547), chẩn đoán IHHNV tại Việt Nam cần cẩn trọng Phúc Kiến-Trung Quốc (EF633688), Tanzania khi xét nghiệm loại virus này, để tránh hiện (AY124937), Úc, Madagascar (DQ228358) tượng dương tính giả với chủng virus chèn vào Việc xác định được sự hiện diện của genome của tôm, vì chủng virus này không có IHHNV type A ở Việt Nam, có ý nghĩa to lớn gây bệnh trên tôm (Tang và Lightner, 2006). Hình 3.7. Cây di truyền so sách giữa các trên thế giới đã được công bố. Nhiều trình tự của chủng IHHNV phân lập tại các tỉnh ở ĐBSCL với các chủng phân lập có kích thước mức độ tương các chủng IHHNV trên ngân hàng gee thế giới đồng của các chủng rất khác nhau. Các chủng bằng phần mềm DNASTAR Lasergene V7.1.0 virus của từng khu vực rất đa dạng, biến đổi theo Phân tích trình tự virus IHHN type lây thời gian và vị trí địa lý khác nhau (Rai và ctv., nhiễm nhiễm trên tôm ở các khu vực khác nhau 2013). Cấu trúc và trình tự của genome IHHNV TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 1 - THAÙNG 7/2013 57
  10. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 kí hiệu ST so với các chủng IHHNV phân lập tương đương với trình tự amino aicd, tương đồng ở Thái Lan và Đài Loan có độ tương đồng cao cao nhất với chủng ở Hawaii (98,8%), Đài Loan lên đến 99,3%. Tuy nhiên chủng IHHNV có kí A, C và Ecuador (98,5%). Mặc dù tỷ lệ nucleotide KG có trình tự lại tương đồng cao với chủng của chủng Ấn Độ và chủng này có tỷ lệ trung bình IHHNV phân lập ở Hawaii trên 98%, so với cao (96,3%), nhưng trình tự amino acid tương chủng IHHNV Mexico, Đài Loan C và Ecuador đồng rất thấp (91,3%), ngược lại chủng IHHNV trên 95%. Theo các nghiên cứu trước, Rai và ctv phân lập tại Úc có trình tự nucleotide tương đồng (2011), hầu hết các chủng IHHNV lây nhiễm thấp (94,8%) có trình tự amino acid cao (95,9%). đều có 3 khung đọc mở mã hóa cho protein ORF Kết quả này cho thấy, chủng này có sự khác biệt (open reading frame): ORF1 mã hóa cho protein về độc lực do sự biến đổi các trình tự nucleotide giả định 1 (NS1) có kích thước khoảng 2001 bp, dẫn đến sự khác biệt về sự mã hóa amino acid đoạn ORF2 mã hóa cho protein giả định (NS2) trong cấu trúc của virus. Đặc biệt, sự khác biệt có kích thước khoảng 1092 bp và ORF3 mã hóa rõ rệt là vị trí đọc mở ORF1 giữa 2 chủng phân cho protein vỏ virus (VP) có kích thước khoảng lập trên tôm sú ở ĐBSCL, ở chủng kí hiệu KG 990 bp. Ở chủng IHHNV có kí hiệu ST và KG đoạn OFR1 mã hóa amino acid (ATG) ở vị trí đều có 3 vùng đọc mở mã hóa protein (OFR1, 514 nt của gen và đoạn OFR1 mã hóa amino acid OFR2 và OFR3). ORF1 ở vị trí 570-2570 có kích (ATG) ở vị trí 570 nt đối với chủng kí hiệu ST. thước là 2001 bp mã hóa cho protein NS1, vùng Nếu đột biến nhiều sẽ dẫn đế sự thay đổi tổng hợp mã hóa cho protein NS2 là ORF2 ở vị trí 514- các amino acid và dẫn đến hiện tượng đột biến 1605 nucleotide có kích thước là 1092 bp, và mã chủng và tính độc lực sẽ biến đổi theo (Tang và hóa cho protein vỏ là ORF3 có vị trí là 2512-501 Lightner., 2002). Vì vậy sự khác biệt này có thể nucleotide có kích thước là 990 bp. So sánh trình dẫn đến độc lực và sự lây nhiễm của hai chủng tự của đoạn ORF1 của chủng kí hiệu KG với IHHNV có kí hiệu ST và KG khác nhau. Khi so các chủng khác thì độ tương đồng cao nhất với sánh trình tự bộ gen chủng IHHNV kí hiệu KG chủng IHHNV ở Hawaii, Đài Loan A, Đài Loan với các chủng IHHNV khác trên thế giới cho thấy C và Ecuador (99,5%), tỷ lệ tương đồng thấp hơn độ tương đồng cao nhất đối với chủng phân lập đối với chủng IHHNV của Madagasca (87,2%), ở Hawaii, Mỹ (AF28266) lên đến 98,8 %, kế đến Tanzania (92,3%) và Úc (GQ411199, 94,8%), tỷ là chủng phân lập Mexico (AF273215), Trung lệ tương đồng so với chủng IHHNV phân lập tại Quốc (EF633688) là 98,6% và xa với chủng Úc ĐBSCL và Ấn Độ (≥ 96,3%). Kết quả này cũng type A (86,1%), Tanzania type A là 91,7%. Bảng 3: So sánh trình tự nucleotide của đoạn mã hóa cho protein của virus IHHN phân lập tại ĐBSCL với các chủng trên thế giới 58 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 1 - THAÙNG 7/2013
  11. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 Chủng virus IHHN phân lập có kí hiệu phân lập có kí hiệu ST có độ tương đồng rất ST, kích thước khoảng 3824 bp. Chủng này cao lên đến 99,7% và có họ hàng gần với chủng tương đồng rất cao, với A+T của toàn bộ gen IHHNV phân lập ở Đài Loan A, B và Thái Lan. là 56,82% tương tự như virus IHHN phân lập Chủng IHHNV phân lập có kí hiệu KG có trình Thái Lan (AY102034) 56,9 %. Chủng IHHNV tự và họ hàng gần với chủng ở Hawaii, Mexico, phân lập có kí hiệu ST có trình tự tương Đài Loan C và Ecuador, độ tương đồng bộ đồng rất cao với chủng IHHNV của Thái Lan gen trên 95%.Trong nghiên cứu này đã khẳng (AY102034), Đài Loan A (AY355306). Chủng định được sự hiện diện IHHNV type A gắn vào IHHNV phân lập có kí hiệu ST có trình tự genome tôm sú và sự hiện diện IHHNV type ORF1 tương đồng rất cao với chủng IHHNV lây nhiễm (1 và 2) trên tôm sú nuôi ở ĐBSCL. của Thái Lan (AY102034) 99,8%, Đài Loan B Trình tự genome của hai chủng IHHNV phân (AY355307) 99,8% và chủng IHHNV phân lập lập ở ĐBSCL có kí hiệu ST và KG đã được đăng ở Kiên Giang có kí hiệu KG 96,5%. ORF1 của kí trên ngân hàng gen với mã số KC513422 và chủng này mã hóa cho protein giả định NS1 JX84006. có vị trí là (570-2570 nucleotide), chiều dài đoạn protein khoảng 666 amino acid với mã TÀI LIỆU THAM KHẢO khởi động ATG ở vị trí 570 nucleotide của bộ Bonami JR, Trumper B, Mari J, Brehelin M, Lightner gen và mã kết thúc TAA ở vị trí 2570, có trọng DV, 1990. Purification and characterization of lượng phân tử là 75,8 kDa. Đoạn ORF2 có vị the infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus of penaeid shrimps. J Gen Virol 71, trí (514-1605 nt) mã hóa cho protein NS2 với 2657-2664. khoảng 363 amino acid có trọng lượng phân Flegel TW, 2006. Detection of major penaeid shrimp tử 42,1 kDa, trình tự của vùng mã hóa này viruses in Asia, a historical perspective with cũng tương đồng rất cao với các chủng Thái emphasis on Thailand. Aquaculture 258, 1-33. Lan 2000, Đài Loan B (99,9%). ORF3 mã hóa Krabsetsve K, Cullen BR, Owens L, 2004. Rediscovery protein vỏ của virus có vị trí trên bộ gen (2512- of the Australian strain of infectious hypodermal 3501 nucleotide) với chiều dài là 990 bp mã and haematopoietic necrosis virus. Dis. Aquat. Organ 61, 153-158. hóa cho protein này 329 amino acid. Trình tự Lightner DV, Redman RM, and Bell TA, 1983. tương đồng của đoạn ORF3 so với các chủng Infectious hypodermal and hematopoietic trên thế giới Đài Loan B, Thái Lan (99,5%). necrosis, a newly recognized virus disease of Kết quả trên cho thấy chủng phân lập IHHNV penaeid shrimp. J. Invertebr. Pathol. 42, 62-70. kí hiệu TG và chủng phân lập ST có thể là Nunan L, Poulos BT, Lightner DV, 2000. Use of cùng 1 chủng và chủng này có họ hàng gần với polymerase chain reaction for the detection of chủng phân lập ở Đài Loan B, Thái Lan 2000. infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus in penaeid shrimp. Mar. Biotechnol. 2 (4), V. KẾT LUẬN 319-328. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã xác định OIE, 2009. Diagnostic Manual for Aquatic Animal chủng virus IHHN type A hiện diện ở Việt Nam, Diseases 6th Edition. Office International des Epizooties (OIE), Paris. Chapter 2.2.2. Infectious trình tự chủng phân lập khi phân tích một đoạn Hypodermal and Hematopoietic Necrosis, pp. 78- gen cho thấy chủng này có độ tương đồng rất 95. cao với chủng IHHNV type A ở Madagascar và Phạm Đặng Thiên An, Phạm Văn Hùng, Hoàng Hiếu Úc (100%). Phân lập được 2 bộ gen của chủng Ngọc, Phạm Hùng Vân, 2009. Giải trình tự bộ gen IHHNV type lây nhiễm trên tôm sú nuôi ở các infectious hypodermal and hematopoietic necrosis tỉnh ở ĐBSCL và thành công trong việc giải virus gây bệnh hoại tử trên tôm. Y học thành phố Hồ Chí Minh, 13 (2), 129-137. hoàn toàn trình tự bộ gen của các chủng virus Rai P,  Safeena M.P, Karunasagar I, Karunasagar I, này. Phân tích trình tự cho thấy chủng IHHNV TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 1 - THAÙNG 7/2013 59
  12. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 2011. Complete nucleic acid sequence of Penaeus parvovirus (HPV) of Penaeus monodon. Virology stylirostris densovirus (PstDNV) from India. 346, 266 - 277. Virus Research 158, 37-45. Tang KFJ and Lightner DV, 2002. Low sequence Rai P, Safeena MP, Karunasagar I, Karunasagar I, 2009. variation among isolates of infectious hypodermal Simultaneous presence of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) originating from Hawaii and the Americas. Dis and Type A virus-related sequence in Penaeus Aquat Org 49, 93-97. monodon from India. Aquaculture, 295, 168-174. Tang KFJ and Lightner DV, 2006. Infectious Rai P, Pradeep B, Safeena MP., Krabsetsve K, La hypodermal and hernatopoietic necrosis virus Fauce K, Owens L and Karunasagar I, 2013. (IHHNV)-related sequences in the genome of the Genomics, molecular epidemiology and black tiger prawn Penaeus monodon from Africa diagnostics of infectious hypodermal and and Australia. Virus Research, 118, 185-191. hematopoietic necrosis virus. Indian Journal of Tang KFJ, Navarro SA and Lightner DV, 2007. A Virology, 23 (2), pp. 203-214. PCR assay for discriminating between infectious Saksmerprome V, Puiprom O, Noonin C, Flegel TW, hypodermal and hematopoietic necrosis virus 2010. Detection of infectious hypodermal and (IHHNV) and the virus-related sequences in the haematopoietic necrosis virus (IHHNV) in farmed genome of Penaeus monodon. Dis. Aquat. Org. Australian Penaeus monodon by PCR analysis 74, 165-170. and DNA sequencing. Aquaculture 298, 190-193. Tang KFJ, Poulos BT, Wang J, Redman RM, Shih HH, Shike H, Dhar AK, Burns JC, Shimizu C, Jousset Lightner DV, 2003. Geographic variations among FX, Klimpel KR, Bergoin M, 2000. Infectious infectious hypodermal and hematopoietic necrosis hypodermal and hematopoietic necrosis virus of virus (IHHNV) isolates and characteristics of their shrimp is related to mosquito brevidensoviruses. infection. Dis. Aquat. Organ. 53, 91-99. Virology 277, 167-177. Website: Sukhumsirichart W, Attasart P, Boonsaeng V, Panyim http://www.ncbi.nlm.nih.gov S., 2006. Complete nucleotide sequence and http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html genomic organization of hepatopancreatic http://us.expasy.org SEQUENCE AND CHARACTERISTIC OF INFECTIOUS HYPODERMAL AND HEMATOPOIETIC NECROSIS VIRUS (IHHNV) ISOLATED FROM THE CULTURED BLACK TIGER SHRIMP (Peneaus monondon) IN MEKONG DELTA Cao Thanh Trung1, Nguyen Thị Kim My2 and Pham Hung Van3 ABSTRACT Genetic IHHNV genome of variants has been charateristed in different geographical areas in the word. In this study, analyzing and sequencing of IHHNV were isolated in the black tiger shrim in Mekong Delta. The type A IHHNV-related sequence has been detected in cultured P. monodon in Mekong Delta. An amplified 1200 fragment of type A IHHNV-related sequence is highest identity with type A IHHNV-related sequence isolated shrimp from Australia and Madagasca (100%). For type IHHNV infection, the infectious IHHNV strain isolated from the shrimps in Kieng Giang province was designated IHHNV-KG and the strain isolated from postlarve shrimp in the Soc Trang was designated IHHNV-TS. Used overlapping PCR primers to amplify all of the IHHNV genome 60 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 1 - THAÙNG 7/2013
  13. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 from the Mekong Delta samples to sequence were analized. Comparison of IHHNV-KG sequence with GenBank records of IHHNV isolates. Comparing the 2 genomes of IHHNV infected in P. monodon in Mekong Delta with the genome of IHHNV of Hawaii that were lost a 79 nucleotides. However, it did not impact to open reading frame (ORFs) coding protein of virus. The IHHNV-KG strain was found that it had more 95% identity to sequences of infectious IHHNV from American, Mexico, Taiwan C and Ecuador. Other infectious IHHNV-ST, it had a low similar sequence with IHHNV-KG, but it had a high sequence identity with the infectious IHHNV from Taiwan A, B and Thailand. The size genome of two IHHNV strains isolated from Mekong Delta is 3825 bp. In this study, the IHHNV-related sequence and infectious IHHNV were detected in the cultured P. mon- odon in Mekong Delta. Key words: Mekong Delta, Peneus monodon, Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) Người phản biện: ThS. Nguyễn Thị Hiền Ngày nhận bài: 6/6/2013 Ngày thông qua phản biện: 6/7/2013 Ngày duyệt đăng: 8/7/2013 1 Southern Monitoring Center for Aquaculture Environment & Epidemic - Research Institute for Aquaculture No.2 Email: thanhtrung77@yahoo.com 2 Faculty of Biology – Ho Chi Minh city University of Science, 227 Nguyen Van Cu st, District 5, Ho Chi Minh City, Vietnam 3 Nam khoa Biotech Company, 793/58 Tran Xuan Soan st - Tân Hưng ward, distric 7, Ho Chi Minh City, Vietnam TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 1 - THAÙNG 7/2013 61
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

THÔNG TIN
TRỢ GIÚP
HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG
Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.

 

Đồng bộ tài khoản
3=>0