Đánh giá giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của các phương pháp định tính, định lượng biến đổi gen

Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 10(83)/2017<br /> <br /> Sequencing, evaluating the similarity between the transformed sequences<br /> and the designed expression sequence of ZmDREB2A in maize<br /> Doan Thi Bich Thao, Nguyen Xuan Thang, Le Cong Luc,<br /> Nguyen Thi Thu Hoai, Ta Thi Thuy Dung, Le Cong Tung,<br /> Bui Manh Cuong, Nong Van Hai<br /> Abstract<br /> ZmDREB2A is a transcription factor belonging to AP2/ERF transcription factor family isolated from maize. Previous<br /> studies pointed out that ZmDREB2A have ability to activate many genes related to the abiotic stress signaling<br /> pathway. In this study, the expression structure Ubi :: ZmDREB2A-S :: 35S in two lines of maize (K3 and K7) and the<br /> accuracy were identified. To achieve that goal, PCR and DNA sequencing of the Ubiquitin promoter, ZmDREB2A<br /> sequence and 35S terminator was used. Results showed that the similarity between the transformed sequences and<br /> the expression sequence in the vector was higher than 98%. It indicated that the expression of the transformation<br /> structure in transformed maize can occur normally.<br /> Keywords: Maize, gene ZmDREB2A, Agrobacterium tumefaciens, drought tolerance<br /> Ngày nhận bài: 30/8/2017 Người phản biện: TS. Huỳnh Thị Huệ<br /> Ngày phản biện: 9/9/2017 Ngày duyệt đăng: 11/10/2017<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> ĐÁNH GIÁ GIỚI HẠN PHÁT HIỆN, GIỚI HẠN ĐỊNH LƯỢNG<br /> CỦA CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG BIẾN ĐỔI GEN<br /> Lưu Minh Cúc1<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Nghiên cứu đã khảo sát các nền mẫu hạt, thức ăn chăn nuôi và thực phẩm có chứa ngô và đậu tương với hai<br /> phương pháp định tính, định lượng biến đổi gen trên ngô (NK603) và đậu tương (GTS40-3-2) với các nồng độ 1%;<br /> 0,1%; 0,04%; 0,02%; 0,01% bằng Real time PCR. Qua đó, đã chứng minh được với dãy nồng độ đã sử dụng, giới<br /> phát hiện và giới hạn định lượng đối với các nền mẫu chứa đậu tương và ngô đã được xác định: Giới hạn phát hiện:<br /> LODđậu tương: 0,04%; LODngô: 0,04%; Giới hạn định lượng: LOQđậu tương: 0,1%; LOQngô: 0,1%. Cách xác định giới hạn<br /> phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) là phương pháp chuẩn có thể áp dụng ở tất cả các phòng thí nghiệm<br /> về phân tích GMO.<br /> Từ khóa: Sinh vật biến đổi gen (GMO), đậu tương, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, ngô<br /> <br /> I. ĐẶT VẤN ĐỀ Các quyết định của cơ quan quản lý về việc có cấp<br /> Hiện nay, đã có 495 sự kiện chuyển gen được phê phép hay không đối với một số hoạt động liên quan<br /> chuẩn, tập trung chủ yếu vào một số cây trồng chính đến sinh vật biến đổi gen được dựa trên quy trình<br /> như ngô (231 sự kiện); bông (59 sự kiện); khoai tây phân tích nguy cơ nghiêm ngặt, trong đó tập trung<br /> (47 sự kiện); cải dầu (40 sự kiện); đậu tương (36 sự vào các bằng chứng khoa học và tư vấn sâu rộng<br /> kiện) và các cây trồng khác. Các nước sử dụng sản của các chuyên gia (Phạm Văn Toản và Nguyễn Thị<br /> phẩm biến đổi gen làm thực phẩm và thức ăn chăn Thanh Thủy, 2015). Các bằng chứng khoa học trên<br /> nuôi cũng tăng lên đến 40 nước, trong đó có cả Cộng thế giới đã chứng minh về tính an toàn của các sản<br /> đồng Châu Âu (EU), tính là một nước (ISAAA, phẩm được tạo ra từ các loại cây trồng biến đổi gen<br /> 2017). Việt Nam đã cấp phép 21 sự kiện ngô, đậu (ISAAA, 2016). Thực phẩm có nguồn gốc từ sinh vật<br /> tương biến đổi gen sử dụng làm thực phẩm và thức và sản phẩm biến đổi gen trải qua nhiều thử nghiệm<br /> ăn chăn nuôi. Đây là một bước tiến quan trọng trong hơn bất cứ thực phẩm nào trong lịch sử.<br /> khâu quản lý để đảm bảo an ninh lương thực trong Đối với Việt Nam, việc phát hiện biến đổi gen<br /> nước và quyền lợi người tiêu dùng khi các thông trong các sản phẩm thực phẩm và thực hiện dán<br /> tin về sản phẩm trở nên minh bạch, công khai hơn. nhãn không liên quan đến an toàn thực phẩm mà<br /> <br /> 1<br /> Viện Di truyền Nông nghiệp<br /> <br /> 37<br /> Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 10(83)/2017<br /> <br /> chính là để đảm bảo quyền lựa chọn của người tiêu II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> dùng. Trong quá trình xây dựng phương pháp định 2.1. Vật liệu nghiên cứu<br /> tính, định lượng biến đổi gen (Genetically Modified<br /> - Vật liệu tham chiếu chuẩn chứng nhận (Certified<br /> Organisms - GMO) trong các sản phẩm nông sản,<br /> Reference Materials - CRM): BF410 (Đậu tương<br /> thực phẩm, việc xác định giới hạn phát hiện (Limit<br /> GTS 4032 - 5%), BF415 (Ngô NK603 -5%).<br /> of detection - LOD), giới hạn định lượng (Limit of<br /> quantification - LOQ) là bước quan trọng nhất để - Các nền mẫu: Bột: Hạt ngô (giống ĐL20), hạt<br /> khẳng định năng lực của phòng thử nghiệm. Chính đậu tương (giống DT84); Thức ăn chăn nuôi: trộn<br /> vì thế, nghiên cứu này được tiến hành nhằm tìm ra (thành phần từ ngô ĐL20 và đậu tương DT84); Thực<br /> LOD, LOQ của phương pháp định tính, định lượng phẩm dạng lỏng: sữa đậu nành (làm từ đậu tương<br /> DT84 của công ty Green life); Thực phẩm chế biến:<br /> biến đổi gen có nguồn gốc từ ngô và đậu tương. Qua<br /> snack vị caramen.<br /> đó khẳng định độ tin cậy, chính xác về mặt kỹ thuật<br /> của các phòng thí nghiệm hoạt động theo tiêu chuẩn - Các hóa chất tách chiết ADN, Real Time PCR<br /> quốc tế ISO/IEC 17025 theo tiêu chí toàn cầu hóa và các vật tư, hóa chất khác.<br /> “Một tiêu chuẩn - một lần thử nghiệm - được chấp - Các mồi và mẫu dò sử dụng cho PCR được nêu<br /> nhận ở mọi nơi”. trong bảng 1.<br /> <br /> Bảng 1. Trình tự các mồi và mẫu dò sử dụng<br /> Tên gen/sự kiện Trình tự nucleotide theo chiều 5’ - 3’<br /> <br /> Mồi xuôi: TTCATTCAAAATAAGATCATACATACAGGTT<br /> Đậu tương GTS4032 Mồi ngược: GGCATTTGTAGGAGCCACCTT<br /> Mẫu dò: FAM-CCTTTTCCATTTGGG-MGBNFQ<br /> Mồi xuôi: ATGAATGACCTCGAGTAAGCTTGTTAA<br /> Ngô NK603 Mồi ngược: AAGAGATAACAGGATCCACTCAAACACT<br /> Mẫu dò: FAM-TGGTACCACGCGACACACTTCCACTC-TAMRA<br /> Mồi xuôi: CCAGCTTCGCCGCTTCCTTC<br /> Gen định loài đậu tương: Lectin Mồi ngược: GAAGGCAAGCCCATCTGCAAGCC<br /> Mẫu dò: FAM -CTTCACCTTCTATGCCCCTGACAC-TAMRA<br /> Mồi xuôi: CCTTCTTGGCGGCTTATCTG<br /> Gen định loài ngô: Adh Mồi ngược: CCAGCCTCATGGCCAAAG<br /> Mẫu dò: FAM -CTTAGGGGCAGACTCCCGTGTTCCCT- TAMRA<br /> <br /> 2.2. Phương pháp nghiên cứu quang phát ra trong suốt quá trình PCR. Mẫu dò đặc<br /> - Phương pháp xử lý mẫu hạt ngô, đậu tương hiệu cho vùng gene mục tiêu cùng với phân tử phát<br /> nghiền thành bột mịn; mẫu sữa đậu nành ly tâm, lấy huỳnh quang (reporter) và phân tử thu hút huỳnh<br /> phần lắng xuống làm mẫu phân tích; mẫu snack vị quang (quencher) được gắn cộng hóa trị ở 2 đầu. Khi<br /> caramen được rửa nhẹ dưới vòi nước chảy, sấy khô mẫu dò vẫn còn nguyên vẹn, tín hiệu huỳnh quang<br /> phát ra bởi reporter sẽ bị quencher thu hút. Khi phản<br /> ở 700 C trong 2 giờ, nghiền thành dạng bột mịn;<br /> ứng PCR xảy ra, mẫu dò bắt cặp với vùng gene mục<br /> mẫu thức ăn chăn nuôi được nghiền thành dạng bột<br /> tiêu nằm giữa 2 mồi và bị phân cắt bởi hoạt tính<br /> mịn. Tách DNA bằng bộ kit Wizard Promega: theo<br /> 5’ - 3’ exonuclease của Taq DNA polymerase. Lúc này,<br /> hướng dẫn của nhà sản xuất (Wizard® ADN Clean-<br /> phân tử reporter và quencher được tách nhau ra và<br /> Up System). tín hiệu huỳnh quang thu được từ reporter trở nên<br /> - Phương pháp Real time PCR (Polymerase chain mạnh hơn. Sự gia tăng tín hiệu này mạnh hơn sau<br /> reaction - PCR): Với việc sử dụng mẫu dò đánh mỗi chu kỳ và tương ứng với lượng sản phẩm PCR<br /> dấu huỳnh quang màu FAM (mẫu dò) đặc hiệu cho được tạo ra. Để định lượng được số% GMO trong<br /> đoạn gene được nhân bản, sự gia tăng số lượng sản mẫu phân tích, cần phải có gen tham chiếu chuẩn<br /> phẩm PCR có thể được theo dõi theo thời gian thực theo loài, từ đó thông qua Real time PCR mới xác<br /> (real-time) bằng cách đo mật độ tín hiệu huỳnh định được số% GMO bằng cách so sánh tỉ lệ giữa<br /> <br /> 38<br />  Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 10(83)/2017<br /> <br /> gen chuyển GMO và gen tham chiếu theo loài thông Trong đó: X là hệ số pha loãng thực tế (lượng chất<br /> qua Chu kỳ ngưỡng (cycle threshold - Ct): là số chu chuẩn biến đổi gen được pha loãng để bù đắp sự khác<br /> kỳ PCR mà ở đó tín hiệu đặc hiệu vượt khỏi tín hiệu biệt về nồng độ); A: Nồng độ DNA của mẫu chứng<br /> nền. Đây là nguyên lý cơ bản của real-time PCR và dương (ng/ μl); B: Nồng độ DNA của mẫu âm tính<br /> là yếu tố quyết định tính chính xác và lặp lại của kết (ng/ μl); Y: Hệ số pha loãng lý thuyết.<br /> quả. Số trình tự mục tiêu trong mẫu ban đầu càng - Cách tính LOD: Thực hiện phản ứng lặp lại ít<br /> cao thì số chu kỳ cần để vượt ngưỡng phát hiện càng nhất 10 lần ở nồng độ thấp của DNA mục tiêu là 1,<br /> nhỏ, nghĩa là giá trị Ct càng thấp. 0,1; 0,04; 0,02; 0,01, 0%. LOD tương đối (%) là nồng<br /> độ thấp nhất của dãy pha loãng mà các lần lặp đều<br /> Chương trình Realtime PCR như sau: Khử nhiễm cho kết quả dương tính.<br /> 120 giây ở 500C; Quá trình lặp lại 45 chu kỳ bắt đầu<br /> - Cách tính LOQ: Thực hiện phản ứng lặp lại ít<br /> từ biến tính 600 giây ở 950C; bắt cặp và kéo dài 60<br /> nhất 10 lần ở nồng độ thấp của DNA mục tiêu là 1,<br /> giây ở 600C đồng thời ghi nhận tín hiệu Realtime 0,1; 0,04; 0,02; 0,01, 0% đối với gen đích và gen tham<br /> (Method Verification, 2011). chiếu. LOQ là nồng độ thấp nhất của dãy pha loãng<br /> - Phương pháp thêm chuẩn: sử dụng hệ số pha mà tại đó độ lệch chuẩn tương đối tái lặp nội bộ lại<br /> loãng cho 2 dung dịch DNA, được tính toán theo (RSDR) của giá trị đo được < 25% giá trị chuẩn thêm<br /> công thức sau: vào (Trapman et al., 2009).<br /> X = (A/B) ˟ (Y – 1) + 1 RSDR được tính theo công thức sau:<br /> <br /> Khác biệt Độ lệch chuẩn<br /> Trung bình Khác biệt Độ lệch chuẩn<br /> tuyệt đối giữa tương đối của các<br /> 2 kết quả phân tích tương đối tái lặp nội bộ<br /> 2 kết quả phân tích tái lặp nội bộ<br /> độc lập radi (%) SR (%)<br /> độc lập di RSDR (%)<br /> ci,1 + ci,2 di d d rad<br /> ci = di = |ci,1 - ci,2| radi = SR = = RSDR =<br /> 2 ci d2 1.13 1.13<br /> <br /> <br /> - Tiêu chí đánh giá: Đối với sản phẩm biến đổi III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> gen, ngưỡng dán nhãn của Việt Nam là 5% (Bộ Trong nghiên cứu này, để đánh giá được ảnh<br /> Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, Bộ Khoa hưởng của nền mẫu đến giá trị LOD, LOQ của<br /> học và Công nghệ, 2015). Giá trị LOD của phương phương pháp định tính, định lượng GMO, hiệu quả<br /> pháp nên thấp hơn 20 lần nồng độ mục tiêu, liên của Real time PCR được xác định là thước đo đầu<br /> quan đến ngưỡng kiểm soát theo luật định, thì LOD tiên. Các loại nền mẫu phân tích gồm: hai nền mẫu<br /> nên < 0,25% để đảm bảo độ chính xác của phương chưa qua xử lý là hạt ngô, hạt đậu tương; bốn nền<br /> pháp (Guidance document from European Network mẫu đã qua xử lý là thức ăn chăn nuôi (chứa cả ngô<br /> of GMO laboratories -ENGL, 2011). Giá trị LOQ<br /> và đậu tương), sữa đậu nành và snack (chứa ngô).<br /> nên bằng hoặc thấp hơn giá trị tính toán trong so<br /> Tiến hành tách chiết tinh sạch ADN với cùng một<br /> sánh liên phòng của thế giới (JRC Compendium of<br /> phương pháp sử dụng bộ kit Wizard của Promega.<br /> Reference Method for GMO Analysis, 2011).<br /> Các mẫu ADN tinh sạch đều đạt nồng độ từ<br /> 2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 50-286 ng/µl và tỉ lệ OD260/280 trong khoảng từ<br /> Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 1 đến tháng 1,8 - 2,0, chứng tỏ các mẫu DNA đủ độ tinh sạch và<br /> 6 năm 2017 tại Phòng Giám định Sinh vật và Sản không bị nhiễm tạp.<br /> phẩm Biến đổi gen -Viện Di truyền Nông nghiệp.<br /> <br /> Bảng 1. Kết quả đo nồng độ ADN (độ tinh sạch) tách chiết trên máy NanoDrop<br /> Tên mẫu/ Hạt ngô Hạt đậu Thức ăn Sữa đậu nành Snack vị H2O Lá<br /> ĐL20 tương DT84 chăn nuôi DT84 caramen (ngô) ĐC ĐC<br /> Lần lặp 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 (-) (+)<br /> Nồng độ (ng/µl) 147 138 286 208 140 120 135 150 50 57 0,1 170<br /> OD260/280 1,84 1,95 1,8 1,91 1,98 1,96 2,01 2,02 1,82 1,89 - 0,05 1,92<br /> <br /> 39<br /> Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 10(83)/2017<br /> <br /> Tiến hành pha loãng tất cả các mẫu đưa về cùng lặp lại 2 lần bởi 2 người khác nhau thực hiện. Mỗi<br /> một nồng độ là 40 ng/µl. Lượng ADN dùng cho lần tiến hành phản ứng sẽ khảo sát tại 1 nồng độ<br /> mỗi phản ứng là 200 ng. Phân tích các mẫu trong nghiên cứu.<br /> thí nghiệm với phương pháp định tính sự kiện Kết quả khảo sát các để xác định giá trị LOD,<br /> ngô biến đổi gen NK603 và đậu tương GTS40-3-2. LOQ cho thấy, ở nồng độ thấp nhất của dãy pha<br /> Các mẫu phân tích đều được xác định là âm tính loãng (0,01%), tất cả các phản ứng đều không phát<br /> (undetermined) với hai sự kiện NK603, GTS40-3-2. hiện được sản phẩm GMO.<br /> Mẫu DNA của chuẩn BF410 (đậu tương GTS 4032<br /> - 5%), BF415 (ngô NK603 -5%) được pha loãng về Khảo sát ở nồng độ 0,02%: kết quả cho 9 x 8 lần<br /> nồng độ 40ng/µl. Thêm chuẩn để đạt nồng độ nghiên phát hiện được sản phẩm GMO ở cả 8 mẫu phân<br /> cứu là 1; 0,1; 0,04; 0,02; 0,01% theo công thức đã nêu tích, giá trị chu kỳ ngưỡng (Ct) trung bình ở mức<br /> ở phần phương pháp, pha loãng theo dãy nồng độ từ 38,06 đến 39,63 đối với nền mẫu có đậu tương<br /> cho thí nghiệm tiếp theo. và 38,07 đến 39,92 đối với nền mẫu có ngô. Kết quả<br /> mỗi nền mẫu trong 10 lần lặp lại có 1 lần không phát<br /> Số phản ứng tiến hành trong thí nghiệm được<br /> tính toán bằng ma trận 4 chiều: hai loại thực vật hiện được tại nồng độ 0,02%. Chính vì thế, nồng độ<br /> (ngô/đậu tương) ˟ bốn nền mẫu (mẫu chuẩn, bột 0,02% không được chọn làm giới hạn phát hiện của<br /> hạt, thực phẩm, thức ăn chăn nuôi) ˟ năm nồng độ phương pháp.<br /> nghiên cứu (1, 0,1; 0,04; 0,02; 0,01%) ˟ 10 lần lặp Ở các nồng độ từ 0,04; 1%, kết quả Realtime PCR<br /> lại = 400 phản ứng. Toàn bộ khối thí nghiệm được đối với mỗi nồng độ thể hiện ở các bảng 2, 3.<br /> <br /> Bảng 2. Kết quả xác định ngưỡng phát hiện bằng Realtime PCR ở nồng độ 0,04%<br /> Nền mẫu có Đậu tương Nền mẫu có Ngô<br /> Giá trị chu kỳ Giá trị chu kỳ<br /> ngưỡng (Ct) Kết quả ngưỡng (Ct) Kết quả<br /> Nền mẫu Nền mẫu<br /> trung bình của định tính trung bình của định tính<br /> 10 lần lặp lại 10 lần lặp lại<br /> Chuẩn 36,24 Phát hiện Chuẩn 36,43 Phát hiện<br /> Bột hạt 35,97 Phát hiện Bột hạt 36,23 Phát hiện<br /> Thức ăn chăn<br /> Thức ăn chăn nuôi 37,08 Phát hiện 37,10 Phát hiện<br /> nuôi<br /> Thực phẩm dạng Thực phẩm chế<br /> 35,76 Phát hiện 35,96 Phát hiện<br /> lỏng (sữa đậu) biến (snack)<br /> <br /> Bảng 3. Kết quả xác định giới hạn định lượng ở nồng độ 0,1%<br /> Khác biệt<br /> Trung bình 2 Độ lệch Độ lệch chuẩn<br /> tuyệt đối giữa Khác biệt<br /> Số nền Lần 1 Lần 2 kết quả phân chuẩn tái tương đối của<br /> 2 kết quả tương đối<br /> mẫu ci,1 ci,2 tích độc lập lặp nội bộ các tái lặp nội<br /> ci phân tích radi (%)<br /> SR (%) bộ RSDR (%)<br /> độc lập di<br /> Nền mẫu có chứa đậu tương<br /> 1 0,12 0,11 0,115 0,01 8,696<br /> 2 0,13 0,11 0,12 0,02 16,667<br /> 0,008 6,84<br /> 3 0,085 0,087 0,086 0,002 2,326<br /> 4 0,092 0,095 0,0935 0,003 3,209<br /> Nền mẫu có chứa ngô<br /> 1 0,111 0,134 0,1225 0,023 18,776<br /> 2 0,121 0,13 0,1255 0,009 7,171<br /> 0,009 8,19<br /> 3 0,092 0,098 0,095 0,006 6,316<br /> 4 0,086 0,082 0,084 0,004 4,762<br /> <br /> 40<br />  Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 10(83)/2017<br /> <br /> Ở nồng độ 0,04%, kết quả 10 lần lặp lại đều phát chuẩn; đối với nền mẫu có chứa ngô là 8,19% giá trị<br /> hiện được sản phẩm GMO ở các nền mẫu phân tích, của mẫu chuẩn. Kết quả này đạt độ tin cậy 99% (khi<br /> với giá trị chu kỳ ngưỡng Ct trung bình từ 35,76 đến k = 1; t = 1,13) khi phân tích các nền mẫu nghiên<br /> 37,08 ở các nền mẫu có đậu tương và từ 35,96 đến cứu với mỗi nền mẫu lặp lại 10 lần. Các giá trị độ<br /> 37,10 ở các nền mẫu có chứa ngô. Tại điểm nồng độ lệch chuẩn tương đối của các tái lặp nội bộ RSDR<br /> này, giá trị dương tính giả, âm tính giả đều bằng 0. đều đạt trong giới hạn cho phép của phương pháp<br /> Chính vì thế, điểm nồng độ GMO 0,04% được xác về độ lệch chuẩn của các giá trị đo phải < 25% giá trị<br /> định là ngưỡng giới hạn phát hiện của phương pháp chuẩn. Chính vì thế, điểm nồng độ GMO 0,1% được<br /> phân tích với nền mẫu đậu tương và ngô. xác định là ngưỡng giới hạn định lượng của phương<br /> Ở nồng độ 0,1%, với mỗi loại nền mẫu, các giá pháp phân tích với nền mẫu chứa đậu tương và ngô.<br /> trị định lượng có độ dao động nhất định giữa giá trị Hiệu suất PCR được tính toán từ đường hồi quy<br /> trung bình của 10 lần phân tích trên một nền mẫu của giá trị Ct nhận được từ chuỗi pha loãng của<br /> của 2 lần phân tích độc lập. Số liệu được đưa vào ADN theo nồng độ đã nêu. Đường chuẩn của từng<br /> tính toán thể hiện ở bảng 3 cho thấy, độ lệch chuẩn loại nền mẫu được xây dựng dựa trên 5 điểm thêm<br /> tương đối của các tái lặp nội bộ RSDR (%) đối với chuẩn pha loãng lần lượt ở các nồng độ 5%; 1%;<br /> nền mẫu có chứa đậu tương là 6,84% giá trị của mẫu 0,1%; 0,04%; 0,02%.<br /> <br /> Bảng 4. Hiệu quả Realtime PCR của các nền mẫu ngô và đậu tương<br /> Gen định loài Gen được chuyển (GMO)<br /> Loài Nền mẫu Hệ số góc Hiệu suất Hệ số Hệ số góc Hiệu suất Hệ số<br /> của đường PCR tương quan của đường PCR tương quan<br /> chuẩn (%) (R2) chuẩn (%) (R2)<br /> CRM -3,51 98,61 0,998 -3,44 95,30 0,998<br /> Đậu Hạt -3,31 100,15 0,998 -3,24 103,41 0,993<br /> tương TĂCN -3,58 90,27 0,968 -3,60 90,43 0,994<br /> Sữa đậu -3,33 97,29 ,0998 -3,57 99,95 0,967<br /> CV (%) 3,45 0,83 6,56 0,85<br /> CRM -3,28 101,45 0,998 -3,36 98,25 0,996<br /> Hạt -3,36 98,62 0,996 -3,34 99,28 0,998<br /> Ngô<br /> TĂCN -3,59 89,67 0,968 -3,59 89,68 0,968<br /> Snack -3,57 90,43 0,997 -3,56 90,69 0,998<br /> CV (%) 6,53 0,84 5,15 0,83<br /> <br /> Kết quả bảng 4 cho thấy hiệu suất PCR đối với hệ số góc đều trong giới hạn chấp nhận mà phương<br /> các nền mẫu khác nhau có sự khác nhau có ý nghĩa pháp yêu cầu từ -3,1 đến -3,6 (JRC Compendium of<br /> ở mức tin cậy 95% (k = 2). Các nền mẫu chuẩn, mẫu Reference Method for GMO Analysis, 2011). Mối<br /> hạt của cả ngô và đậu tương cho hiệu suất cao từ liên quan giữa hệ số góc với hiệu suất PCR đã thể<br /> 98,62 đến 101,45%. Với nền mẫu thức ăn chăn nuôi hiện hệ số tương quan chặt từ 0,83 đến 0,85. Việc<br /> (TĂCN), hiệu suất PCR chỉ đạt từ 89,67 đến 90,27% định lượng GMO dựa trên đường chuẩn, vì thế sự<br /> trên các mẫu có cả thành phần là ngô, đậu tương và tương đồng giữa nền mẫu chuẩn và nền mẫu phân<br /> các thành phần khác. Như vậy, nền mẫu phức tạp tích là rất quan trọng để có thể định lượng đúng.<br /> cũng ảnh hưởng đến hiệu suất nhân bản của PCR. Nghiên cứu này đã chứng minh được với phương<br /> Đối với nền mẫu đã qua chế biến như sữa đậu hoặc pháp đã sử dụng, giới phát hiện và giới hạn định<br /> snack, hiệu suất PCR đạt 90,43 đến 97,29%, chứng lượng đối với nền mẫu chứa đậu tương và ngô đã<br /> tỏ quá trình xử lý chế biến mẫu đã có ảnh hưởng ít được xác định:<br /> nhiều đến hiệu suất PCR. So sánh giá trị hệ số góc<br /> LODđậu tương: 0,04%; LODngô: 0,04%.<br /> của các nền mẫu trên các phương pháp khác nhau<br /> cho thấy, tuy hiệu suất PCR có sự dao động, nhưng LOQđậu tương: 0,1%; LOGngô: 0,1% (ở độ tin cậy 99%).<br /> <br /> 41<br />