Đánh giá hiệu quả ly giải tế bào u đại trực tràng của vắc xin virut sởi và quai bị dùng phối hợp in vitro

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 2-2018<br /> <br /> ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ LY GIẢI TẾ BÀO U ĐẠI TRỰC TRÀNG<br /> CỦA VẮC XIN VIRUT SỞI VÀ QUAI BỊ<br /> DÙNG PHỐI HỢP IN VITRO<br /> Lê Duy Cương*; Hồ Anh Sơn*; Nguyễn Lĩnh Toàn*<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: đánh giá hiệu quả ly giải tế bào ung thư đại trực tràng (UTĐTT) (HT29) của virut<br /> vắc xin sởi và quai bị dùng phối hợp in vitro. Đối tượng và phương pháp: virut vắc xin sởi và<br /> quai bị (MeV và MuV) được tách dòng từ vắc xin Priorix (Hãng GlaxosmithKline, Anh). Thu thập<br /> tế bào HT29 nhiễm virut ở ngày thứ 3, 4, 5 làm nghiệm pháp MTT và chạy flow cytometry đo tế<br /> bào chết theo chương trình (apoptosis). Kết quả và kết luận: tỷ lệ tế bào sống và tế bào chết<br /> apoptosis ở các nhóm nhiễm virut khác biệt có nghĩa thống kê (p < 0,05) so với nhóm chứng.<br /> Tỷ lệ tế bào sống và tế bào chết apoptosis ở nhóm kết hợp virut khác biệt có nghĩa thống kê (p<br /> < 0,05) so với các nhóm đơn virut. Việc phối hợp vắc xin MeV và MuV gây ly giải tế bào HT29<br /> tốt hơn so với đơn virut in vitro.<br /> * Từ khóa: Ung thư đại trực tràng; Vắc xin virut sởi; Vắc xin virut quai bị.<br /> <br /> Evaluating the Oncolytic Efficacy of Measles and Mumps Virus<br /> Combination Vaccines against Colorectal Cancer Cells in Vitro<br /> Summary<br /> Objectives: Evaluation of oncolytic efficacy of measles and mumps virus combination against<br /> colorectal cancer cells (HT29) in vitro. Materials and methods: Measles and mumps virus<br /> vaccine (MeV and MuV) from Priorix vaccine (GlaxosmithKline, UK). Collection of HT29 infected<br /> th<br /> th<br /> th<br /> cells at day 3 , 4 and 5 , to carry out an MTT assay and flow cytometry to evaluate apoptosis<br /> cell death. Results and conclusions: The proportion of living cells and of apoptotic cell death in<br /> infected cell groups was statistically different (p < 0.05) versus the control group. The proportion<br /> of living cells and of apoptotic cell death in infected virus combination group was statistically<br /> different (p < 0.05) versus single virus groups. The MeV and MuV vaccine combination lysis<br /> HT29 cells better than single virus.<br /> * Keywords: Colorectal cancer; Measles virus vaccine; Mumps virus vaccine.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Trên thế giới, UTĐTT là loại ung thư<br /> phổ biến thứ ba ở nam giới và thứ hai ở<br /> nữ giới, là nguyên nhân gây tử vong do ung<br /> thư đứng thứ ba, với khoảng 600.000 ca<br /> <br /> tử vong mỗi năm. Năm 2014, trên toàn<br /> cầu có khoảng 1,2 triệu người được chẩn<br /> đoán mắc mới UTĐTT, trong số đó gần 1/2<br /> đã tử vong [1]. Tiên lượng sống > 5 năm<br /> cho bệnh nhân UTĐTT đã di căn < 20% [2].<br /> <br /> * Học viện Quân y<br /> Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Lĩnh Toàn (toannl@vmmu.edu.vn)<br /> Ngày nhận bài: 04/12/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 15/01/2018<br /> Ngày bài báo được đăng: 25/01/2018<br /> <br /> 24<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 2-2018<br /> Có nhiều phương pháp điều trị UTĐTT,<br /> <br /> tài này nhằm: Đánh giá khả năng ly giải tế<br /> <br /> gồm các phương pháp điều trị đích và<br /> <br /> bào UTĐTT (HT29) của virut vắc xin sởi<br /> <br /> các thuốc có hoạt tính sinh học như là<br /> <br /> và quai bị dùng phối hợp in vitro.<br /> <br /> kháng thể đặc hiệu kháng nguyên… Tuy<br /> nhiên, kết quả điều trị phụ thuộc vào<br /> <br /> ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> <br /> nhiều yếu tố và hiệu quả chưa thực sự<br /> <br /> NGHIÊN CỨU<br /> <br /> như mong muốn.<br /> <br /> 1. Đối tượng nghiên cứu.<br /> <br /> Virotherapy Oncolytic (OV) là một<br /> phương thức điều trị ung thư mới, là<br /> phương pháp biến sự nhân lên của virut<br /> thành vũ khí tiêu diệt các tế bào u và<br /> không ảnh hưởng đến tế bào lành. OV có<br /> nhiều lợi thế hơn so với các phương<br /> pháp điều trị ung thư khác như: rất ít tác<br /> dụng phụ, khả năng áp dụng rộng rãi cho<br /> nhiều loại bệnh ung thư và là một phương<br /> thức tự khuếch đại các hoạt động kháng<br /> u bằng cách sản xuất ra virut điều trị<br /> nhiều hơn ở khối u.<br /> <br /> Tế bào Vero và HT29: được nuôi cấy<br /> <br /> Trong số các loại OV, chủng vắc xin<br /> MeV và MuV sống, giảm độc lực cho thấy<br /> có nhiều tiềm năng điều trị UTĐTT.<br /> Chúng có khả năng ly giải đặc hiệu tế bào<br /> u đại trực tràng, kích hoạt mạnh phản<br /> ứng miễn dịch, làm tăng hiệu quả ly giải<br /> tế bào u. Bên cạnh đó vắc xin MeV và<br /> MuV sống, giảm độc lực đã được chứng<br /> minh có độ an toàn cao. Trong hơn nửa<br /> thế kỷ qua, vắc xin MeV và MuV sống,<br /> giảm độc lực đã tiêm cho hơn một tỷ<br /> người và độ an toàn được ghi nhận [3].<br /> <br /> trong phòng thí nghiệm với môi trường<br /> nuôi cấy DMEM hay RPMI (thêm 10%<br /> foetal bovine serum, 1% glutamine và 1%<br /> kháng sinh), duy trì tế bào ở tủ ấm 370C,<br /> 5% CO2.<br /> Vắc xin sống, giảm độc lực MeV và<br /> MuV: phân lập, tăng sinh MeV và MuV<br /> nguồn gốc từ vắc xin Priorix (Hãng<br /> GlaxosmithKline, Anh), thực hiện tại<br /> Trường Đại học Quốc gia Singapore.<br /> 2. Phương pháp nghiên cứu.<br /> * Chuẩn độ virut (TCID50):<br /> Nhiễm virut tế bào Vero trên đĩa 96<br /> giếng: gieo tế bào Vero vào các giếng<br /> trên đĩa 96 giếng với nồng độ tế bào<br /> 104/200 µl/giếng, duy trì tế bào trên đĩa<br /> 96 giếng ở tủ ấm 370C, 5% CO2.<br /> Sau 24 giờ, kiểm tra tế bào trên đĩa 96<br /> giếng dưới kính hiển vi thấy tế bào Vero<br /> bám đáy tốt. Tiến hành nhiễm virut vào<br /> <br /> Tuy nhiên, đến nay chưa có nghiên<br /> <br /> các giếng trên đĩa 96 giếng theo hàng A,<br /> <br /> cứu đánh giá hiệu quả ly giải tế bào<br /> <br /> B, C, D, E, F, I, tương ứng với nồng độ<br /> <br /> UTĐTT của vắc xin MeV và MuV dùng<br /> <br /> 10-2 đến 10-8 của sotck virut, cột 11 và 12<br /> <br /> phối hợp. Do đó, chúng tôi tiến hành đề<br /> <br /> là nhóm chứng (không nhiễm).<br /> 25<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 2-2018<br /> Kiểm tra tế bào Vero nhiễm virut ở các giếng trên đĩa 96 giếng hàng ngày dưới kính<br /> hiển vi. Đến ngày thứ 6 nhiễm virut, các giếng có hình ảnh nhiễm virut rõ, tiến hành<br /> nhuộm xanh thylen và tính TCID50. Công thức tính TCID50:<br /> I: khoảng tỷ lệ (PD) =<br /> <br /> (% CPE > 50%) - (50%)<br /> <br /> (% CPE > 50%) - (% CPE < 50%)<br /> II: -log của nồng độ pha loãng có CPE > 50% (nghĩa là 10-3 sẽ là 3).<br /> III: [(PD) + (-log của nồng độ pha loãng có CPE > 50%)].<br /> IV: TCID50 = 10III/ml (CPE là hiệu ứng gây độc tế bào).<br /> * Nghiệm pháp MTT:<br /> - Chuẩn bị tế bào HT29: tế bào HT29<br /> được lấy từ nguồn tủ âm sâu -800C, gieo<br /> vào đĩa nuôi cấy petri disk 100 x 20 mm,<br /> thêm môi trường nuôi cấy (RPMI, 10%<br /> FBS, 1% kháng sinh). Khi tế bào bám đáy<br /> và phát triển tốt, tiến hành tách và gieo tế<br /> bào HT29 (nồng độ đạt 104 tế bào/200<br /> µl/giếng) vào 3 đĩa 96 giếng tại 3 thời<br /> điểm (nhiễm virut ngày thứ 3, 4 và 5).<br /> - Nhiễm virut vào tế bào HT29: sau 24<br /> giờ, kiểm tra tế bào HT29 ở các đĩa<br /> 96 giếng dưới kính hiển vi, nếu tế bào<br /> bám đáy tốt, tiến hành nhiễm virut trên<br /> từng đĩa 96 giếng theo 3 nhóm: nhóm I<br /> nhiễm MuV, nhóm II nhiễm MeV, nhóm III<br /> nhiễm MuV + MeV. Sử dụng môi trường<br /> nuôi cấy (RPMI, 10% FBS, 1% kháng<br /> sinh) pha loãng MeV (TCID50 là 5 x 107,5)<br /> và MuV (TCID50 là 5 x 106,4) thành các<br /> nồng độ 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 108<br /> , sau đó nhiễm vào các giếng trên đĩa 96<br /> giếng, giếng ở nhóm chứng không nhiễm.<br /> - Các bước tiến hành nghiệm pháp<br /> MTT: loại bỏ hết dịch nuôi cấy tế bào ở<br /> các giếng trên đĩa 96 giếng. Cho 100 µl<br /> dung dịch nuôi cấy có 10% MTT vào<br /> trong mỗi giếng, ủ trong 4 giờ. Sau đó,<br /> loại bỏ toàn bộ dịch nổi trong mỗi giếng ở<br /> đĩa 96 giếng (làm nhẹ nhàng, tránh hút cả<br /> tinh thể MTT), cho 100 µl dung dịch<br /> 26<br /> <br /> M-8910 vào từng giếng. Lắc nhẹ để hòa<br /> tan hết tinh thể MTT.<br /> Đo hấp thụ OD ở bước sóng 490 nm.<br /> * Đánh giá tế bào chết theo chương<br /> trình (apoptosis):<br /> - Chuẩn bị tế bào HT29: tế bào HT29<br /> từ nguồn tủ âm sâu -800C, hoạt hóa tế<br /> bào trong đĩa nuôi cấy 100 x 20 mm có<br /> môi trường RPMI, thêm 10% FBS và<br /> 1% kháng sinh. Khi tế bào phát triển tốt,<br /> tiến hành tách và gieo tế bào HT29 vào<br /> đĩa 6 giếng (6-well plate) với nồng độ 105<br /> tế bào/200 µl/giếng, tổng số 5 đĩa (đánh<br /> số các giếng trên đĩa nuôi cấy).<br /> - Sau 24 giờ, kiểm tra tế bào HT29 ở<br /> các đĩa 6 giếng dưới kính hiển vi thấy tế<br /> bào bám đáy tốt. Tiến hành nhiễm virut vắc<br /> xin với nồng độ 1 mol (chuẩn độ TCID50<br /> của MuV là 106,4, MeV là 107,5) theo 3 nhóm:<br /> nhóm I nhiễm ngày thứ 5, nhóm II nhiễm<br /> ngày thứ 4 và nhóm III nhiễm ngày thứ 3,<br /> mỗi nhóm nhắc lại 3 lần, nhóm IV là nhóm<br /> chứng (không nhiễm virut).<br /> - Kỹ thuật phân tích tế bào dòng chảy<br /> (flow cytometry) đánh giá tế bào chết theo<br /> chương trình (apoptosis): sử dụng kháng<br /> thể kháng annexin V gắn với tác nhân<br /> phát huỳnh quang PE và chất nhuộm<br /> nhân tế bào 7AAD (có dải sóng kích<br /> thích/phát xạ trùng với PerCP-Cy5-5-A).<br /> Xử lý và nhuộm tế bào theo quy trình và<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 2-2018<br /> hóa chất của bộ kít PE Annexin V<br /> Apoptosis Detection kit (BD).<br /> - Đánh giá tỷ lệ tế bào chết apoptosis<br /> trên hệ thống FACS CANTO 2 (BD): xác<br /> định quần thể tế bào cần đánh giá, xác<br /> định vùng giá trị huỳnh quang (PE và<br /> <br /> PerCP) âm tính, xác định tỷ lệ tế bào chết<br /> apoptosis/hoại tử (hình 1). Tín hiệu PE<br /> cho thấy biểu hiện của Anexin V. Tín hiệu<br /> của PerCP-Cy5-5A cho thấy biểu hiện<br /> của 7AAD. Số tế bào chết apoptosis sẽ là<br /> tổng của Q1 và Q2.<br /> <br /> Hình 1: Phân bố tế bào trong vùng tín hiệu huỳnh quang khác nhau của PerCp-Cy5-5A<br /> và PE. Tỷ lệ Q1, Q2, Q3, Q4 được xác định theo phần mềm FACS DIVA II.<br /> * Phân tích thống kê:<br /> Kết quả được tổng hợp, phân tích thống kê, sử dụng phần mềm thống kê chuyên<br /> dụng STAVIEW 5.0E. Khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.<br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU<br /> 1. Nuôi cấy và nhiễm virut tế bào HT29.<br /> Tế bào HT29 được nuôi cấy và nhiễm virut nồng độ 1 mol. Kiểm tra hình ảnh tế bào<br /> nhiễm virut từng ngày.<br /> <br /> Hình 2: Hình ảnh tế bào HT29 nhiễm virut tạo hợp bào ở ngày thứ 1 - 6.<br /> 27<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 2-2018<br /> Từ ngày thứ 2 sau nhiễm virut, có hình ảnh tế bào HT29 nhiễm virut, một số tế bào<br /> co nhỏ có xu hướng bong ra, tách khỏi đám tế bào. Đến ngày thứ 3, hình ảnh tế bào<br /> HT29 nhiễm virut đã rõ ràng, có nhiều tế bào co nhỏ lại bong ra, các tế bào bắt đầu<br /> hòa màng với nhau tạo hình ảnh hợp bào (tế bào khổng lồ có nhiều nhân, nổi lên trên).<br /> Ngày thứ 4 và 5, hình ảnh hợp bào nhiều hơn nổi lên trên. Ngày thứ 6, tế bào HT29<br /> bong đáy hoàn toàn, hình thành hợp bào, các hợp bào có xu thế phân giải kèm theo tế<br /> bào chết do bị đói (không thay môi trường nuôi cấy được) để lại hình ảnh xác và mảnh<br /> vỡ tế bào.<br /> 2. Virut vắc xin sởi và quai bị ly giải tế bào HT29 in vitro.<br /> * Nghiệm pháp MTT:<br /> 1<br /> 0.8<br /> 0.6<br /> 0.4<br /> 0.2<br /> 0<br /> 10^-2<br /> <br /> 10^-3<br /> con tro l<br /> <br /> 10^-4<br /> <br /> 10^-5<br /> <br /> Me V+Mu V(%)<br /> <br /> 10^-6<br /> <br /> 10^-7<br /> <br /> Me V(%)<br /> <br /> 10^-8<br /> <br /> Mu V(%)<br /> <br /> Hình 3: Kết quả đo MTT nhiễm virut ngày thứ 3 của các nhóm.<br /> 1<br /> 0.9<br /> 0.8<br /> 0.7<br /> 0.6<br /> 0.5<br /> 0.4<br /> 0.3<br /> 0.2<br /> 0.1<br /> 0<br /> <br /> P