intTypePromotion=1
ADSENSE

Đánh giá kết quả ngoại kiểm xét nghiệm đột biến gen EGFR trên bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ tại Bệnh viện Bạch Mai theo tiêu chuẩn Châu Âu

Chia sẻ: Ni Ni | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:9

60
lượt xem
1
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm chuẩn hóa kỹ thuật và xác định tính chính xác của xét nghiệm đột biến gen EGFR bằng kỹ thuật Strip Assay đang thực hiện tại Đơn vị Gen trị liệu, Bệnh viện Bạch Mai.

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Đánh giá kết quả ngoại kiểm xét nghiệm đột biến gen EGFR trên bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ tại Bệnh viện Bạch Mai theo tiêu chuẩn Châu Âu

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2016<br /> <br /> ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ NGOẠI KIỂM ÉT NGHIỆM ĐỘT BIẾN GEN<br /> EGFR TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƢ PHỔI KHÔNG TẾ BÀO NHỎ<br /> TẠI BỆNH VIỆN BẠCH MAI THEO TIÊU CHUẨN CHÂU ÂU<br /> Phạm Cẩm Phương*; Mai<br /> <br /> ọng Khoa*<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: nhằm chuẩn hóa kỹ thuật và xác định tính chính xác của xét nghiệm đột biến<br /> gen EGFR bằng kỹ thuật Strip Assay đang thực hiện tại Đơn vị Gen trị liệu, Bệnh viện<br /> Bạch Mai. Phương pháp: 10 mẫu bệnh phẩm do Mạng lưới Kiểm soát Chất lượng Di truyền<br /> học Phân tử châu Âu (The European Molecular Genetics Quality Network - EMQN) cung cấp<br /> để xác định đột biến gen EGFR bằng kít EGFR StripAssay® (ViennaLab). Các kết quả này sẽ<br /> gửi trả trực tuyến và được EMQN đánh giá, công bố kết quả. Kết quả: cả 10 mẫu kiểm chuẩn<br /> thực hiện đều cho kết quả chính xác với công bố của EMQN (100%). Kết luận: kỹ thuật xét<br /> nghiệm sử dụng kit EGFR StripAssay® và các thiết bị hiện có tại Đơn vị Gen trị liệu, Bệnh<br /> viện Bạch Mai đảm bảo tiêu chuẩn phát hiện đột biến gen EGFR. Các xét nghiệm này có độ<br /> chính xác cao, ổn định. Từ đó, cung cấp các thông tin chính xác cho bác sỹ lâm sàng để<br /> chẩn đoán và lập kế hoạch điều trị cho bệnh nhân (BN) ung thư phổi không tế bào nhỏ<br /> (UTPKTBN).<br /> * Từ khóa: Ung thư phổi không tế bào nhỏ; Đột biến gen EGFR; Ngoại kiểm tra chất lượng<br /> xét nghiệm.<br /> <br /> Evaluate the Results of EGFR Mutation Testing in Non-Small Cell<br /> Lung Cancer by European Quality Assessment at Bachmai Hospital<br /> Summary<br /> Objectives: To standardize the technique and assess the realibility of EGFR mutations tests<br /> by Strip Assay technique at the Gene Therapy Unit, Bachmai Hospital. Methods: Ten samples<br /> for external quality assessment which obtained from the European Molecular Genetics Quality<br /> Network (EMQN) were detected EGFR mutations by EGFR StripAssay® (ViennaLab), these<br /> results were submited online and compared with EMQN’s validated results. Results: ll of ten<br /> samples had same results with publication of EMQN (100% efficiency). Conclusion: EGFR<br /> mutations tests with EGFR StripAssay® kit and equipment available at the Gene Therapy Unit,<br /> Bachmai Hospital ensure the quality to detect EGFR mutations. These tests have high accuracy,<br /> providing more details for clinicians in non-small lung cancer management.<br /> * Key words: Non-small cell lung cancer; EGFR mutation; External quality assessment.<br /> * Bệnh viện Bạch Mai<br /> Người phản hồi (Corresponding): Phạm Cẩm Phương (camphuongmd@yahoo.com)<br /> Ngày nhận bài: 20/08/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 10/01/2016<br /> Ngày bài báo được đăng: 25/01/2016<br /> <br /> 44<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2016<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Ung thư phổi (UTP) là bệnh ung thư<br /> phổ biến trên thế giới và ở Việt Nam.<br /> Hiện có nhiều tiến bộ trong chẩn đoán<br /> (sinh học phân tử, tế bào…) và điều trị<br /> bệnh UTP (phẫu thuật, xạ trị, hóa trị, điều<br /> trị đích…), do đó nâng cao hiệu quả điều<br /> trị và cải thiện chất lượng sống cho người<br /> bệnh.<br /> Một trong những tiến bộ trong chẩn<br /> đoán là xét nghiệm đột biến gen EGFR<br /> (Epidermal Growth Factor Receptor: thụ<br /> thể yếu tố phát triển biểu mô). Gen EGFR<br /> này đóng vai trò quan trọng trong hoạt<br /> động chức năng phát triển và biệt hóa tế<br /> bào. Đột biến EGFR dẫn đến tăng biểu<br /> hiện hoặc tăng cường hoạt động của EGFR<br /> được phát hiện trong nhiều loại bệnh ung<br /> thư, trong đó có UTP.<br /> Hiện nay, các thuốc điều trị đích ra đời<br /> (kháng thể đơn dòng, thuốc phân tử nhỏ,<br /> ức chế vùng tyrosine kinase [tyrosine<br /> kinase inhibitor - TKI] của thụ thể yếu tố<br /> tăng trưởng biểu mô) và được sử dụng<br /> để điều trị cho BN UTPKTBN. Các nghiên<br /> cứu trên thế giới và tại Việt Nam đã cho<br /> thấy BN có đột biến EGFR có thời gian<br /> sống thêm không bệnh tiến triển (progressionfree survival - PFS) và thời gian sống<br /> thêm toàn bộ (overall survival - OS) cao<br /> hơn BN không có đột biến EGFR khi<br /> được điều trị bằng TKI [1, 2]. Vì vậy, xét<br /> nghiệm đột biến gen EGFR cho BN<br /> UTPKTBN thực sự cần thiết để bác sỹ<br /> lâm sàng lựa chọn phương án điều trị tối<br /> ưu nhất cho người bệnh.<br /> Hiện nay, có nhiều phương pháp khác<br /> nhau để xét nghiệm đột biến gen EGFR<br /> như giải trình tự gen (giải trình tự Sanger<br /> <br /> hoặc pyrosequencing), realtime-PCR (ví dụ<br /> như kít therascreen - Qiagen), lai đầu dò<br /> (StripAssay - ViennaLab)… Mỗi phương<br /> pháp đều có những ưu nhược điểm riêng:<br /> các kít therascreen, StripAssay có độ<br /> nhạy cao, nhưng chỉ phát hiện được số<br /> lượng đột biến giới hạn theo thiết kế kít;<br /> trong khi các phương pháp giải trình tự có<br /> khả năng phát hiện được đột biến mới,<br /> hiếm gặp, nhưng đòi hỏi số lượng tế bào<br /> mang đột biến trong mẫu phân tích lớn<br /> [3]. Do vậy, các phương pháp xét nghiệm<br /> này có thể cho kết quả khác nhau trên<br /> cùng một mẫu phân tích. Vì vậy, việc<br /> ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm<br /> (đặc biệt là kiểm chuẩn quốc tế) có vai trò<br /> đặc biệt quan trọng trong việc đánh giá<br /> khả năng phát hiện đột biến gen EGFR.<br /> Đơn vị Trị liệu gen, Bệnh viện Bạch<br /> Mai đã thực hiện thường quy xét nghiệm<br /> đột biến EGFR từ 2014 và tham gia Mạng<br /> lưới Kiểm soát Chất lượng Di truyền học<br /> Phân tử châu Âu (có trụ sở tại thành phố<br /> Manchester, Anh). Chúng tôi tiến hành đề<br /> tài này nhằm: Chuẩn hóa kỹ thuật và xác<br /> định tính chính xác của xét nghiệm đột<br /> biến gen EGFR bằng kỹ thuật Strip ssay<br /> đang thực hiện tại Đơn vị Gen trị liệu,<br /> Bệnh viện Bạch Mai.<br /> ĐỐI TƢỢNG, PHƢƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Đối tƣợng nghiên cứu.<br /> 10 mẫu bệnh phẩm được nhận từ EMQN,<br /> với mã tham chiếu 1.369. Các mẫu đều<br /> được lấy trực tiếp từ khối u phổi (2 mẫu)<br /> hoặc từ tế bào nuôi cấy (8 mẫu) của BN<br /> UTPKTBN. Cố định các mẫu này bằng<br /> 45<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2016<br /> <br /> formalin và đúc paraffin (formalin-fixed,<br /> paraffin-embedded - FFPE) để làm tiêu<br /> bản HE. Trong tiêu bản HE, tỷ lệ tế bào<br /> ung thư phải đạt > 20%.<br /> <br /> gia ngoại kiểm (bao gồm 277 phòng thí<br /> nghiệm của 39 quốc gia), trong đó tình<br /> trạng đột biến gen EGFR được xác định<br /> trước đó từ một phòng thí nghiệm chuẩn.<br /> <br /> Đây là các mẫu mù, được gửi cho tất<br /> cả các phòng thí nghiệm đăng ký tham<br /> <br /> Thông tin chi tiết về các mẫu ngoại<br /> kiểm được trình bày trong bảng 1.<br /> <br /> Bảng 1: Thông tin về các mẫu kiểm chuẩn.<br /> TT mẫu<br /> <br /> Mã<br /> bệnh phẩm<br /> <br /> Chẩn đoán<br /> <br /> Vị trí/phƣơng pháp lấy mẫu<br /> <br /> Tỷ lệ<br /> tế bào u<br /> <br /> 01<br /> <br /> 01.6127774<br /> <br /> UTP (biểu mô tuyến)<br /> <br /> U thùy trên phổi phải (phẫu thuật)<br /> <br /> > 20%<br /> <br /> 02<br /> <br /> 02.6130768<br /> <br /> UTP (biểu mô tuyến)<br /> <br /> U phổi (sinh thiết)<br /> <br /> > 30%<br /> <br /> 03<br /> <br /> 03.6153218<br /> <br /> UTP (biểu mô tuyến)<br /> <br /> U thùy trên phổi phải (phẫu thuật)<br /> <br /> > 20%<br /> <br /> 04<br /> <br /> 04.6126965<br /> <br /> EMQN không cung cấp<br /> <br /> EMQN không cung cấp<br /> <br /> > 20%<br /> <br /> 05<br /> <br /> 05.6127265<br /> <br /> EMQN không cung cấp<br /> <br /> EMQN không cung cấp<br /> <br /> > 20%<br /> <br /> 06<br /> <br /> 06.6130038<br /> <br /> EMQN không cung cấp<br /> <br /> EMQN không cung cấp<br /> <br /> > 20%<br /> <br /> 07<br /> <br /> 07.6130241<br /> <br /> EMQN không cung cấp<br /> <br /> EMQN không cung cấp<br /> <br /> > 20%<br /> <br /> 08<br /> <br /> 08.6126384<br /> <br /> EMQN không cung cấp<br /> <br /> EMQN không cung cấp<br /> <br /> > 20%<br /> <br /> 09<br /> <br /> 09.6161625<br /> <br /> EMQN không cung cấp<br /> <br /> EMQN không cung cấp<br /> <br /> > 20%<br /> <br /> 10<br /> <br /> 10.6161844<br /> <br /> EMQN không cung cấp<br /> <br /> EMQN không cung cấp<br /> <br /> > 20%<br /> <br /> 2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br /> * Địa điểm nghiên cứu: Đơn vị Gen trị liệu Trung tâm Y học Hạt nhân và Ung bướu,<br /> Bệnh viện Bạch Mai.<br /> * Thời gian nghiên cứu: tháng 7 - 2014.<br /> * Phương pháp nghiên cứu: đối chiếu<br /> kết quả đột biến EGFR tại Đơn vị Gen trị<br /> liệu, Bệnh viện Bạch Mai với kết quả của<br /> EMQN.<br /> * Thiết bị, vật tư, hóa chất:<br /> - Thiết bị: các thiết bị cơ bản của<br /> phòng thí nghiệm sinh học phân tử như<br /> 46<br /> <br /> bộ pipet kèm giá đỡ (Eppendorf Research<br /> Plus), máy ly tâm lạnh (Eppendorf 5424R),<br /> máy ủ nhiệt kèm lắc rung (Eppendorf<br /> Thermomixer comfort), máy định lượng<br /> ADN theo nguyên tắc huỳnh quang<br /> (Qubit® 2.0 Fluorometer), máy PCR<br /> (Eppendorf Mastercycler pro S)…<br /> - Hóa chất: kít tách ADN từ mô FFPE<br /> (QIAamp® DNA FFPE Tissue Kit, Qiagen),<br /> kít định lượng ADN theo nguyên tắc<br /> huỳnh quang (Qubit™ dsDNA HS, Molecular<br /> Probes), kít xác định đột biến gen EGFR<br /> (EGFR StripAssay®, ViennaLab)…<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2016<br /> <br /> - Vật tư tiêu hao: vật tư cần thiết do<br /> các hãng uy tín cung cấp: ống PCR; ống<br /> ly tâm 1,7 ml; đầu tip 10, 20, 200, 1000 µl<br /> (Corning); ống Qubit assay (Invitrogen)…<br /> * Các bước tiến hành: 10 mẫu bệnh<br /> phẩm được thực hiện xét nghiệm đột biến<br /> EGFR theo quy trình như sau: tách ADN<br /> từ mô FFPE (sử dụng kít QIAamp® DNA<br /> FFPE Tissue Kít, Hãng Qiagen), định lượng<br /> ADN (Qubit™ dsDNA HS, Molecular<br /> Probes), khuếch đại đoạn gen quan tâm<br /> bằng phản ứng PCR và lai sản phẩm<br /> khuếch đại với đầu dò đặc hiệu (EGFR<br /> StripAssay®, ViennaLab), phân tích kết<br /> <br /> quả (sử dụng phần mềm StripAssay®<br /> Evaluator, ViennaLab).<br /> * Đối chiếu kết quả: kết quả chất<br /> lượng ADN sau khi tách và đột biến gen<br /> EGFR được gửi lại EMQN tại địa chỉ<br /> https://www.formdesk.com/EMQN/LUNG_<br /> EQA_2014. Sau đó, so sánh kết quả<br /> EMQN của 10 mẫu xét nghiệm đột biến<br /> EGFR tại Đơn vị Gen trị liệu với kết quả<br /> xét nghiệm đã biết trước và EMQN sẽ gửi<br /> lại kết quả cho Đơn vị Gen trị liệu. Ngoài<br /> ra, EMQN còn thông báo với Đơn vị Gen<br /> trị liệu về kết quả xét nghiệm của các labo<br /> khác trên thế giới cùng tham gia chương<br /> trình này.<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU<br /> 1. Nồng độ ADN s u khi tách từ mẫu p r ffin block.<br /> Bảng 2: Nồng độ ADN sau khi tách từ mẫu paraffin block của các mẫu kiểm chuẩn.<br /> STT mẫu<br /> <br /> Mã bệnh phẩm<br /> <br /> Nồng độ ADN<br /> (ng/µl)<br /> <br /> STT<br /> <br /> Mã bệnh phẩm<br /> <br /> Nồng độ ADN<br /> (ng/µl)<br /> <br /> 01<br /> <br /> 01.6127774<br /> <br /> 6,54<br /> <br /> 06<br /> <br /> 06.6130038<br /> <br /> 6,49<br /> <br /> 02<br /> <br /> 02.6130768<br /> <br /> 12,50<br /> <br /> 07<br /> <br /> 07.6130241<br /> <br /> 6,67<br /> <br /> 03<br /> <br /> 03.6153218<br /> <br /> 6,01<br /> <br /> 08<br /> <br /> 08.6126384<br /> <br /> 8,85<br /> <br /> 04<br /> <br /> 04.6126965<br /> <br /> 7,79<br /> <br /> 09<br /> <br /> 09.6161625<br /> <br /> 43,00<br /> <br /> 05<br /> <br /> 05.6127265<br /> <br /> 7,23<br /> <br /> 10<br /> <br /> 10.6161844<br /> <br /> 8,03<br /> <br /> Các mẫu đều thu được nồng độ ADN đạt tiêu chuẩn của kít xét nghiệm EGFR<br /> StripAssay® (hàm lượng ADN cho vào phản ứng PCR nằm trong khoảng 1 - 10 ng/μl).<br /> 2. Phát hiện đột biến gen EGFR.<br /> Kết quả một số mẫu phân tích được thể hiện trên hình 1. Mẫu 01.6127774 không<br /> phát hiện đột biến trên exon 18 - 21 gen EGFR. Mẫu 02.6130768 phát hiện đột biến<br /> L858R trên exon 21, là dạng phổ biến thứ hai với tần số xuất hiện khoảng 41% trong<br /> tổng số các đột biến. Mẫu 03.6153218 phát hiện đột biến G719S khá rõ ràng, đây là<br /> đột biến tương đối ít gặp, nằm trên exon 18 gen EGFR.<br /> 47<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2016<br /> <br /> Hình 1: Phân tích kết quả trên thanh teststrip.<br /> Trên mỗi thanh teststrip có sẵn vạch control cho phản ứng lai, PCR negative control<br /> cho từng exon (vạch 17 - 20) và PCR positive control (vạch 21) làm đối chứng. Các vạch<br /> 1 - 16 tương ứng với 16 đột biến trên 4 exon 18 - 21. Mẫu 01.6127774 (trái) không phát<br /> hiện đột biến, mẫu 02.6130768 (giữa) phát hiện đột biến L858R trên exon 21, mẫu<br /> 03.6153218 (phải) phát hiện đột biến G719S trên exon 18.<br /> Bảng 3: So sánh kết quả phân tích đột biến gen EGFR trên các mẫu kiểm chuẩn.<br /> STT<br /> mẫu<br /> <br /> Mã<br /> bệnh phẩm<br /> <br /> Kết quả phân tích t i<br /> Đơn vị Gen trị liệu<br /> <br /> Kết quả củ EMQN<br /> <br /> 01<br /> <br /> 01.6127774<br /> <br /> Không phát hiện đột biến<br /> <br /> Không phát hiện đột biến<br /> <br /> 02<br /> <br /> 02.6130768<br /> <br /> Đột biến L858R (exon 21)<br /> <br /> Đột biến L858R (exon 21)<br /> <br /> 03<br /> <br /> 03.6153218<br /> <br /> Đột biến G719S (exon 18)<br /> <br /> Đột biến G719S (exon 18)<br /> <br /> 04<br /> <br /> 04.6126965<br /> <br /> Không phát hiện đột biến<br /> <br /> Không phát hiện đột biến<br /> <br /> 05<br /> <br /> 05.6127265<br /> <br /> Không phát hiện đột biến<br /> <br /> Không phát hiện đột biến<br /> <br /> 06<br /> <br /> 06.6130038<br /> <br /> Không phát hiện đột biến<br /> <br /> Không phát hiện đột biến<br /> <br /> 07<br /> <br /> 07.6130241<br /> <br /> Đột biến mất đoạn E746-A750 (exon 19)<br /> <br /> Đột biến mất đoạn E746-A750 (exon 19)<br /> <br /> 08<br /> <br /> 08.6126384<br /> <br /> Đột biến L861Q (exon 21)<br /> <br /> Đột biến L861Q (exon 21)<br /> <br /> 09<br /> <br /> 09.6161625<br /> <br /> Đột biến L858R (exon 21)<br /> <br /> Đột biến L858R (exon 21)<br /> <br /> 10<br /> <br /> 10.6161844<br /> <br /> Đột biến mất đoạn E746-A750 (exon 19)<br /> <br /> Đột biến mất đoạn E746-A750 (exon 19)<br /> <br /> Kết quả phân tích đột biến gen EGFR trên 10 mẫu kiểm chuẩn tại Đơn vị Gen trị liệu<br /> đều cho kết quả chính xác theo công bố của EMQN, đạt tỷ lệ 100%.<br /> 48<br /> <br />
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2