TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2016<br />
<br />
ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ NGOẠI KIỂM ÉT NGHIỆM ĐỘT BIẾN GEN<br />
EGFR TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƢ PHỔI KHÔNG TẾ BÀO NHỎ<br />
TẠI BỆNH VIỆN BẠCH MAI THEO TIÊU CHUẨN CHÂU ÂU<br />
Phạm Cẩm Phương*; Mai<br />
<br />
ọng Khoa*<br />
<br />
TÓM TẮT<br />
Mục tiêu: nhằm chuẩn hóa kỹ thuật và xác định tính chính xác của xét nghiệm đột biến<br />
gen EGFR bằng kỹ thuật Strip Assay đang thực hiện tại Đơn vị Gen trị liệu, Bệnh viện<br />
Bạch Mai. Phương pháp: 10 mẫu bệnh phẩm do Mạng lưới Kiểm soát Chất lượng Di truyền<br />
học Phân tử châu Âu (The European Molecular Genetics Quality Network - EMQN) cung cấp<br />
để xác định đột biến gen EGFR bằng kít EGFR StripAssay® (ViennaLab). Các kết quả này sẽ<br />
gửi trả trực tuyến và được EMQN đánh giá, công bố kết quả. Kết quả: cả 10 mẫu kiểm chuẩn<br />
thực hiện đều cho kết quả chính xác với công bố của EMQN (100%). Kết luận: kỹ thuật xét<br />
nghiệm sử dụng kit EGFR StripAssay® và các thiết bị hiện có tại Đơn vị Gen trị liệu, Bệnh<br />
viện Bạch Mai đảm bảo tiêu chuẩn phát hiện đột biến gen EGFR. Các xét nghiệm này có độ<br />
chính xác cao, ổn định. Từ đó, cung cấp các thông tin chính xác cho bác sỹ lâm sàng để<br />
chẩn đoán và lập kế hoạch điều trị cho bệnh nhân (BN) ung thư phổi không tế bào nhỏ<br />
(UTPKTBN).<br />
* Từ khóa: Ung thư phổi không tế bào nhỏ; Đột biến gen EGFR; Ngoại kiểm tra chất lượng<br />
xét nghiệm.<br />
<br />
Evaluate the Results of EGFR Mutation Testing in Non-Small Cell<br />
Lung Cancer by European Quality Assessment at Bachmai Hospital<br />
Summary<br />
Objectives: To standardize the technique and assess the realibility of EGFR mutations tests<br />
by Strip Assay technique at the Gene Therapy Unit, Bachmai Hospital. Methods: Ten samples<br />
for external quality assessment which obtained from the European Molecular Genetics Quality<br />
Network (EMQN) were detected EGFR mutations by EGFR StripAssay® (ViennaLab), these<br />
results were submited online and compared with EMQN’s validated results. Results: ll of ten<br />
samples had same results with publication of EMQN (100% efficiency). Conclusion: EGFR<br />
mutations tests with EGFR StripAssay® kit and equipment available at the Gene Therapy Unit,<br />
Bachmai Hospital ensure the quality to detect EGFR mutations. These tests have high accuracy,<br />
providing more details for clinicians in non-small lung cancer management.<br />
* Key words: Non-small cell lung cancer; EGFR mutation; External quality assessment.<br />
* Bệnh viện Bạch Mai<br />
Người phản hồi (Corresponding): Phạm Cẩm Phương (camphuongmd@yahoo.com)<br />
Ngày nhận bài: 20/08/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 10/01/2016<br />
Ngày bài báo được đăng: 25/01/2016<br />
<br />
44<br />
<br />
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2016<br />
<br />
ĐẶT VẤN ĐỀ<br />
Ung thư phổi (UTP) là bệnh ung thư<br />
phổ biến trên thế giới và ở Việt Nam.<br />
Hiện có nhiều tiến bộ trong chẩn đoán<br />
(sinh học phân tử, tế bào…) và điều trị<br />
bệnh UTP (phẫu thuật, xạ trị, hóa trị, điều<br />
trị đích…), do đó nâng cao hiệu quả điều<br />
trị và cải thiện chất lượng sống cho người<br />
bệnh.<br />
Một trong những tiến bộ trong chẩn<br />
đoán là xét nghiệm đột biến gen EGFR<br />
(Epidermal Growth Factor Receptor: thụ<br />
thể yếu tố phát triển biểu mô). Gen EGFR<br />
này đóng vai trò quan trọng trong hoạt<br />
động chức năng phát triển và biệt hóa tế<br />
bào. Đột biến EGFR dẫn đến tăng biểu<br />
hiện hoặc tăng cường hoạt động của EGFR<br />
được phát hiện trong nhiều loại bệnh ung<br />
thư, trong đó có UTP.<br />
Hiện nay, các thuốc điều trị đích ra đời<br />
(kháng thể đơn dòng, thuốc phân tử nhỏ,<br />
ức chế vùng tyrosine kinase [tyrosine<br />
kinase inhibitor - TKI] của thụ thể yếu tố<br />
tăng trưởng biểu mô) và được sử dụng<br />
để điều trị cho BN UTPKTBN. Các nghiên<br />
cứu trên thế giới và tại Việt Nam đã cho<br />
thấy BN có đột biến EGFR có thời gian<br />
sống thêm không bệnh tiến triển (progressionfree survival - PFS) và thời gian sống<br />
thêm toàn bộ (overall survival - OS) cao<br />
hơn BN không có đột biến EGFR khi<br />
được điều trị bằng TKI [1, 2]. Vì vậy, xét<br />
nghiệm đột biến gen EGFR cho BN<br />
UTPKTBN thực sự cần thiết để bác sỹ<br />
lâm sàng lựa chọn phương án điều trị tối<br />
ưu nhất cho người bệnh.<br />
Hiện nay, có nhiều phương pháp khác<br />
nhau để xét nghiệm đột biến gen EGFR<br />
như giải trình tự gen (giải trình tự Sanger<br />
<br />
hoặc pyrosequencing), realtime-PCR (ví dụ<br />
như kít therascreen - Qiagen), lai đầu dò<br />
(StripAssay - ViennaLab)… Mỗi phương<br />
pháp đều có những ưu nhược điểm riêng:<br />
các kít therascreen, StripAssay có độ<br />
nhạy cao, nhưng chỉ phát hiện được số<br />
lượng đột biến giới hạn theo thiết kế kít;<br />
trong khi các phương pháp giải trình tự có<br />
khả năng phát hiện được đột biến mới,<br />
hiếm gặp, nhưng đòi hỏi số lượng tế bào<br />
mang đột biến trong mẫu phân tích lớn<br />
[3]. Do vậy, các phương pháp xét nghiệm<br />
này có thể cho kết quả khác nhau trên<br />
cùng một mẫu phân tích. Vì vậy, việc<br />
ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm<br />
(đặc biệt là kiểm chuẩn quốc tế) có vai trò<br />
đặc biệt quan trọng trong việc đánh giá<br />
khả năng phát hiện đột biến gen EGFR.<br />
Đơn vị Trị liệu gen, Bệnh viện Bạch<br />
Mai đã thực hiện thường quy xét nghiệm<br />
đột biến EGFR từ 2014 và tham gia Mạng<br />
lưới Kiểm soát Chất lượng Di truyền học<br />
Phân tử châu Âu (có trụ sở tại thành phố<br />
Manchester, Anh). Chúng tôi tiến hành đề<br />
tài này nhằm: Chuẩn hóa kỹ thuật và xác<br />
định tính chính xác của xét nghiệm đột<br />
biến gen EGFR bằng kỹ thuật Strip ssay<br />
đang thực hiện tại Đơn vị Gen trị liệu,<br />
Bệnh viện Bạch Mai.<br />
ĐỐI TƢỢNG, PHƢƠNG PHÁP<br />
NGHIÊN CỨU<br />
1. Đối tƣợng nghiên cứu.<br />
10 mẫu bệnh phẩm được nhận từ EMQN,<br />
với mã tham chiếu 1.369. Các mẫu đều<br />
được lấy trực tiếp từ khối u phổi (2 mẫu)<br />
hoặc từ tế bào nuôi cấy (8 mẫu) của BN<br />
UTPKTBN. Cố định các mẫu này bằng<br />
45<br />
<br />
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2016<br />
<br />
formalin và đúc paraffin (formalin-fixed,<br />
paraffin-embedded - FFPE) để làm tiêu<br />
bản HE. Trong tiêu bản HE, tỷ lệ tế bào<br />
ung thư phải đạt > 20%.<br />
<br />
gia ngoại kiểm (bao gồm 277 phòng thí<br />
nghiệm của 39 quốc gia), trong đó tình<br />
trạng đột biến gen EGFR được xác định<br />
trước đó từ một phòng thí nghiệm chuẩn.<br />
<br />
Đây là các mẫu mù, được gửi cho tất<br />
cả các phòng thí nghiệm đăng ký tham<br />
<br />
Thông tin chi tiết về các mẫu ngoại<br />
kiểm được trình bày trong bảng 1.<br />
<br />
Bảng 1: Thông tin về các mẫu kiểm chuẩn.<br />
TT mẫu<br />
<br />
Mã<br />
bệnh phẩm<br />
<br />
Chẩn đoán<br />
<br />
Vị trí/phƣơng pháp lấy mẫu<br />
<br />
Tỷ lệ<br />
tế bào u<br />
<br />
01<br />
<br />
01.6127774<br />
<br />
UTP (biểu mô tuyến)<br />
<br />
U thùy trên phổi phải (phẫu thuật)<br />
<br />
> 20%<br />
<br />
02<br />
<br />
02.6130768<br />
<br />
UTP (biểu mô tuyến)<br />
<br />
U phổi (sinh thiết)<br />
<br />
> 30%<br />
<br />
03<br />
<br />
03.6153218<br />
<br />
UTP (biểu mô tuyến)<br />
<br />
U thùy trên phổi phải (phẫu thuật)<br />
<br />
> 20%<br />
<br />
04<br />
<br />
04.6126965<br />
<br />
EMQN không cung cấp<br />
<br />
EMQN không cung cấp<br />
<br />
> 20%<br />
<br />
05<br />
<br />
05.6127265<br />
<br />
EMQN không cung cấp<br />
<br />
EMQN không cung cấp<br />
<br />
> 20%<br />
<br />
06<br />
<br />
06.6130038<br />
<br />
EMQN không cung cấp<br />
<br />
EMQN không cung cấp<br />
<br />
> 20%<br />
<br />
07<br />
<br />
07.6130241<br />
<br />
EMQN không cung cấp<br />
<br />
EMQN không cung cấp<br />
<br />
> 20%<br />
<br />
08<br />
<br />
08.6126384<br />
<br />
EMQN không cung cấp<br />
<br />
EMQN không cung cấp<br />
<br />
> 20%<br />
<br />
09<br />
<br />
09.6161625<br />
<br />
EMQN không cung cấp<br />
<br />
EMQN không cung cấp<br />
<br />
> 20%<br />
<br />
10<br />
<br />
10.6161844<br />
<br />
EMQN không cung cấp<br />
<br />
EMQN không cung cấp<br />
<br />
> 20%<br />
<br />
2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br />
* Địa điểm nghiên cứu: Đơn vị Gen trị liệu Trung tâm Y học Hạt nhân và Ung bướu,<br />
Bệnh viện Bạch Mai.<br />
* Thời gian nghiên cứu: tháng 7 - 2014.<br />
* Phương pháp nghiên cứu: đối chiếu<br />
kết quả đột biến EGFR tại Đơn vị Gen trị<br />
liệu, Bệnh viện Bạch Mai với kết quả của<br />
EMQN.<br />
* Thiết bị, vật tư, hóa chất:<br />
- Thiết bị: các thiết bị cơ bản của<br />
phòng thí nghiệm sinh học phân tử như<br />
46<br />
<br />
bộ pipet kèm giá đỡ (Eppendorf Research<br />
Plus), máy ly tâm lạnh (Eppendorf 5424R),<br />
máy ủ nhiệt kèm lắc rung (Eppendorf<br />
Thermomixer comfort), máy định lượng<br />
ADN theo nguyên tắc huỳnh quang<br />
(Qubit® 2.0 Fluorometer), máy PCR<br />
(Eppendorf Mastercycler pro S)…<br />
- Hóa chất: kít tách ADN từ mô FFPE<br />
(QIAamp® DNA FFPE Tissue Kit, Qiagen),<br />
kít định lượng ADN theo nguyên tắc<br />
huỳnh quang (Qubit™ dsDNA HS, Molecular<br />
Probes), kít xác định đột biến gen EGFR<br />
(EGFR StripAssay®, ViennaLab)…<br />
<br />
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2016<br />
<br />
- Vật tư tiêu hao: vật tư cần thiết do<br />
các hãng uy tín cung cấp: ống PCR; ống<br />
ly tâm 1,7 ml; đầu tip 10, 20, 200, 1000 µl<br />
(Corning); ống Qubit assay (Invitrogen)…<br />
* Các bước tiến hành: 10 mẫu bệnh<br />
phẩm được thực hiện xét nghiệm đột biến<br />
EGFR theo quy trình như sau: tách ADN<br />
từ mô FFPE (sử dụng kít QIAamp® DNA<br />
FFPE Tissue Kít, Hãng Qiagen), định lượng<br />
ADN (Qubit™ dsDNA HS, Molecular<br />
Probes), khuếch đại đoạn gen quan tâm<br />
bằng phản ứng PCR và lai sản phẩm<br />
khuếch đại với đầu dò đặc hiệu (EGFR<br />
StripAssay®, ViennaLab), phân tích kết<br />
<br />
quả (sử dụng phần mềm StripAssay®<br />
Evaluator, ViennaLab).<br />
* Đối chiếu kết quả: kết quả chất<br />
lượng ADN sau khi tách và đột biến gen<br />
EGFR được gửi lại EMQN tại địa chỉ<br />
https://www.formdesk.com/EMQN/LUNG_<br />
EQA_2014. Sau đó, so sánh kết quả<br />
EMQN của 10 mẫu xét nghiệm đột biến<br />
EGFR tại Đơn vị Gen trị liệu với kết quả<br />
xét nghiệm đã biết trước và EMQN sẽ gửi<br />
lại kết quả cho Đơn vị Gen trị liệu. Ngoài<br />
ra, EMQN còn thông báo với Đơn vị Gen<br />
trị liệu về kết quả xét nghiệm của các labo<br />
khác trên thế giới cùng tham gia chương<br />
trình này.<br />
<br />
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU<br />
1. Nồng độ ADN s u khi tách từ mẫu p r ffin block.<br />
Bảng 2: Nồng độ ADN sau khi tách từ mẫu paraffin block của các mẫu kiểm chuẩn.<br />
STT mẫu<br />
<br />
Mã bệnh phẩm<br />
<br />
Nồng độ ADN<br />
(ng/µl)<br />
<br />
STT<br />
<br />
Mã bệnh phẩm<br />
<br />
Nồng độ ADN<br />
(ng/µl)<br />
<br />
01<br />
<br />
01.6127774<br />
<br />
6,54<br />
<br />
06<br />
<br />
06.6130038<br />
<br />
6,49<br />
<br />
02<br />
<br />
02.6130768<br />
<br />
12,50<br />
<br />
07<br />
<br />
07.6130241<br />
<br />
6,67<br />
<br />
03<br />
<br />
03.6153218<br />
<br />
6,01<br />
<br />
08<br />
<br />
08.6126384<br />
<br />
8,85<br />
<br />
04<br />
<br />
04.6126965<br />
<br />
7,79<br />
<br />
09<br />
<br />
09.6161625<br />
<br />
43,00<br />
<br />
05<br />
<br />
05.6127265<br />
<br />
7,23<br />
<br />
10<br />
<br />
10.6161844<br />
<br />
8,03<br />
<br />
Các mẫu đều thu được nồng độ ADN đạt tiêu chuẩn của kít xét nghiệm EGFR<br />
StripAssay® (hàm lượng ADN cho vào phản ứng PCR nằm trong khoảng 1 - 10 ng/μl).<br />
2. Phát hiện đột biến gen EGFR.<br />
Kết quả một số mẫu phân tích được thể hiện trên hình 1. Mẫu 01.6127774 không<br />
phát hiện đột biến trên exon 18 - 21 gen EGFR. Mẫu 02.6130768 phát hiện đột biến<br />
L858R trên exon 21, là dạng phổ biến thứ hai với tần số xuất hiện khoảng 41% trong<br />
tổng số các đột biến. Mẫu 03.6153218 phát hiện đột biến G719S khá rõ ràng, đây là<br />
đột biến tương đối ít gặp, nằm trên exon 18 gen EGFR.<br />
47<br />
<br />
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2016<br />
<br />
Hình 1: Phân tích kết quả trên thanh teststrip.<br />
Trên mỗi thanh teststrip có sẵn vạch control cho phản ứng lai, PCR negative control<br />
cho từng exon (vạch 17 - 20) và PCR positive control (vạch 21) làm đối chứng. Các vạch<br />
1 - 16 tương ứng với 16 đột biến trên 4 exon 18 - 21. Mẫu 01.6127774 (trái) không phát<br />
hiện đột biến, mẫu 02.6130768 (giữa) phát hiện đột biến L858R trên exon 21, mẫu<br />
03.6153218 (phải) phát hiện đột biến G719S trên exon 18.<br />
Bảng 3: So sánh kết quả phân tích đột biến gen EGFR trên các mẫu kiểm chuẩn.<br />
STT<br />
mẫu<br />
<br />
Mã<br />
bệnh phẩm<br />
<br />
Kết quả phân tích t i<br />
Đơn vị Gen trị liệu<br />
<br />
Kết quả củ EMQN<br />
<br />
01<br />
<br />
01.6127774<br />
<br />
Không phát hiện đột biến<br />
<br />
Không phát hiện đột biến<br />
<br />
02<br />
<br />
02.6130768<br />
<br />
Đột biến L858R (exon 21)<br />
<br />
Đột biến L858R (exon 21)<br />
<br />
03<br />
<br />
03.6153218<br />
<br />
Đột biến G719S (exon 18)<br />
<br />
Đột biến G719S (exon 18)<br />
<br />
04<br />
<br />
04.6126965<br />
<br />
Không phát hiện đột biến<br />
<br />
Không phát hiện đột biến<br />
<br />
05<br />
<br />
05.6127265<br />
<br />
Không phát hiện đột biến<br />
<br />
Không phát hiện đột biến<br />
<br />
06<br />
<br />
06.6130038<br />
<br />
Không phát hiện đột biến<br />
<br />
Không phát hiện đột biến<br />
<br />
07<br />
<br />
07.6130241<br />
<br />
Đột biến mất đoạn E746-A750 (exon 19)<br />
<br />
Đột biến mất đoạn E746-A750 (exon 19)<br />
<br />
08<br />
<br />
08.6126384<br />
<br />
Đột biến L861Q (exon 21)<br />
<br />
Đột biến L861Q (exon 21)<br />
<br />
09<br />
<br />
09.6161625<br />
<br />
Đột biến L858R (exon 21)<br />
<br />
Đột biến L858R (exon 21)<br />
<br />
10<br />
<br />
10.6161844<br />
<br />
Đột biến mất đoạn E746-A750 (exon 19)<br />
<br />
Đột biến mất đoạn E746-A750 (exon 19)<br />
<br />
Kết quả phân tích đột biến gen EGFR trên 10 mẫu kiểm chuẩn tại Đơn vị Gen trị liệu<br />
đều cho kết quả chính xác theo công bố của EMQN, đạt tỷ lệ 100%.<br />
48<br />
<br />
Thêm vào BST
Báo xấu
Download
Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ
