Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng: Đánh giá mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA tinh trùng và các chỉ số tinh dịch đồ ở nam giới vô sinh đến khám và điều trị tại Bệnh viện A Thái Nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ..................  ....................

DƯƠNG THỊ NHÀN

ĐÁNH GIÁ MỐI LIÊN HỆ GIỮA

MỨC ĐỘ PHÂN MẢNH DNA TINH TRÙNG VÀ CÁC CHỈ SỐ TINH DỊCH ĐỒ Ở NAM GIỚI VÔ SINH ĐẾN KHÁM VÀ ĐIỀU TRỊ TẠI BỆNH VIỆN A THÁI NGUYÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

THÁI NGUYÊN, 2020

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ..................  ....................

DƯƠNG THỊ NHÀN

ĐÁNH GIÁ MỐI LIÊN HỆ GIỮA

MỨC ĐỘ PHÂN MẢNH DNA TINH TRÙNG

VÀ CÁC CHỈ SỐ TINH DỊCH ĐỒ Ở NAM GIỚI VÔ SINH

ĐẾN KHÁM VÀ ĐIỀU TRỊ TẠI BỆNH VIỆN A THÁI NGUYÊN

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số: 84 20 201

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Phú Hùng

THÁI NGUYÊN, 2020

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung

thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào. Mọi kết quả thu được

không chỉnh sửa, sao hoặc chép từ các nghiên cứu khác. Mọi trích dẫn trong

luận văn đều ghi rõ nguồn gốc.

Tác giả

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành được luận văn này, em xin trân trọng được gửi lời cảm ơn

sâu sắc nhất tới TS. Nguyễn Phú Hùng đã định hướng khoa học, tận tình hướng

dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất trong suốt quá trình em tiến hành

nghiên cứu.

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo và cán bộ Khoa Công nghệ

Sinh học, Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã tận tình dạy dỗ,

chỉ bảo và truyền cho em niềm đam mê nghiên cứu khoa học.

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo và cán bộ Bộ phận Sau đại

học – Phòng Đào tạo & QHQT, Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái

Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi về thủ tục, văn bản trong suốt quá trình

học tập.

Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Bệnh viện A Thái Nguyên, đặc

biệt các anh chị, các bạn, các em trong Khoa Hỗ trợ Sinh sản – Bệnh viện A

Thái Nguyên nơi tôi đang công tác, đã chia sẻ và giúp đỡ tôi trong thời gian tôi

tiến hành làm luận văn.

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn bố mẹ, anh chị em trong gia đình

luôn động viên và cho tôi thêm động lực hoàn thành tốt quá trình học tập và

nghiên cứu khoa học.

Thái Nguyên,09 tháng 07 năm 2020

Tác giả

Dương Thị Nhàn

iii

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................... ii

ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1

1. Lý do chọn đề tài ............................................................................................... 1

2. Mục tiêu nghiên cứu .......................................................................................... 3

3. Nội dung nghiên cứu ......................................................................................... 3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 4

1.1. Sơ lược sinh lý sinh sản nam .......................................................................... 4

1.1.1. Cấu tạo hệ sinh dục nam ......................................................................... 4

1.1.2. Cấu tạo tinh trùng người ......................................................................... 4

1.1.2. Cấu tạo nhiễm sắc chất tinh trùng người ................................................ 7

1.2. Tình hình vô sinh ở nam giới ......................................................................... 8

1.2.1. Sơ lược vô sinh nam ................................................................................ 8

1.2.2. Nguyên nhân vô sinh ở nam giới ............................................................ 9

1.2.3. Sơ lược tinh dịch đồ ................................................................................ 9

1.3. Sự phân mảnh DNA tinh trùng người .......................................................... 10

1.3.1. Khái niệm về sự phân mảnh DNA tinh trùng ....................................... 11

1.3.2. Một số nguyên nhân chính gây tổn thương DNA của tinh trùng .......... 11

1.3.3. Ảnh hưởng của sự phân mảnh DNA tinh trùng tới khả năng sinh sản

của nam giới .................................................................................................... 13

1.3.4. Các phương pháp xác định sự phân mảnh DNA tinh trùng .................. 15

1.3.5. Phương pháp khảo sát cấu trúc nhiễm sắc chất tinh trùng .................... 16

1.4. Tình hình khám và điều trị vô sinh tại khoa Hỗ trợ Sinh sản – Bệnh viện A

Thái Nguyên ........................................................................................................ 18

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ........................ 21

NGHIÊN CỨU .................................................................................................... 21

2.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu............................................... 21

2.2. Hóa chất và thiết bị....................................................................................... 22

2.2.1. Hóa chất ................................................................................................. 22

2.2.2. Dụng cụ và thiết bị ................................................................................ 22

2.3. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 23

2.3.1. Phương pháp thu nhận mẫu bệnh phẩm ................................................ 23

2.3.2. Phương pháp phân tích tinh dịch đồ ..................................................... 23

2.3.3. Quy trình phân tích sự phân mảnh DNA tinh trùng bằng phương pháp

khảo sát cấu trúc nhiễm sắc chất (SCSA) ....................................................... 24

2.3.4. Phân tích số liệu .................................................................................... 25

2.4. Đạo đức trong nghiên cứu ............................................................................ 25

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................ 26

3.1. Đặc điểm lâm sàng và đặc điểm tinh dịch đồ của đối tượng nghiên cứu .... 26

3.1.1. Đặc điểm lâm sàng của đối tượng nghiên cứu ...................................... 26

3.1.2. Đặc điểm tinh dịch đồ của đối tượng nghiên cứu ................................. 28

3.2. Kết quả phân tích mức độ phân mảnh DNA của tinh trùng ......................... 29

3.3. Kết quả mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA tinh trùng với đặc điểm

lâm sàng và chỉ số tinh dịch đồ của đối tượng nghiên cứu ................................. 31

3.3.1. Mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA tinh trùng với các đặc điểm

lâm sàng ........................................................................................................... 32

3.3.2. Mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA tinh trùng và chỉ số tinh dịch

đồ của đối tượng nghiên cứu ........................................................................... 39

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................. 49

1. Kết luận ........................................................................................................... 49

2. Kiến nghị ......................................................................................................... 50

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt

AO Acridine orange

AOT Acridine orangetest Phương pháp nhuộm acridine orange

ART Kỹ thuật hỗ trợ sinh sản Assited reproductive techniques

BN Bệnh nhân

DFI DNA fragmentation index Chỉ số phân mảnh DNA

dsDNA Double – stranded DNA DNA mạch đôi

FCM Flow cytometer Máy phân tích dòng chảy tế bào

FSH Follice stimulating hormone Hormon kích thích nang noãn

HTSS Hỗ trợ sinh sản

LH Luteinizing hormone Hormon kích thích hoàng thể

ICSI Intra cytoplasmic sperm ịnjection Kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương trứng

IUI Intra ulterine insemination Kỹ thuật bơm tinh trùng vào buồng tử cung

Invitro fertilization Thụ tinh trong ống nghiệm IVF

Nhiễm sắc thể NST

Reactive oxygen species Các tác nhân oxy hóa ROS

Giãn tĩnh mạch thừng tinh GTMTT

Thụ tinh trong ống nghiệm TTTON

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Giá trị bình thường của tinh dịch đồ [54], [81] .................................. 10

Bảng 1.2. Một số phương pháp xác định sự phân mảnh DNA tinh trùng .......... 15

Bảng 2.1. Danh mục hóa chất sử dụng cho nghiên cứu ..................................... 22

Bảng 2.2. Danh mục dụng cụ sử dụng cho nghiên cứu ...................................... 22

Bảng 2.3. Danh mục thiết bị sử dụng cho nghiên cứu ........................................ 23

Bảng 3.1. Đặc điểm lâm sàng của đối tượng nghiên cứu ................................... 26

Bảng 3.2. Đặc điểm tinh dịch đồ của đối tượng nghiên cứu .............................. 28

Bảng 3.3. Kết quả đánh giá mức độ phân mảnh DNA tinh trùng ...................... 30

Bảng 3.4. Mối liên hệ giữa việc sử dụng rượu bia với mức độ phân mảnh DNA

tinh trùng ............................................................................................................. 32

Bảng 3.5. Mối liên hệ giữa việc sử dụng thuốc lá với mức độ phân mảnh DNA

tinh trùng ............................................................................................................. 34

Bảng 3.6. Mối liên hệ giữa tiền sử bị quai bị với mức độ phân mảnh DNA tinh

trùng ..................................................................................................................... 36

Bảng 3.7. Mối liên hệ giữa độ tuổi với mức độ phân mảnh DNA tinh trùng .... 38

Bảng 3.8. Mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA tinh trùng với thời gian

kiêng xuất tinh ..................................................................................................... 40

Bảng 3.9. Mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA tinh trùng với độ pH của

tinh dịch ............................................................................................................... 41

Bảng 3.10. Mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA tinh trùng với thể tích

xuất tinh ............................................................................................................... 42

Bảng 3.11. Mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA với mật độ tinh trùng ... 43

Bảng 3.12. Mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA với độ di động của tinh

trùng ..................................................................................................................... 44

Bảng 3.13. Mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA với tỷ lệ sống của tinh

trùng ..................................................................................................................... 45

Bảng 3.14. Mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA với hình dạng của tinh

trùng ..................................................................................................................... 47

vii

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc tinh trùng trưởng thành ......................................................... 5

Hình 1.2. Sự sinh tinh .......................................................................................... 6

Hình 1.3. Cấu trúc chromatin của tinh trùng ....................................................... 8

Hình 1.4. Các cơ chế chính gây tổn thương DNA trong tinh trùng trong quá

trình sản xuất hoặc vận chuyển các tế bào tinh trùng ........................................ 11

Hình 3.1. Cường độ tín hiệu của tinh trùng sau khi nhuộm AO ....................... 29

Hình 3.2. Tần suất mức độ phân mảnh DNA tinh trùng trong tổng số 151 bệnh

nhân được nghiên cứu ......................................................................................... 31

Hình 3.3. Mối liên hệ giữa tiền sử quai bị với mức độ phân mảnh DNA tinh

trùng ..................................................................................................................... 37

Hình 3.4. Mối tương quan giữa mức độ phân mảnh DNA tinh trùng và pH tinh dịch41

Hình 3.5. Mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA với mật độ tinh trùng ..... 43

Hình 3.6. Mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA với độ di động của tinh

trùng ..................................................................................................................... 45

Hình 3.7. Mối tương quan giữa mức độ phân mảnh DNA với tỷ lệ sống của tinh

trùng ..................................................................................................................... 46

ĐẶT VẤN ĐỀ

1. Lý do chọn đề tài

Vô sinh là tình trạng không có thai sau một thời gian 1 năm chung sống

vợ chồng và không sử dụng một biện pháp tránh thai nào [110]. Vô sinh đã trở

nên phổ biến trên toàn thế giới và ảnh hưởng đến hơn 70 triệu cặp vợ chồng

trong độ tuổi sinh sản [23]. Theo ghi nhận của y văn thế giới, tỷ lệ vô sinh nam

chiếm từ 30 – 40% và cách đây hơn 10 năm, tỷ lệ nam giới điều trị hiếm muộn

có liên quan đến bất thường tinh dịch chiếm 77,3% [7]. Có ý kiến cho rằng khả

năng sinh sản của nam giới đã giảm trong nhiều thập kỷ qua [51] và tỷ lệ khuyết

tật hạt nhân tinh trùng là nguyên nhân gây vô sinh được ước tính đại diện cho

khoảng 3% các cặp vợ chồng vô sinh được hỗ trợ bằng phương pháp thụ tinh

trong ống nghiệm (IVF - In Vitro Fertilization) [62].

Trong hai thập kỷ qua, hình thái tinh trùng được công nhận là một yếu tố

dự báo quan trọng về kết quả trong thụ tinh nhân tạo, thông thường là IVF và

ICSI (Intra cytoplasmic sperm injection) [74]. Trong khi mối quan hệ giữa mật

độ tinh trùng và sự phân mảnh DNA tinh trùng (SDF- Sperm DNA

fragmentation) ở nam giới hiếm muộn có vẻ khác nhau, mối tương quan giữa

SDF và khả năng sống của tinh trùng cũng đã được đánh giá [24]. Nhiều nghiên

cứu cho thấy mức độ đứt gãy DNA tinh trùng ở những người nam vô sinh cao

hơn ở người bình thường [21], [100] và có mối liên quan giữa mức độ dị dạng

của tinh trùng với sự phân mảnh DNA tinh trùng [27], [77], nhưng yếu tố để dự

đoán mức độ phân mảnh DNA tinh trùng không phải là hình dạng tinh trùng

[27] và những tinh trùng bình thường vẫn có thể mang DNA bị phân mảnh [16].

Tinh trùng có tỷ lệ DNA phân mảnh cao sẽ làm ảnh hưởng tới chất lượng

tinh trùng và kết quả có thai của các trường hợp bệnh nhân được điều trị bằng

các phương pháp hỗ trợ sinh sản. DNA bị phân mảnh sẽ ảnh hưởng tới độ di

động của tinh trùng [95], làm giảm tỷ lệ thụ tinh đối với các trường hợp làm

ICSI [79], tăng nguy cơ sảy thai [108], giảm chất lượng phôi, giảm tỷ lệ tiền làm

tổ [48]. Theo Aziz N (2008), thất bại của IUI (Intra ulterine insemination) đòi

hỏi phải đánh giá thêm các đặc tính sinh học của tinh trùng, chẳng hạn như dấu

hiệu apoptotic và phân mảnh DNA tinh trùng [17].

Các phương pháp phổ biến được sử dụng để đánh giá sự phân mảnh DNA

tinh trùng gồm có phương pháp khảo sát sự phân tán nhiễm sắc chất tinh trùng

(SCD – Sperm chromatin dispersion assay), phương pháp khảo sát cấu trúc

nhiễm sắc chất tinh trùng (SCSA – Sperm chromatin structure assay), phương

pháp dịch mã đứt gãy tại chỗ,... Một trong những phương pháp phổ biến được sử

dụng để đánh giá sự phân mảnh DNA tinh trùng là phương pháp SCSA. Phương

pháp này sẽ định lượng sự phân mảnh DNA trực tiếp dựa vào sự kết hợp DNA

bị biến tính với chất nhuộm DNA huỳnh quang acridine orange. Giá trị ngưỡng

của SCSA đã được xác định và đưa vào trong chẩn đoán lâm sàng. SCSA là một

phương pháp có nhiều tiềm năng hỗ trợ cho chẩn đoán và điều trị của các cặp vợ

chồng hiếm muộn.

Tại Bệnh viện A Thái Nguyên, lượng bệnh nhân vô sinh đến khám và

điều trị ngày càng tăng và với nhiều nguyên nhân khác nhau. Để đưa ra được

hướng điều trị nhằm đạt kết quả tốt nhất cho từng trường hợp, các cặp vợ chồng

cần phải làm đầy đủ các xét nghiệm lâm sàng, đối với nữ: xét nghiệm nội tiết,

siêu âm đánh giá tử cung – buồng trứng, xét nghiệm máu cơ bản (viêm gan B,

viêm gan C, HIV,…); đối với nam: xét nghiệm nội tiết, xét nghiệm tinh dịch đồ,

xét nghiệm máu cơ bản, và gần đây là xét nghiệm phân mảnh DNA tinh trùng.

Ở Việt Nam hiện nay, có nhiều trung tâm đã nghiên cứu và triển khai

đánh giá mức độ phân mảnh DNA tinh trùng bằng nhiều phương pháp khác

nhau. Tuy nhiên, để đánh giá mối tương quan giữa các chỉ số tinh dịch đồ với

mức độ phân mảnh của các trường hợp vô sinh nam đến khám và điều trị tại

khoa Hỗ trợ Sinh sản – Bệnh viện A Thái Nguyên chưa được xây dựng. Chính

vì vậy, tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Đánh giá mối liên hệ giữa mức độ

phân mảnh DNA tinh trùng và các chỉ số tinh dịch đồ ở nam giới vô sinh

đến khám và điều trị tại Bệnh viện A Thái Nguyên” để góp phần vào việc đưa

thêm yếu tố tiên lượng cho việc hỗ trợ điều trị hiếm muộn được cải thiện và

nâng cao hơn.

2. Mục tiêu nghiên cứu

Phân tích sự phân mảnh DNA của tinh trùng và mối liên hệ giữa mức độ

phân mảnh với các chỉ số tinh dịch đồ phục vụ cho công tác chẩn đoán và điều

trị vô sinh nam tại Bệnh viện A Thái Nguyên.

3. Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu các chỉ số tinh dịch đồ và đặc điểm lâm sàng của đối tượng

nghiên cứu.

- Phân tích mức độ phân mảnh DNA tinh trùng của đối tượng nghiên cứu.

- Phân tích mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA tinh trùng và các

chỉ số tinh dịch đồ.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Sơ lược sinh lý sinh sản nam

1.1.1. Cấu tạo hệ sinh dục nam

Hệ sinh dục nam bao gồm:

- Tinh hoàn: là nơi sinh ra tinh trùng và tổng hợp nội tiết tố nam

testosterone.

- Đường dẫn tinh trùng: từ tinh hoàn đi đến đổ vào niệu đạo và ra ngoài.

- Các tuyến sinh dục phụ: chế tiết các dịch tiết, đóng vai trò quan trọng

trong việc hình thành tinh dịch.

Sự điều hòa hoạt động sinh tinh chế tiết nội tiết tố của tinh hoàn thông

qua trục hạ đồi – tuyến yên – tinh hoàn và một số cơ chế điều hòa nội tại ở tinh

hoàn. Hiện tượng cương dương vật và phóng tinh ở nam có sự tham gia của hệ

thần kinh tự động và hệ thần kinh cảm thể [3], [7].

Trong những năm gần đây, vô sinh nam đang thu hút sự quan tâm ngày

càng tăng vì bằng chứng về chất lượng tinh dịch giảm ở những người đàn ông

trẻ và khỏe mạnh trên toàn thế giới [12], [83], [106]. Giảm số lượng hay chất

lượng tinh trùng hay bất thường ở bất kỳ giai đoạn nào trong quá trình sinh tinh

trùng, vận chuyển tinh trùng, phóng tinh… đều có thể dẫn đến vô sinh nam [21],

[100].

1.1.2. Cấu tạo tinh trùng người

Tinh trùng người là các tế bào đơn bội, mang 23 nhiễm sắc thể (NST) là

đặc điểm di truyền của người cha. Tinh trùng có cấu tạo phù hợp giúp tinh trùng

có thể di chuyển, nhận biết và thụ tinh với noãn trong đường sinh dục nữ. Tế bào

tinh trùng có kích thước nhỏ nhất trong cơ thể và có mức độ biệt hóa cao. Một

tinh trùng trưởng thành có chiều dài khoảng 50µm, bao gồm phần đầu và phần

đuôi. Phần đầu có chiều dài khoảng 5µm, ngang 2,5µm và dày 1,5µm bao gồm

thể cực đầu (acrosome) chứa các enzyme cần thiết cho quá trình thụ tinh và nhân

chứa vật chất di truyền [1]. Phần đuôi tinh trùng dài khoảng 45µm, gồm phần

cổ, đoạn giữa, đoạn chính và chóp đuôi. Đuôi tinh trùng là bộ phận chịu trách

nhiệm chính cho khả năng di động của tinh trùng (Hình 1.1)

(Head: đầu; Plasma membrane: màng plasma; Acrosome: thể cực đầu; Nucleus:

nhân; Centriole: trung thể; Mitochondria: ty thể; Mid-pieace: đoạn giữa; Tail: đuôi;

End piece: chóp đuôi; Flagellium: roi; Axialflament: trục chính)

Hình 1.1. Cấu trúc tinh trùng trưởng thành [14]

Theo Mortimer (1994), sau khi quá trình sinh tinh được diễn ra, để hình

thành nên tinh trùng trưởng thành từ tinh nguyên bào sẽ mất khoảng 70 ± 4 ngày

và gồm 2 giai đoạn chính [84]:

- Giai đoạn hình thành tinh tử.

- Giai đoạn tinh tử biệt hóa thành tinh trùng.

Các tinh nguyên bào tinh trùng gồm có tinh nguyên bào loại A1, A2, A3,

A4, tinh nguyên bào trung gian và tinh nguyên bào loại B nằm ở phần biểu mô

gần màng đáy ống sinh tinh. Mỗi loại, theo thứ tự là kết quả của việc phân chia

nguyên nhiễm từ loại tinh nguyên bào trước đó. Tinh nguyên bào loại B là loại

cuối cùng còn nguyên phân để tạo nên tinh bào sơ cấp. Các tinh bào sơ cấp trải

qua giảm phân I tạo thành tinh bào thứ cấp. Tinh bào thứ cấp giảm phân II tạo ra

tinh tử đơn bội.

Theo Dym (1971), các tinh nguyên bào sẽ liên kết với nhau qua cầu sinh

chất trong suốt quá trình phân bào và tế bào chất phân chia không hoàn toàn.

Suốt quá trình phát triển, các tế bào dần dần di chuyển từ màng đáy để tiến về

lòng ống sinh tinh. Khi tinh tử đến thành ngoài cùng của lòng ống, chúng tách

bỏ phần tế bào chất dính với nhau (thể thừa) và biệt hóa thành các tinh trùng tự

do [41], [88].

Để tạo nên tinh trùng trưởng thành, tinh tử sẽ thay đổi về cấu tạo, hình

thái sau khi trải qua 3 bước gồm: sự cô đặc nhân, sự hình thành thể cực đầu

(acrosome) và quá trình hình thành đuôi. Sự cô đặc nhân là quá trình nén chặt để

NST (Nhiễm sắc thể) có cấu trúc nhỏ gọn nhất. Cấu trúc này giúp ổn định và

bảo vệ DNA người cha trong suốt quá trình di chuyển của tinh trùng. Acrosome

được hình thành từ bộ máy Golgi, che phủ khoảng 30 – 50% bề mặt nhân tế bào

tinh trùng [37]. Acrosome có chứa nhiều enzyme thủy phân, bao gồm

hyaluronidase và proacrosine, cần thiết cho quá trình xâm nhập vào noãn và thụ

tinh của tinh trùng. Những enzyme này có vai trò quan trọng trong việc hỗ trợ

tinh trùng xâm nhập vào màng trong suốt (màng zona pellucida – zp) của noãn.

Như vậy, nhân tinh trùng và acrosome là cấu tạo chính phần đầu của tinh trùng.

Phần cổ và đuôi tinh trùng được hình thành từ trung tử. Đuôi có cấu trúc sợi

trục, gồm hai sợi trong trung tâm và chín cặp ngoại vi. Các ti thể bao bọc quanh

sợi trục ở phần giữa, cung cấp năng lượng cho hoạt động di chuyển của đuôi

tinh trùng.

Hình 1.2. Sự sinh tinh [41]

Như vậy, sự biệt hóa thành tinh tử được đặc trưng bởi việc bất hoạt bộ

gen, nhiễm sắc thể được nén chặt tạo thuận lợi cho quá trình di chuyển của tinh

trùng và sự hình thành các cấu trúc chức năng quan trọng cho quá trình di

chuyển và thụ tinh như phần đuôi tinh trùng, thể cực đầu. Sự phát sinh tinh trùng

là một quá trình được kiểm soát liên tục và chính xác, bao gồm những thay đổi

cực kỳ rõ rệt về tế bào, di truyền và nhiễm sắc thể dẫn đến việc tạo ra các tế bào

tinh trùng chuyên biệt cao.

Sau khi tinh trùng được giải phóng ra mào tinh, tinh trùng mất đi các túi

bào tương thừa ở cổ, ổn định cấu trúc cực đầu. Cấu trúc glycoprotein màng

ngoài tinh trùng thay đổi tạo thuận lợi cho quá trình nhận diện và phản ứng với

noãn. Bên cạnh đó, mức độ chuyển hóa trong tinh trùng tăng dần và khả năng di

động của tinh trùng tăng dần trong thời gian tinh trùng di chuyển dọc theo mào

tinh. Như vậy, sự trưởng thành của tinh trùng trong mào tinh giúp tinh trùng tăng

khả năng di chuyển, nhận diện và kết hợp với noãn trong đường sinh dục nữ.

1.1.2. Cấu tạo nhiễm sắc chất tinh trùng người

Nhiễm sắc chất (Chromatin) là vật chất di truyền của tế bào gồm các

chuỗi DNA kết hợp với protein cấu trúc. Phần lớn chất nhiễm sắc của tinh trùng

được ngưng tụ bởi các protamine ở dạng cấu trúc hình xuyến rất nhỏ gọn, mỗi

cấu trúc chứa khoảng 50 Kb DNA [18], [62], mặc dù khoảng 8% DNA vẫn được

tổ chức bởi histones [55], [56], [61]. Các protein cấu trúc này có vai trò tổ chức

hình thái và điều hòa hoạt động của DNA. Ở tế bào sinh dưỡng, protein cấu trúc

chủ yếu là các protein histone. Chromatin trong tế bào tinh trùng có sự khác biệt

với chromatin của tế bào sinh dưỡng. Trước quá trình giảm phân, chromatin của

tinh nguyên bào cũng mang các protein histone, khi các tế bào giảm phân,

protein histone này được thay thế bởi biến thể histone đặc trưng cho tinh hoàn

[30]. Trước khi tiến hành thay thế histone, chromatin dãn rộng và có nhiều vùng

co cụm. Các biến thể histone thay thế vào giúp chromatin trở nên gọn gàng và

đồng đều hơn [86]. Tiếp theo, trong các tinh tử hình cầu, protein histone được

thay thế dần bởi protein chuyển tiếp. Đến giai đoạn tinh tử kéo dài, protein

chuyển tiếp bị loại khỏi chromatin và thay bằng protamine. Ở người khi kết thúc

quá trình sinh tinh, khoảng 85% histone được thay thế bởi protamine [39]. Quá

trình thay thế histone thành protamine rất quan trọng trong sự hình thành

tinh trùng cũng như chức năng sinh lý của tinh trùng khi gặp noãn [115].

Protamine có kích thước khoảng một nửa histone. Chúng là các protein rất

kiềm, giàu 2 amino axit là arginine và cysteine [39], [71]. Hàm lượng arginine

cao (lên đến 70% trong tổng số các amino axit) hình thành một mạng lưới điện

tích dương, giúp protamine có thể liên kết chặt chẽ với DNA mang điện tích âm

[26]. Cysteine góp phần trong việc hình thành cầu nối disulfide nội phân tử của

protamine và liên kết giữa các protamine với nhau [34]. Protamine giúp nén chặt

các sợi DNA và hình thành các đơn vị đóng gói cơ bản của chromatin tinh trùng

được gọi là toroid, một phần nhỏ liên kết với histone tạo cấu trúc lỏng lẻo hơn

và phần còn lại liên kết với chất nền nhân tinh trùng (Matrix Attachment

Regions - MAR) có kích thước khoảng 50kb (Hình 1.3). Các liên kết chéo

disulfide nội phân tử và liên phân tử giữa các cysteine trong protamine giúp các

toroid càng nén chặt hơn nữa [70]. Với cấu trúc có sự tham gia của protamine,

DNA tinh trùng người được nén chặt bằng 1/6 so với DNA của tế bào sinh

dưỡng bình thường.

Hình 1.3. Cấu trúc chromatin của tinh trùng [111]

Thành phần protein quan trọng khác trong cấu trúc DNA tinh trùng là

histone. Theo Hammoud và cộng sự (2009), có khoảng 4% lượng DNA liên kết

với histone tại các vùng gen khởi động phiên mã (gene promoter site) [61]. Toàn

bộ các vùng gen đặc trưng cho quá trình sinh tinh và thụ tinh được xác định là

liên kết với histone trong nhiễm sắc thể của tinh trùng. Tuy nhiên, những vùng

gen này lại dễ bị bất hoạt bởi hoạt động của các enzyme nuclease. Histone trong

DNA tinh trùng không được thay thế bởi histone của noãn sau quá trình thụ tinh

nên bất cứ tổn thương nào ở vùng này cũng sẽ truyền trực tiếp cho phôi [10]. Do

đó, nếu không được phát hiện và sửa chữa sẽ ảnh hưởng lớn đến sự phát triển

của phôi và thai nhi.

1.2. Tình hình vô sinh ở nam giới

1.2.1. Sơ lược vô sinh nam

Vô sinh nam được định nghĩa là tình trạng nam giới không có khả năng

thụ thai cho nữ giới sau khi kết hôn 12 tháng mà không sử dụng biện pháp tránh

thai nào [40]. Người ta ước tính rằng 20 - 30% các trường hợp vô sinh chỉ do

yếu tố nam giới và 20% khác liên quan đến các vấn đề từ cả hai vợ chồng [64]

và sự suy giảm số lượng tinh trùng được báo cáo trong các báo cáo khoa học

ngày càng tăng [78]. Song song với số lượng tinh trùng, suy giảm là một xu

hướng đáng lo ngại không kém và kéo dài trong các bất thường của hệ thống

sinh sản nam giới, chẳng hạn như hiện tượng tinh hoàn ẩn, khối u tế bào mầm và

đến tuổi dậy thì [104]. Nếu xu hướng tiêu cực về số lượng tinh trùng và các vấn

đề về hệ thống sinh sản nam có giá trị, thì điều đó có nghĩa gì đối với khả năng

sinh sản của nam giới nói chung và có những vấn đề khác liên quan đến sức

khỏe sinh sản của nam giới [105].

1.2.2. Nguyên nhân vô sinh ở nam giới

Các nguyên nhân dẫn tới vô sinh nam bao gồm [3]:

- Nhóm nguyên nhân bất thường về tinh trùng:

+ Thiểu năng tinh trùng: Tinh trùng ít, yếu, dị dạng.

+ Không tinh trùng.

- Nhóm nguyên nhân khác:

+ Giãn tĩnh mạch thừng tinh (GTMTT).

+ Rối loạn chức năng giao hợp, rối loạn phóng tinh.

+ Rối loạn nội tiết.

+ Miễn dịch.

+ Bệnh lý toàn thân.

+ Tổn thương tinh hoàn mắc phải.

+ Nhiễm trùng tuyến sinh dục phụ.

+ Bệnh lý di truyền.

1.2.3. Sơ lược tinh dịch đồ

Người ta ước tính các bất thường của tinh trùng về sản xuất hay hoạt động

chức năng, chiếm từ 35% đến 50% các trường hợp vô sinh. Tinh dịch đồ là một

xét nghiệm nhằm đánh giá chất lượng của tinh trùng, thông qua các chỉ số như

số lượng, khả năng di động, hình dạng bình thường… mặc dù không cung cấp

các thông tin về hoạt động chức năng của tinh trùng, dựa vào kết quả của một

tinh dịch đồ, người ta có thể đánh giá một cách khái quát về khả năng sinh sản

của nam giới [20], [113].

Đa số các trung tâm trên thế giới và khu vực đều đánh giá tinh dịch đồ

dựa theo cẩm nang của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO). Phiên bản đầu tiên được

phát hành vào 1980 và từ 2010 đến nay, hầu hết các trung tâm đều thực hiện

theo hướng dẫn của phiên bản thứ năm (WHO, 2010) [113]. Đây là phiên bản

hoàn chỉnh nhất hiện nay, thay đổi quy trình và cách diễn giải kết quả, cũng như

cách đánh giá theo tiêu chuẩn mới chính xác hơn, nghiêm ngặt hơn để hạn chế

sai số tối thiểu và mang lại kết quả tối ưu nhất cho các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản

(Bảng 1.1).

Tinh dịch đồ theo tiêu chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới, ngoài các chỉ số

về tinh trùng còn có các trị số về pH tinh dịch. Dịch túi tinh mang tính kiềm,

trong khi đó dịch tiền liệt tuyến mang tính axít, sự pha trộn của hai dịch này làm

cho độ pH của tinh dịch có tính kiềm (pH = 7,2 - 8). Nếu túi tinh không có, teo

hay vô chức năng, hay bế tắc cả hai ống phóng tinh, thể tích tinh dịch sẽ thấp (<

1mL) và pH axit (< 7,0) vì tinh dịch chỉ có dịch tuyến tiền liệt là chính [66],

[113].

Trong điều kiện được kiểm soát, chất lượng tinh dịch phụ thuộc các yếu

tố thường không thể thay đổi như khả năng sản xuất tinh trùng từ tinh hoàn, dịch

tiết từ các tuyến phụ và tình trạng sức khỏe gần thời điểm lấy mẫu (đặc biệt là

bệnh sốt cao), cũng như thời gian kiêng xuất tinh. Các điều này cần được ghi

nhận khi phân tích kết quả.

Bảng 1.1. Giá trị bình thường của tinh dịch đồ [54], [81]

Các chỉ số bình thường của WHO, Các chỉ số bình thường của WHO,

2010 1999

- Thể tích tinh dịch: ≥ 1,5ml. - Thể tích tinh dịch ≥ 2 ml.

- pH ≥ 7,2. - pH: 7,2 - 8,0.

- Mật độ tinh trùng: ≥ 15.106/ml. - Mật độ: ≥ 20.106 TT/ml.

- Tổng số tinh trùng: ≥ 39.106/lần xuất

tinh. - Độ di động của tinh trùng: A ≥ - Độ di động của tinh trùng: 25%, hoặc A+B ≥ 50%. PR ≥ 32%, hoặc PR + NP ≥ 40%. - Hình dạng bình thường: ≥ 15%. - Hình dạng bình thường: ≥ 4%. - Tỉ lệ sống ≥ 75%. - Tỉ lệ sống: ≥ 58%.

1.3. Sự phân mảnh DNA tinh trùng người

1.3.1. Khái niệm về sự phân mảnh DNA tinh trùng

Sự phân mảnh DNA tinh trùng là hiện tượng bất ổn trong bộ nhiễm sắc thể

của tinh trùng. Các phân tử DNA bị đứt gãy, làm thay đổi tính toàn vẹn của bộ gen.

Sự bất thường về bộ gen này gây ra mất khả năng kết hợp giữa tinh trùng và trứng,

mất khả năng phân chia tế bào hoặc phôi ngừng phân chia, thoái hoá và chết. Điều

này giải thích cho sự giảm khả năng thụ tinh hoặc sảy thai liên tiếp, hoặc sinh con

bất thường. Đây là nguyên nhân đặc biệt quan trọng dẫn tới vô sinh nam. Nguyên

nhân dẫn tới phân mảnh DNA của tinh trùng có thể bao gồm:

- Khiếm khuyết trong thay thế histone bằng protamine trong quá trình biệt hóa.

- Hiện tượng chết theo chu trình (Apoptosis).

- Hậu quả của việc tiếp xúc với các tác nhân oxy hóa (Reactive

oxygen species - ROS) trong quá trình di chuyển trong lòng ống sinh tinh và

mào tinh hoàn.

Bên cạnh đó, trong nghiên cứu của Denny Sakkas và cộng sự (2010) cũng

chỉ ra một số nguyên nhân gây ra sự phân mảnh DNA tinh trùng (Hình 1.4)

Hình 1.4. Các cơ chế chính gây tổn thương DNA trong tinh trùng trong quá

trình sản xuất hoặc vận chuyển các tế bào tinh trùng [38]

((i) Apoptosis trong quá trình sản sinh tinh trùng; (ii) Sự phá vỡ chuỗi DNA

trong quá trình sản sinh tinh trùng; (iii) DNA phân mảnh do ROS ở sau tinh hoàn; (iv)

DNA phân mảnh do yếu tố nội sinh và ngoại sinh; (v) DNA phân mảnh do xạ trị và

hóa trị; (vi) DNA phân mảnh do ô nhiễm môi trường)

1.3.2. Một số nguyên nhân chính gây tổn thương DNA của tinh trùng

* Khiếm khuyết trong thay thế histon bằng protamine trong quá trình biệt hóa

Trong quá trình biệt hóa, tinh tử được thay thế protein histon bằng

protamine dẫn đến hư hỏng DNA. Trong quá trình này, các chromatin phải biến

đổi để nén toàn bộ vật chất di truyền vào đầu tinh trùng. Khi thay đổi các protein

cấu trúc và tiến hành cuộn nén, DNA phải chịu một áp lực xoắn rất lớn. Enzyme

DNA topoisomerase II giúp DNA tháo xoắn và giảm áp lực này bằng cách cắt

mạch DNA tạo các nick tạm thời [76].

* Hiện tượng chết theo chu trình (apoptosis)

Quá trình apoptosis ở tế bào mầm sinh dục xảy ra theo con đường truyền

tín hiệu đến thụ thể nhận diện sự chết nằm trên bề mặt tế bào (cell surface death

receptor). Quá trình này được điều khiển bởi tế bào Sertoli khi tế bào mầm bước

vào giai đoạn giảm phân I, thông qua sự hoạt động của các thụ thể chết (Fas).

Các tế bào Sertoli có chức năng nuôi dưỡng, giúp các tế bào mầm phát triển và

biệt hóa tinh tử thành tinh trùng. Tuy nhiên, tế bào Sertoli chỉ có thể hỗ trợ một

số lượng tế bào mầm có giới hạn. Vì vậy, quá trình chết theo chương trình

(apoptosis) thường xảy ra để ngăn chặn sự sản xuất quá mức các tế bào mầm và

loại bỏ có chọn lọc các tế bào mầm bị tổn thương [52]. Protamine hoạt động như

một trạm kiểm soát (checkpoint) của quá trình sinh tinh, những tế bào biểu hiện

protamine bất thường, có nguy cơ tổn thương DNA sẽ kích hoạt quá trình

apoptosis [42]. Trong quá trình sinh tinh, có khoảng 50% – 60% tế bào mầm

sinh dục sẽ bị sàng lọc và cảm ứng quá trình apoptosis.

* Tiếp xúc với các tác nhân oxy hóa tự do nội bào hay ngoại bào

Khi tinh trùng tách ra khỏi các tế bào Sertoli thì khả năng sửa chữa sai

hỏng DNA cũng bị hạn chế. Tinh tử trước khi phát triển thành tinh trùng sẽ loại

bỏ các túi bào tương thừa để trưởng thành về hình thái. Những túi bào tương

thừa này chứa rất nhiều enzyme glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH).

G6PDH tồn tại ở nồng độ cao đã kích thích sự sản sinh ra NADPH, một nguồn

cung cấp electron cho các phản ứng tạo ra ROS [94]. Gần đây, một số nghiên

cứu đã chứng minh rằng ở những người đàn ông vô sinh, ty thể của tinh trùng

tạo ra sự dư thừa của ROS có liên quan đến giảm khả năng vận động và tổn

thương DNA [102]. Người ta đã phát hiện ra rằng, sự khiếm khuyết tinh trùng

người được đặc trưng bởi hàm lượng axit béo không bão hòa cao bất thường

thúc đẩy sự tạo ra ROS bởi ty thể của tinh trùng, tạo ra trạng thái căng thẳng oxy

hóa và mất khả năng chức năng đồng thời [69], [89]. Việc sản xuất ROS của tinh

trùng được liên kết với hệ thống NADPH oxyase được định vị trong màng

plasma của tinh trùng và với hệ thống oxy hóa NADH có trong chuỗi hô hấp của

ty thể. Các enzyme này, trong điều kiện đặc biệt, tạo ra H2O2, được coi là chất

nền có khả năng phản ứng cao trong các phản ứng hóa học với kim loại (ví dụ

Fe² +), mang lại sự hình thành OH hydroxyl triệt để. -OH được coi là gốc phản

ứng nguy hiểm và nguy hiểm nhất có thể phản ứng với lipit màng, protein và

DNA/RNA khi nồng độ của nó vượt quá nồng độ của chất nền [67]. Hai yếu tố

bảo vệ DNA tinh trùng khỏi các tác động của gốc tự do: đóng gói DNA bằng

protein histone và các hợp chất chống oxy hóa [59], [60].

Stress oxy hóa xảy ra khi có sự sản sinh các tác nhân oxy hóa (Reactive

Oxygen Species – ROS) vượt mức. Một ví dụ oxy hóa điển hình là peroxide hóa

lipid trong màng tế bào. Màng tế bào tinh trùng chứa nhiều axit béo không bão

hòa. Khi bị oxy hóa, chúng tạo thành gốc peroxyl (ROO-) và alkoxyl (RO-),

đồng thời giải phóng H+ hoặc OH-. Gốc OH- có thể gây hư hỏng DNA bằng

việc tấn công các phân tử đường pentose, purin và pyrimidine [5], [93].Tinh

trùng có thể tiếp xúc ROS do những nguyên nhân sau: (1) tiếp xúc với các tinh

trùng chưa trưởng thành khi cùng di chuyển trong lòng ống sinh tinh và mào

tinh hoàn; (2) do các tác động từ môi trường. ROS được tạo ra có thể cảm ứng

làm phân mảnh DNA tinh trùng trưởng thành do các tế bào tinh trùng trưởng

thành di chuyển cùng và ở rất gần với các tế bào tinh trùng chưa trưởng thành từ

ống sinh tinh đến đuôi mào tinh [117].

Tuy nhiên, các tổn thương xảy ra sau tinh hoàn, trong quá trình vận

chuyển tinh trùng trong mào tinh cũng là một trong những nguyên nhân gây

phân mảnh DNA tinh trùng.

1.3.3. Ảnh hưởng của sự phân mảnh DNA tinh trùng tới khả năng sinh sản

của nam giới

Tinh trùng không có khả năng sửa chữa DNA bị tổn thương xảy ra trong

mào tinh hoặc trong quá trình xuất tinh [8]. Hoạt động sửa chữa DNA của tinh

trùng phụ thuộc vào hệ thống tự sửa chữa của tế bào noãn sau khi thụ tinh được

diễn ra [108]. Trên thực tế, các bản sao và protein của mẹ hỗ trợ sự phát triển

của hợp tử cho đến khi bộ gen của phôi thai được kích hoạt. Khả năng của noãn

bào để sửa chữa tổn thương DNA trong thụ tinh tinh trùng sẽ không chỉ phụ

thuộc vào mức độ và loại tổn thương nhiễm sắc thể tinh trùng, mà còn về chất

lượng của máy móc sửa chữa tế bào mầm nữ [108]. Vì vậy, sự phân mảnh DNA

tinh trùng là một trong những nguyên nhân quan trọng gây ra tình trạng vô sinh

ở nam giới.

Tính toàn vẹn DNA của tinh trùng là yếu tố quan trọng để có thể truyền

đạt ổn định đặc điểm di truyền của người cha [43]. Nghiên cứu của Brahem và

cộng sự (2012) đã chứng minh có mối liên quan giữa sự phân mảnh DNA và khả

năng tồn tại của tinh trùng, mức độ phân mảnh DNA cao thì tỷ lệ tinh trùng chết

cũng cao [19]. Nhiều nghiên cứu cũng đã cho thấy mức độ tổn thương DNA tinh

trùng cao có ảnh hưởng đến khả năng sinh sản. Chỉ số phân mảnh DNA tinh

trùng (DFI) thấp (0 –15%), trung bình (16 – 29%) và cao (≥ 30%) lần lượt tương

ứng với tiềm năng sinh sản cao, trung bình và rất thấp [43]. Cũng theo nghiên

cứu của Evenson và cộng sự (2008), sự phân mảnh DNA có liên quan đến việc

giảm khả năng thụ thai tự nhiên, suy giảm chất lượng phôi và tỷ lệ sẩy thai cao

hơn bình thường [19]. Đồng thời, theo nghiên cứu của Zini và cộng sự (2005), tỷ

lệ phân mảnh DNA cao cũng gia tăng nguy cơ sẩy thai khi thực hiện các kỹ

thuật hỗ trợ sinh sản như thụ tinh trong ống nghiệm (Invitro Fertilization – IVF)

hay tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (Intra Cytoplasmic Sperm Injection –

ICSI) [117]. Ngoài ra, tổn thương DNA tinh trùng có thể gây ảnh hưởng đến tỷ

lệ thành công của các quá trình hỗ trợ sinh sản như làm giảm tỷ lệ thụ tinh, giảm

khả năng làm tổ, giảm chất lượng phôi, giảm tỷ lệ thai tiến triển và tỷ lệ trẻ sinh

sống [13]. Trẻ sinh ra từ bố có tinh trùng bị phân mảnh DNA có nguy cơ bị dị tật

bẩm sinh, mắc các bệnh ung thư, giảm khả năng sinh sản và có thể ảnh hưởng

đến nhiều chức năng khác trong cơ thể sau khi trưởng thành [9]. Theo Bungum

và cộng sự (2007), nếu những người chồng có chỉ số DFI của tinh trùng trên

25% thì cặp vợ chồng đó nên được điều trị bằng ICSI để đạt được tỷ lệ thành

công cao nhất. Bungum cũng cho rằng cơ hội mang thai bị giảm đáng kể khi một

cặp vợ chồng tiến hành bơm tinh trùng vào buồng tử cung

(IntraUterineInsemination – IUI) với chỉ số DFI của người chồng càng gần 30%

và cơ hội gần như bằng không nếu chỉ số DFI vượt quá 30% [25].

1.3.4. Các phương pháp xác định sự phân mảnh DNA tinh trùng

Năm 2016, một hội đồng bao gồm năm bác sĩ tiết niệu và bác sĩ nội khoa

cùng với chuyên gia về vô sinh nam đã đưa ra khuyến nghị dựa trên bằng chứng

và đưa ra các phương pháp đánh giá sự phân mảnh DNA tinh trùng [6]. Các

phương pháp sử dụng phổ biến hiện nay được trình bày trong bảng 1.2.

Bảng 1.2. Một số phương pháp xác định sự phân mảnh DNA tinh trùng

Tên phương pháp

Nguyên tắc phát hiện

Phương thức đọc kết quả

Acridine Orange Staining - Nhuộm

Phát hiện sự tổn thương DNA dựa trên sự bắt màu thuốc nhuộm khác nhau giữa DNA mạch đôi và

Kính hiển vi huỳnh quang

acridine orange

DNA mạch đơn

Kính hiển vi huỳnh quang

Phát hiện sự phân mảnh DNA

hoặc máy phân tích dòng chảy tế bào (Flow Cytometry

TUNEL assay - Sàng lọc Tunel

nguyên nhân do dứt gãy DNA mạch đơn và mạch đôi

– FCM)

Đánh giá mức độ toàn vẹn DNA

Alkaline single

Kính hiển vi huỳnh quang

tinh trùng dựa vào phát hiện tỷ lệ DNA đứt gãy mạch đôi hoặc

cell gel electrophoresis

mạch đơn

(Comet assay) -

Sàng lọc Comet

Máy phân tích dòng chảy tế bào (FCM)

Biến tính DNA trong môi trường axit, nhuộm với Acridine Orange để đánh giá mức độ tổn thương DNA

Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA) - Khảo sát cấu trúc nhiễm sắc chất tinh trùng

Sperm Chromatin

Kính hiển vi huỳnh quang hoặc kính hiển vi quang học

Dựa vào kích thước quầng sáng DNA tập trung xung quanh phần đầu tinh trùng để đánh giá tính toàn vẹn của DNA

Dispersion Test (SCD test)- Test sự phân tán nhiễm sắc chất

Các phương pháp đã được xây dựng thành công trong những năm gần đây

bao gồm: phương pháp khảo sát cấu trúc nhiễm sắc chất tinh trùng (SCSA),

phương pháp điện di trên cá thể tế bào đơn (COMET), phương pháp nhuộm

acridine orange (AOT), phương pháp đánh dấu đứt gãy DNA bằng các dUTP

được xúc tác bởi enzyme terninal deoxunucleotidyl transferase (TUNEL),

phương pháp dịch mã đứt gãy tại chỗ (ISNT), phương pháp khảo sát sự phân tán

nhiễm sắc chất của tinh trùng (SCD)…[46], [52], [53] (Bảng 1.2). Các phương

pháp thường được sử dụng là phương pháp TUNEL, SCD, và SCSA [80]. Hiện

nay, khảo nghiệm SCSA chỉ có một quy trình được quốc tế chấp nhận, trong khi

các phương pháp khác (TUNEL, COMET, SCD) đều có các quy trình biến thể

riêng phù hợp với khả năng của các phòng thí nghiệm [49]. Trong nghiên cứu

này, chúng tôi đã sử dụng phương pháp khảo sát cấu trúc nhiễm sắc chất tinh

trùng và phương pháp này được trình bày cụ thể ở phần tiếp theo.

1.3.5. Phương pháp khảo sát cấu trúc nhiễm sắc chất tinh trùng

1.3.5.1. Nguyên tắc phương pháp khảo sát cấu trúc nhiễm sắc chất tinh

trùng

Evenson bắt đầu nghiên cứu về cấu trúc nhiễm sắc chất (chromatin) của

động vật có vú vào những năm cuối của thập niên 70. Evenson đã sử dụng kính

hiển vi điện tử truyền qua cho thấy, tinh trùng của người có một lượng lớn

chromatin không đồng nhất [43]. Khi so sánh kết quả nhuộm acridine orange

(AO) trên chromatin của người và chuột thông qua máy phân tích dòng chảy tế

bào đã chứng minh sự không đồng nhất này [44]. Kết quả nghiên cứu cho thấy

sự không đồng nhất này được cho là do các đứt gãy trên sợi DNA, hay còn gọi

là “phân mảnh DNA tinh trùng”. Nguyên tắc cơ bản của phương pháp khảo sát

cấu trúc nhiễm sắc chất tinh trùng (SCSA) chủ yếu dựa vào sự phát màu khác

nhau của AO khi bám lên mạch đôi DNA (dsDNA) hay mạch đơn DNA

(ssDNA). Các phân tử AO kích thước nhỏ, có thể dễ dàng thấm sâu vào

chromatin của tinh trùng. Xử lý mẫu tinh dịch bằng axit làm màng tinh trùng tạo

ra các lỗ nhỏ giúp các phân tử AO đi qua, đồng thời môi trường axit giúp các

mạch đôi DNA bị biến tính và tách ra, tạo điều kiện cho AO bám vào giữa hai

mạch [47]. Khi nhận được năng lượng từ ánh sáng laser kích thích màu xanh

dương (bước sóng 488nm) thì phức hợp giữa phân tử AO và dsDNA sẽ phát

huỳnh quang màu xanh lá cây (bước sóng 515 – 530nm). Như vậy, ánh sáng

huỳnh quang màu đỏ chính là dấu hiệu để nhận biết các DNA bị phân mảnh

(DNA bị tổn thương).

Chỉ số phân mảnh tinh trùng (DFI) được tính bằng công thức:

Tín hiệu huỳnh quang màu đỏ

DFI = (%)

Tổng tín hiệu huỳnh quang (đỏ + xanh lá)

Dựa vào chỉ số DFI, người ta có thể chia sự phân mảnh DNA tinh trùng

thành 3 mức độ [47]:

 DFI ≤ 15%: tinh trùng có DNA không bị phân mảnh.

 15% < DFI < 30%: tinh trùng có DNA phân mảnh mức độ nhẹ.

 DFI ≥ 30%: tinh trùng có DNA phân mảnh mức độ nặng.

1.3.5.2 Máy phân tích dòng chảy tế bào Flow cytometry

Trong phương pháp SCSA, máy phân tích dòng chảy tế bào (FCM) được

sử dụng để đếm và phân loại tế bào bằng năng lượng laser. Các tế bào được đưa

vào một dòng chất lỏng và lần lượt từng tế bào “chảy” qua thiết bị đo lường điện

tử và các đặc điểm của tế bào được máy ghi nhận. Kỹ thuật này cho phép đồng

thời phân tích đa thông số về các đặc tính vật lý và hóa học với tốc độ có thể lên

đến hàng nghìn tế bào mỗi giây. Với phương pháp SCSA, sau khi nhận được

năng lượng từ ánh sáng laser kích thích, phức hợp phân tử AO – DNA sẽ phát

các tín hiệu huỳnh quang khác nhau. Qua hệ thống kính lọc điện tử, các tín hiệu

khác nhau sẽ được ghi nhận và thể hiện trên máy vi tính được kết nối với máy.

Dữ liệu có thể được biểu diễn một chiều các kênh tín hiệu để tạo ra biểu đồ tần

suất hay hai chiều được thể hiện dưới dạng biểu đồ điểm. Các khu vực nhỏ trên

những biểu đồ này có thể được khoanh vùng dựa trên cường độ huỳnh quang để

tạo thành các tập hợp con. Tinh trùng được chia ra thành các quần thể tùy thuộc

vào cường độ tín hiệu huỳnh quang xanh và đỏ: quần thể tinh trùng bình thường

(Norm với DFI ≤ 15%) tinh tử với DNA được nén chặt (High DNA Staining –

HDS); tinh trùng có độ phân mảnh DNA trung bình (Mod DFI với 15% < DFI <

30%); tinh trùng có độ phân mảnh DNA cao (High DFI với DFI ≥ 30%); mảnh

vỡ tế bào và các tín hiệu nhiễu (debris).

Phương pháp SCSA sử dụng máy FCM để chạy mẫu nên cho kết quả rất

khách quan so với các phương pháp thủ công khác sử dụng kính hiển vi (kết quả

phụ thuộc vào kinh nghiệm của người phân tích kết quả). Tổng cộng có khoảng

20.000 tế bào tinh trùng sẽ chạy qua máy FCM cho 1 mẫu tinh dịch nên phương

pháp SCSA mang tính thống kê cao và mức độ bao phủ mẫu lớn so với các

phương pháp khác (chỉ đếm từ 200 – 400 tinh trùng). Đặc biệt, phương pháp

SCSA cho độ chính xác khi lặp lại rất cao. Dữ liệu biểu đồ tán xạ tế bào đơn từ

các phép đo SCSA độc lập của một mẫu tinh dịch là gần như giống hệt nhau,

mối tương quan giữa các giá trị SCSA của một mẫu sau các lần lặp lại luôn luôn

khoảng 0,99 (p < 0,01) [45].

Một phương pháp khác cũng sử dụng máy FCM là phương pháp TUNEL

(deoxynucleotidyl terminal transferasemediated fluorescein - dUTP nick end

labelling) cũng có thể đo hàng nghìn tinh trùng trong mỗi mẫu. Tuy nhiên,

phương pháp này phải cần nhiều giờ cho mỗi mẫu do phải trải qua nhiều bước

chuẩn bị bao gồm: lọc rửa, xử lý với dithiothreitol (DTT), bắt cặp với

paraformaldehyde, thấm triton X, nhuộm với bộ kit enzyme terminal

deoxynucleotidyl transferase (TdT) thương mại, rửa sạch và cuối cùng mới đánh

giá mức độ phân mảnh của mẫu tinh dịch. Kết quả chỉ số DFI – TUNEL là tỷ lệ

giữa số tinh trùng dương tính với kênh màu FITC (xanh lá cây) trên tổng số tinh

trùng chạy qua máy [57].

1.4. Tình hình khám và điều trị vô sinh tại khoa Hỗ trợ Sinh sản – Bệnh

viện A Thái Nguyên

Bệnh viện A Thái Nguyên là bệnh viện đa khoa hạng I của tỉnh Thái

Nguyên với quy mô 705 giường bệnh và thực kê là trên 1000 giường. Nhằm đáp

ứng nhu cầu khám, chữa bệnh ngày càng tăng cho nhân dân trong tỉnh và các

vùng lân cận, bệnh viện đã không ngừng đổi mới hoạt động, nâng cao chất

lượng chuyên môn và cơ sở vật chất, trang thiết bị.

Khoa Hỗ trợ Sinh sản được thành lập vào năm 2015, tuy nhiên công tác

khám và điều trị hiếm muộn đã được triển khai từ năm 2011 với bước đầu là

khám vô sinh và thực hiện kỹ thuật bơm tinh trùng vào buồng tử cung (IUI), cho

đến 09/2015 bệnh viện chính thức thực hiện kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm

(TTTON), trở thành Trung tâm Hỗ trợ Sinh sản thứ 24 trên cả nước và là trung

tâm Hỗ trợ Sinh sản đầu tiên trên địa bàn tỉnh Thái Nguyên cũng như khu vực

các tỉnh miền núi phía Bắc.

Thụ tinh trong ống nghiệm bắt đầu được thực hiện từ 09/2015, ca chọc

trứng đầu tiên được thực hiện vào 03/2016, cho đến 10/2018 đã có 641 chu kỳ

chọc trứng làm IVF được thực hiện, trên tổng số hơn 900 hồ sơ IVF và trên tổng

số khoảng 30.000 lượt bệnh nhân đến khám và điều trị vô sinh tại bệnh viện [4].

Để đưa đến được thành công cho mỗi cặp vợ chồng hiếm muộn là một em

bé khỏe mạnh được ra đời, các cặp vợ chồng cần trải qua quá trình khám, thăm

dò chức năng, làm các xét nghiệm lâm sàng như sau:

- Đối với vợ: bao gồm các xét nghiệm:

+ Xét nghiệm nội tiết (FSH, LH, Progesterol, estradiol) vào ngày thứ 2

của chu kỳ kinh.

+ Thăm dò chức năng buồng trứng được thực hiện vào ngày 2 của chu kỳ kinh.

+ Thăm dò chức năng vòi trứng thực hiện vào ngày thứ 2 sau sạch kinh

dưới hình ảnh chụp của phim X-quang.

+ Các xét nghiệm khác: Viêm gan B, viêm gan C, HIV, kháng thể kháng

lao, xét nghiệm tế bào…

- Đối với chồng:

+ Xét nghiệm nội tiết tố: FSH, LH, testosterone, progesterone, estradiol.

+ Xét nghiệm tinh dịch đồ được thực hiện sau khi kiêng xuất tinh từ 2 – 7

ngày theo tiêu chuẩn của WHO, 2010.

+ Xét nghiệm phân mảnh DNA tinh trùng.

Sau khi 2 vợ chồng đã được thực hiện đầy đủ các xét nghiệm trên, bác sĩ

sẽ dựa vào đó để đưa ra hướng điều trị phù hợp cho từng trường hợp.

Qua nghiên cứu các trường hợp thực hiện TTTON tại khoa HTSS - Bệnh

viện A Thái Nguyên từ 03/2016 đến 10/2018 với 641 chu kỳ chọc trứng, 740

chu kỳ chuyển phôi, chúng tôi thấy kết quả điều trị đạt cao tương đương và cao

hơn một số cơ sở điều trị khác:

- Tuổi trung bình của bệnh nhân là: 31,5 ± 4,145

- Số năm vô sinh trung bình: 4,82 ± 3,112

- 100% các chu kỳ được thực hiện IVF/ICSI

- Tỷ lệ KTBT có noãn sau chọc hút đạt 100%

- Số noãn chọc hút trung bình: 14,78 ± 7.28

- Tỷ lệ noãn thụ tinh: 97,5%

- Số phôi trung bình tạo thành: 9,15 ± 5,196

- Số phôi chuyển trung bình 2 - 3 phôi

- Tỷ lệ thai sinh hóa: 52,7%

- Tỷ lệ đa thai : 24,87%

- Tình trạng vô sinh nguyên phát hay thứ phát không ảnh hưởng tới kết

quả thụ tinh ống nghiệm.

- Tỷ lệ có thai giảm khi tuổi mẹ tăng, chi phí điều trị cho bệnh nhân lớn

tuổi cao hơn nhiều so với bệnh nhân trẻ tuổi.

- Tỷ lệ có thai cao nhất ở nhóm bệnh nhân được chuyển 2 - 3 phôi.

- Đa số bệnh nhân có niêm mạc tử cung đều đạt tiêu chuẩn để chuyển phôi

- 92,4% các trường hợp chuyển phôi dễ, catheter sạch, không có máu,

không có nhày.

- Tỷ lệ quá kích buồng trứng 4%, không có quá kích nặng.

Tỷ lệ thành công của kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm tại khoa hỗ trợ

sinh sản- bệnh viện A Thái Nguyên là 52,7%, đây là tỷ lệ thành công cao so với

các trung tâm khác trong khu vực. Vì vậy, khoa Hỗ trợ Sinh sản - Bệnh viện A

Thái Nguyên là địa chỉ tin cậy cho các cặp vợ chồng hiếm muộn trên địa bàn

tỉnh và các tỉnh lân cận.

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: Mẫu tinh dịch của bệnh nhân nam được lấy bằng

phương pháp thủ dâm khi đến khám.

Địa điểm nghiên cứu: - Thu nhận mẫu bệnh phẩm và phân tích tinh dịch đồ

tại khoa Hỗ trợ Sinh sản - Bệnh viện A Thái Nguyên.

- Phân tích sự phân mảnh DNA của tinh trùng tại phòng thí nghiệm Công

nghệ gen và tế bào - Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên.

Thời gian nghiên cứu: từ tháng 7 năm 2019 đến tháng 4 năm 2020.

Cỡ mẫu: Theo nghiên cứu của Salah Albasir và cộng sự (2018) [95], mức độ

tương quan giữa chỉ số DFI và độ di động của tinh trùng là - 0,391. Để khẳng định

thật sự có tương quan nghịch giữa DFI và độ di động, chúng tôi cần thu nhận 134

bệnh nhân (sai số cho phép α = 0,05, năng lực thống kê là 90%). Với ước tính 10%

mất mẫu hay không đáp ứng tiêu chuẩn nhận mẫu, chúng tôi lên kế hoạch tuyển ít

nhất 149 đối tượng tham gia nghiên cứu. Công thức tính cỡ mẫu như sau:

Tiêu chuẩn nhận – loại mẫu:

- Bệnh nhân nam trong độ tuổi sinh sản.

- Không bị triệu chứng vô tinh (azoospermia).

- Không đang trong quá trình điều trị bệnh hiểm nghèo.

- Không mắc các bệnh lây truyền qua đường tình dục.

2.2. Hóa chất và thiết bị

2.2.1. Hóa chất

Bảng 2.1. Danh mục hóa chất sử dụng cho nghiên cứu

Hóa chất

Nhà sản xuất

Xuất xứ

Sodium Bicarbonate

Merck

Hoa Kỳ

Cồn 700

Sigma

Hoa kỳ

Cồn 1000

Sigma

Hoa Kỳ

Acridine orange

Sigma

Hoa kỳ

Natri clorid

Sigma

Hoa Kỳ

EDTA

Sigma

Hoa kỳ

HCl 2N

Sigma

Hoa Kỳ

HCl đậm đặc

Sigma

Hoa kỳ

Tris

Sigma

Hoa Kỳ

Hóa chất chạy máy FCM BD Biosystem

Hoa kỳ

2.2.2. Dụng cụ và thiết bị

Bảng 2.2. Danh mục dụng cụ sử dụng cho nghiên cứu

Nhà sản xuất

Xuất xứ

Tên vật tư

Micro pipette (1–10µL ; 10–100µL, 100–

Thermo

Phần Lan

1000µL)

Pipette gun

Biohit

Phần Lan

Pipette nhựa vô trùng (5mL và 10mL)

Bioneer

Hàn Quốc

Bình trung tính (100mL và 500mL)

Schott-Duran

Đức

Ống ly tâm đáy nhọn (15mL và 50mL)

Việt Nam

Eppendorf vô trùng (1,5mL và 2mL)

Bioneer

Hàn Quốc

Việt Nam

Găng tay, khẩu trang y tế

Bảng 2.3. Danh mục thiết bị sử dụng cho nghiên cứu

Thiết bị

Nhà sản xuất

Xuất xứ

Tủ ấm CO2

Eppendorf

Hoa Kỳ

Máy bách phân

Digisystem

Đài Loan

Máy hấp dụng cụ

Labtech

Hàn Quốc

Cân phân tích

Sartorius

Đức

Máy phân tích tế bào theo dòng chảy (BD C6) BD Accuri

Hoa Kỳ

Kính hiển vi

Olympus CX23

Nhật Bản

Máy chuẩn độ pH

Jenway

Anh

Assistant

Đức

Buồng đếm Neubauer cải tiến

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Phương pháp thu nhận mẫu bệnh phẩm

Phương pháp thu nhận mẫu bệnh phẩm được thực hiện theo quy trình

chuẩn của WHO, 2010: Mẫu tinh dịch sau khi xuất tinh được thu nhận vào lọ

đựng mẫu chuyên dụng và chờ ly giải từ 15 – 60 phút. Sau đó, mẫu được đánh

giá mật độ và độ di động theo quy trình chuẩn của WHO, 2010 [113].

2.3.2. Phương pháp phân tích tinh dịch đồ

- Tinh dịch đồ thực hiện theo các bước sau (WHO, 2010) [113]:

+ Đặt lọ đựng mẫu trên bàn thao tác hoặc tủ ấm 370C để ly giải.

+ Đánh giá sự ly giải và tính chất tổng quát của tinh dịch.

+ Đo thể tích tinh dịch.

+ Đo pH tinh dịch.

+ Chuẩn bị một tiêu bản tươi để đánh giá tổng quát dưới kính hiển vi, sự

di động tinh trùng và định độ pha loãng để đánh giá số lượng tinh trùng.

+ Đánh giá tỷ lệ sống của tinh trùng.

+ Tạo phiến phết tinh dịch để đánh giá hình dạng tinh trùng.

+ Pha loãng tinh dịch để đánh giá mật độ tinh trùng.

+ Đánh giá tổng số tinh trùng trong mẫu.

+ Ly tâm tinh dịch (nếu muốn xét nghiệm các dấu ấn sinh hóa).

+ Cố định và nhuộm phiến phết để đánh giá hình dạng tinh trùng.

2.3.3. Quy trình phân tích sự phân mảnh DNA tinh trùng bằng phương pháp

khảo sát cấu trúc nhiễm sắc chất (SCSA)

* Xác định độ pha loãng mẫu tinh dịch (WHO, 2010)

- Pha loãng mẫu với dung dịch cố định (NaHCO3 5%) theo tỷ lệ 1/20, 1/5

hay 1/2 tùy theo số lượng tinh trùng được quan sát được trong vi trường.

- Đưa mẫu tinh dịch pha loãng vào buồng đếm và chờ khoảng 3 phút để

các tế bào bất động định vị trên các lưới ô vuông.

- Đếm số lượng tinh trùng bằng buồng đếm với kính hiển vi quang học ở

độ phóng đại 400X.

- Đếm hai buồng, mỗi buồng đếm ít nhất 200 tinh trùng để hạn chế sai số

chọn mẫu.

- So sánh kết quả đếm được ở hai buồng xem sự chênh lệch có chấp nhận

được không. Nếu được, tính mật độ tinh trùng trong mẫu theo công thức:

C = (N/n) x (1/20) x hệ số pha loãng x 106 (tinh trùng/mL)

Trong đó:

N: tổng số tinh trùng đếm được trên 2 buồng đếm.

n: tổng số hàng đã khảo sát trên 2 buồng đếm.

20: thể tích của 1 hàng trong lưới ô vuông số 4,5,6.

* Quy trình SCSA sử dụng trong phân tích phân mảnh DNA tinh trùng

Bước 1: Pha loãng mẫu tinh dịch trong dung dịch TNE 1X đến mật độ 1 –

2 x 106 tinh trùng/ml.

Bước 2: Xử lý mẫu với dung dịch axit loãng (HCl 0,08N) để biến tính

tách mạch đôi DNA.

Bước 3: Nhuộm mẫu với 1200 µl dung dịch nhuộm Acridin Orange trong

30 giây.

Bước 4: Chạy mẫu qua máy Flow Cytometry (FCM).

Điều chỉnh thông số của máy FCM để máy thu nhận 20.000 tế bào với tốc

độ 200 – 300 tế bào/giây.

Bước 5: Xử lý số liệu và tính chỉ số DFI bằng phần mềm BD Accuri C6.

Số liệu thu được từ 10.000 tế bào sẽ được lọc và loại bỏ các tín hiệu nhiễu, loại

bỏ các tế bào HDS (tín hiệu xanh quá cao). Tính chỉ số phân mảnh của từng tinh

trùng theo công thức ở mục 1.3.5.1. Sau đó tính tỷ lệ tế bào có phân mảnh DNA

≥ 25% trên tổng số tế bào [35]. Đó là chỉ số DFI trung bình của mẫu tinh dịch

thu nhận được.

2.3.4. Phân tích số liệu

Dữ liệu thu được bao gồm: chỉ số DFI được đo bằng phương pháp SCSA

(DFI – SCSA), sự liên hệ giữa DFI và các chỉ số tinh dịch đồ như mật độ tinh

trùng, độ di động và hình dạng tinh trùng sẽ được phân tích bằng phần mềm R

(phiên bản 3.5.0). Mối liên hệ giữa DFI và các chỉ số tinh dịch đồ được kiểm

định bằng kiểm định Student hoặc phân tích phương sai (ANOVA). Giá trị <

0,05 được xác định là có ý nghĩa thống kê. Với các so sánh có p-value <0.05 ta

tiến hành phân tích tương quan giữa DFI và biến đó bằng kiểm định hệ số tương

quan Spearman.

2.4. Đạo đức trong nghiên cứu

Nghiên cứu này được tiến hành đảm bảo tuân thủ nguyên tắc về đạo đức

trong nghiên cứu khoa học.

Đối tượng nghiên cứu được giải thích rõ ràng mục đích và qui trình xét

nghiệm trong nghiên cứu, không làm tổn hại đến người bệnh. Người bệnh đồng

ý tham gia nghiên cứu. Mẫu sau khi được phân tích được hủy theo đúng quy

trình hủy mẫu y tế.

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. Đặc điểm lâm sàng và đặc điểm tinh dịch đồ của đối tượng nghiên cứu

3.1.1. Đặc điểm lâm sàng của đối tượng nghiên cứu

Đặc điểm lâm sàng của 151 bệnh nhân đến khám và điều trị tại khoa Hỗ

trợ Sinh sản – Bệnh viện A Thái Nguyên trình bày trong bảng 3.1.

Bảng 3.1. Đặc điểm lâm sàng của đối tượng nghiên cứu

Đặc điểm Kết quả

Tuổi bệnh nhân (năm) 32,04 ± 5,97

BN có hút thuốc – n (%) 79 (52,3)

BN có sử dụng rượu bia – n (%) 134 (88,7)

BN có từng bị quai bị – n (%) 33 (21,9)

FSH (mIU/mL) 4,35 ± 1,90

LH (mIU/mL) 4,49 ± 1,89

Testosterone (nmol/L) 15,76 ± 5,86

Chú thích: Dữ liệu được trình bày dưới dạng trung bì nh ± độ lệch

chuẩn với biến liên tục và số lượng (phầm trăm) với biến phân loại.

Theo số liệu thống kê, độ tuổi trung bình của bệnh nhân đến khám vô sinh

nam là 32,04 ± 5,97 tuổi. Nam giới đến khám và điều trị vô sinh có độ tuổi trẻ nhất

là 22 tuổi và lớn tuổi nhất là 55 tuổi. Các giá trị nội tiết được khảo sát bao gồm

FSH (Follice Stimulating Hormone), LH (Luiteinizing Hormone), Testosterone.

Bên cạnh đó, tỷ lệ bệnh nhân có hút thuốc lá chiếm phần lớn trong tổng số những

bệnh nhân được nghiên cứu với 79 bệnh nhân (52,3%) và 134 bệnh nhân có sử

dụng rượu bia chiếm 88,7%. Điều này cho thấy, đặc điểm về lối sống của bệnh

nhân tiếp xúc với các chất kích thích ngày càng tăng và những yếu tố này có ảnh

hưởng tiêu cực tới chất lượng tinh trùng cũng như làm tăng sự tổn thương về DNA

của tinh trùng người. Vì vậy, trong các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra việc thực hành

các lối sống là đặc điểm lâm sàng quan trọng trong điều trị vô sinh nam, đặc biệt là

các trường hợp vô sinh nam không rõ nguyên nhân [72].

Tỷ lệ nam vô sinh có tiền sử bị quai bị chiếm số lượng nhỏ với 33 bệnh

nhân trong tổng số 151 bệnh nhân được nghiên cứu. Quai bị là bệnh truyền

nhiễm cấp tính, gây dịch, do virus quai bị gây nên. Virus quai bị có ái tính đặc

biệt với các tuyến ngoại tiết như tuyến nước bọt, tuyến sinh dục (tinh hoàn,

buồng trứng) tụy tạng và hệ thần kinh. Giảm sinh tinh trùng sau biến chứng

viêm tinh hoàn của bệnh quai bị là một trong những nguyên nhân gây vô sinh

nam. Biểu mô sinh tinh bị ảnh hưởng hay bị hủy hoàn toàn do tác động trực tiếp

của nhiễm trùng, do hiện tượng viêm, tăng nhiệt độ hoặc do phản ứng miễn dịch

sau khi hàng rào máu – tinh hoàn bị phá hủy [101].

Nồng độ FSH trong máu vào ngày bệnh nhân đến khám, làm xét nghiệm

tinh dịch đồ có giá trị là 4,35 ± 1,90 mIU/mL. Nồng độ LH của các đối tượng

nghiên cứu là 4,49 ± 1,89 mIU/mL). Nồng độ Testosterone trong máu là 15,76 ±

5,86 nmol/L. Nhìn chung, các giá trị này nằm trong giới hạn bình thường về yếu

tố nội tiết của nam.

Trục hạ đồi, tuyến yên và tinh hoàn có vai trò quan trọng trong việc kích

hoạt quá trình biệt hóa tế bào mầm sinh dục. Trong đó, LH và FSH là hai nội tiết

chính trong điều hòa hoạt động quá trình sản sinh tinh trùng. Tuy nhiên, mỗi loại

nội tiết đóng vai trò khác nhau. LH tác động lên tế bào Leydig, kích thích quá

trình sinh tổng hợp testosterone. FSH lại liên quan trực tiếp đến hoạt động sinh

tinh trùng thông qua tác động của tế bào Sertoli. Khi FSH tác dụng lên tế bào

Sertoli còn kích thích quá trình hình thành hàng rào máu – tinh hoàn, tạo ra các

chất ức chế và cơ chế phản hồi âm lên thùy trước tuyến yên, dẫn đến giảm sản

xuất FSH. FSH khi gắn lên tế bào Leydig sẽ kích thích tế bào tăng các thụ thể

với LH, từ đó kích thích tuyến yên tăng sản xuất LH.

Theo nghiên cứu của McLachlan (1998) thì ông cho rằng, các yếu tố nội

tiết này có vẻ không tác động lên sự tăng sinh hoặc biệt hóa của tinh nguyên bào

dạng A [28]. Sản xuất steroid sinh dục, chức năng túi tinh dường như ảnh hưởng

đến tính toàn vẹn của tinh trùng và do đó khả năng thụ tinh của tinh trùng được

đề xuất trong nghiên cứu của Richthoff J. và cộng sự (2002) [92].

3.1.2. Đặc điểm tinh dịch đồ của đối tượng nghiên cứu

Trong các cặp vợ chồng vô sinh đến khám và điều trị tại khoa, có 151

mẫu tinh trùng của người chồng đủ điều kiện nghiên cứu và đặc điểm tinh dịch

đồ của các đối tượng được mô tả trong bảng 3.2 dưới dạng giá trị trung bình ±

độ lệch chuẩn.

Bảng 3.2. Đặc điểm tinh dịch đồ của đối tượng nghiên cứu

Đặc điểm Kết quả

Thời gian kiêng xuất tinh (ngày) 4,18 ± 1,63

Thể tích xuất tinh (mL) 3,05 ± 1,35

Độ pH (độ) 7,45 ± 0,21

Mật độ (x106 tinh trùng/mL) 22,63 ± 14,17

Di động tiến tới PR (%) 25,36 ± 6,13

Di động không tiến tới NP (%) 26,09 ± 5,47

Bất động IM (%) 48,66 ± 9,54

Di động (PR + NP) (%) 51,46 ± 9,69

Tỷ lệ sống (%) 65,15 ± 9,98

Hình dạng tinh trùng (%) 1,16 ± 0,45

Các mẫu tinh dịch được lấy bằng cách thủ dâm và bảo quản trong tủ ấm

370C nhằm để mẫu được ly giải và giải phóng tinh trùng. Các chỉ số tinh dịch đồ

bao gồm thời gian kiêng xuất tinh, độ pH, thể tích xuất tinh, mật độ, độ di động

– di động tiến tới PR (Progressive), di động không tiến tới NP (Non –

Progressive), bất động IM (Immotility), tỷ lệ sống (TLS) và hình thái tinh trùng

được phân tích theo tiêu chuẩn của WHO, 2010 [113].

Trong đó, thời gian kiêng xuất tinh trung bình là 4,18 ngày. Thể tích xuất

tinh trung bình là 3,05 ± 1,35mL/một lần xuất tinh. Giá trị pH trung bình là 7,45

± 0,21. Các mẫu xuất tinh có mật độ tinh trùng trung bình là 22,63 ± 14,17 x

106 tinh trùng/mL. Tỷ lệ tinh trùng di động tiến tới PR là 25,36 ± 6,13%. Tinh

trùng di động không tiến tới NP là 26,09 ± 5,47%. Tinh trùng bất động là 48,66

± 9,54%. Các mẫu xuất tinh có tinh trùng có tỷ lệ sống với giá trị trung bình là

65,15 ± 9,98%. Giá trị tinh trùng có hình thái bình thường là 1,16 ± 0,45%.

Các giá trị trung bình về đặc điểm tinh dịch đồ của nam giới vô sinh đến

khám và điều trị tại khoa Hỗ trợ Sinh sản – Bệnh viện A Thái Nguyên phần lớn đều

nằm trong giới hạn bình thường theo tiêu chuẩn của WHO, 2010. Tuy nhiên, có tỷ

lệ tinh trùng di động tiến tới (PR ≥ 32%) chỉ đạt mức 25,36%, tỷ lệ thấp hơn so với

tiêu chuẩn. Bên cạnh đó, tỷ lệ tinh trùng có hình dạng bình thường có giá trị xoay

quanh 1%, giá trị này thấp so với giá trị bình thường trong Cẩm nang hướng dẫn

xét nghiệm và đánh giá tinh chất của WHO, 2010 [113]. Điều này cũng nói lên

rằng chất lượng tinh trùng của nam giới ngày càng có xu hướng giảm.

3.2. Kết quả phân tích mức độ phân mảnh DNA của tinh trùng

Sau khi đã thu thập dược các thông tin về đặc điểm lâm sàng và đánh giá

các chỉ số tinh dịch đồ của 151 bệnh nhân, chúng tôi tiến hành phân tích mức độ

phân mảnh DNA tinh trùng bằng phương pháp SCSA theo khảo nghiệm của

Evenson và cộng sự (2000) [47].

Kết quả biểu thị các quần thể tinh trùng có DNA bị phân mảnh ở các mức

độ khác nhau được được xử lý theo phần mềm phân tích dữ liệu của máy phân

tích dòng chảy tế bào (FCM) và thể hiện trong hình 3.1.

Hình 3.1. Cường độ tín hiệu của tinh trùng sau khi nhuộm AO - mức độ phân

mảnh thấp (a); mức độ phân mảnh trung bình (b); mức độ phân mảnh cao (c);

P1: vùng DNA tinh trùng không bị phân mảnh; P2: vùng DNA tinh trùng bị

phân mảnh mức trung bình; P3: vùng DNA tinh trùng bị phân mảnh cao

Hình 3.1 thể hiện quần thể các tế bào tinh trùng người với sự bắt màu

khác nhau. Trong đó, vùng có các tế bào tinh trùng bắt màu xanh là vùng có

chứa những tinh trùng có DNA được nén chặt nên các phân tử AO sẽ không

bám được vào các mạch DNA đã được biến tính, dưới năng lượng ánh sáng của

tia Laser chúng sẽ có màu xanh. Còn những vùng có tín hiệu màu đỏ là vùng có

chứa các tế bào tinh trùng bị đứt gãy DNA nên các phân tử AO bám vào sau khi

DNA đã bị biến tính.

Dựa vào cường độ tín hiệu của tinh trùng khi nhuộm AO và công thức

trình bày trong phần 1.3.5.1 để tính được giá trị phân mảnh DNA tinh trùng. Cụ

thể, các ngưỡng giá trị về mức độ phân mảnh DNA tinh trùng người với các

nhóm như sau [47]:

∙ DFI ≤ 15%: tinh trùng có DNA không bị phân mảnh.

∙ 15% < DFI < 30%: tinh trùng có DNA phân mảnh ở mức độ nhẹ.

∙ DFI ≥ 30%: tinh trùng có DNA bị phân mảnh mức độ nặng.

Kết quả phân tích về mức độ phân mảnh DNA tinh trùng của 151 bệnh

nhân được thể hiện dưới bảng 3.3:

Bảng 3.3. Kết quả đánh giá mức độ phân mảnh DNA tinh trùng

Nhóm Kết quả

Chỉ số DFI (%) 21,58 ± 15,53

Nhóm DFI thấp (15% ≤ DFI) – n (%) 58 (38,4)

Nhóm DFI trung bình (15% < DFI < 30%) – n (%) 57 (37,7)

Nhóm DFI cao (DFI ≥ 30%) – n (%) 36 (23,8)

Theo số liệu thống kế trên bảng 3.3 ta nhận thấy, mức độ phân mảnh

DNA tinh trùng của nam giới đến khám và điều trị vô sinh tại khoa Hỗ trợ Sinh

sản – Bệnh viện A Thái Nguyên có giá trị trung bình là 21,58 ± 15,53%. Trong

đó, nhóm DFI thấp (15% ≤ DFI) có số lượng bệnh nhân nhiều nhất là 58 bệnh

nhân, chiếm 38,4%, nhóm có chỉ số phân mảnh DNA tinh trùng trung bình (15%

< DFI < 30%) với 57 bệnh nhân (37,7%), nhóm có mức độ phân mảnh cao (DFI

≥ 30%) với 36 bệnh nhân chiếm số lượng thấp nhất trong tổng số 151 bệnh nhân

được nghiên cứu.

Ngoài ra, tần suất về giá trị phân mảnh DNA tinh trùng của 151 bệnh

nhân cũng được thể hiện trong hình 3.2. Trong đó, tần suất của những trường

hợp bệnh nhân có mức độ phân mảnh DNA tinh trùng dưới 25% là nhiều nhất

và với những trường hợp có mức độ phân mảnh cao có tần suất thấp hơn.

Hình 3.2. Tần suất mức độ phân mảnh DNA tinh trùng trong tổng số 151 bệnh

nhân được nghiên cứu

Hiện nay, chưa có một giá trị tham chiếu xác định nào được thống nhất

cho việc đánh giá mức độ phân mảnh DNA tinh trùng trong việc dự đoán khả

năng mang thai và nguy cơ vô sinh [96]. Tuy nhiên, trong các nghiên cứu gần

đây về các phương pháp xác định mức độ phân mảnh DNA tinh trùng đã đưa ra

các ngưỡng tham khảo để đánh giá tình trạng vô sinh ở nam giới như: phương

pháp TUNEL là 16% - 22%; phương pháp SCSA là 18% - 20%; phương pháp

SCD là 20% - 26%; phương pháp COMET là 40% - 50% [91], [112]. Và trong

một nghiên cứu hệ thống của Santi và cộng sự (2018) đánh giá 28 nghiên cứu

trên 2.883 nam giới vô sinh và 1.294 nam giới có khả năng sinh sản bình thường

đã chỉ ra rằng ngưỡng DFI = 20% là giá trị tốt nhất để xác định khả năng sinh

sản của những người đàn ông vô sinh dựa vào 4 xét nghiệm SDF phổ biến nhất

với độ nhạy 79%, độ đặc hiệu 86% [97]. Giá trị ngưỡng trung bình về mức độ

phân mảnh DNA tinh trùng của nam giới vô sinh trong nghiên cứu của chúng tôi

cũng đồng nhất với những nghiên cứu khác đã được công bố.

3.3. Kết quả mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA tinh trùng với đặc

điểm lâm sàng và chỉ số tinh dịch đồ của đối tượng nghiên cứu

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về các phương pháp đánh giá mức

độ phân mảnh DNA tinh trùng và đồng thời nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng

lên khả năng tổn thương của DNA tinh trùng. Tại khoa Hỗ trợ Sinh sản – Bệnh

viện A Thái Nguyên hiện nay, lượng bệnh nhân đến khám và điều trị vô sinh

ngày càng tăng. Chính vì vậy, để đánh giá mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh

DNA tinh trùng với các đặc điểm lâm sàng và chỉ số tinh dịch đồ, chúng tôi đã

chọn ra 151 mẫu tinh dịch đủ điều kiện nghiên cứu từ các bệnh nhân vô sinh

nam đến khám và điều trị tại đơn vị.

Trong nghiên cứu này của chúng tôi, giữa các yếu tố nội tiết và mức độ

phân mảnh DNA tinh trùng không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê. Tuy

nhiên, trong nghiên cứu của Richthoff J. (2002) đã chỉ ra rằng, việc sản xuất các

steroid sinh dục, chức năng sinh tinh của tinh hoàn và chức năng túi tinh dường

như ảnh hưởng đến tính toàn vẹn của tinh trùng và do đó ảnh hưởng tới khả

năng thụ tinh của tinh trùng. Những phát hiện này có thể cải thiện sự hiểu biết

hiện tại về sinh lý bệnh của vô sinh nam [92]. Vì vậy, chúng tôi đã đi sâu đánh

giá mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA tinh trùng với các đặc điểm lâm

sàng còn lại như độ tuổi, hút thuốc lá, tiền sử bị quai bị, và tình trạng sử dụng

rượu bia của các đối tượng nghiên cứu.

3.3.1. Mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA tinh trùng với các đặc điểm

lâm sàng

3.3.1.1. Mối liên hệ giữa việc sử dụng rượu bia với mức độ phân mảnh DNA

tinh trùng

Tình trạng sử dụng rượu bia hiện nay khá phổ biến đối với nam giới, một

phần có thể do thói quen hoặc do tính chất công việc và các mối quan hệ xã hội.

Vì vậy, việc sử dụng rượu bia và mức độ phân mảnh DNA của tinh trùng ở nam

giới vô sinh có mối liên hệ như nào trong nghiên cứu này, được thể hiện trong

bảng 3.4.

Bảng 3.4 cho thấy, nhóm bệnh nhân nam có sử dụng rượu bia là 134 bệnh

nhân, có mức độ phân mảnh DNA tinh trùng trung bình là 21,13%. Trong nhóm

này, bệnh nhân có tinh trùng bị phân mảnh ở mức thấp nhất là 1,8% và bệnh

nhân có tinh trùng bị phân mảnh cao nhất là 97%. Nhóm bệnh nhân này cũng là

nhóm có nhiều bệnh nhân có tinh trùng bị phân mảnh ở mức cao (DFI ≥ 30%)

với 30 bệnh nhân chiếm 21,64%, bệnh nhân có tinh trùng bị phân mảnh ở mức

trung bình (15% < DFI < 30%) là 53 bệnh nhân chiếm 39,55% trong tống số

bệnh nhân có sử dụng rượu bia.

Bảng 3.4. Mối liên hệ giữa việc sử dụng rượu bia với mức độ phân mảnh DNA

tinh trùng

Bệnh nhân có sử dụng Số lượng DFI (%) P-value rượu bia

Có 134 (88,74%) 21,13 ± 15,25 0,321 Không 17 (12,26%) 25,12 ± 17,68

Nhóm bệnh nhân không sử dụng rượu bia chiếm một lượng rất nhỏ trong

các đối tượng được nghiên cứu, chỉ có 17 bệnh nhân, chiếm 11,25% tổng số

bệnh nhân được nghiên cứu. Trong nhóm này, giá trị DFI trung bình là 25,12 ±

17,68% và bệnh nhân có tinh trùng bị đứt gãy DNA thấp nhất là 6,2%, mức độ

đứt gãy DNA của tinh trùng cao nhất là 68%. Vì vậy, nghiên cứu của chúng tôi

không chỉ ra sự khác biệt về mức độ phân mảnh với việc sử dụng rượu bia giữa

những người sử dụng và những người không sử dụng (p = 0,321). Điều này chỉ

ra rằng, việc sử dụng rượu bia không ảnh hưởng tới sự phân mảnh DNA tinh

trùng. Một kết quả tương tự cũng được chỉ ra trong nghiên cứu của Pacey A. và

cộng sự (2014) [87].

Tuy nhiên, trong nghiên cứu Akira Komiya và cộng sự (2014) về các yếu

tố lâm sàng liên quan đến sự phân mảnh DNA của tinh trùng ở bệnh nhân nam

bị vô sinh đã chỉ ra mối tương quan đáng kể giữa DFI và việc sử dụng rượu bia

của các bệnh nhân nam vô sinh [11]. Giữa thói quen sử dụng rượu bia của bệnh

nhân với mức độ phân mảnh DNA tinh trùng có mối liên hệ đáng kể cũng được

chỉ ra trong nghiên cứu của Lê Minh Tâm và cộng sự (2019) [2].

3.3.1.2. Mối liên hệ giữa việc sử dụng thuốc lá với mức độ phân mảnh DNA tinh

trùng

Các nghiên cứu trước đây đã phát hiện ra rằng, hút thuốc có liên quan đến

việc giảm khả năng sinh sản của nam giới thông qua việc thay đổi chất lượng

tinh dịch. Tuy nhiên, cơ chế mà việc hút thuốc lá ảnh hưởng đến chất lượng tinh

dịch vẫn phải được làm rõ hoàn toàn. Vì vậy, tác động của việc hút thuốc lá với

sự phân mảnh DNA tinh trùng trên các đối tượng nam vô sinh đến khám và điều

trị tại khoa Hỗ trợ Sinh sản – Bệnh viện A Thái Nguyên đã được khảo sát và

thống kê trong bảng 3.5.

Bảng 3.5. Mối liên hệ giữa việc sử dụng thuốc lá với mức độ phân mảnh DNA

tinh trùng

Bệnh nhân có hút thuốc lá Số lượng DFI (%) P-value

Có 79 (52,32%) 20,27 ± 14,61 0,277 Không 72 (47,68%) 23,02 ± 16,46

Trong nghiên cứu của chúng tôi có 79 bệnh nhân có sử dụng thuốc lá và

giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn về mức độ phân mảnh DNA tinh trùng là

20,27 ± 14,62%. Ở nhóm này, bệnh nhân có tỷ lệ tổn thương DNA tinh trùng

cao nhất là 97% hay hầu hết các tinh trùng đều có DNA bị phân mảnh.

Trong nhóm không sử dụng thuốc lá có 72 bệnh nhân. Giá trị DFI trung

bình của tinh trùng là 23,02 ± 16,46%. Bệnh nhân có mức độ phân mảnh DNA

tinh trùng thấp nhất là 1,5% và bệnh nhân bị phân mảnh DNA tinh trùng cao

nhất là 93,2%.

Như vậy, giữa hai nhóm bệnh nhân sử dụng thuốc lá và nhóm bệnh nhân

không sử dụng thuốc lá đều có tinh trùng có DNA bị phân mảnh cao tương tự

nhau hay không có sự khác biệt giữa mức độ phân mảnh DNA tinh trùng và việc

sử dụng thuốc lá với p = 0,277.

Kết quả tương tự cũng được chỉ ra trong nghiên cứu của Lê Minh Tâm và

cộng sự (2019) khi nghiên cứu 390 mẫu tinh trùng của các bệnh nhân nam vô

sinh đến khám tại trung tâm Hỗ trợ Sinh sản – Bệnh viện Trung ương Huế.

Trong đó, sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê giữa 2 nhóm bệnh nhân sử

dụng thuốc lá và không sử dụng thuốc lá với mức độ phân mảnh DNA tinh trùng

với giá trị p = 0,364 đã được chỉ ra [2].

Tuy nhiên, trong nghiên cứu của Potts R.J. và cộng sự (1999) đã chỉ ra

mối tương quan thuận về tác động của thuốc lá tới sự phân mảnh DNA tinh

trùng [90]. Hay trong nghiên cứu của Hongyi Yang và cộng sự năm (2019), đã

đánh giá mức độ tương quan giữa DFI và việc sử dụng thuốc lá của nam giới vô

sinh là có tương quan thuận với hệ số tương quan r = 0,109; p < 0,001 [63].

Tổn thương DNA nặng do hút thuốc đã được báo cáo có tương quan với

tinh trùng bất thường và vô sinh nam. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng, để đáp ứng với

tổn thương DNA, kích hoạt điểm checkpoint kinase 1 (Chk1) tạo điều kiện cho

việc bắt giữ điểm kiểm tra tại pha S và G2. Những dữ liệu trong nghiên cứu của

Xiangrong Cui và cộng sự (2016) cho thấy sự giảm chất lượng tinh dịch do hút

thuốc lá không chỉ tương quan với tốc độ phân mảnh DNA của tinh trùng, mà

còn tương quan với sự suy giảm mức độ biểu hiện của Chk1 mà biểu hiện của

Chk1 có liên quan đến tổn thương DNA và apoptosis [114].

3.3.1.3. Mối liên hệ giữa tiền sử bị quai bị với mức độ phân mảnh DNA tinh

trùng

Trong nghiên cứu này, để đánh giá mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh

DNA tinh trùng với tiền sử từng bị quai bị, chúng tôi chia tiền sử mắc quai bị

của bệnh nhân thành hai nhóm là nhóm bệnh nhân có tiền sử từng mắc quai bị

và nhóm chưa từng mắc quai bị.

Bảng 3.6. Mối liên hệ giữa tiền sử bị quai bị với mức độ phân mảnh DNA

tinh trùng

Bệnh nhân có tiền sử bị quai bị Số lượng DFI (%) P-value

Có 33 (21,85%) 28,77 ± 22,85 0,002 Không 118 (78,15%) 19,57 ± 12,15

Nhóm bệnh nhân nam vô sinh có tiền sử bị quai bị có 33 bệnh nhân và giá

trị DFI trung bình tương ứng là 28,77 ± 22,85% được thể hiện trong bảng 3.6.

Cũng trong nhóm này, có 2 bệnh nhân có tinh trùng bị đứt gãy DNA gần như

100% với 2 giá trị tương ứng là 97% và 93,2% và là 2 trường hợp có giá trị DFI

cao nhất trong 151 bệnh nhân được nghiên cứu.

Nhóm bệnh nam vô sinh nhưng không có tiền sử mắc quai bị trước đó có

118 bệnh nhân với giá trị DFI trung bình là 19,57 ± 12,15% (Bảng 3.6). Trong

nhóm này, bệnh nhân có tinh trùng bị tổn thương DNA với giá trị DFI tương

ứng cao nhất là 50,5%, còn các bệnh nhân khác đều có mức phân mảnh DNA

tinh trùng ở mức trung bình.

Bên cạnh đó, chúng tôi đã tìm thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p =

0,002) khi đánh giá mối liên hệ giữa DFI với tiền sử bị quai bị và có mối tương

quan thuận với hệ số tương quan r = 0,17 và p = 0,035 khi kiểm định bằng

sperman (Hình 3.3). Điều này đồng nghĩa với việc những bệnh nhân nam bị vô

sinh và có tiền sử từng mắc quai bị sẽ có mức độ phân mảnh DNA tinh trùng cao

hơn so với những người không có tiền sử từng mắc quai bị.

Hình 3.3. Mối liên hệ giữa tiền sử quai bị với mức độ phân mảnh DNA

tinh trùng

Tuy nhiên, giữa nhóm bệnh nhân có tiền sử mắc quai bị và nhóm bệnh

nhân không có tiền sử mắc quai bị với mức độ phân mảnh DNA tinh trùng có sự

khác biệt không có ý nghĩa thống kê trong phân tích của Lê Minh Tâm và cộng

sự (2019) [2]. Và đặc điểm nền cũng không có mối liên quan đáng kể nào được

tìm thấy trong nghiên cứu của Pacey A và cộng sự (2014) [87] và Potts RJ. và

cộng sự (1999) [90].

3.3.1.4. Mối liên hệ giữa độ tuổi với mức độ phân mảnh DNA tinh trùng

Để đánh giá mối liên hệ giữa độ tuổi của bệnh nhân với mức độ phân

mảnh DNA tinh trùng trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chia độ tuổi của

bệnh nhân thành hai nhóm tuổi: nhóm bệnh nhân ≤ 35 tuổi và nhóm bệnh

nhân > 35 tuổi với mức độ phân mảnh DNA tinh trùng được thể hiện dưới

bảng 3.7 như sau:

Bảng 3.7. Mối liên hệ giữa độ tuổi với mức độ phân mảnh DNA tinh trùng

Tuổi bệnh nhân Số lượng DFI (%) P-values

≤ 35 tuổi 115 (76,16%) 20,52 ± 15,63 0,133 > 35 tuổi 36 (23,84%) 24,98 ± 14,89

Theo số liệu thống kê trong bảng 3.7, nhóm bệnh nhân ≤ 35 tuổi có 115

bệnh nhân, chiếm 76,16% và có giá trị phân mảnh DNA tinh trùng trung bình là

20,52 ± 15,63%. Nhóm bệnh nhân có độ tuổi > 35 tuổi có 36 bệnh nhân, chiếm

23,84% với giá trị DNA tinh trùng bị phân mảnh trung bình là 24,98 ± 14,89%.

Tuy nhiên, giữa độ tuổi của bệnh nhân và mức độ phân mảnh DNA trùng ở hai

nhóm bệnh nhân ≤ 35 tuổi và nhóm bệnh nhân > 35 tuổi không khác biệt có ý

nghĩa thống kê với p = 0,133. Hơn nữa, xu hướng điều trị vô sinh nam với độ

tuổi ngày càng trẻ hóa. Bên cạnh đó, trong nhóm bệnh nhân có độ tuổi > 35

(n=36) có mức độ phân mảnh khá cao với giá trị trung bình 24,98 ± 14,89% hay

càng lớn tuổi thì mức độ phân mảnh của DNA tinh trùng càng lớn. Điều này

cũng chỉ ra rằng, ở bất cứ độ tuổi nào, DNA của tinh trùng vẫn có thể bị phân

mảnh.

Một kết quả tương tự cũng đã được Salah Elbashir chỉ ra trước đó với p =

0,076 [95] và trong nghiên cứu của Colasante A. và cộng sự (2011) cũng chỉ ra

rằng, chất lượng tinh trùng giảm đáng kể liên quan đến tuổi đặc biệt là về lượng

tinh dịch và tổn thương DNA của tinh trùng. Hay, một mối tương quan đáng kể

giữa độ tuổi của nam giới vô sinh với DFI được nghiên cứu trên 6.881 bệnh

nhân tại Ấn Độ có độ tuổi từ 23 đến 61 và nghiên cứu này cho thấy, với những

đàn ông có độ tuổi > 45 có chỉ số phân mảnh DNA tinh trùng cao hơn so với

những người đàn ông < 45 tuổi [15].

Tuy nhiên, một mối tương quan không đáng kể giữa độ tuổi của bệnh

nhân và mức độ phân mảnh DNA tinh trùng được chỉ ra trong nghiên cứu của

Lê Minh Tâm và cộng sự (2019) trong 390 bệnh nhân được chia làm 2 nhóm

tương tự với giá trị p = 0,130 [2].

Những dữ liệu này chỉ ra rằng, đàn ông có thể ngày càng ít khả năng sinh

sản khi tuổi của họ tăng lên. Bên cạnh đó, độ tuổi sinh sản của phụ nữ được

khuyến cáo là dưới 35 tuổi và những phát hiện này cho thấy việc thiếu giá trị

ngưỡng tuổi đối với nam giới trong sinh sản hay sự suy giảm dần dần chất lượng

tinh trùng song song với lão hóa [32].

3.3.2. Mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA tinh trùng và chỉ số tinh dịch

đồ của đối tượng nghiên cứu

Có nhiều bằng chứng lâm sàng đã chỉ ra rằng mối tương quan giữa các chỉ

số tinh dịch đồ và mức độ phân mảnh DNA của tinh trùng có nhiều quan điểm

còn gây tranh cãi. Các đặc điểm tinh dịch đồ kém như mật độ tinh trùng thấp, độ

di động kém và hình thái tinh trùng bất thường nhiều thường tương quan với tỷ

lệ tinh trùng có DNA bị tổn thương cao. Hoặc một số bệnh nhân có các giá trị

tinh dịch đồ bình thường nhưng lại có mức độ DNA bị phân mảnh cao [102]. Vì

vậy, mối liên hệ giữa đặc điểm tinh dịch đồ với mức độ phân mảnh DNA tinh

trùng của 151 bệnh nhân trong nghiên cứu này được trình bày ở những phần

dưới đây.

3.3.2.1. Mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA tinh trùng với thời gian kiêng

xuất tinh

Theo khuyến cáo của Tổ chức Y tế Thế giới về Hướng dẫn xét nghiệm và

xử lý tinh trùng người – WHO, 2010 thì thời gian kiêng xuất tinh đối với các

trường hợp khi đến khám và điều trị vô sinh sẽ nằm trong khoảng từ 2 đến 7

ngày. Trong nghiên cứu này, chúng tôi nghiên cứu mối liên hệ giữa mức độ

phân mảnh DNA tinh trùng và thời gian kiêng xuất tinh được chia thành 3 nhóm

thể hiện trong bảng 3.8.

- Nhóm kiêng xuất tinh < 2 ngày: có 17 bệnh nhân và nhóm này có giá trị

phân mảnh DNA tinh trùng ở mức trung bình là 15,59 ± 9,42%.

- Nhóm có thời gian kiêng xuất tinh từ 2 - 7 ngày: có 132 bệnh nhân,

chiếm phần lớn bệnh nhân trong tổng số bệnh nhân được nghiên cứu và có giá

trị DFI trung bình là 22,18 ± 16,02%. Nhóm bệnh nhân này nằm trong ngưỡng

tinh trùng có mức độ phân mảnh trung bình.

- Nhóm có thời gian kiêng xuất tinh > 7 ngày: có 2 bệnh nhân, chiếm số

lượng thấp nhất nhưng lại là nhóm có mức độ phân mảnh DNA tinh trùng nằm

trong ngưỡng cao với giá trị DFI là 33,10 ± 13,72.

Bảng 3.8. Mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA tinh trùng với thời gian

kiêng xuất tinh

Thời gian kiêng xuất tinh Số lượng DFI (%) P- values

< 2 ngày 17 (11,26%) 15,59 ± 9,42

2 – 7 ngày 132 (87,42%) 22,18 ± 16,02 0,147

> 7 ngày 2 (1,32%) 33,10 ± 13,72

Tuy nhiên, sự khác biệt giữa thời gian kiêng xuất tinh và mức độ phân

mảnh DNA tinh trùng trong nghiên cứu này không có ý nghĩa thống kê với giá

trị p = 0,147. Kết quả tương tự cũng được chỉ ra trong nghiên cứu của Sergerie

M. và cộng sự (2005) [95], [99], Evenson và cộng sự (1991) [45].

Trong nghiên cứu của Richthoff J. và cộng sự (2002) lại tìm thấy một mối

tương quan tích cực nhưng tương đối yếu giữa mức độ phân mảnh DNA tinh

trùng với thời gian kiêng xuất tinh. Bên cạnh đó, hiệu quả của việc rút ngắn thời

gian xuất tinh như một biện pháp tiềm năng trong việc giảm mức độ phân mảnh

DNA tinh trùng đã được nghiên cứu. Giảm 22% - 25% tỷ lệ tinh trùng có DNA

bị tổn thương đã đạt được với sự kiêng xuất tinh từ 1 – 2 ngày mà không ảnh

hưởng đến các thông số tinh dịch thông thường [58]. Thời gian kiêng xuất tinh

cũng là một trong những yếu tố ảnh hưởng tới khả năng di động và tỷ lệ sống

của tinh trùng [114].

3.3.2.2. Mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA tinh trùng với độ pH của tinh

dịch

Giá trị pH của tinh dịch được xác định sau khi bệnh nhân xuất tinh từ 30

phút đến 1 giờ bằng cách nhỏ 10µL tinh dịch lên giấy chỉ thị màu (30 giây), so

màu với bảng và ghi nhận giá trị pH. Bảng 3.9 thể hiện mối liên hệ giữa pH và

mức độ phân mảnh DNA tinh trùng trong nghiên cứu của chúng tôi.

Bảng 3.9. Mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA tinh trùng với độ pH của

tinh dịch

pH tinh dịch Số lượng DFI (%) P- values

< 7,2 12 (7,95%) 36,95 ± 28,80 < 0,001 ≥ 7,2 139 (92,05%) 20,26 ± 13,18

Trong nghiên cứu này, mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA tinh

trùng và pH có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,01 và được chia làm

hai nhóm. Nhóm có pH < 7,2 có 12 bệnh nhân, giá trị DFI là 36,95 ± 28,80%,

giá trị DFI này thuộc nhóm cao. Nhóm có giá trị pH ≥ 7,2 chiếm phần lớn trong

tổng số bệnh nhân được nghiên cứu và có giá trị DFI là 20,26 ± 13,18%.

Đồng thời, một mối tương quan nghịch giữa giá trị pH và mức độ phân

mảnh DNA tinh trùng với hệ số tương quan r = - 0,02 và p = 0,012 hay pH càng

thấp (pH < 7,2) thì tinh trùng có mức độ phân mảnh càng cao (Hình 3.4).

Hình 3.4. Mối tương quan giữa mức độ phân mảnh DNA tinh trùng và pH tinh dịch

Kết quả trong nghiên cứu này cũng phù hợp với công bố trước đó về ảnh

hưởng của pH lên mức độ phân mảnh của tinh trùng [38]. Tuy nhiên, trong

nghiên cứu của Lê Minh Tâm và cộng sự (2019) lại chỉ ra không có mối tương

quan đáng kể nào giữa mức độ phân mảnh DNA tinh trùng và pH khi phân tích

trên 318 bệnh nhân vô sinh nam [2].

3.3.2.3. Mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA tinh trùng với thể tích xuất tinh

Mẫu tinh dịch của nam giới khi xuất tinh sẽ bao gồm tinh trùng và tinh

tương. Trong đó, 90% tinh dịch là sản phẩm của tuyến sinh dục (túi tinh và

tuyến tiền liệt), phần còn lại là do tinh hoàn, mào tinh và tuyến hành niệu đạo

tiết ra. Thể tích xuất tinh cần được tiến hành đo chính xác, vì thông số này sẽ

liên quan tới cách tính tổng số tinh trùng và tổng số tế bào lạ trong một lần xuất

tinh [113].

Bảng 3.10. Mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA tinh trùng với thể tích

xuất tinh

Thể tích xuất tinh Số lượng DFI (%) P- values

< 1mL 2 (1,32%) 28,30 ± 18,67

1 mL – 1,5 mL 8 (5,3%) 19,52 ± 13,13 0,775

≥ 1,5 mL 141 (93,38%) 21,60 ± 15,69

Trong đánh giá của chúng tôi, dựa theo tiêu chuẩn phân tích tinh dịch đồ

của WHO, 2010, thể tích xuất tinh của nam giới vô sinh được chia thành 3 nhóm

thể hiện ở bảng 3.10 như trên. Chỉ có 2 trường hợp có thể tích xuất tinh < 1mL

với giá trị DFI trung bình là 28,30 ± 18,67%. Nhóm bệnh nhân có thể tích xuất

tinh ≥ 1,5 mL chiếm số lượng nhiều nhất trong tổng số bệnh nhân được nghiên

cứu với 114 bệnh nhân và chỉ số phân mảnh DNA tinh trùng là 21,60 ± 15,69%.

Tuy nhiên, giữa các nhóm này và chỉ số phân mảnh DNA tinh trùng không có sự

khác biệt có ý nghĩa thống kê với p = 0,775. Kết quả nghiên cứu này cũng phù

hợp với một số nghiên cứu khác của Sepaniak S. và cộng sự (2006) [98], Lê

Minh Tâm và cộng sự (2019) [2].

3.3.2.4. Mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA với mật độ tinh trùng

Giới hạn tối thiểu của mật độ tinh trùng trong một lần xuất tinh là 15.106

(TT/ml) theo tiêu chuẩn đánh giá của WHO, 2010. Vì vậy, để đánh giá mối liên

hệ giữa mức độ phân mảnh DNA tinh trùng, chúng tôi chia mật độ tinh trùng

thành hai nhóm và mối liên hệ này được thể hiện như trong bảng 3.11.

Bảng 3.11. Mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA với mật độ tinh trùng

Mật độ tinh trùng (TT/mL) Số lượng DFI (%) P-values

< 15.106 45 (29,8%) 26,66 ± 18,77 0,008 ≥ 15. 106 106 (70,2%) 19,43 ± 13,46

Giữa hai nhóm mật độ và mức độ tổn thương DNA của tinh trùng, một

mối liên hệ có ý nghĩa thống kê được xác định với giá trị p = 0,008 và có mối

tương quan nghịch với hệ số tương quan r = - 0,26, p = 0,02 được tìm thấy (Hình

3.5). Cụ thể, nhóm bệnh nhân xuất tinh có mật độ tinh trùng < 15.106 (TT/mL)

(mật độ tinh trùng thấp dưới ngưỡng cho phép) có 45 bệnh nhân và giá trị DFI

trung bình khá cao là 26,66 ± 18,77%. Nhóm bệnh nhân xuất tinh có mật độ tinh

trùng ≥ 15. 106 (TT/mL) có 106 bệnh nhân (chiếm 70,2%) trong tổng số 151

bệnh nhân được nghiên cứu có giá trị phân mảnh DNA tinh trùng trung bình là

19,43 ± 13,46%.

Hình 3.5. Mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA với mật độ tinh trùng

Mặt khác, mật độ và tổng số tinh trùng trong một lần xuất tinh sẽ đánh giá

đươc khả năng sản sinh tinh trùng của tinh hoàn cũng như sự thông suốt của ống

dẫn tinh và mật độ tinh trùng có liên quan quan nhiều đến kết quả có thai của

bệnh nhân hay cơ sở để tiên lượng khả năng có thai [75]. Điều này thể hiện rằng,

khi quá trình sinh tinh hoặc ống dẫn tinh có vấn đề, đã dẫn đến việc sản xuất

tinh trùng không được diễn ra bình thường và mật độ thấp thì tinh trùng sẽ có

mức độ phân mảnh cao như trong nghiên cứu của chúng tôi. Sự phân mảnh

DNA tinh trùng cũng có thể bị gây ra trong quá trình sinh tinh, chính vì vậy, đã

có nhiều nghiên cứu đánh giá về mối liên hệ giữa hai yếu tố này.

Trong một nghiên cứu của Zhonghua và cộng sự (2008) đã sử dụng

phương pháp SCD để phân tích mức độ phân mảnh của tinh trùng và chỉ ra

chúng có mối liên hệ với mật độ của tinh trùng với p < 0,01 [116]. Tuy nhiên,

kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với một nghiên cứu gần đây của Salah

Elbashir (2018) trên 182 trường hợp đã chỉ ra rằng không có mối liên hệ nào

giữa mức độ phân mảnh với mật độ của tinh trùng (T test, p = 0,181) [95],

Sivanarayana và cộng sự (2014) [103], Lê Minh Tâm và cộng sự (2019) [2].

3.3.3.5. Mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA với độ di động của tinh trùng

Để đánh giá mối liên hệ giữa độ di động của tinh trùng với mức độ phân

mảnh DNA, độ di động của tinh trùng được chia thành 2 nhóm, thể hiện ở bảng

3.12.

Bảng 3.12. Mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA với độ di động của

tinh trùng

Di động Số lượng DFI (%) P-values

PR + NP ≥ 40% 138 (91,39%) 20,30 ± 13,66 0,001 PR + NP < 40% 13 (8,61%) 35,24 ± 25,73

Dựa theo số lượng được thống kê ở trên, nhóm có tinh trùng di động tiến

tới PR + NP ≥ 40% có 138 bệnh nhân, chiếm 91,39%, gần như toàn bộ số lượng

bệnh nhân trong tổng số đối tượng được nghiên cứu. Cũng trong nhóm này, chỉ

số phân mảnh DNA trung bình là 20,30 ± 13,66%. Nhóm còn lại có 13 bệnh

nhân và có giá trị DFI trung bình là 35,24 ± 25,73%. Mối liên hệ giữa hai nhóm

về độ di động tinh trùng với mức độ phân mảnh DNA tinh trùng có sự khác biệt

có ý nghĩa thống kê với giá trị p = 0,001.

Khi đánh giá mối tương quan giữa DFI và độ di động của tinh trùng trong

nghiên cứu này, một mối tương quan nghịch được chỉ ra với hệ số tương quan r

= - 0,29 và p < 0,001(Hình 3.6). Điều này cũng có nghĩa rằng, tinh trùng có độ

di động càng thấp (PR + NP < 40%) có chỉ số phân mảnh DNA càng cao.

Hình 3.6. Mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA với độ di động của

tinh trùng

Kết quả này cũng phù hợp với một số nghiên cứu của các tác giả trước

đây như Sivanarayana và cộng sự (2014) chỉ ra rằng tinh trùng có phân mảnh

DNA cao tương quan nghịch với các thông số tinh dịch: mật độ, khả năng vận

động [103]. Muriel và cộng sự (2006) chỉ ra mối tương quan nghịch giữa tổn

thương DNA của tinh trùng với độ di động của tinh trùng [85]. Mối tương quan

nghịch giữa độ di động và DFI của tinh trùng cũng được tìm thấy trong nghiên

cứu của Lê Minh Tâm và cộng sự (2019) [2].

Ngược lại, một số nghiên cứu khác lại không tìm thấy mối liên hệ có ý

nghĩa thống kê giữa các thông số tinh dịch thông thường và mức độ phân mảnh

DNA của tinh trùng. Ngay cả ở những người đàn ông mắc bệnh

Oligozoospermia (mật độ tinh trùng ít < 15.106 TT/ mL), không có mối tương

quan đáng kể giữa sự phân mảnh DNA của tinh trùng và độ di động, mật độ

hoặc hình dạng bình thường [68], [98]. Mặt khác, tỷ lệ tinh trùng di động tiến tới

có liên quan tới tỷ lệ có thai của một cặp vợ chồng [75].

3.3.2.6. Mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA với tỷ lệ sống của tinh trùng

Dựa theo tiêu chuẩn của WHO, 2010, để đánh giá mối liên hệ giữa mức

độ phân mảnh DNA và tỷ lệ sống của tinh trùng, tỷ lệ sống của tinh trùng được

chia thành hai nhóm: nhóm tinh trùng có tỷ lệ sống (TLS) < 58% và nhóm tinh

trùng có TLS > 58%. Dữ liệu được thống kê trong bảng 3.13.

Bảng 3.13. Mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA với tỷ lệ sống của

tinh trùng

Tỉ lệ sống – TLS Số lượng DFI (%) P-values

TLS < 58% 24 (15,89%) 34,85 ± 20,14 < 0,001 TLS > 58% 127 (84,11%) 19,08 ± 13,16

Trong bảng 3.13 ở trên, nhóm tinh trùng có tỷ lệ sống < 58% có 24 bệnh

nhân, chiếm số lượng ít trong tổng số 151 bệnh nhân được nghiên cứu nhưng

mức độ phân mảnh DNA tinh trùng thuộc nhóm cao với giá trị DFI trung bình là

34,85 ± 20,14%. Nhóm tinh trùng có tỷ lệ sống > 58% có 127 bệnh nhân và có

giá trị DFI trung bình thuộc mức trung bình thấp là 19,08 ± 13,16%. Bên cạnh

đó, giữa hai nhóm này với mức độ phân mảnh DNA tinh trùng có sự khác biệt

có ý nghĩa thống kê với p < 0,001.

Khi đánh giá tỷ lệ sống của tinh trùng, kết quả này sẽ cho phép người làm

xét nghiệm kiểm tra chéo kết quả của tỷ lệ di động. Bởi vì, tỷ lệ sống của tinh

trùng có ý nghĩa rất quan trọng trong các trường hợp tinh trùng bất động hoàn

toàn trong mẫu tinh dịch sau khi được xuất tinh. Tỷ lệ tinh trùng bất động lớn,

có khả năng do bất thường trong cấu trúc đuôi của tinh trùng [29]. Tỷ lệ tinh

trùng chết và bất động cao, có thể là do bệnh lý ở mào tinh hoàn [33]. Bên cạnh

đó, một mối tương quan nghịch cũng được chỉ ra giữa DFI và tỷ lệ sống của tinh

trùng với hệ số tương quan r = - 0,32 và p < 0,001 (Hình 3.7). Hay những mẫu

tinh trùng có tỷ lệ sống thấp (TLS < 58%) có mức độ phân mảnh cao hơn so với

mức mẫu tinh trùng có tỷ lệ sống > 58%.

Hình 3.7. Mối tương quan giữa mức độ phân mảnh DNA với tỷ lệ sống của

tinh trùng

Như vậy, kết quả nghiên cứu của đề tài luận văn này đã chỉ ra có mối

tương quan nghịch giữa tỷ lệ sống với sự phân mảnh DNA của tinh trùng và

cũng hoàn toàn phù hợp với một số nghiên cứu của Denny Sakkas và cộng sự

(2010) [38], Salah Elbashira và cộng sự (2018) [95], Zhonghua Yi và cộng sự

(2008) [116]. Tuy nhiên, trong một số nghiên cứu của Sepaniak S. và cộng sự

(2006) [98], Khalili MA. và cộng sự [68], Lê Minh Tâm và cộng sự (2019) [2]

lại không chỉ ra mối tương quan đáng kể nào.

3.3.2.7. Mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA với hình dạng của tinh trùng

Mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA với hình dạng của tinh trùng

được thể hiện trong bảng 3.14 và được chia thành hai nhóm: nhóm tinh trùng có

hình dạng bất thường (HD < 4) và nhóm tinh trùng có hình dạng bình thường

(HD ≥ 4).

Bảng 3.14. Mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA với hình dạng của

tinh trùng

Hình dạng tinh trùng – HD Số lượng DFI (%) P-values

Bất thường (HD < 4) 115 (76,16%) 20,52 ± 15,63 0,134 Bình thường (HD ≥ 4) 36 (23,84%) 24,98 ± 14,89

Hình dạng bình thường của tinh trùng được xác định dựa vào kết quả

khảo sát các tinh trùng vượt qua chất nhày cổ tử cung hay tinh trùng đã gắn kết

được lên bề mặt lớp màng trong suốt zona pellucida của noãn [82]. Vì vậy, tinh

trùng bình thường sẽ có phần đầu, cổ, phần giữa và đuôi bình thường. Theo

khuyến cáo mới nhất của Tổ chức Y tế Thế giới, hình dạng bình thường của tinh

trùng được đánh giá một cách nghiêm ngặt theo Kruger [73].

Theo dữ liệu thống kê trong bảng trên, tỷ lệ bệnh nhân có mẫu tinh dịch

chứa tinh trùng có hình dạng bình thường < 4% (bất thường) là 115 bệnh nhân

(76,16%). Nhóm bệnh nhân này chiếm phần lớn trong tổng số bệnh nhân được

nghiên cứu và có giá trị DFI trung bình 20,52 ± 15,63%. Nhóm bệnh nhân còn

lại có 36 bệnh nhân có tinh trùng có hình dạng bình thường ≥ 4% và có chỉ số

phân mảnh DNA tinh trùng là 24,98 ± 14,89%. Tuy nhiên, giữa hai nhóm hình

thái với mức độ phân mảnh DNA tinh trùng không có mối liên hệ có ý nghĩa

thống kê hay giữa tinh trùng có hình dạng bình thường hay bất thường và chỉ số

phân mảnh DNA là độc lập với nhau.

Theo nghiên cứu của Daris B. và cộng sự (2010), những tinh trùng có bất

thường ở đầu, đặc biệt là đầu có hình dạng bất định, được báo cáo là có liên

quan đến khả năng DNA bị phân mảnh cao [36]. Ngoài ra, khi đánh giá hình

dạng tinh trùng bằng phân tích Fourier hình elip và phát hiện sự phân mảnh

DNA tinh trùng bằng phương pháp TUNEL, người ta đã đưa ra nhận định rằng

những tinh trùng có hình elip bất thường, góc cạnh và có không bào lớn ở hạt

nhân tinh trùng có liên quan tới sự phân mảnh DNA [109]. Bên cạnh đó, tỷ lệ

tinh trùng có hình dạng bình thường được đánh giá theo tiêu chuẩn nghiêm ngặt,

có mối tương quan thuận với tỷ lệ có thai tự nhiên hoặc có thai khi thực hiện các

kỹ thuật hỗ trợ sinh sản [22].

Đối lập với kết quả nghiên cứu của chúng tôi, sự khác biệt có ý nghĩa

thống kê đã được quan sát giữa những người đàn ông có hình thái tinh trùng bất

thường và những người đàn ông có hình thái tinh trùng bình thường (p = 0,0002)

trong nghiên cứu của Joanna Jakubik-Uljasz và cộng sự (2020) cũng đã chỉ ra có

mối tương quan thuận giữa DFI và hình thái tinh trùng bất thường ở đàn ông vô

sinh khi đánh giá mức độ phân mảnh DNA tinh trùng bằng phương pháp SCD

[65]. Có một mối tương quan thuận giữa bất thường hình thái đầu tinh trùng và

sự phân mảnh DNA tinh trùng trong nghiên cứu của Lê Minh Tâm và cộng sự

(2019) khi phân tích 390 bệnh nhân nam vô sinh (r = 0,113, p = 0,027) [2].

Như vậy, trong nghiên cứu của các tác giả khác, có một mối quan hệ rõ

ràng giữa hình thái tinh trùng và tính toàn vẹn DNA của tinh trùng. Các tác giả

kết luận rằng kiểm tra hình thái rất quan trọng trong quá trình đánh giá tinh dịch

thông thường, kết hợp với các dấu hiệu toàn vẹn DNA, là một yếu tố dự báo

hoàn hảo về chất lượng tinh dịch trong đánh giá chất lượng tinh trùng của nam

giới vô sinh. Đổi lại, một số tác giả khác Cissen. M và cộng sự (2016) [31],

Evenson D.P và cộng sự (2017) [50], Tang S.S và cộng sự (2010) [107], đã tìm

thấy trong nghiên cứu của họ rằng mức độ phân mảnh DNA tinh trùng ở những

đối tượng mắc chứng teratozoospermia cao hơn đáng kể so với đối tượng khác.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1. Kết luận

- Đã đánh giá được các đặc điểm lâm sàng của 151 bệnh nhân đến khám

và điều trị tại khoa Hỗ trợ Sinh sản - Bệnh viện A Thái Nguyên và xác định

được độ tuổi trung bình của bệnh nhân là 32,04 ± 5,97 tuổi, có 79 bệnh nhân sử

dụng thuốc lá, có 134 bệnh nhân sử dụng rượu bia và 33 bệnh nhân có tiền sử bị

quai bị.

- Đã xác định được các đặc điểm tinh dịch đồ của các đối tượng nghiên

cứu gồm: thời gian kiêng xuất tinh trung bình là 4,18 ngày; thể tích xuất tinh

trung bình là 3,05mL; giá trị pH trung bình của các mẫu tinh dịch là 7,45; mật

độ tinh trùng trung bình trong một lần xuất tinh là 22,63.106 TT/mL; tỷ lệ tinh

trùng di động tiến tới là 25,36%; tinh trùng có tỷ lệ sống trung bình là 65,15%;

tỷ lệ tinh trùng có hình dạng bình thường trung bình là 1,16%.

- Giá trị phân mảnh DNA tinh trùng trung bình bằng phương pháp khảo

sát cấu trúc nhiễm sắc chất tinh trùng (SCSA) là 21,58 ± 15,53%.

- Không có mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA tinh trùng với

các đặc điểm về độ tuổi, sử dụng thuốc lá, rượu bia, các yếu tố nội tiết cũng

như các chỉ số tinh dịch đồ - thời gian kiêng xuất tinh, thể tích xuất tinh, hình

dạng tinh trùng.

- Đã xác định được mối tương quan thuận giữa mức độ phân mảnh

DNA tinh trùng với bệnh nhân từng mắc quai bị, hệ số tương quan r = 0,17 và

p = 0,35.

- Có mối tương quan nghịch giữa mức độ phân mảnh DNA tinh trùng với

pH tinh dịch (r = - 0,02 và p = 0,012), mật độ tinh trùng (r = - 0,26, p = 0,02), tỷ

lệ sống của tinh trùng (r = - 0,32 và p < 0,001).

2. Kiến nghị

- Cần phân tích trên số lượng mẫu lớn hơn để đưa ra các đánh giá chính

xác cho mối liên hệ giữa sự phân mảnh DNA tinh trùng với các trường hợp bệnh

nhân có tiền sử bị quai bị đến khám và điều trị vô sinh tại khoa Hỗ trợ Sinh sản -

Bệnh viện A Thái Nguyên.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của sự phân mảnh DNA tinh trùng lên kết quả có

thai của những trường hợp thực hiện các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản như IUI và

IVF/ICSI tại khoa Hỗ trợ Sinh sản - Bệnh viện A Thái Nguyên.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

1. Hồ Mạnh Tường, Đặng Quang Vinh, Vương Thị Ngọc Lan (2011), “Thụ tinh trong ống nghiệm”, NXB Giáo dục Việt Nam, 44-45.

2. Lê Minh Tâm, Trần Thị Như Quỳnh, Lê Đình Dương, Cao Ngọc Thành Bệnh viện Đại học Y Dược Huế (2019), “Một số yếu tố liên quan phân mảnh DNA tinh trùng”, Journal of obstetrics and gynecology – Tạp chí Phụ sản - Tập 17 (01), 09 – 2019. 54-61.

3. Nguyễn Khắc Liêu (2002), “Vô sinh chẩn đoán và điều trị”, Nhà xuất bản Y học, 35-38.

4. Vũ Đào Minh Thông, Nguyễn Thị Trà My (2018), “Đánh giá kết quả kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm tại khoa hỗ trợ sinh sản bệnh viện A Thái Nguyên từ 2016 đến 2018”, Đề tài nghiên cứu khoa học cấp cơ sở năm 2018 – Bệnh viện A Thái Nguyên. 40-43.

Tài liệu tiếng Anh

5. Agarwal A., Saleh R.A., Bedaiwy M.A. (2003), “Role of reactive oxygen species in the pathophysiology of human reproduction”, Fertility and sterility, 79(4), 829-843.

6. Agarwal, A., Majzoub Ahmad C., Esteves Sandro, Ko Edmund, Ramasamy, Zini Armand (2016), “Clinical utility of sperm DNA fragmentation testing: practice recommendations based on clinical scenarios”, Transl Androl Urol; 5(6):935-950.

7. Agarwal Ashok, Shubhadeep Roychoudhury, Kimberly B., Bjugstad, and Chak-Lam Cho (2016), “Oxidation-reduction potential of semen: what is its role in the treatment of male infertility?”, Fertility and sterility, pg 302-318.

8. Aguilar C., Meseguer M., Garcıa-Herrero S., Gil-Salom M., O’Connor J.E. & Garrido N. (2010), “Relevance of testicular sperm DNA oxidation for the outcome of ovum donation cycles”, Fertil Steril 94, 979–988.

9. Aitken R.J., de Iuliis G.N. (2007), “Origins and consequences of DNA damage in male germ cells”, Reprod Biomed Online, 14, 727-733.

10. Ajduk A., Yamauchi Y., Ward M.A. (2006), “Sperm chromatin remodeling after intracytoplasmic sperm injection differs from that of in vitro fertilization”, Biol Reprod, 75, 442-51.

Komiya, Tomonori Kato, Yoko

11. Akira Kawauchi, Akihiko Watanabe, and Hideki Fuse (2014), “Clinical Factors Associated with Sperm DNA Fragmentation in Male Patients with Infertility”, Published online 2014 Aug 4. doi: 10.1155/2014/868303.

( 2014), “Testicular sperm aspiration I.J. & Zini A.

12. Alrabeeah K., Yafi F., Flageole C., Phillips S., Wachter A., Bissonnette F., Kadoch for nonazoospermic men: sperm retrieval and intracytoplasmic sperm injection outcomes”, Urology 84, 1342– 1346.

13. Alvarez J.G. (2003), “DNA fragmentation in human spermatozoa: significance in the diagnosis and treatment of infertility”, Minerva Ginecol, 55, 233-239.

14. Anatomy & Physiology, “Chapter 7: The reproductive system”, OpenStax CollegeRice University, p. 1223, 77005.

15. Anupama Deenadayal Mettlera, Mirudhubashini Govindarajanb, Sapna Srinivasa, Sridurga Mithraprabhub, Donald Evensond and Tara Mahendran, “Male age is associated with sperm DNA/chromatin integrity”, Andrology Center, 1056/2.

16. Avendaño C., Franchi A., Duran H. & Oehninger S. (2010), “DNA fragmentation of normal spermatozoa negatively impacts embryo quality and intracytoplasmic sperm injection outcome”, Fertility and sterility, 94(2), 549557.

17. Aziz N., Agarwal A. (2008), “Evaluation of sperm damage: beyond the World HealthOrganization criteria”, Fertil Steril , vol. 90(pg. 484–485).

18. Balhorn R. (2007), “The protamine family of sperm nuclear proteins” Genome biology, 8(9) 77-82.

(2012), “The protamine family of sperm nuclear

19. Balhorn R. proteins”, Genome biology, 8(9) 77-82.

20. Barratt C.L.R, Björndahl L., Menkveld R., Mortimer D. (2011), “Special interest group for andrology basic semen analysis course: a continued focus on accuracy, quality, efficiency and clinical relevance”, Human Reproduction, 3207-3212.

21. Benchaib M, Braun V, Lornage J, Hadj S, Salle B, Lejeune H, Guerin J.F. (2003), “Sperm DNA fragmentation decreases the pregnancy rate in an assisted reproductive technique”, Hum Reprod, 18, 1023–1028.

22. Boe-Hansen G. B., Fedder J., Ersbøll A.K., & Christensen, (2006), “The sperm chromatin structure assay as a diagnostic tool in the human fertility clinic”, Human Reproduction, 21(6), 1576–1582. doi:10.1093/humrep/del019 .

J., Bunting, L., Collins, J.A.,

23. Boivin, and Nygren, K.G. (2007), “International estimates of infertility prevalence and treatment-seeking: potential need and demand for infertility medical care”, Hum Reprod; 22: 1506– 1512.

24. Brahem S., Jellad S., Ibala S., Saad A., Mehdi M. (2012), “DNA fragmentation status in patients with necrozoospermia”, SystBiolReprod Med; 58:319-23.

25. Bungum M., Humaidan P., Axmon A., Spano M., Bungum L., Erenpreiss J.& Giwercman A. (2007), “Sperm DNA integrity assessment in prediction ofassisted reproduction technology outcome”, Human Reproduction, 22(1),174- 179.

26. Cathy K., Naughton, Ajay K., Nangia, Ashok Agarwal (2001), “Varicocele and male infertility: Part II: Pathophysiology of varicoceles in male infertility”, Human Reproduction Update, vol 7, No 5, pp,473 – 481.

27. Celik-Ozenci C., Jakab A., Kovacs T., Catalanotti J., Demir R., Bray-Ward P. & Huszar G. (2004), “Sperm selection for ICSI: shape properties do notpredict the absence or presence of numericalchromosomal aberrations”, Human Reproduction, 19(9), 2052-2059.

28. Cheek A.O. and MacLachlan J.A. (1998), “Environmental hormones and the male reproductive system”, J Androl 19: 5-10.

29. Chemes H.E., Rawe Y.V. (2003), “Sperm pathology: a step beyond descriptive morphology. Origin, characterization and fertility potential of abnormal sperm phenotypes in infertile men”, Hum Reprod Update; 9:405 – 428.

I.A. & Zalensky A.O.

30. Churikov D., Zalenskaya (2004), “Male germlinespecific histones in mouse and man”, Cytogenetic and genome research, 105(2-4), 203-214.

31. Cissen M., Wely M.V., Scholten I., et al (2016), “Measuring sperm DNA fragmentation and clinical outcomes of medically assisted reproduction: a systematic review and metaanalysis”, PLoS One;10;11:e0165125.

32. Colasante A., lobascio A.M., Scarselli F., Minasi M.G., Alviggi E.P., Casciani V., Peña R., Varricchio M.T. , Litwicka K., Ferrero S., Zavaglia D., Franco G., Nagy Z.P., Greco E., “The relationship between male age, sperm quality and sperm DNA damage in an unselected population of 1566 men attending a fertility centre for the first time”, Human Reproduction, Volume 26, Issue suppl_1, 2011, Pages i123–i148.

33. Correa-Perez J.R., Fernandez Plegrina R., Aslanis P. et al (2004), “Clinical management of men producing ejaculates characterized by high levels of dead sperm and altered seminal plasma factors consistent with epididymal necrospermia”, Fertil Steril 81:1148-50.

34. Courtens J.L. & Loir M. (1981), “Ultrastructural detection of basic nucleoproteins: alcoholic phosphotungstic acid does not bind to arginine residues”, Journal of ultrastructure research, 74(3), 322-326.

35. Dadoune J.P. (1995), “The nuclear status of human sperm cells”, Micron, 26(4), 323-345.

36. Daris B., Goropevsek A., Hojnik N., Vlaisavljevic V. (2010), “Sperm morphological abnormalities as indicators of DNA fragmentation and fertilization in ICSI”, Archives of gynecology and obstetrics; 281(2):363-7

“Ultrastructural (1969),

37. De Kretser D.M. features of human spermiogenesis”, Zeitschrift für Zellforschung und Mikroskopische Anatomie, 98(4), 477-505.

38. Denny Sakkas, Juan G., Alvarez (2010), “Sperm DNA fragmentation: mechanisms of origin, impact on reproductive outcome, and analysis”, Fertil Steril. 1;93(4), pp:1027-36.

39. Dixon G.H., Aiken J.M., Jankowski J.M., McKenzie D.I. & Moir R. (1985), “Organization and evolution of the protamine genes of salmonid fishes, In Chromosomal proteins and gene expression”, Springer US, 287-314.

40. Dyer S., Chambers G.M., De Mouzon J., Nygren K.G., Zegers-Hochschild F., Mansour R., Ishihara O., Banker M., (2016), “Adamson, International committee for monitoring assisted reproductive technologies world report: Assisted reproductive technology 2008, 2009 and 2010”, Hum. Reprod. https://doi.org/10.1093/humrep/dew082.

41. Dym M. & Fawcett D.W. (1971), “Further observations on the numbers of spermatogonia, spermatocytes, and spermatids connected by intercellular bridges in the mammalian testis”, Biology of Reproduction, 4(2), 195-215.

42. Elaine N.M. (2012), “Essentials of human anatomy and physiology”, Pearon Education, USA.

43. Evenson D.P., Witkin S.S., De Harven E. & Bendich A. (1978), “Ultrastructureof partially decondensed human spermatozoal chromatin”, Journal ofultrastructure research, 63(2), 178-187.

44. Evenson D.P., Darzynkiewicz Z. & Melamed M.R. (1980), “Comparison of human and mouse sperm chromatin structure by flow cytometry”, Chromosoma, 78(2), 225-238.

45. Evenson D.P., Jost L.K., Baer R.K., Turner T.W. & Schrader S.M. (1991), “Individuality of DNA denaturation patterns in human sperm as measured bythe sperm chromatin structure assay”, Reproductive Toxicology, 5(2), 115-125.

46. Evenson D.P., Jost L.K., Marshall D., Zinaman M.J., Clegg E., Purvis K. & Claussen O.P. (1999), “Utility of the sperm chromatin structure assay as a

tool in the human fertility clinic”, Human

diagnostic and prognostic Reproduction, 14(4), 1039-1049.

47. Evenson D.P. & Jost L.K. (2000), “Sperm chromatin structure assay is usefulfor fertility assessment”, Methods in Cell Science, 22(2-3), 169-189.

48. Evenson D.P., Wixon R. (2005), “Comparison of the Halosperm test kit with the sperm chromatin structure assay (SCSA) infertility test in relation to patient diagnosis and prognosis”, Fertil Steril, 84, 846–849.

49. Evenson D.P. (2016), “The Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA®) andother sperm DNA fragmentation tests for evaluation of sperm nuclear DNAintegrity as related to fertility”, Animal reproduction science, 169, 56-75.

50. Evenson D.P. (2017), “Evaluation of sperm chromatin structure and DNA strand breaks is an important part of clinical male fertility assessment”, Transl Androl Urol; 6:S495-500.

51. ESHRE Capri Workshop Group (2010), “Europe, the continent with the lowest fertility”, Hum Reprod Update; 16: 590–602.

52. Fernández J.L., Muriel L., Rivero M.T. et al. (2003), “The sperm chromatin dispersion test: a simple method for the determination of sperm DNA fragmentation”, J Androl,24, 59–66.

53. Fernández J.L. et al. (2005), “Simple determination of human sperm DNA fragmentation with an improved sperm chromatin dispersion test”, Fertil Steri, l84, 833-842.

54. Figà-Talamanca I., Cini C., Varricchio G.C., Dondero F., Gandini L., Lenzi A., Lombardo F., Angelucci L., Di Grezia R., Patacchioli F.R. (1996), “Effects of prolonged autovehicle driving on male reproduction function: a study among taxi drivers”, Am J Ind Med. Dec;30(6):750-8.

55. Gatewood J.M., Cook G.R., Balhorn R., Bradbury E.M. &Schmid C.W. (1987), “Sequence-specific packaging of DNA in human sperm chromatin”, Science 236, 962–964.

56. Gatewood J.M., Cook G.R., Balhorn R., Schmid C.W. & Bradbury E.M. (1990), “Isolation of four core histones from human sperm chromatin representing a minor subset of somatic histones”, J BiolChem 265,20662–20666.

57. Gorczyca W., Traganos F., Jesionowska H. & Darzynkiewicz Z. (1993), “Presence of DNA strand breaks and increased sensitivity of DNA in situ to denaturation in abnormal human sperm cells: analogy to apoptosis of somatic cells”, Experimental cell research, 207(1), 202-205.

58. Gosa´ lvez J., Gonza´ lez-Martı´ nez M., Lo´ pez-Ferna´ ndez C., Ferna´ ndez J.L., Sa´ nchez-Martı´ n P. (2011), “Shorter abstinence decreases sperm deoxyribonucleic acid fragmentation in ejaculate”, Fertil Steril; 96:1083–6.

59. Greco E., Romano S., Iacobelli M., Ferrero S., Baroni E., Minasi M.G., Ubaldi F., Rienzi L. & Tesarik J. ( 2005a), “ICSI in cases of sperm DNA damage: beneficial effect of oral antioxidant treatment”, Hum Reprod 20, 2590– 2594.

60. Greco E., Iacobelli M., Rienzi L., Ubaldi F., Ferrero S. & Tesarik J. ( 2005b), “Reduction of the incidence of sperm DNA fragmentation by oral antioxidant treatment”, J Androl 26, 349– 353.

61. Hammoud S.S., Nix D.A., Zhang H., Purwar J., Carrell D.T., Cairns B.R. (2009), “Distinctive chromatin in human sperm packages genes for embryo development”, Nature, 460, 473-8.

62. Haruo Katayose, Tomoko Takayama, Shoutarou Hayashi and Akira Sato (2006), “Role of mammalian sperm nuclear structure in fertilization and embryo development”, Reproductive Medicine and Biology; 5: 161–168.

63. Hongyi Yang, Gang Li, Haixia Jin, Yihong Guo, Yingpu Sun (2019), “The effect of sperm DNA fragmentation index on assisted reproductive technology outcomes and its relationship with semen parameters and lifestyle”, Transl Androl Urol; 8(4):356-365.

64. Jarvi K., Lau S., Lo K., Grober E., Trussell J.C., Hotaling J., Walsh T., Kolettis P., Chow V., Zini A., Spitz A., Fischer M., Domes T., Zeitlin S., Fuchs E., Hedges J., Samplaski M., Sandlow J., Brannigan R., Dupree J., Goldstein M., Ko E., Smith J., Kamal P., Hsieh M., Bieniek J., Shin D., Nangia A., “Results of

a North American Survey on the Characteristics of Men Presenting for Infertility”, Investigations: the Andrology Research Consortium, J. Urol. 199 (2018) e247. https://doi.org/10.1016/j.juro.2018.02.658.

65. Joanna Jakubik-Uljasz, Kamil Gill, Aleksandra Rosiak-Gill, Malgorzata Piasecka (2020), “Relationship between sperm morphology and sperm DNA dispersion”, Transl Androl Urol;9(2):405-415.

66. Joel L. Marmar (2001), “Varicocele and male infertility: Part II: The pathophysiology of varicoceles in the light of current molecular and genetic information”, Human Reproduction Update, Volume 7, Issue 5, September 2001, Pages 461–472.

plasma membrane on DNA integrity and of

67. Kemal Duru N., Morshedi M. & Oehninger S. ( 2000), “Effects of hydrogen human peroxide spermatozoa”, Fertil Steril; 74, 1200– 1207.

68. Khalili M.A., Aghaie‐Maybodi F., Anvari M., Talebi A.R. (2006), “Sperm nuclear DNA in ejaculates of fertile and infertile men: correlation with semen parameters”, Urol J; 3(3):154-159.

69. Koppers A.J., Iuliis G.N., Finnie J.M., McLaughlin E.A. & Aitken R.J. (2008), “Significance of mitochondrial reactive oxygen species in the generation of oxidative stress in spermatozoa”, J Clan Endocrinol Metab 93, 3199– 3207.

70. Kosower N.S., Katayose H. & Yanagimachi R. (1992), “Thiol‐disulfide status and acridine orange fluorescence of mammalian sperm nucleic”, Journal of andrology, 13(4), 342-348.

71. Krawetz S.A. & Dixon G.H. (1988), “Sequence similarities of the protamine genes: implications for regulation and evolution”, Journal of molecular evolution, 27(4), 291-297.

72. Kristian Leisegang, Sulagna Dutta (2020), “Do lifestyle practices impede male fertility? Invited review Special Edition: An Update on Male Infertility: Factors, Mechanisms and Interventions”, Andrologia; 00:e13595.

73. Kruger, T. F., Menkveld, Lombard C.J., Van der Merwe J.P., Van Zyl J.A., et al (1986), “Sperm morphologic features as a prognostic factor in in vitro fertilization”, Fertil Steril 46:1118-23.

74. Kruger T.F., Acosta A.A., Simmons K.F., Swanson R.J., Matta J.F., Oehninger S. 1988, “Predictive value of abnormal sperm morphology in in vitro fertilization”, Fertil Steril; 49:112-7.

75. Lasen L., Scheike T., Jensen T.K., Bonde J..P, Giwercman A. (2000), “Computer-assited semen analaysis prameters as predictors for fertility of men from the general population”, The Danish First Pregnancy Planner Study Team. Human Reprod ;15:1562-1567.

76. Larson - Cook K.L., DeJonge C., Barnes A., Jost L. & Evenson và cs D.P. (2000), “Relationship between assisted reproductive techniques (ART) outcome andstatus of chromatin integrity as measured by the Sperm Chromatin StructureAssay (SCSA)”, Hum Reprod, 15, 1717-1722.

77. Larson-Cook K.L., Brannian J.D., Hansen K.A., Kasperson K.M., Evenson và cs D.P. (2003), “Relationship between the outcomes of assisted reproductive techniques and sperm DNA fragmentation as measured by the sperm chromatin structure assay”, Fer & Ster, 80(4), 895-902.

78. Levine H., Jorgensen N., Martino-Andrade A., Mendiola J., Weksler-Derri D., Mindlis I., Pinotti R. & Swan S.H. (2017), “Temporal trends in spermcount: a systematic review and meta-regression analysis”, Hum ReprodUpdate; 23, 646–659.

79. Lopes S., Sun J.G., Jurisicova A., Meriano J., Casper R.F. (1998), “Sperm deoxyribonucleic acid fragmentation is increased in poor-quality semen samples and correlates with failed fertilization in intracytoplasmic sperm injection”, Fertil Steril, 69, 528–532.

80. Majzoub A., Esteves S.C., Gosálvez J., et al (2016), “Specialized sperm function tests in vari cocele and the future of andrology laboratory”, Asian J Androl; 18(2): 205-12.

81. Mary Ann Emanuele, M.D., Nicholas V. Emanuele, M.D (1998), “Alcohol’s Effects on Male Reproduction”, Alcohol Health & Research World, Vol. 22, No. 3, 1998, 195 – 201.

82. Menkveld R., Wong W.Y., Lombard CJ., Wetzels A.M., Thomas C.M., Merkus H.M., Steegers-Theunissen R.P. (2001), “Semen parameters including

WHO and strict criteria morphology, in a fertile and subfertile population: an effort towards standardization of in-vivo thresholds”, Hum Reprod, vol. 16 (pg. 1165-1171).

83. Milewski R., Milewska AJ., Czerniecki J., Lesniewska M. & Wolczynski S. (2013), “Analysis of the demographic profile of patients treated for infertility using assisted reproductive techniques in 2005–2010”, Ginekol Pol 84, 609– 614.

84. Mortimer D. (1994), “Sperm physiology”. In: Mortimer D., ed. Practical laboratory andrology”, Oxford University Press, UK.

insemination: a blind prospective

85. Muriel L., Meseguer M., Fernandez JL., et al (2006), “Value of the sperm chromatin dispersion test in predicting pregnancy outcome in in- study”, Human Reprod trauterine ;21(3):738‐744.

86. Oko R.J., Jando V., Wagner C.L., Kistler W.S., Hermo L.S. (1996), “Chromatin reorganization in rat spermatids during the disappearance of testis- specific histone, H1t, and the appearance of transition proteins TP1 and TP2”, Biol Reprod, 54(5), 1141–57.

87. Pacey A.A., Povey A.C., Clyma J.A., McNamee R., Moore H.D., Baillie H., Cherry N.M., Participating Centres of Chaps-UK Author Notes (2014), “Modifiable and non-modifiable risk factors for poor sperm morphology”, Human Reproduction, Volume 29, Issue 8, August 2014, Pages 1629–1636.

88. Parmegiani L., Cognigni G., Filicori M. (2012), “New advances in Intracytoplasmic sperm injection (ICSI)”, Intech, 2, 99-117.

89. Plessis SS., McAllister DA., Luu A., Savia J., Agarwal A. & Lampiao F. ( 2010), “Effects of H(2)O(2) exposure on human sperm motility parameters, reactive oxygen species levels and nitric oxide levels”, Andrologia 42, 206– 210.

90. Potts R., Newbury C., Smith G., Notarianni L., Jefferies T. (1999), “Sperm chromatin damage associated with male smoking”, Mutat Res; 423: 103-111. [DOI:10.1016/S0027-5107(98)00242-5].

91. Ribas-Maynou J., García-Peiró A., Fernández-Encinas A., et al (2013), “Comprehensive analysis of sperm DNA fragmentation by five different assays: TUNEL assay, SCSA, SCD test and alkaline and neutral Comet assay”, Andrology; 1:715-722.

92. Richthoff J. , Spano M., Giwercman Y.L., Frohm B., Jepson K., Malm J., Elzanaty S., Stridsberg M., Giwercman A. (2002), “The impact of testicular and accessory sex gland function on sperm chromatin integrity as assessed by the sperm chromatin structure assay (SCSA)”, Human Reproduction, Volume 17, Issue 12, December 2002, Pages 3162–3169.

93. Said T.M., Paasch U., Glander H.J., Agarwal A. (2004), “Role of caspases in male infertility”, Human Reproduction Update, 10(1), 39-51.

94. Said T.M., Aziz N., Sharma R.K., Lewis-Jones I., Thomas A.J., Agarwal A (2005), “Novel association between sperm deformity index and oxidative stress-induced DNA damage in infertile male patients”, Asian J Androl, 7, 121- 126.

95. Salah Elbashira, Yasmin Magdib, Ayman Rashedc, Mohamed Ahmed, IbrahimdYehiaEdrisd, Ahmed Mostafa, Abdelazizd (2018), “Relationship between sperm progressive motility and DNA integrity in fertile and infertile men”, Middle East Fertility Society Journal, Volume 23, Issue 3, pp: 195-1978.

96. Sandro C. Esteves, Daniele Santi, Manuela Simoni (2020), “An update on clinical and surgical interventions to reduce sperm DNA fragmentation in infertile men”, Andrology; 8:53–81.

for male tool

97. Santi D., Spaggiari G., Simoni M. (2018), “Sperm DNA fragmentation index as a promising predictive infertility diagnosis and treatment management – meta-analyses”, Reprod Biomed Online.;37:315-326

98. Sepaniak S, Forges T, Gerard H, Foliguet B, Bene MC, Monnier Barbarino P. (2006), “The influence of cigarette smoking on human sperm quality and DNA fragmentation”, Toxicology; 223(1-2):54-60.

99. Sergerie M., Laforest G., Boulanger K., Bissonnette F. and Bleau1G., “Longitudinal study of sperm DNA fragmentation as measured by terminal

uridine nick end-labelling assay”, Human Reproduction Vol.20, No.7 pp. 1921– 1927, 2005.

100. Sergerie M., Laforest G., Bujan L., Bissonnette F., Bleau G. (2005), “Sperm DNA fragmentation: threshold value in male fertility”, Hum Reprod, 20, 3446– 3451.

101. Setchell BP. (1986), “Spermatogenesis and spermatozoa”, In: Austin CR, Short RV, eds. Reproduction in mamals, Book 1: Germ cells and fertilization. Cambridge University Press; 63-101.

102. Shi, TY, Chen, G, Huang, X, Yuan, Y, Wu, X, Wu, B, Li, Z, Shun, F, Chen, H & Shi, H. ( 2012), “Effects of reactive oxygen species from activated leucocytes on human sperm motility, viability and morphology”, Int J Androl Volume44, Issues1May 2012 Pages 696-703.

103. Sivanarayana T, Ravi Krishna C, Jaya Prakash G, Krishna KM, Madan K, Sudhakar G, et al (2014), “Sperm DNA fragmentation assay by sperm chromatin dispersion (SCD): correlation between DNA fragmentation and outcome of intracytoplasmic sperm injection”, Reproductive medicine and biology,13(2):87- 94.

104. Skakkebaek NE, Rajpert‐De Meyts E, Buck Louis GM, Toppari J, Andersson A‐M, Eisenberg ML, Kold Jensen T, Jorgensen N, Swan SH, Sapra KJ, Ziebe S, Priskorn L & Juul A (2016), “Male reproductive disorders and fertility trends: influences of environment and genetic susceptibility”, Physiol Rev 96, 55– 97.

(2019), “Populations, decreasing

105. Skakkebaek NE, Jorgensen N, Andersson A‐M, Juul A, Main KM, Kold Jensen T & Toppari J fertility, and reproductive health”, Lancet 393, 1500– 1501.

L, Franzago M, Ballerini P, Gatta V & Antonucci

106. Stuppia I. ( 2015), “Epigenetics and male reproduction: the consequences of paternal lifestyle on fertility, embryo development, and children lifetime health”, Clin Epigenet; 7, 120.

107. Tang SS., Gao H., Zhao Y., et al (2010), “Aneuploidy and DNA fragmentation in morphologically abnormal sperm”, Int J Androl;33:e163-79.

108. Tesarik J., Greco E., Mendoza C. (2004), “Late, but not early, paternal effect on human embryo development is related to sperm DNA fragmentation”, Hum Reprod, 19, 611–615.

109. Utsuno H, Oka K, Yamamoto A, Shiozawa T (2013), “Evaluation of sperm head shape at high magnification revealed correlation of sperm DNA fragmentation with aberrant head ellipticity and angularity”, Fertility and sterility.;99(6):1573-80.

110. Venkatesh T, Suresh PS & Tsutsumi R. ( 2014), “New insights into the genetic basis of infertility”, Appl Clin Gen 7, 235– 243.

111. Ward W.S. (2010), “Function of sperm chromatin structural elements in fertilization and development”, Mol Hum Reprod, 16, 30-36

fragmentation in male index

112. Wiweko B, Utami P (2017), “Predictive value of sperm deoxyribonucleic acid infertility”, Basic Clin (DNA) Androl.;27:1.

113. World Health Organization 2010, “Laboratory manual for the examination and processing of human semen”.

114. Xiangrong Cui, Xuan Jing, Xueqing Wu, Zhenqiang Wang, and Qiang Li. “Potential effect of smoking on semen quality through DNA damage and the down regulation of chk1 in sperm”. Mol Med Rep. 2016 Jul; 14(1): 753–761.

115. Zhao M., Shirley C.R., Mounsey S. & Meistrich M.L. (2004), “Nucleoprotein transitions during spermiogenesis in mice with transition nuclear protein Tnp1 and Tnp2 mutations”, Biology of reproduction, 71(3), 1016-1025.

116. Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi (2008), “Analysis of sperm chromosomal abnormalities and sperm DNA fragmentation in infertile males”, Article in Chinese, 25(6) pp:681-5.

117. Zini A., Meriano J., Kder K., Jarvi K., Laskin C.A. & Cadesky K. (2005), “Potential adverse effect of sperm DNA damage on embryo quality after ICSI”, Hum Reprod, 20, 3476-3480.

PHỤ LỤC 1. PHIẾU ĐỒNG Ý THAM GIA NGHIÊN CỨU

Tên đề tài: Đánh giá mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA tinh trùng và

các chỉ số tinh dịch đồ ở nam giới vô sinh đến khám và điều trị tại Bệnh viện A Thái Nguyên.

Chủ nhiệm đề tài: Dương Thị Nhàn

Đơn vị công tác: Khoa Hỗ trợ Sinh sản - Bệnh viện A Thái Nguyên

Quyền lợi khi tham gia:

1. Được cung cấp thông tin đầy đủ về nội dung nghiên cứu, lợi ích và nghĩa vụ của người tham gia nghiên cứu, những nguy cơ, tai biến có thể xảy ra trong quá trình nghiên cứu.

2. Việc tham gia nghiên cứu là hoàn toàn tự nguyện, không bị ép buộc và có quyền tự ý rút khỏi nghiên cứu ở bất kỳ thời điểm nào mà không bị phân biệt đối xử.

3. Các thông tin bí mật, riêng tư của ngưởi tham gia nghiên cứu được đảm

bảo, các số liệu và kết quả nghiên cứu chỉ phục vụ cho mục đích khoa học.

Sau khi đã được nhóm nghiên cứu giải thích các nguy cơ có thể xảy ra, tôi

đồng ý tham gia. Việc tham gia nghiên cứu này là hoàn toàn tự nguyện.

(Người tình nguyện tham gia ký và ghi rõ họ tên)

Thái Nguyên, ngày…….tháng…….năm……

PHỤ LỤC 2. PHIẾU THU THẬP THÔNG TIN BỆNH NHÂN

Họ tên người bệnh:……………………………………Năm sinh………………...

Địa chỉ:…………………………………………………………………………….

Nghề nghiệp……………………………………………………………………….

I. TIỀN SỬ NGƯỜI BỆNH

1. Mắc quai bị

Có:….. Không:…..

2. Hút thuốc

Có:….. Không:…..

3. Uống rượu, bia

Có:….. Không:…..

II. XÉT NGHIỆM NỘI TIẾT

1. FSH:………. (mIU/mL)

2. LH:………. (mIU/mL)

3. Testoteron:………. (nmol/L)

Thái Nguyên, ngày…….tháng…….năm……

Người thu thập thông tin

PHỤ LỤC 3. CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN

1. Dương Thị Nhàn, Nguyễn Phú Hùng (2020), “Mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA tinh trùng và các chỉ số tinh dịch đồ ở nam giới vô sinh”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ - Đại học Thái Nguyên, số 225, tập 08, trang 105-111.

Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng: Đánh giá mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA tinh trùng và các chỉ số tinh dịch đồ ở nam giới vô sinh đến khám và điều trị tại Bệnh viện A Thái Nguyên

DƯƠNG THỊ NHÀN

ĐÁNH GIÁ MỐI LIÊN HỆ GIỮA

MỨC ĐỘ PHÂN MẢNH DNA TINH TRÙNG VÀ CÁC CHỈ SỐ TINH DỊCH ĐỒ Ở NAM GIỚI VÔ SINH ĐẾN KHÁM VÀ ĐIỀU TRỊ TẠI BỆNH VIỆN A THÁI NGUYÊN

DƯƠNG THỊ NHÀN

ĐÁNH GIÁ MỐI LIÊN HỆ GIỮA

MỨC ĐỘ PHÂN MẢNH DNA TINH TRÙNG

VÀ CÁC CHỈ SỐ TINH DỊCH ĐỒ Ở NAM GIỚI VÔ SINH

ĐẾN KHÁM VÀ ĐIỀU TRỊ TẠI BỆNH VIỆN A THÁI NGUYÊN

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số: 84 20 201

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Phú Hùng

MỤC LỤC

((i) Apoptosis trong quá trình sản sinh tinh trùng; (ii) Sự phá vỡ chuỗi DNA

Tên phương pháp

Nguyên tắc phát hiện

Phương thức đọc kết quả

Acridine Orange Staining - Nhuộm

acridine orange

TUNEL assay - Sàng lọc Tunel

Alkaline single

cell gel electrophoresis

(Comet assay) -

Sàng lọc Comet

Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA) - Khảo sát cấu trúc nhiễm sắc chất tinh trùng

Sperm Chromatin

Dispersion Test (SCD test)- Test sự phân tán nhiễm sắc chất

Tổng tín hiệu huỳnh quang (đỏ + xanh lá)

Đối tượng nghiên cứu: Mẫu tinh dịch của bệnh nhân nam được lấy bằng

Địa điểm nghiên cứu: - Thu nhận mẫu bệnh phẩm và phân tích tinh dịch đồ

Thời gian nghiên cứu: từ tháng 7 năm 2019 đến tháng 4 năm 2020.

Cỡ mẫu: Theo nghiên cứu của Salah Albasir và cộng sự (2018) [95], mức độ

Tiêu chuẩn nhận – loại mẫu:

Hóa chất

Nhà sản xuất

Xuất xứ

Nhà sản xuất

Xuất xứ

Tên vật tư

Thiết bị

Nhà sản xuất

Xuất xứ

Có thể bạn quan tâm

Luận văn Thạc sĩ: Quản lý hoạt động phát triển nhận thức cho trẻ mẫu giáo ở các trường mầm non, huyện Hoàng Su Phì, tỉnh Hà Giang

Bài giảng Virus: Chương 1 - Khái niệm cơ bản về vi rút

Luận văn Thạc sĩ tóm tắt: Pháp luật về điều kiện đầu tư kinh doanh trong lĩnh vực giáo dục, đào tạo ở Việt Nam

Luận văn Thạc sĩ: Sự nghiệp nghiên cứu phê bình văn học của Hoài Thanh

Luận văn Thạc sĩ: Tiểu thuyết của Đỗ Phấn từ góc nhìn sinh thái

Luận văn Thạc sĩ: Giải pháp ứng phó với nhập cư ở Liên minh Châu Âu

Luận văn Thạc sĩ: Diễn ngôn về giới nữ trong văn xuôi nữ Việt Nam đương đại (khảo sát sáng tác của Dạ Ngân, Y Ban, Lý Lan, Nguyễn Thị Thu Huệ)

Luận văn Thạc sĩ: Xây dựng mức phát thải tham chiếu rừng khu vực huyện Bảo Lâm tỉnh Lâm Đồng

Luận văn Thạc sĩ: Đặc điểm nhân vật chính trong ba tác phẩm của Franz Kafka: Lâu đài, Vụ án, Hóa thân

Kháo luận tốt nghiệp: Vận dụng lí thuyết học tập trải nghiệm vào dạy học Thống kê - Xác suất ở lớp Hai

Luận văn Thạc sĩ: Xây dựng hệ thống điều khiển và thu nhận dữ liệu cho Robot dịch vụ

Luận văn Thạc sĩ: Thế giới nhân vật trong truyện ngắn Lê Minh Khuê sau năm 1975

Luận văn Thạc sĩ: Tác động của cấu trúc vốn đến hiệu quả hoạt động của các ngân hàng thương mại cổ phần niêm yết trên thị trường chứng khoán Việt Nam

Luận văn Thạc sĩ: Kiểm soát rủi ro tín dụng bán lẻ tại Ngân hàng Thương mại Cổ phần Đầu tư và Phát triển Việt Nam chi nhánh Thủ Thiêm

Luận văn Thạc sĩ: Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả kinh doanh của ngân hàng thương mại cổ phần niêm yết trên thị trường chứng khoán Việt Nam

Luận văn Thạc sĩ: Các nhân tố ảnh hưởng đến hành vi sử dụng dịch vụ ngân hàng điện tử tại Ngân hàng Thương mại Cổ phần Ngoại thương Việt Nam – Chi nhánh Thủ Đức

Luận văn Thạc sĩ: Các yếu tố tác đồng đến nợ xấu tại Ngân hàng Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn - Chi nhánh Tiền Giang

Luận văn Thạc sĩ: Yếu tố ảnh hưởng đến quyết định sử dụng dịch vụ thanh toán không dùng tiền mặt tại Ngân hàng TMCP Công thương Việt Nam (Vietinbank)

Luận văn Thạc sĩ tóm tắt: Pháp luật về du lịch biển, thực tiễn tại tỉnh Bình Định

Luận văn Thạc sĩ: Ảnh hưởng của các yếu tố thương hiệu với vai trò trung gian của Marketing truyền miệng đến quyết định chọn việc làm của nhân viên GenZ tại chuỗi nhà hàng gà rán Popeyes khu vực Thành Phố Hồ Chí Minh

Tài liêu mới

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng thuật toán thích nghi và học tăng cường cấu trúc Actor - Critic điều khiển bám quỹ đạo cho robot di động đa hướng mecanum

Luận án Tiến sĩ: Cơ cấu bệnh tim mạch và chất lượng cuộc sống của người cao tuổi mắc suy tim, rung nhĩ điều trị tại Bệnh viện Thống Nhất, thành phố Hồ Chí Minh

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng giải pháp đảm bảo an toàn thông tin cho quá trình học liên kết dựa trên mật mã

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Phát triển năng lực đánh giá công nghệ cho học sinh trong dạy học môn Công nghệ 11 ở trường trung học phổ thông

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu phân loại chi cầu diệp – Bulbophyllum Thouars (Orchidaceae) ở vùng Tây Nguyên bằng phương pháp hình thái và phân tử

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu đặc điểm phân bố và dinh dưỡng của các loài lưỡng cư ở Vườn Quốc gia Bến En và Khu bảo tồn thiên nhiên Pù Luông, tỉnh Thanh Hóa

Luận án Tiến sĩ: Tổng hợp luật dẫn và điều khiển cho một lớp tên lửa đối hải trên cơ sở ứng dụng mạng nơ ron và hệ mờ

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu tổng hợp hệ điều khiển góc Pitch tua bin gió trong điều kiện có nhiễu tác động

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hóa học lipid của hai loài san hô thủy tức Millepora dichotoma và Millepora platyphylla ở Việt Nam

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu kiểm soát phân phối công suất kéo trên cầu chủ động của ô tô con bằng ABS

Luận án Tiến sĩ: Ứng dụng phản ứng Domino vào tổng hợp các dẫn xuất Podophyllotoxin, Pyrimidine và đánh giá hoạt tính sinh học của các chất tổng hợp được

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và một số hoạt tính sinh học của cây chùm ngây (Moringa oleifera)

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và ứng dụng ức chế ăn mòn cho thép của cao chiết xuất từ cây Lộc vừng thuộc họ Lecythidaceae

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê