Định danh và nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng lên khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào của Bacillus subtilis DC5

TAP CHI SINH HOC 2015, 37(1se): 177­183<br />  DOI:     10.15625/0866­7160/v37n1se.<br /> <br /> <br /> ĐỊNH DANH VÀ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG LÊN KHẢ <br /> NĂNG SINH TỔNG HỢP PROTEASE NGOẠI BÀO CỦA Bacillus subtilis DC5<br /> <br /> Đỗ Thị Bích Thủy*, Phan Thị Bé, Đoàn Thị Thanh Thảo<br /> Trường Đại học Nông Lâm Huế, *dothibichthuy@huaf.edu.vn<br /> <br /> TÓM TẮT: Chủng Bacillus subtilis DC5 có khả năng sinh tổng hợp amylase và protease ngoại <br /> bào cao được định danh bằng phương pháp giải trình tự gene 16S rDNA. Hoạt độ protease trong <br /> môi trường nuôi cấy chủng này trong môi trường có tinh bột (0,423 HP/ml) cao hơn so với các <br /> nguồn cacbon khác. Cao nấm là nguồn ni tơ  thích hợp nhất để  chủng này sinh protease cao so  <br /> với các nguồn nitơ  khác, hoạt tính đạt 0,528 HP/ml. Kết quả  khảo sát kết hợp bổ  sung các <br /> nguồn cacbon và nitơ  đều không cao hơn so với việc bổ  sung riêng rẻ  nguồn tinh bột và cao  <br /> nấm. Hoạt độ protease đạt cao nhất (0,649 HP/ml) khi môi trường nuôi cấy có 0,75% tinh bột.  <br /> Chủng B. subtilis DC5 có khả năng sinh protease cao nhất khi nuôi cấy ở môi trường có pH ban <br /> đầu là 7,0; nhiệt độ 35oC trong môi trường thích hợp. Thời gian thu nhận enzyme tốt nhất sau 22  <br /> giờ nuôi cấy.<br /> Từ khóa: Bacillus subtilis DC5, hoạt độ protease, protease ngoại bào, sinh tổng hợp amylase.<br /> <br /> MỞ ĐẦU bột,   glucose  được   cung   cấp   bởi   hãng  Merk, <br /> Protease chiếm 2/3 lượng enzyme sử dụng   Đức. <br /> trong   các   ngành   công   nghiệp   khác   nhau.  Phân tích trình tự gen 16S rDNA<br /> Enzyme này có  ứng dụng rộng rãi trong nhiều  Tách   DNA   tổng   số   của   vi   khuẩn:  dịch <br /> lĩnh vực, đặc biệt là  trong công nghiệp thực  huyền   phù   vi   khuẩn  được   cho   vào  ống <br /> phẩm [2] và công nghiệp y dược [3, 5]. Do nhu  Eppendorf 1,5<br /> cầu ngày càng tăng, việc nghiên cứu sản xuất <br /> enzyme công nghiệp này đang trở  nên rất cần <br /> thiết.  Người   ta   có   thể   thu   nhận   protease   từ <br /> nhiều nguồn khác nhau, trong đó, vi sinh vật là <br /> đối   tượng   chính   để   sản   xuất   enzyme   nói <br /> chung và protease nói riêng với số lượng nhiều <br /> và giá thành rẻ. Những kết quả đạt được trong <br /> lĩnh  vực   nghiên  cứu   về   protease  vi   sinh   vật  <br /> chủ yếu tập trung vào Bacillus sp. [9,10]. Với <br /> mục đích góp phần vào việc khai thác các chế <br /> phẩm enzyme từ  vi sinh vật, trong công trình <br /> này, chúng tôi đã tuyển chọn chủng B. subtilis <br /> DC5 có khả  năng sinh protease ngoại bào cao <br /> và xác định điều kiện thích hợp để  chủng này <br /> sinh tổng hợp protease ngoại bào cao nhất.<br /> VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> <br /> Vật  liệu  nghiên cứu là chủng DC5 được <br /> tuyển chọn từ các chủng vi khuẩn phân lập từ <br /> dưa   cải.  Các   hợp   chất   sử   dụng   làm   môi <br /> trường như pepton, cao thịt, cao nấm men, tinh  <br /> <br /> <br /> 177<br />  ml đã có sẵn 200 μl dung dịch InstageneTM  sóng 750nm. Dựa  vào đồ  thị  chuẩn tyrosine,  <br /> MaxTrix  (Bio­rad), lắc  đều (vortex) trong 10  để  tính sản phẩm tạo thành tương  ứng dưới  <br /> giây và sau đó ly tâm (spin down),  ủ   ở  56oC  tác   dụng   của   enzyme.   Một   đơn   vị   hoạt   độ <br /> trong 30 phút, sau đó, lắc đều mẫu trong 10  proteinase   (HP)   được   định   nghĩa   là   lượng <br /> giây  và  đun  sôi   ở  100oC  trong  8 phút,   rồi   ủ  enzyme mà trong một phút ở 30oC có khả năng <br /> trong nước đá trong 5 phút. Hỗn hợp tiếp tục  phân giải protein tạo thành các sản phẩm hoà <br /> được  ly tâm  ở  13.200 vòng/phút trong 5 phút   tan trong tricloacetic acid, cho phản  ứng màu <br /> và pha loãng 10 lần dịch nổi thu được để thực   tương đương với 1,0 µmol tyrosine.<br /> hiện phản ứng PCR. Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi  <br /> Tách dòng và giải trình tự  gen 16S rDNA:  trường  nuôi   cấy,   pH   và   nhiệt   độ  lên   khả  <br /> dịch DNA của vi khuẩn sau khi tách chiết (5μl)  năng sinh tổng hợp protease ngoại bào bởi  <br /> được cho vào 20 μl hỗn hợp PCR  (NK16S­PCR)  B.   subtilis   DC5  và   xác   định   thời   gian   thu  <br /> (Công ty Nam Khoa, Thành Phố Hồ Chí Minh)  nhận enzyme thích hợp.<br /> và   thực   hiện   phản  ứng  PCR,   theo   chu   trình <br /> nhiệt như sau: 1 chu kỳ 95 oC trong 10 phút; 40  Ban đầu, thí nghiệm được thực hiện bằng <br /> chu kỳ gồm các giai đoạn: 94oC trong 30 giây,  cách nuôi cấy B. subtilis DC5 trong môi trường <br /> 60oC trong 30 giây, 72oC trong 1 phút và 1 chu  cơ bản (MTCB) có bổ sung nguồn C (tinh bột <br /> kỳ   72oC   trong   10   phút.   Kiểm   tra   sản   phẩm  hòa tan, lactose, maltose, glucose, saccharose) <br /> PCR   bằng   phương   pháp   điện   di   trên   gel  và   nguồn   N   (NH4Cl,   NH4NO3,   (NH4)2SO4, <br /> agarose 2%. Sản phẩm PCR có độ dài khoảng  casein, cao nấm men). Sau đó, tiến hành phối <br /> 0,5 kb được tinh sạch và giải trình tự  trên hệ  hợp nguồn C và N để  chọn ra thành phần môi  <br /> thống ABI 3130XL (Applied Biosystems, Hoa  trường   thích   hợp   cho   hoạt   độ   protease   cao <br /> Kỳ).  nhất. Tiếp theo, B. subtilis DC5 được nuôi cấy <br /> trong môi trường thích hợp nhất để chủng này <br /> Phương pháp nuôi cấy để thu nhận enzyme sinh tổng hợp protease ngoại bào cao với pH <br /> Chủng vi khuẩn được nuôi cấy trong môi  ban   đầu   thay   đổi   từ   5   đến   11.  Cuối   cùng, <br /> trường  lỏng,  lắc 200 vòng/phút  ở  35oC trong  chủng này được nuôi cấy trong môi trường và <br /> 24   giờ.   Dịch   môi   trường   nuôi   cấy   có   chứa   pH thích hợp với các mức nhiệt độ 30oC, 40oC, <br /> enzyme được thu nhận bằng cách ly tâm tách  50oC và 60oC để  xác định nhiệt độ  thích hợp.  <br /> tế   bào   ở   14000  vòng/phút,   nhiệt   độ   4oC,   10  Để  chọn thời gian nuôi cấy thích hợp   nhằm <br /> phút. thu   được   protease   ngoại   bào   nhiều   nhất,  B.  <br /> Xác  định  hoạt   độ   protease   bằng   phương   subtilis  DC5   được   nuôi   cấy  trong  điều   kiện <br /> pháp Anson cải tiến [6] thích hợp về  môi trường, pH ban đầu và nhiệt <br /> Hỗn hợp phản  ứng thủy phân gồm dung  độ  và  xác   định   hoạt   độ   protease   trong   môi <br /> dịch enzyme và dung dịch casein 2,0%, tỷ  lệ  trường trong các khoảng thời gian nuôi cấy từ <br /> 1:2 (v/v) được  ủ  ở 30oC, 10 phút; ngưng phản  8 giờ đến 96 giờ. <br /> ứng   bằng   dung   dịch   tricloacetic   acid   (TCA)   Phương pháp xử lý số liệu <br /> 5,0% theo tỷ lệ 5 thể tích dung dịch acid cho 1   Số  liệu thí nghiệm được  xử  lý thống kê <br /> thể  tích enzyme; ly tâm thu dịch nổi để  thực   bằng phần mềm SPSS.<br /> hiện phản  ứng tạo màu với thuốc thử  Folin  <br /> 0,2N có mặt Na2CO3  6% (tỷ  lệ  dịch nổi: dung  KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> dịch Na2CO3: Folin 0,2N = 1:4:1). Thực hiện  Định danh chủng vi khuẩn DC5<br /> đồng thời mẫu kiểm tra bằng cách cho dung <br /> Chủng vi khuẩn DC5 thể  hiện hoạt tính <br /> dịch TCA vào enzyme trước khi ủ với cơ chất. <br /> protease và amylase ngoại bào cao (hình 1) đã <br /> Độ hấp thụ ánh sáng (OD) của dung dịch màu <br /> được định danh bằng phương pháp phân tích <br /> thu được sau phản ứng được xác định  ở bước <br /> trình tự gene 16S rDNA và khảo sát các yếu tố <br /> <br /> <br /> 178<br />  ảnh   hưởng   đến   khả   năng   sinh   tổng   hợp   AYC3, NBT­15 cho thấy mức độ  tương đồng <br /> protease   ngoại   bào.  Đối   chiếu   trình   tự   16S  đến   99%.  <br /> rDNA của chủng DC5 (hình 2) với trình tự gen   Do đó, chúng tôi xác định chủng DC5 thuộc <br /> của một số  chủng  Bacillus subtilis  như  MA4,  loài B. subtilis.<br /> <br /> CGCGGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGC<br />  a  b TTTCTGGTTAGGTACCGTCAGGTGCCGCCCT<br /> ATTTGAACGGCACTTGTTCTTCCCTAACAACA<br /> GAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCA<br /> CGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATT<br /> GCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGG<br /> AGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGC<br /> CGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTCG<br /> CCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAA<br /> TGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCCGA<br /> AGCCACCTTTTATGTCTGA<br /> Hình 1. Vòng thủy phân protease (a)  Hình 2. Trình tự gen 16S DNA của chủng<br /> và amylase (b) của chủng DC5 B. subtilis DC5<br /> <br /> Nguồn  cacbon thích hợp cho sinh protease   protease ngoại bào cao nhất (0,514 HP/ml) <br /> ngoại bào của B. subtilis DC5 (MT5) (hình 3). Kết quả này phù hợp với công <br /> Trong   các   nguồn   cacbon,   tinh   bột   tan   có  bố của Joo et al. (2002) [8]. Trong MT1 có mặt <br /> khả  năng kích thích  B. subtilis  DC5 sinh tổng  glucose gây ức chế ngược làm giảm khả năng <br /> hợp sinh tổng hợp protease, hoạt độ đạt được thấp <br /> Hoạt độ HP/ml<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> nhất (0,059 HP/ml). Đối với các chủng có kh a ả <br /> 0.6 0.514<br /> b<br /> năng sinh tổng hợp protease ngoại bào mạnh <br /> 0.5 0.423 khi   có   mặt   tinh   bột   trong   môi   trường,  <br /> c<br /> 0.4 protease ngoại bào c 0.32ủa nó thi<br /> c 0.324 ếu tính đặc hiệu <br /> tuyệt đối. <br /> 0.3<br /> <br /> 0.2 d<br /> e 0.078<br /> 0.059<br /> 0.1<br /> Môi trường<br /> 0<br /> ĐC MT1 MT2 MT3 MT4 MT5<br />  Hoạt độ HP/ml<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> a<br /> 0.6 0.514<br /> b<br /> 0.5 0.423<br /> c c<br /> 0.32 0.324<br /> 0.4<br /> <br /> 0.3<br /> <br /> 0.2<br /> Hình 3. Ảnh hưở ng của nguồ0.059<br /> n carbon đ<br /> e ếdn khả năng <br /> 0.078<br /> sinh tổng hợp protease ngo<br /> 0.1 ại bào của chủng B. subtilis DC5 Môi trường<br /> ĐC: MTCB; MT1: ĐC+glucose 0,5%; MT2: ĐC+saccharose 0,5%; MT3: ĐC+maltose 0,5%; <br /> 0<br /> ĐC MT1 MT2 ột tan 0,5%.<br /> MT4: ĐC+lactose 0,5%; MT5: ĐC +tinh b MT3 MT4 MT5<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 179<br />  Hình 4. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp <br /> protease ngoại bào của chủng Bacillus subtilis DC5<br /> ĐC: MTCB; MT6: ĐC+casein 0,5%; MT7: ĐC+NH4Cl 0,5%; MT8: ĐC+NH4NO3 0,5%;<br /> MT9: ĐC+(NH4)2SO4 0,5%; MT10: ĐC+ cao nấm men 0,5%.<br /> <br /> Nguồn   nitơ   thích   hợp   cho   sinh   protease   protease ngoại bào của chủng  B. subtilis  DC5 <br /> ngoại bào của B. subtilis DC5 được tiếp tục khảo sát. <br /> Trong   các   nguồn   nitơ  đã   được   khảo   sát,  Hàm   lượng   tinh   bột   thích   hợp   cho   sinh <br /> khả  năng kích thích quá trình sinh protease bởi  protease ngoại bào của B. subtilis DC5.<br /> chủng  B.subtilis  DC5 của nguồn nitơ  hữu cơ  Hàm lượng tinh bột 0,75% được bổ  sung <br /> tốt hơn nguồn vô cơ, mạnh nhất là cao nấm  vào MTCB cho hoạt độ protease (0,649 HP/ml)  <br /> men (0,528 HP/ml)  (hình 4). Kết quả  trên phù  cao hơn so với các hàm lượng khác (0,25; 0,5; <br /> hợp với nghiên cứu  của Đỗ  Thị  Bích Thủy &  1;   1,25;   1,5;   1,75%)   (hình   5).   MTCB   có   bổ <br /> Trần Thị Xô (2004) [12], Sangeetha et al. (2008)  sung   0,75%   tinhb   bộ0.649 a<br /> t   tan   đượb c   gọbi   là   môi <br /> 0.7 b<br /> [11].  Trong   khi   đó,   Agrebi  et   al.  (2009)  [1],  0.601 0.598<br /> trường bổ  sung tinh bột. Với các môi trườ0.513<br /> 0.583 0.6<br /> ng c<br /> 0.6 c<br /> Mussarat  et   al.  (2008)  [9]  cho   rằng   casein   là  có   hàm   lượng   tinh   bột   tan  nhỏ  hơn   0,75%, <br /> 0.501<br /> <br /> nguồn nitơ  kích thích khả  năng sinh tổng hợp  0.5<br /> hoạt độ protease thấp hơn có lẽ  là do tinh bột  <br /> protease.  0.4<br /> chưa   đủ   nhiều   để   kích   thích   quá   trình   sinh <br /> 0.3<br /> Khi bổ sung phối trộn các nguồn carbon và  tổng hợp protease ngoại bào. Trường hợp hàm <br /> nitơ vào MTCB có chứa 1% peptone, 0,3% cao  lượng   tinh   bột   trong   môi   trường   cao   hơn <br /> 0.2<br /> <br /> thịt và 0,5% NaCl, hoạt độ  protease trong môi  0,75% làm cho độ  nhớt môi trường lớn hơn  <br /> 0.1<br /> <br /> trường nuôi cấy không cao hơn so với chỉ  bổ  nên ph<br /> 0 ần nào làm cho vi khuẩn khó tiếp xúc <br /> MT5 MT20 MT21 MT22 MT23 MT24 MT25<br /> sung   tinh   bột.   Vì   vậy,   ảnh   hưởng   của   hàm   với các thành ph ần khác c ủa môi tr ường làm  <br /> lượng   tinh   bột   lên   khả   năng   sinh   tổng   hợp   kìm   hãm   một   phần  khả   năng  sinh  tổng  hợp <br /> Hoạt độ HP/ml<br /> <br /> <br /> <br /> <br />       Nhiệt độ (oC)<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 180<br />  Hình 5. Ảnh hưởng của hàm lượng tinh bột đến khả năng sinh tổng hợp <br /> protease ngoại bào của chủng B. subtilis DC5<br /> MT5: ĐC + Tinh bột 0,5%; MT20: ĐC + Tinh bột 0,25%; MT21: ĐC + Tinh bột 0,75%; MT22: ĐC + Tinh <br /> Hoạt độ HP/ml<br /> bột 1%; MT23: ĐC + Tinh bột 1,25%; MT24: ĐC + Tinh bột 1,5%; MT25: ĐC + Tinh bột 1,75%.<br /> <br /> <br /> <br /> a<br /> 0.7<br /> 0.7<br /> <br /> 0.6<br /> <br /> <br /> 0.5<br /> b<br /> 0.376<br /> 0.4 b<br /> 0.303<br /> <br /> 0.3<br /> <br /> 0.2 c<br /> 0.113 c<br /> 0.091 c<br /> 0.07 c<br /> 0.1 0.026<br />       Nhiệt độ (oC)<br /> Hoạt độ  HP/ml<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 0<br /> 30 35 40 45 50 55 60<br /> Hình 6. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp <br /> protease ngoại bào của chủng B. subtilis  DC5<br /> <br /> Ảnh   hưởng   của   pH   ban   đầu   của   môi  60oC,   khả   năng   sinh   enzyme   của  B.   subtitis <br /> trường   cho   sinh   protease   ngoại   bào   của  DC5 giảm mạnh. Rai & Ashis (2010) [10]  cho <br /> chủng B. subtilis DC5 0.699<br /> a thấy,   nhiệt   độ   thích   hợp   cho   sinh   tổng   hợp  <br /> 0.7 b b protease của chủng  B. subtilis  DM­04  là 37 ­ <br /> Chủng  B.   subtitis  DC50.625<br />   có   khả   năng  sinh <br /> 0.622<br /> 45oC, Mussarat et al. (2008) [9] công bố rằng ở <br /> protease cao nhất (0,699 HP/ml) khi nuôi c<br /> 0.6 ấ y <br /> nhiệt độ  50oC khả  năng sinh enzyme protease <br /> trong môi trường bổ sung tinh b ột v ớ i pH ban  <br /> 0.5 của B. subtilis BS1 mạnh nhất.<br /> đầu là 7 (hình 6). Hoạt độ  protease đạt được  <br /> khi nuôi cấy trong cùng môi tr<br /> 0.4<br /> ường với pH 5  Khcảo   sát   thời   gian   thích   hợp   để   thu <br /> 0.351<br />     Hoạt độ HP/ml<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> và pH 6 đạt được khá cao. K 0.3 ế t qu ả này tương  protease ngo<br /> 0.276<br /> d<br /> ại bào của B. subtilis DC5<br /> tự  như  kết quả  mà Ghafoor & Shahida (2008)  Hoạt   độ   protease   trong   môi   trường   tăng <br /> 0.2<br /> [7], Yong et al. (2003) [14] đã nghiên c ứu. Một  nhanh và đạt cực đại sau khi nuôi cấy 24  giờ, <br /> số công bố cho thấy đi 0.1ều kiện pH 7,5, pH 8,0   (0,697 HP/ml) sau đó gi<br /> 0.019<br /> e<br /> ả ần.  Ở  80, 88, 96 <br /> e m d  pH<br /> 0.02<br /> và pH 10 thích hợp cho các chủng thuộc loài   giờ   chủng   này   không   còn   khả   năng   sinh <br /> 0<br /> B.   subtilis  sinh   tổng   hợp   protease<br /> 5 6  ngoại 7  bào  8enzyme  9 (hình 8). Đ<br /> 10 ể11 kết quả  được  chính xác <br /> cao [4, 13, 9].  hơn,   chúng   tôi   tiến   hành   khảo   sát   quá   trình <br /> Ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng sinh  sinh enzyme trong khoảng thời gian từ  8 giờ <br /> protease   ngoại   bào   của   chủng  B.   subtilis   đến 34 giờ, 2 giờ nuôi cấy lấy mẫu 1 lần. Sau  <br /> DC5. 22 giờ  nuôi cấy, hoạt  độ  protease trong môi  <br /> trường cao nhất (0,714 HP/ml).   Sangeetha  et  <br /> Khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào <br /> al. (2008) [11] nghiên cứu trên B. subtilis SG2 <br /> của chủng  B. subtitis  DC5 cao nhất khi nuôi <br /> cho   thấy   ở   36   giờ   chủng   này   sinh   protease  <br /> cấy  ở  nhiệt độ  35oC, hoạt độ  đạt được là 0,7 <br /> mạnh nhất. <br /> HP/ml   (hình   7).   Ở   khoảng   nhiệt   độ   45oC   ­ <br /> <br /> <br /> <br /> 181<br /> <br /> <br /> <br /> <br />  Thời gian (giờ)<br />  Hình 7. Ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường đến khả năng sinh tổng hợp <br /> protease ngoại bào của chủng B. subtilis DC5<br /> <br /> 0.8 a<br /> 0.714 a<br /> 0.697<br /> 0.7<br /> b<br /> 0.6 0.548<br /> b c<br /> 0.553 0.477<br /> 0.5 d<br /> d<br /> 0.388 d 0.391<br /> 0.4 0.413<br /> e<br /> 0.329<br /> 0.3 f<br /> 0.231<br /> fg<br /> gh 0.186<br /> 0.2 0.151<br /> 0.18<br /> fg f 0.152<br /> gh hi<br /> fg 0.213 0.121<br /> 0.179 jk<br /> 0.1 hij gh 0.059 ij<br /> k 0.106 0.133 0.074<br /> 0.001 k<br /> 0 0.01<br /> 0 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 40 48 56 64 72 80 88 96<br /> <br />  Hình 8. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp<br /> protease ngoại bào của chủng B. subtilis DC5<br /> <br /> KẾT LUẬN isolation   from  Bacillus   amyloliquefaciens <br /> An6   grown   on   mirabilis   jalapa   tuber <br /> Chủng Bacillus subtilis DC5 được phân lập  powders. Appl Biochem Biotechnol, 162(1): <br /> từ  dưa   cải  là   chủng   có   khả   năng   tổng   hợp  75­88.<br /> protease ngoại bào  cao. Chủng này  sinh tổng <br /> 2. Annalisa   C.,   Rossella   D.  M.,   Silvana   C., <br /> hợp protease ngoại bào cao nhất khi nuôi cấy <br /> Fidel   T.,   Danilo   E.,   Francesco   V.,  2007. <br /> trên môi trường có chứa pepton 1%; cao thịt  <br /> Proteolytic and lipolytic starter cultures and <br /> 0,3%; tinh bột tan 0,75% và NaCl 0,5%;  ở  pH <br /> their   effect   on   traditional   fermented <br /> ban đầu bằng 7; nhiệt  độ  nuôi cấy là 35oC, <br /> sausages  ripening  and  sensory  traits.  Food <br /> trong thời gian 22 giờ. <br /> Microbiol, 25: 335­348.<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> 3. Brice   K.,   Thierry   M.,   Francis   G.,  2007. <br /> 1. Agrebi   R.,   Noomen   H.,   Mohamed   H.,  Neutrophil   elastase,   proteinase   3   and <br /> Nawrez K., Anissa H., Nahed F.Z., Moncef  cathepsin   G:   Physicochemical   properties, <br /> N.,  2009.  Fibrinolytic   serine   protease <br /> <br /> 182<br />  activity   and   physiopathological   functions.  production   and   activity   of   protease   from <br /> Biochimie, 90: 227­242. Bacillus   subtilis  BS1.   Parkistan   J   of <br /> 4. Deepak   V.,   Kalishwaralal   K.,  Microbiol, 40(5): 2161­2169.<br /> Ramkumarpandian   S.,   Babu   S.  V.,  10. Rai   S.  K.,   Ashis   K.  M.,  2010.  Statistical <br /> Senthilkumar S.  R., Sangiliyandi G.,  2008.  optimization of production, purification and <br /> Optimization   of   media   composition   for  industrial application of a laundry detergent <br /> Nattokinase production by  Bacillus subtilis  and   organic   solvent­stable   subtilisin­like <br /> using   response   surface   methodology.  serine protease (Alzwiprase) from  Bacillus <br /> Bioresour Technol, 99(17): 8170­8174. subtilis DM­04. Biochem Eng J, 48(2): 173­<br /> 5. Fernandez   L.,   Lopez   L.  R.,   Secades   P.,  180.<br /> Menendez   A.,   Marquez   I.,   Guijarro   J.  A.,  11. Sangeetha,   Phil   M.,  Geetha, <br /> 2003.  In   vitro   and   in   vivo   studies   of   the  Arulpandi, 2008.  Optimization   of   protease <br /> Yrp1 protease from Yersinia ruckeri and its  and   lipase   production   by Bacillus  <br /> role in protective immunity against enteric  pumilus SG   2   isolated   from   an   industrial <br /> red mouth disease of salmonids. Appl and  effluent. The Internet J of Microbiol, 5(2).<br /> Environ Microbiol, 69(12): 7328­7335. 12. Đỗ   Thị   Bích   Thủy,   Trần   Thi   Xô,  2004. <br /> 6. Folin O., Ciocatteu V., 1927. On tyrosine and  Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố <br /> tryptophan determination in proteins. Journal  lên   khả   năng   sinh   protease   của  Bacillus  <br /> of Biological Chemistry, 73: 627­650. subtilis. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển <br /> 7. Ghafoor   A.,  Shahida  H.,  2009.  Production  nông thôn, Số 12/2004: 1667­1668.<br /> dynamics Bacillus subtilis strains AG­1 and  13. Wang S. H., Cheng Z., Yan L. Y., Miao D., <br /> EAG­2, producing an extracellular alkaline  Ming   F.  B.,  2008.  Screening   of   a   high <br /> protease. Afr J of Microbiol Res, 3(5): 258­ fibrinolytic   enzyme   producing   strain   and <br /> 263. characterization  of   the   fibrinolytic   enzyme <br /> 8. Joo H. S., Kumar C. G., Park G. C., Kim K.  produced   from  Bacillus   subtilis  LD­8547. <br /> T.,   Paik   S.  R.,   Chang   C.  S.,  2002.  World J Microbiol Biotechnol, 24: 475­482. <br /> Optimization   of   the   production   of   an  14. Yong J. K., Kim J. H., Gal S. W., Kim J. E., <br /> extracellular   alkaline   proteinase   from  Park S. S., Chung K. T., Kim Y. H., Kim B. <br /> Bacillus   horikoshi.  Process   Biochem,  38:  W., Joo W. H., 2003. Molecular cloning and <br /> 155­159. characterization   of   the   gene   encoding   a <br /> 9. Mussarat S., Aamer A.S., Abdul H., Fariha  fibrinolytic   enzyme   from  Bacillus   subtilis <br /> H.,  2008. Influence of culture condition on  strain   A1.   World   J   of   Microbiol   and <br /> Biotechnol, 20: 711­717.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> OPTIMIZATION OF GROWTH CONDITIONS AND PRODUCTION OF <br /> EXTRACELLULAR PROTEASE BY Bacillus subtilis DC5<br /> <br /> Do Thi Bich Thuy, Phan Thi Be, Doan Thi Thanh Thao<br /> Hue University of Agriculture and Forestry<br /> <br /> 183<br /> SUMMARY<br /> <br /> The  strain  Bacilus  subtilis  DC5   having  high   productivity  of   extracellular   amylase   and   protease  was <br /> determined as based on its 16S rDNA gene sequence. Cultivating strain  B. subtilis  DC5 in optimum basic <br /> medium supplemented with soluble starch or yeast extract increased protease productivity (0.423 HP/ml and <br /> 0.528   HP/ml,   respectively).   However,   protease   productivity   of   this   strain   was   not   increased   in   case <br /> combination of these nitrogen and carbon sources in the culture medium. The highest protease activity was <br /> 0.649 HP/ml when cultivating the strain in medium containing 0.75% soluble starch. Study on effect  of  <br /> physical  conditions indicated that  protease  activity of  B. subtilis  DC5 was obtained at  the highest  when <br /> cultivated at initial pH 7, temperature of 35oC after 22 hours of cultivation. <br /> Keywords: Bacillus subtilis DC5, extracellular protease, protease productivity.<br /> <br /> <br /> Ngày nhận bài: 22­10­2014<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 184<br />