T¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 9-2017<br />
<br />
ĐỊNH LƢỢNG MAFENID ACETAT TRONG DUNG DỊCH<br />
MAFENID ACETAT 5% BẰNG PHƢƠNG PHÁP<br />
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO<br />
Lê Thị Thu Hằng*; Nguyễn Như Lâm*; Vũ Ngọc Thắng**<br />
TÓM TẮT<br />
Mục tiêu: xây dựng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để định lượng mafenid<br />
acetat trong dung dịch mafenid acetat 5%. Đối tượng và phương pháp: thẩm định phương pháp<br />
định lượng mafenid acetat trong dung dịch mafenid acetat 5% (chế phẩm được điều chế từ<br />
nguồn nguyên liệu sản xuất trong nước) với các tiêu chí: tính tương thích của hệ thống, khoảng<br />
tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại, giới hạn định lượng và giới hạn phát hiện theo hướng dẫn<br />
của USP và ICH. Kết quả: điều kiện sắc ký gồm: cột Phenomenex C18 (150 x 4,6 mm, 5 µm);<br />
pha động là hỗn hợp dung dịch đệm phosphat pH 2,5-acetonitril (90:10); tốc độ dòng 1,0 ml/phút;<br />
detector UV-VIS 267 nm. Phương pháp xây dựng được có độ đúng (% tìm lại) từ 98,32 - 99,58%<br />
và độ lặp lại cao (RSD% = 0,35%). Khoảng tuyến tính 0,05 - 2,0 mg/ml với hệ số tương quan r<br />
= 0,9999. Giới hạn phát hiện (LOD) 0,1076 µg/ml và giới hạn định lượng (LOQ) 0,3227 µg/ml.<br />
Kết luận: đã xây dựng được phương pháp phù hợp để định lượng mafenid acetat trong dung<br />
dịch mafenid acetat 5%.<br />
* Từ khóa: Dung dịch mafenid acetat; Thẩm định phương pháp; HPLC.<br />
<br />
Quantitative of Mafenid Acetate in 5% Mafenid Acetate Solution by<br />
High Performance Liquid Chromatography<br />
Summary<br />
Objectives: To establish the HPLC method for the quantitative of mafenide acetate in 5% mafenide<br />
acetate solution. Subjects and methods: Validating some parameters of the established method<br />
used to quantify 5% mafenide acetate solution (the products are prepared by domestic materials)<br />
including system suitability, specificity, linear range, precision, accuracy, the limit of detection,<br />
the limit of quantitation. Results: Chromatographic conditions of the method: Phenomenex C18<br />
(150 x 4.6 mm, 5 µm) column, phosphate buffer solution pH 2.5-acetonitrile (90:10) as mobile phase,<br />
monitored at 267 nm. The established method has high accuracy (average recovery ratio from<br />
98.50 to 99.58%) and the high precision (RSD% = 0.35%). Linear range is 0.05 - 2.0 mg/mL<br />
with r = 0.9999; the limit of detection was 0.1076 µg/mL, the lower limit of quantitation was<br />
0.3227 µg/mL. Conclusion: A suitable HPLC method for quantifying mafenide acetate in 5% mafenide<br />
acetate solution was validated.<br />
* Keywords: Mafenide acetate solution; Validation; HPLC.<br />
* Bệnh viện Bỏng Quốc gia<br />
** Viện Kiểm nghiệm, Nghiên cứu Dược và Trang thiết bị Y tế Quân đội<br />
Người phản hồi (Corresponding): Lê Thị Thu Hằng (lehangvb@gmail.com)<br />
Ngày nhận bài: 07/08/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 10/11/2017<br />
Ngày bài báo được đăng: 23/11/2017<br />
<br />
5<br />
<br />
T¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 9-2017<br />
<br />
ĐẶT VẤN ĐỀ<br />
Mafenid acetat là một sulfonamid có<br />
hoạt tính kháng khuẩn rộng trên các chủng<br />
vi khuẩn, đặc biệt là trực khuẩn mủ xanh<br />
[6]. Thuốc đã và đang được sử dụng có<br />
hiệu quả tại các trung tâm bỏng trên thế<br />
giới dưới dạng dung dịch hoặc dạng kem<br />
để điều trị nhiễm khuẩn tại chỗ do trực<br />
khuẩn mủ xanh và vi khuẩn đa kháng<br />
thuốc khác [1, 2, 5]. Hiện nay, chúng ta<br />
chưa sản xuất được sản phẩm này mà<br />
phải nhập khẩu với giá rất cao.<br />
Trên cơ sở đó, Viện Bỏng Quốc gia đã<br />
phối hợp với Trường Đại học Dược Hà<br />
Nội nghiên cứu tổng hợp thành công<br />
nguyên liệu mafenid acetat đạt tiêu chuẩn<br />
Dược Điển Mỹ USP 38, đồng thời Khoa<br />
Dược, Viện Bỏng Quốc gia Lê Hữu Trác<br />
đã điều chế được dung dịch mafenid<br />
acetat 5%.<br />
Hiện tại, trong các Dược điển tham<br />
khảo chưa có chuyên luận cho dung dịch<br />
mafenid acetat. Tuy nhiên, nhu cầu sử<br />
dụng dung dịch mafenid acetat để điều trị<br />
bỏng rất lớn. Vì vậy, cần phải xây dựng<br />
phương pháp định lượng thành phần<br />
hoạt chất trong chế phẩm dung dịch<br />
mafenid acetat phù hợp với điều kiện<br />
phòng thí nghiệm hiện có để phục vụ<br />
công tác xây dựng tiêu chuẩn chế phẩm<br />
nhằm kiểm soát tốt chất lượng và hiệu<br />
quả của chế phẩm.<br />
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP<br />
NGHIÊN CỨU<br />
1. Vật liệu nghiên cứu.<br />
- Chế phẩm nghiên cứu: dung dịch<br />
mafenid acetat 5% được điều chế tại<br />
6<br />
<br />
Khoa Dược, Viện Bỏng Quốc gia Lê Hữu<br />
Trác ngày 06/03/2017, số lô: M1.<br />
- Chất chuẩn: mafenid acetat (Hội đồng<br />
Dược điển Mỹ, số lô GOL 536, hàm lượng<br />
nguyên trạng 99,4%).<br />
- Hóa chất, dung môi: kali dihydrophosphat,<br />
natri hexansulfonat, axít phosphoric (Merk)<br />
đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích (PA);<br />
acetonitril (Merck) đạt tiêu chuẩn tinh khiết<br />
dùng cho HPLC.<br />
- Thiết bị, dụng cụ: hệ thống phân tích<br />
HPLC Shimadzu 10 AVP với detector UV;<br />
cân phân tích Mettler Toledo độ chính xác<br />
0,1 mg (Thụy Sỹ); bộ lọc hút chân không<br />
Pall (Mỹ)… Các thiết bị được hiệu chuẩn,<br />
kiểm định định kỳ theo quy định.<br />
2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br />
* Điều kiện sắc ký: qua tham khảo tài<br />
liệu [4] và thực nghiệm, lựa chọn điều kiện<br />
sắc ký gồm:<br />
- Cột Phenomenex C18 (150 x 4,6 mm,<br />
5 µm).<br />
- Detector UV: 267 nm.<br />
- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút.<br />
- Thể tích tiêm: 20 µl.<br />
- Dung dịch đệm pH 2,5: hòa tan 6,8 g kali<br />
dihydrophosphat và 1,0 g natri hexansulfonat<br />
trong 1.000 ml nước, điều chỉnh pH về<br />
2,5 bằng axít phosphoric.<br />
* Pha động: hỗn hợp dung dịch đệm<br />
pH 2,5:acetonitril (90:10), lọc qua màng<br />
0,45 µm, siêu âm đuổi khí.<br />
<br />
T¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 9-2017<br />
* Phương pháp chuẩn bị mẫu:<br />
<br />
để được dung dịch có nồng độ mafenid<br />
<br />
- Dung dịch chuẩn gốc: cân chính xác<br />
<br />
acetat khoảng 0,5 mg/ml, lọc qua màng<br />
<br />
100 mg mafenid acetat chuẩn vào bình<br />
<br />
0,45 μm.<br />
<br />
định mức 20 ml, thêm khoảng 15 ml pha<br />
<br />
* Thẩm định phương pháp phân tích:<br />
<br />
động, lắc để hòa tan; bổ sung pha động<br />
<br />
Theo hướng dẫn của USP và ICH với<br />
<br />
vừa đủ đến vạch, lắc đều. Dung dịch có<br />
<br />
các tiêu chí: tính tương thích hệ thống;<br />
<br />
nồng độ mafenid acetat khoảng 5 mg/ml.<br />
<br />
tính đặc hiệu; độ tuyến tính; độ đúng và<br />
<br />
- Dung dịch thử: pha loãng một lượng<br />
chế phẩm mafenid acetat 5% với pha động<br />
<br />
độ lặp lại; giới hạn phát hiện và giới hạn<br />
định lượng [3, 4].<br />
<br />
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN<br />
1. Tính tƣơng thích của hệ thống.<br />
Từ dung dịch chuẩn gốc, pha loãng với pha động được dung dịch chuẩn mafenid<br />
acetat có nồng độ khoảng 0,5 mg/ml. Tiêm lặp lại 6 lần dung dịch này vào hệ thống<br />
sắc ký.<br />
Bảng 1: Tính tương thích của hệ thống sắc ký.<br />
TT<br />
<br />
Thời gian lƣu (phút)<br />
<br />
Diện tích píc (µAU.s)<br />
<br />
Số đĩa lý thuyết<br />
<br />
Hệ số bất đối xứng<br />
<br />
1<br />
<br />
3,448<br />
<br />
1756257<br />
<br />
2324<br />
<br />
1,43<br />
<br />
2<br />
<br />
3,453<br />
<br />
1764536<br />
<br />
2346<br />
<br />
1,45<br />
<br />
3<br />
<br />
3,457<br />
<br />
1773225<br />
<br />
2307<br />
<br />
1,44<br />
<br />
4<br />
<br />
3,460<br />
<br />
1762404<br />
<br />
2355<br />
<br />
1,44<br />
<br />
5<br />
<br />
3,445<br />
<br />
1783756<br />
<br />
2389<br />
<br />
1,43<br />
<br />
6<br />
<br />
3,432<br />
<br />
1779267<br />
<br />
2400<br />
<br />
1,42<br />
<br />
TB<br />
<br />
3,449<br />
<br />
1769908<br />
<br />
2354<br />
<br />
1,44<br />
<br />
SD<br />
<br />
0,01<br />
<br />
10600,74<br />
<br />
36,04<br />
<br />
0,01<br />
<br />
RSD (%)<br />
<br />
0,29<br />
<br />
0,60<br />
<br />
1,53<br />
<br />
0,73<br />
<br />
Độ lặp lại của diện tích píc và thời gian lưu tốt (RSD% đều < 2%), số đĩa lý thuyết<br />
và hệ số bất đối xứng phù hợp. Như vậy, thiết bị và điều kiện sắc ký phù hợp để phân<br />
tích mẫu nghiên cứu.<br />
7<br />
<br />
T¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 9-2017<br />
2. Tính đặc hiệu.<br />
Tiêm lần lượt mẫu trắng (pha động), dung dịch chuẩn, dung dịch thử và mẫu thử<br />
thêm chuẩn vào hệ thống theo các điều kiện trên, thu được kết quả như sau:<br />
<br />
(Mafenide acetat)<br />
<br />
0.10<br />
Mafenide acetat<br />
<br />
mcAU<br />
<br />
mcAU<br />
<br />
0.02<br />
<br />
3.448<br />
<br />
0.15<br />
<br />
0.04<br />
<br />
0.05<br />
<br />
0.00<br />
0.00<br />
<br />
0.0<br />
<br />
0.5<br />
<br />
1.0<br />
<br />
1.5<br />
<br />
2.0<br />
<br />
2.5<br />
<br />
3.0<br />
<br />
3.5<br />
<br />
4.0<br />
<br />
4.5<br />
<br />
5.0<br />
<br />
0.0<br />
<br />
5.5<br />
<br />
0.5<br />
<br />
1.0<br />
<br />
1.5<br />
<br />
2.0<br />
<br />
2.5<br />
<br />
3.0<br />
<br />
3.5<br />
<br />
4.0<br />
<br />
4.5<br />
<br />
5.0<br />
<br />
5.5<br />
<br />
Minutes<br />
<br />
Minutes<br />
<br />
b) Sắc ký đồ dung dịch chuẩn<br />
<br />
a) Sắc ký đồ mẫu trắng<br />
<br />
0.15<br />
<br />
0.05<br />
<br />
0.00<br />
0.0<br />
<br />
0.5<br />
<br />
1.0<br />
<br />
1.5<br />
<br />
2.0<br />
<br />
3.395<br />
<br />
0.2<br />
Mafenide acetat<br />
<br />
Mafenide acetat<br />
<br />
mcAU<br />
<br />
0.10<br />
<br />
mcAU<br />
<br />
3.463<br />
<br />
0.3<br />
<br />
0.1<br />
<br />
0.0<br />
<br />
2.5<br />
<br />
3.0<br />
<br />
3.5<br />
<br />
4.0<br />
<br />
4.5<br />
<br />
5.0<br />
<br />
5.5<br />
<br />
0.0<br />
<br />
0.5<br />
<br />
1.0<br />
<br />
Minutes<br />
<br />
c) Sắc ký đồ dung dịch thử<br />
<br />
1.5<br />
<br />
2.0<br />
<br />
2.5<br />
<br />
3.0<br />
<br />
3.5<br />
<br />
4.0<br />
<br />
4.5<br />
<br />
5.0<br />
<br />
5.5<br />
<br />
Minutes<br />
<br />
d) Sắc ký đồ mẫu thử thêm chuẩn<br />
<br />
Hình 1: Sắc ký đồ các mẫu: mẫu trắng (a); dung dịch chuẩn (b);<br />
dung dịch thử (c) và mẫu thử thêm chuẩn (d).<br />
Kết quả cho thấy trên sắc ký đồ của dung dịch thử và mẫu thử thêm chuẩn xuất<br />
hiện píc tương ứng với vị trí của mafenid acetat như trên sắc ký đồ của dung dịch<br />
chuẩn. Các píc này cân đối và riêng biệt. Trên sắc ký đồ của mẫu trắng tại vị trí tương<br />
ứng với mafenid acetat không thấy xuất hiện píc. Như vậy, phương pháp phân tích<br />
mafenid acetat xây dựng đảm bảo có tính đặc hiệu cao.<br />
3. Độ tuyến tính.<br />
Chuẩn bị các dung dịch có nồng độ mafenid acetat 0,05; 0,1; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0 và<br />
2,0 mg/ml. Tiêm lần lượt các dung dịch trên vào hệ thống sắc ký, ghi lại sắc đồ, vẽ đường<br />
hồi quy tuyến tính về sự phụ thuộc của diện tích píc vào nồng độ.<br />
8<br />
<br />
T¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 9-2017<br />
Bảng 2: Phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích píc vào nồng độ mafenid acetat.<br />
Nồng độ (mg/ml)<br />
Diện tích píc (µAU.s)<br />
<br />
0,05<br />
<br />
0,1<br />
<br />
0,25<br />
<br />
0,5<br />
<br />
0,75<br />
<br />
1,0<br />
<br />
2,0<br />
<br />
140632<br />
<br />
352340<br />
<br />
866759<br />
<br />
1704847<br />
<br />
2543670<br />
<br />
3387260<br />
<br />
6663168<br />
<br />
Đường chuẩn y = ax + b<br />
<br />
y = 3334162x + 22117; r = 0,9999<br />
<br />
Hình 2: Đồ thị thể hiện sự phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích píc vào<br />
nồng độ mafenid acetat.<br />
Trong khoảng nồng độ khảo sát có sự phụ thuộc tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích<br />
píc vào nồng độ mafenid acetat theo phương trình y = 3334162x + 22117 với hệ số<br />
tương quan r = 0,9999. Kết quả này là cơ sở để lựa chọn nồng độ định lượng các hợp<br />
chất nghiên cứu tương ứng.<br />
4. Độ đúng.<br />
Độ đúng của phương pháp được xác định bằng cách thêm chuẩn với các mẫu<br />
được chuẩn bị như sau: thêm chính xác một lượng mafenid acetat chuẩn ở 3 nồng độ<br />
khoảng 0,25; 0,5 và 0,75 mg/ml vào dung dịch ban đầu có nồng độ khoảng 0,5 mg/ml.<br />
Tính nồng độ tìm lại dựa vào đường chuẩn. Độ đúng là tỷ lệ % giữa nồng độ tìm lại và<br />
nồng độ thêm vào. Tiến hành lặp lại 3 lần ở mỗi nồng độ.<br />
Bảng 3: Kết quả thẩm định độ đúng của phương pháp.<br />
Nồng độ thêm<br />
vào (mg/ml)<br />
<br />
Nồng độ tìm lại<br />
(mg/ml)<br />
<br />
% tìm lại<br />
<br />
0,2499<br />
<br />
0,2481<br />
<br />
99,27<br />
<br />
0,2481<br />
<br />
0,2411<br />
<br />
97,15<br />
<br />
0,2515<br />
<br />
0,2492<br />
<br />
99,08<br />
<br />
0,4999<br />
<br />
0,5042<br />
<br />
100,87<br />
<br />
0,4963<br />
<br />
0,4931<br />
<br />
99,36<br />
<br />
0,5030<br />
<br />
0,4955<br />
<br />
98,51<br />
<br />
0,7498<br />
<br />
0,7515<br />
<br />
100,23<br />
<br />
0,7444<br />
<br />
0,7375<br />
<br />
99,06<br />
<br />
0,7545<br />
<br />
0,7444<br />
<br />
98,66<br />
<br />
Trung bình tìm lại<br />
(%)<br />
<br />
SD<br />
<br />
RSD (%)<br />
<br />
98,50<br />
<br />
1,18<br />
<br />
1,19<br />
<br />
99,58<br />
<br />
1,19<br />
<br />
1,20<br />
<br />
99,32<br />
<br />
0,82<br />
<br />
0,82<br />
<br />
Phương pháp có độ đúng cao, % tìm lại trung bình từ 98,32 - 99,58%.<br />
9<br />
<br />
Thêm vào BST
Báo xấu
Download
Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ
