Độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của cao chiết nấm Cordyceps miltaris

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:13

Thêm vào BST

Báo xấu

26
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài viết Độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của cao chiết nấm Cordyceps miltaris được thực hiện nhằm đánh giá tính an toàn của nấm này, góp phần tạo nguồn dược liệu để sản xuất các sản phẩm có hoạt tính sinh học hỗ trợ điều trị bệnh, làm cơ sở cho các thử nghiệm tiếp theo về tác dụng sinh học của loại nấm dược liệu này.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của cao chiết nấm Cordyceps miltaris

ACUTE AND SUBCHRONIC ORAL TOXICITY OF Cordyceps miltaris EXTRACT Nguyen Pham Tuan1, Bang Hong Lam2, Nguyen Hoang Nam1, and Nguyen Thi Bao Tran2 1 An Giang Biotechnology center, Chau Thanh district, An Giang province 2 An Giang University, Viet Nam Nation University, Ho Chi Minh City *Corresponding author: ngphamtuan1983@gmail.com Tel: +84.988202055. Abstract Cordyceps militaris fungal (C. Miltaris) is an entomopathogenic fungus with many medicinal values similar to Cordyceps sinensis and has been used for a long time in traditional medicines. Studies on “Acute and sub-chronic oral toxicity of Cordyceps miltaris extract" was conducted to evaluate the safety of C. Miltaris mushroom cultured on artificial media and was a prerequisite for the production of products capable of supporting and treating diseases. C. Miltaris mushroom is made by immersion method with ethanol 80% and combined with ultrasound. The acute and semi-chronic toxicities of C. Miltaris were evaluated by the Litchfield - Wilcoxon‟s method on mice. The results of acute toxicity study showed that C. Miltaris with the maximum dose in white mice was 16.28 g/kg body weight of mice with a mortality rate of 0% after 72 hours. The results of this study showed that, C. Miltaris mushroom dose of 1.63 g/kg body weight of mice without any manifestations often about sub-chronic toxicity in mice for 60 days. Hematological parameters, histology of liver, kidney mice in the mices test batches are not different compared with the control batch. The results of the study showed that C. Miltaris mushroom on artificial media is not cause acute and sub-chronic oral toxicity on experiment animals and is a potential source of raw materials for research and applications. Keywords: acute toxicity, chronic toxicity, Cordyceps militaris. 200
ĐỘC TÍNH CẤP VÀ ĐỘC TÍNH BÁN TRƢỜNG DIỄN CỦA CAO CHIẾT NẤM Cordyceps miltaris Nguyễn Phạm Tuấn1*, Bằng Hồng Lam2, Nguyễn Hoàng Nam1 và Nguyễn Thị Bảo Trân 1 Trung tâm Công nghệ Sinh học tỉnh An Giang, huyện Châu Thành, tỉnh An Giang 2 Trường Đại học An Giang, Đại học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh *Tác giả liên hệ: ngphamtuan1983@gmail.com Số điện thoại: 0988.202055 Tóm tắt Nấm Cordyceps militaris (C. Miltaris) là một loài nấm ký sinh côn trùng có giá trị dược liệu quý tương tự như nấm Cordyceps sinensis và được sử dụng nhiều trong y học cổ truyền trong nhiều năm qua. Nghiên cứu “Độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của cao chiết nấm Cordyceps miltaris” được thực hiện nhằm đánh giá tính an toàn của nấm C. Miltaris được nuôi cấy trên môi trường nhân tạo, làm tiền đề cho quá trình sản xuất các sản phẩm có khả năng hỗ trợ và điều trị bệnh. Cao chiết nấm C. Miltaris được chiết xuất theo phương pháp ngâm dầm với ethanol 80% và kết hợp với sóng siêu âm. Xác định độc tính cấp và bán trường diễn của nấm C. Miltaris bằng phương pháp Litchfield - Wilcoxon trên chuột nhắt trắng dòng Swiss. Kết quả nghiên cứu độc tính cấp cho thấy, nấm C. Miltaris với liều tối đa trên chuột nhắt trắng là 16,28 g/kg thể trọng chuột có phân suất tử vong là 0% sau 72 giờ uống cao chiết ethanol nấm C. Miltaris. Kết quả độc tính bán trường diễn, nấm C. Miltaris liều 1,63g/kg thể trọng chuột không có biểu hiện bất thường về độc tính bán trường diễn trên chuột nhắt trắng sau 60 ngày cho uống cao chiết. Các thông số về huyết học, chỉ số sinh hóa thuộc về chức năng gan - thận không sai khác với đối chứng. Kết quả nghiên cứu cho thấy, nấm C. Miltaris không gây độc tính cấp và độc tính bán trường diễn trên mô hình động vật thí nghiệm và là nguồn dược liệu tiềm năng cho các nghiên cứu tiếp theo và ứng dụng. Từ khóa: Cordyceps militaris, độc tính cấp, độc tính bán trường diễn. 201
1. Mở đầu Nấm dược liệu từ lâu đã là một phần quan trọng của văn hóa và nền văn minh nhân loại, đặc biệt các loài trong chi Cordyceps được đánh giá cao do chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học. Chi Cordyceps có hai loài hiện đang được nghiên cứu nhiều do có giá trị dược liệu và giá trị kinh tế cao (Nguyễn Thị Liên Thương và cs., 2016). C. Miltaris (thường được gọi nấm cam sâu bướm), chứa các hợp chất sinh học tương tự như của C. sinensis, nhưng có thể dễ dàng nuôi trồng trong môi trường nhân tạo (Dong et al., 2012). Quả thể của nấm C. Miltaris dùng làm thực phẩm, dùng trong các món hầm, súp, trà,... ở các nước Đông Nam Á như Hongkong, Đài Loan, Trung Quốc. Lượng an toàn ít hơn 2,5 g/kg thể trong. Quả thể và sinh khối nấm cũng được sử dụng làm thuốc và bồi bổ sức khoẻ như nước uống, viên nhộng, rượu, dấm, trà, yogurt, và nước chấm (Wang et al., 2006). Các chế phầm từ nấm này dùng duy trì chức năng thận, phổi, chống lão hóa, điều hòa giấc ngủ, điều trị viêm phế quản mãn tính (Das et al., 2010). Do có giá trị dược liệu, giá trị kinh tế cao và việc nuôi trồng nấm C. Miltaris ở quy mô lớn có tính khả thi, đáp ứng nhu cầu của thị trường trong nước và chuyển giao công nghệ cho các đơn vị sản xuất, góp phần phát triển kinh tế địa phương. Xuất phát từ thực tế nêu trên, nghiên cứu ―Độc tính cấp và độc tính bán trƣờng diễn của cao chiết nấm Cordyceps miltaris‖ được thực hiện nhằm đánh giá tính an toàn của nấm này, góp phần tạo nguồn dược liệu để sản xuất các sản phẩm có hoạt tính sinh học hỗ trợ điều trị bệnh, làm cơ sở cho các thử nghiệm tiếp theo về tác dụng sinh học của loại nấm dược liệu này. 2. Nguyên vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu 2.1. Nguyên vật liệu Mẫu nấm C. Miltaris được lưu giữ ở phòng Thí nghiệm Sinh hóa của Trung tâm Công nghệ Sinh học tỉnh An Giang. Hóa chất và thiết bị gồm máy đo quang phổ (Human, Hàn Quốc), máy đông khô chân không (Christ, Đức), máy cô quay chân không (Eyala, Nhật Bản), peptone, MgSO4,… Chuột nhắt trắng thuần chủng, dòng Swiss albino trưởng thành (5 tuần tuổi) được cung cấp bởi Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế Nha Trang, được ổn định ít nhất một tuần trước khi thử nghiệm. Chuột được nuôi trong các lồng nhựa, mỗi lồng 10 con chuột. Chuột được nuôi bằng thực phẩm viên (cung cấp bởi Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế Nha Trang), nước uống đầy đủ. Thể tích cho chuột uống là 20 mL/kg thể trọng chuột trong thử nghiệm độc tính cấp đường uống và 10 ml/kg thể trọng chuột trong thử nghiệm độc bán trường diễn. Thời gian cho chuột uống thuốc ở các thử nghiệm khoảng 8 - 9 giờ sáng. 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Hoạt hóa và nuôi trồng nấm Cordyceps miltaris Giống nấm C. miltaris được hoạt hóa trên môi trường Potato Dextrose Agar (PDA) có bổ sung 1% peptone ở nhiệt độ 25 0C trong 5-7 ngày. Quy trình nuôi trồng nấm C. militaris trên môi trường nhân tạo được tiến hành dựa theo phương pháp của Lê Văn Vẻ và cs. (2015), được điều chỉnh để phù hợp với điều kiện thí nghiệm: Môi trường Yeast magnesium Potassium (YMK) được sử dụng để nhân giống dịch thể: 20 g/Lglucose; 5 g/L cao nấm men; 2 g/L KH2PO4; 1 g/L MgSO4.7H2O ở nhiệt độ 250C, pH = 6,0, tốc độ lắc 150 vòng/phút, thời gian nhân giống là 120 giờ. 202
Chuẩn bị cơ chất gạo lứt 20 g/keo để nuôi trồng, môi trường lên men là Basal medium 5 g/L peptone; 1 g/L K2HPO4; 0,5 g/L MgSO4.7H2O; 10 g/L glucose và 1 mg/L vitamin B1. Các keo thí nghiệm được chủng 30 mL môi trường lên men, tiến hành hấp thanh trùng, để nguội rồi chủng 10 mL giống dịch thể của nấm C. militaris vào môi trường đã chuẩn bị sẵn. Nấm C. miltaris được nuôi trong bình có kích thước 7 × 10 cm với cơ chất trong mỗi keo là 25g, chế độ ươm và chăm sóc ra quả thể theo quy trình của Lê Văn Vẻ và cs. (2015). Các keo nấm được ủ ở 200C trong 10-12 ngày, tránh ánh sáng để tơ nấm lan kín các keo nấm. Sau đó, các keo nấm nuôi được sốc nhiệt để kích thích tạo quả thể ở 250C với chu kỳ chiếu sáng/tối 14/10 (500 lux). 2.2.2. Phƣơng pháp tạo cao chiết từ nấm Cordyceps miltaris Nấm C. miltaris nuôi trồng trên môi trường nhân tạo sau 60 ngày được tiến hành thu phần quả thể và phần giá thể. Quả thể và giá thể của nấm C. miltaris được tiến hành đông khô bằng máy đông khô chân không trong 96 giờ, nghiền mịn và tiến hành trích ly với dung môi là ethanol 80%, với tỷ lệ dược liệu và dung môi là 1: 10 (v/v) và có hỗ trợ của sóng siêu âm trong 2 giờ. Sau 72 giờ, tiến hành ly tâm với tốc độ 4.000 vòng phút trong 20 phút, thu dịch lọc và bỏ phần cặn. Phần dịch lọc được lọc qua giấy lọc có đường kính 0,45 µm và thu phần dịch bỏ phần bã. Phần dịch được tiến hành cô quay chân không để loại bỏ dung môi và đông khô bằng máy đông khô chân không thu được cao chiết thô. Cao chiết được bảo quản ở nhiệt độ -200C. 2.2.3. Khảo sát độc tính cấp đƣờng uống của cao chiết nấm Cordyceps miltaris Chuột nhắt chia thành các lô tương tự, những chuột ở cùng một lô sẽ nhận cùng một liều chất khảo sát. Sự đánh giá dựa vào phản ứng toàn ứng hay bất ứng (sống hay chết) nhận thấy ở mỗi chuột trong nhóm sau 72 giờ. Chuột được tiếp tục theo dõi sau 14 ngày uống để ghi nhận những triệu chứn g bất thường (nếu có). 2.2.4. Khảo sát độc tính bán trƣờng diễn đƣờng uống của cao chiết nấm C. miltaris Dựa vào kết quả thử nghiệm độc tính cấp, khảo sát tính an toàn của cao chiết nấm C. miltaris ở liều tương ứng với khoảng 10 g dược liệu là 1,63 g/kg thể trọng chuột (dựa trên kết quả liều Dmax = 16,28 g cao/kg thể trọng chuột. Suy ra liều thử nghiệm tương đối an toàn DS dùng trong các thực nghiệm dược lý có thể bằng 1/5 Dmax hoặc 1/10 Dmax. Tiến hành thử nghiệm khảo sát độc tính bán trường diễn với liều 1/10 Dmax là 1,63 g/kg). Mẫu thử nghiệm được pha với nước cất và cho chuột nhắt trắng uống với thể tích 10 mL/kg thể trọng chuột, liên tiếp trong 60 ngày với liều 1,63 g/kg. Thực hiện song song với lô chứng (chỉ uống nước cất). Lấy máu tĩnh mạch ở đuôi chuột xét nghiệm (lấy máu vào buổi sáng trước khi cho chuột ăn) (Viện Dược liệu, 2006). Chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi thể trọng chuột: vào các thời điểm trước thử nghiệm, sau 1 tháng và sau 2 tháng; Các thông số huyết học (bạch cầu, hồng cầu, tiểu cầu); Các chỉ tiêu sinh hóa gan thận chuột (GOT, GPT, creatinin, urea); Trọng lượng tương đối của gan, tim, thận. 2.3. Phƣơng pháp xử lý số liệu Số liệu thí nghiệm được xử lý thống kê bằng phần mềm Statgraphics plus 16.0. 203
3. Kết quả và thảo luận 3.1. Độc tính cấp đƣờng uống của cao chiết nấm Cordyceps miltaris Cao nấm C. miltaris không có thể hiện độc tính cấp đường uống trên chuột nhắt trắng, toàn bộ chuột vẫn ăn uống và sinh hoạt bình thường trong 72 giờ quan sát. Chuột được tiếp tục theo dõi sau 14 ngày uống và không ghi nhận các triệu chứng bất thường (Bảng 1). Từ liều tối đa có thể cho uống cao nấm C. miltaris trên chuột nhắt trắng là 16,28 g cao/kg thể trọng chuột có phân suất tử vong là 0% và không thể xác định được LD50, do đó xác định được liều Dmax = 16,28 g cao/kg thể trọng chuột. Suy ra liều thử nghiệm tương đối an toàn DS dùng trong các thực nghiệm dược lý có thể bằng 1/5 Dmax hoặc 1/10 Dmax. Tiến hành thử nghiệm khảo sát độc tính bán trường diễn với liều 1/10 Dmax là 1,63 g/kg (tương ứng với khoảng 10 g dược liệu). Theo phân loại độc tính của GHS (Globally Harmonised System for Classification of Chemicals), những chất có giá trị LD50 > 5.000 mg/kg khối lượng cơ thể, được coi là chất gần như không độc. Theo Kennedy et al. (1986) cho rằng, các cao chiết có giá trị LD50 cao hơn 5g/kg đường uống có thể được xem là không độc, nên cao chiết nấm C. militaris không gây độc tính cấp. Thử nghiệm giới hạn chủ yếu được sử dụng trong trường hợp điều tra viên có thông tin chỉ ra rằng vật liệu thử nghiệm có thể không độc hại hoặc có độc tính thấp (OECD, 2002). 3.2. Độc tính bán trƣờng diễn đƣờng uống của cao chiết nấm Cordyceps miltaris Trong nghiên cứu độc tính bán trường diễn, chuột được thử nghiệm là chuột đực và cái 6 tuần tuổi, đang trong giai đoạn tăng trưởng và phát triển để chuyển sang giai đoạn trưởng thành nên thể trọng chuột của lô chứng và lô uống cao C. militaris 1,63 g/kg sau 2 tháng thử nghiệm tăng so với trước thử nghiệm; đồng thời, sự tăng thể trọng của lô thử nghiệm không có sự khác biệt thống kê so với lô chứng cho thấy cao C. militaris không ảnh hưởng đến thể trọng chuột trong thời gian cho uống. Bảng 1: Kết quả đánh giá các hành vi của chuột trong 14 ngày khảo sát sau khi uống cao nấm Cordyceps miltaris ở liều Dmax. Hệ thống cơ Quan sát và thử nghiệm Dấu hiệu chung quan Chuột vận động và sinh hoạt ăn Hệ thần kinh uống bình thường trong lồng nuôi. trung ương và hệ Không ghi nhận các trạng thái bị Hành vi, vận động thần kinh vận kích động hay mất phản xạ thăng động bằng, ngủ, hôn mê Phản ứng não và tủy Không biểu hiện bất thường sống Hệ thần kinh thực Trương lực cơ Bình thường vật Mắt-mũi Bình thường Hệ hô hấp Đặc tính và tốc độ Nhịp thở bình thường, không ghi 204
nhận triệu chứng khó thở hay co giật khí quản Không ghi nhận triệu chứng bất Hệ tim mạch Dấu hiệu của tim mạch thường ở nhịp tim Không ghi nhận triệu chứng tiêu Các triệu chứng chảy, táo bón. Không ghi nhận triệu chứng đau Hình dáng bụng Dạ dày, ruột xoắn bụng Độ chắc và màu sắc của Phân chuột bình thường. phân Cơ quan sinh dục Dương vật Hồng hào và trạng thái căng phồng Lông trắng mượt. Da và lông Màu, tình trạng Không ghi nhận triệu chứng ửng đỏ trên da hay xù lông Tình trạng chung Sự tăng trọng Trong ngưỡng sinh lý bình thường Phân tích các thông số huyết học có liên quan đến đánh giá rủi ro và sự thay đổi trong các hệ thống huyết học và sinh hóa có giá trị dự báo cao hơn đối với độc tính (Olson et al., 2000). Vì không có tác dụng lên mức transaminase và creatinine, là chỉ số tốt cho gan và chức năng thận; điều này cho thấy cao C. militaris không gây hại cho gan và thận và thực tế là không có ảnh hưởng đáng kể đến nồng độ cholesterol huyết tương (Giknis and Clifford, 2008) và chức năng bình thường của gan (Hilaly et al., 2004). Trọng lượng chuột của lô chứng cho uống nước cất và lô thử cho uống cao C. militaris ở thời điểm sau 1 và 2 tháng (30,3±1,62 và 40,40±0,45 g) khác biệt có ý nghĩa thống kê so với trước thử nghiệm (23,50±0,73 g). Ở thời điểm sau 1 và 2 tháng, thể trọng chuột khi cho uống cao C. militaris không khác biệt ý nghĩa thống kê so với lô chứng cùng thời điểm khảo sát (40,80±1,55 g) (Bảng 2). Số lượng hồng cầu ở lô chứng và lô thử uống cao C. militaris ở thời điểm sau 1 và 2 tháng không có sự khác biệt ý nghĩa thống kê so với trước thử nghiệm. Đồng thời, số lượng hồng cầu ở lô thử nghiệm ở thời điểm thử nghiệm sau 1 và 2 tháng (9,12±0,25 và 9,94±0,27) khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (9,21±0,21 và 9,76±0,29) cùng thời điểm khảo sát (Bảng 2). Hàm lượng hemoglobin ở lô chứng và lô chuột uống cao C. militaris ở thời điểm sau 1 và 2 tháng (15,04 ±0,32 và 15,69±0,27 (g/dL) đều khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với trước thử nghiệm (15,09±0,2 và 15,31±0,24) (g/dL) (Bảng 2). Hàm lượng hematocrit ở lô chứng uống nước cất và lô thử nghiệm uống cao C. militaris ở thời điểm sau 1 và 2 tháng (49,01±0,95 và 51,62±1,01 (Hct) (%)khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với trước thử nghiệm (48,80±0,69 và 50,46±0,97) (Hct) (%) (Bảng 2). 205
Số lượng tiểu cầu ở lô chứng ở thời điểm sau 1 và 2 tháng (952,40±121,27 và 923,44±52,80) (103 tế bào/µL) khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với trước thử nghiệm (919,40 ± 51,26 và 860,60 ± 98,47 (103 tế bào/µL)). Đồng thời, số lượng tiểu cầu ở lô thử nghiệm uống cao C. militaris giảm, khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với lô chứng ở thời điểm sau 1 và 2 tháng thử nghiệm (Bảng 2). Số lượng bạch cầu ở lô chứng và lô chuột uống cao C. militaris ở thời điểm sau 1 tháng đều tăng nhưng không đạt ý nghĩa thống kê so với trước thử nghiệm (10,84±0,81 và 11,64±0,93) (K tế bào/µL). Số lượng bạch cầu ở lô chứng và lô chuột uống cao C. militaris ở thời điểm sau 2 tháng đều tăng đạt ý nghĩa thống kê so với trước thử nghiệm (10,92±1,14 và 8,75±0,93 (K tế bào/µL). Điều này có thể lý giải là do lấy máu nhiều lần làm cho cơ chế miễn dịch của cơ thể tăng làm cho số lượng bạch cầu tăng lên ở cả lô chứng và lô thử nghiệm. Đồng thời, số lượng bạch cầu ở lô thử nghiệm không khác biệt ý nghĩa thống kê so với lô chứng ở cùng các thời điểm khảo sát (Bảng 2). Thể tích trung bình của hồng cầu ở lô chứng (51,92±0,59; 53,15±0,78 và 51,92±0,90) (MCV) (fL) và lô thử khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở thời điểm trước và sau thử nghiệm 1 và 2 tháng (51,07±0,73; 53,91±0,75 và 51,61±1,15 MCV) (fL) (Bảng 2). Thể tích trung bình của hồng cầu ở lô uống cao C. militaris giảm có ý nghĩa thống kê so với lô chứng ở thời điểm trước thử nghiệm 1 tháng, nhưng vẫn nằm trong giới hạn bình thường. Chỉ số huyết sắc tố trung bình hồng cầu ở lô chứng (16,11±0,21; 16,44±0,26 và 15,76±0,37 (MCH) (pg) và lô thử (15,8 ±0,22; 16,52±0,17 và 15,82 ±0,27 (MCH)n(pg khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở thời điểm trước và sau thử nghiệm 1 và 2 tháng (Bảng 2). Nồng độ huyết sắc tố trung bình hồng cầu ở lô chứng (31,02±0,17; 30,93±0,15 và 30,35±0,27) (MCHC) (g/dL) và lô thử (31,13±0,31; 30,68±0,34 và 30,39±0,15 (MCHC) (g/dL) không có sự khác biệt thống kê ở thời điểm trước và sau thử nghiệm 1 và 2 tháng (Bảng 2). Bảng 2: Trọng lƣợng và các thông số huyết học của chuột thử nghiệm độc tính bán trƣờng diễn. Liều Trọng lượng chuột (g) Lô (N=10) (g/kg) Trước thử nghiệm Sau 1 tháng Sau 2 tháng Chứng - 23,50 ± 0,85 27,50 ± 0,96* 40,80 ± 1,55** Cao nấm C. 1,63 23,50 ± 0,73 30,3 ± 1,62* 40,40 ± 0,45 ** miltaris Số lượng hồng cầu (M/UL) Trước thử nghiệm Sau 1 tháng Sau 2 tháng Chứng - 9,41 ± 0,23 9,21 ± 0,21 9,76 ± 0,29 Cao nấm C. 1,63 9,59 ± 0,25 9,12 ± 0,25 9,94 ± 0,27 206
miltaris Huyết sắc tố (g/dL) Trước thử nghiệm Sau 1 tháng Sau 2 tháng Chứng - 15,14 ± 0,3 15,09 ±0,2 15,31 ± 0,24 Cao nấm C. 1,63 15,21 ± 0,38 15,04 ± 0,32 15,69 ± 0,27 miltaris Thể tích khối hồng cầu (Hct) (%) Trước thử nghiệm Sau 1 tháng Sau 2 tháng Chứng - 48,82 ± 1,07 48,80 ± 0,69 50,46 ± 0,97 Cao nấm C. 1,63 48,84 ± 0,97 49,01 ± 0,95 51,62 ± 1,01 miltaris Tiểu cầu (103 tế bào/µL) Trước thử nghiệm Sau 1 tháng Sau 2 tháng Chứng - 685,00 ± 42,47 919,40 ± 51,26 860,60 ± 98,47 Cao nấm C. 1,63 853,33 ± 94,90 952,40 ± 121,27 923,44 ± 52,80 miltaris Bạch cầu (K tế bào/µL) Chứng - Trước thử nghiệm Sau 1 tháng Sau 2 tháng Cao nấm C. 1,63 7,96 ± 1,22 10,84 ± 0,81 10,92 ± 1,14* miltaris 8,25 ± 0,75 11,64 ± 0,93 8,75 ± 0,93* Thể tích trung bình hồng cầu (MCV) (fL) Trước thử nghiệm Sau 1 tháng Sau 2 tháng Chứng - 51,92 ± 0,59 53,15 ± 0,78 51,92 ± 0,90 Cao nấm C. 1,63 51,07 ± 0,73 53,91 ± 0,75* 51,61 ± 1,15 miltaris Huyết sắc tố trung bình hồng cầu (MCH)(pg) Trước thử nghiệm Sau 1 tháng Sau 2 tháng 207
Chứng - 16,11 ± 0,21 16,44 ± 0,26 15,76 ± 0,37 Cao nấm C. 1,63 15,88 ± 0,22 16,52 ± 0,17* 15,82 ± 0,27 miltaris Nồng độ huyết sắc tố trung bình hồng cầu (MCHC) (g/dL) Trước thử nghiệm Sau 1 tháng Sau 2 tháng Chứng - 31,02 ± 0,17 30,93 ± 0,15 30,35 ± 0,27* Cao nấm C. 1,63 31,13 ± 0,31 30,68 ± 0,34 30,39 ± 0,15 miltaris Ghi chú: *: khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05; **: khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p < 0,001. Hàm lượng GOT ở lô chứng (39,60 ± 1,56; 41,10 ± 2,13 và 35,33 ± 1,61 (IU/L)) và lô thử uống cao C. militaris liều 1,63 g/kg sau thử nghiệm 1 và 2 tháng (49,20 ± 6,09; 42,90 ± 3,21 và 38,44 ± 3,42 (IU/L)) không có khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với trước thử nghiệm. Hàm lượng GOT ở lô thử uống cao C. militaris liều 1,63 g/kg sau thử nghiệm 1 và 2 tháng không có khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng ở cùng các thời điểm khảo sát (Bảng 3). Bảng 3. Các chỉ tiêu sinh hóa gan và thận của chuột thử nghiệm độc tính bán trƣờng diễn. Hàm lượng GOT (IU/L) Liều Lô (n=10) Trước thử (g/kg) Sau 1 tháng Sau 2 tháng nghiệm Chứng - 39,60 ± 1,56 41,10 ± 2,13 35,33 ± 1,61 Cao nấm C. 1,63 49,20 ± 6,09 42,90 ± 3,21 38,44 ± 3,42 miltaris Hàm lượng GPT (IU/L) Trước thử Sau 1 tháng Sau 2 tháng nghiệm Chứng - 56,30 ± 4,50 51,33 ± 3,27 49,33 ± 5,85 Cao nấm C. 1,63 53,10 ± 3,13 48,20 ± 2,80 45,44 ± 2,05 miltaris Hàm lượng Protein (g/dL) Trước thử Sau 1 tháng Sau 2 tháng 208
nghiệm Chứng - 3,04 ± 0,11 3,84 ± 0,07** 5,03 ± 0,11** Cao nấm C. 1,63 3,12 ± 0,15 3,97 ± 0,15** 4,96 ± 0,14** miltaris Hàm lượng Creatinin (mg/dL) Trước thử Sau 1 tháng Sau 2 tháng nghiệm Chứng - 0,85 ± 0,14 0,55 ± 0,06 0,72 ± 0,03 Cao nấm C. 1,63 0,93 ± 0,05 0,63 ± 0,07* 0,58 ± 0,02**# miltaris Hàm lượng Urea (mg/dL) Trước thử Sau 1 tháng Sau 2 tháng nghiệm Chứng - 48,26 ± 1,94 45,26 ± 4,54 51,38 ± 1,64* Cao nấm C. 1,63 42,56 ± 2,13 40,82 ± 2,32 51,27 ± 1,32* miltaris Ghi chú: *: khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05; **: khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p < 0,001. Hàm lượng GPT ở lô chứng (56,30±4,50; 51,33±3,27 và 49,33±5,85 (IU/L)) và lô thử uống cao C. militaris liều 1,63 g/kg sau thử nghiệm 1 và 2 tháng không có khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với trước thử nghiệm (53,10±3,13; 48,20±2,80 và 45,44±2,05) (IU/L). Hàm lượng GPT ở lô thử uống cao C. militaris liều 1,63 g/kg sau thử nghiệm 1 và 2 tháng khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với lô chứng ở cùng các thời điểm khảo sát (Bảng 3). Hàm lượng protein ở lô chứng (3,84±0,07 và 5,03±0,11) (g/dL) và lô thử nghiệm cho uống cao Đông trùng hạ thảo liều 1,63 g/kg sau 1 và 2 tháng (3,97±0,15 và 4,96±0,14) (g/dL) đều có sự tăng đạt ý nghĩa thống kê so với trước thử nghiệm. Đồng thời, hàm lượng protein ở lô thử nghiệm tại thời điểm sau 1 và 2 tháng khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với lô chứng trong cùng thời điểm khảo sát (Bảng 3). Hàm lượng creatinin ở lô chuột uống cao C. Militaris liều 1,63 g/kg ở thời điểm trước thí nghiệm, sau 1 tháng (0,93±0,05 và 0,63±0,07) (mg/dL) đều không có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng sinh lý cùng thời điểm khảo sát (0,85±0,14 và 0,55±0,06) (mg/dL). Tuy nhiên ở thời điểm sau 2 tháng, lô thử uống Đông trùng hạ thảo liều 1,63 g/kg có sự giảm khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với chứng sinh lý (0,58±0,02 và 0,72±0,03) (mg/dL) (Bảng 23). Hàm lượng creatinin ở lô thử nghiệm giảm đạt ý nghĩa thống kê so với lô thử trước thử nghiệm ở các thời điểm sau 1 và 2 209
tháng thử nghiệm. Tuy nhiên, hàm lượng creatinin vẫn nằm trong giới hạn bình thường của chỉ số này (0,5-0,8 mg/dL). Hàm lượng urea ở lô chứng và lô thử sau 1 tháng cho uống cao Đông trùng hạ thảo liều 1,63 g/kg không có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với trước thử nghiệm (45,26±4,54 và 40,82±2,32) (mg/dL). Hàm lượng urea ở lô chứng và lô thử nghiệm sau 2 tháng cho uống cao C. militaris liều 1,63 g/kg có sự tăng đạt ý nghĩa thống kê so với trước thử nghiệm (51,38 ±1,64 và 51,27±1,32) (mg/dL). Tuy nhiên, giá trị này vẫn nằm trong giới hạn bình thường của của chỉ số này. Đồng thời, hàm lượng urea ở lô thử nghiệm tại thời điểm sau 1 và 2 tháng không có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng trong cùng thời điểm khảo sát (Bảng 3). Bảng 4. Kết quả Hàm lƣợng triglycerid, trọng lƣợng tƣơng đối của gan, tim, thận chuột uống cao nấm C. miltaris sau 60 ngày thử nghiệm. Hàm lượng Triglycerid (mg/dL) Liều Lô (n=10) Trước thử (g/kg) Sau 1 tháng Sau 2 tháng nghiệm Chứng - 72,10 ± 4,68 98,50 ± 4,51** 99,56 ± 6,44** Cao C. miltaris 1,63 68,10 ± 2,95 86,2 ± 4,54* 106,33 ± 6,60** Trọng lượng tương đối cơ quan gan, tim, thận Gan Tim Thận Chứng - 4,23 ± 0,15 0,40 ± 0,02 0,84 ± 0,04 Cao C. miltaris 1,63 3,96 ± 0,16 0,43 ± 0,03 0,87 ± 0,02 Ghi chú: *: khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05; **: khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p < 0,001. Hàm lượng triglycerid của lô chứng và lô thử nghiệm cho uống cao C. militaris sau 1 và 2 tháng có sự gia tăng đạt ý nghĩa thống kê so với trước thử nghiệm. Mặc dù ở lô chứng (98,50±4,51 và 99,56±6,44) (mg/dL) và lô thử nghiệm tại thời điểm sau 1 và 2 tháng thử nghiệm (86,2±4,54 và 106,33±6,60) (mg/dL), hàm lượng triglycerid tăng đạt ý nghĩa thống kê so với trước thử nghiệm nhưng vẫn ở trong giới hạn bình thường. Đồng thời, hàm lượng triglycerid ở lô thử nghiệm tại thời điểm sau 1 và 2 tháng không có sự khác biệt thống kê so với lô chứng trong cùng thời điểm khảo sát (Bảng 4). Phân tích đánh giá các bộ phận nội tạng của nhóm chuột được điều trị với liều cao nhất và lô đối chứng đã cho thấy kiến trúc bình thường, không có thay đổi bất lợi và rối loạn hình thái gây ra bằng cách cho uống cao chiết nấm C. militaris sau 60 ngày uống cao chiết (Silva et al., 2011). Liều uống liều 1,63 g/kg của chiết nấm C. militaris sau 60 liên tiếp không gây độc tính bán trường diễn trên chuột được thử nghiệm các thông số huyết học, các chỉ tiêu sinh hóa… nằm trong giới hạn bình thường. Theo Giknis and Clifford (2008); không có các dấu hiệu giải phẫu đáng chú ý được quan sát, 210
có thể được định nghĩa là mức NOAEL không quan sát được (NOAEL) đối với chuột ở điều kiện thực nghiệm được sử dụng. Trọng lượng tương đối của gan, tim, thận ở lô chứng (4,23±0,15; 0,40±0,02 và 0,84±0,04 (g%)) và lô uống cao C. militaris sau 2 tháng (3,96±0,16; 0,43±0,03 và 0,87±0,02 (g%) đều không có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê. Sau thời gian 2 tháng cho uống cao C. militaris với liều 1,63 g/kg không làm ảnh hưởng lên cấu trúc vi thể gan và thận chuột so với lô chứng. 4. Kết luận Cao chiết nấm C. miltaris an toàn qua thử nghiệm độc tính cấp và độc tính bán trường diễn trên chuột nhắt trắng, với liều lượng trên chuột nhắt trắng là 16,28 g cao/kg thể trọng chuột có phân suất tử vong là 0%. Cao chiết nấm C. miltaris với liều 1,63 g/kg sau 2 tháng cho uống không có biểu hiện bất thường thể hiện qua các thông số huyết học, sinh hóa… đều trong giới hạn bình thường. Lời cảm ơn Nhóm nghiên cứu xin chân thành cảm ơn Sở khoa học và công nghệ tỉnh An Giang và Trung tâm Công nghệ Sinh học tỉnh An Giang đã hỗ trợ và tạo điều kiện để nhóm nghiên cứu thực hiện. Tài liệu tham khảo Đỗ Trung Đàm. (1996). Phương pháp xác định độc tính cấp của thuốc, NXB Y học, Hà Nội, 7-24. Nguyên Thị Liên Thương, Trịnh Diệp Phương Danh và Nguyễn Văn Hiệp. 2016. Nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris: đăc điểm sinh học, giá tri dược liệu và các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi trồng nấm. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản và Công nghệ Sinh học: 44: 9-22. Dong, J.Z., Lei, C. and Ai, X.R. (2012). Selenium enrichment on Cordyceps militaris Link and analysis on its main active components. Applied Biochemistry and Biotechnology. 166: 1215-1224. Wang, J.F. and Yang, C.Q. (2006). Research survey on artificial cultivation and product development of Cordyceps militaris. Lishizhen Medicine And Material Medical Research. 17: 268-269. Das, S.K., Masuda, M. and Mikio, S. (2010). Medicinal uses of the mushroom Cordyceps militaris: current state and prospects. Fitoterapia. 81: 961-968. Lê Văn Vẻ, Trần Thu Hà, Nguyễn Thị Bích Thùy và Ngô Xuân Nghiễn. (2015). Bước đầu nghiên cứu công nghệ nuôi trồng Nhộng trùng thảo (Cordyceps militaris L. ex Fr.) ở Việt Nam. Tạp chí Khoa học và Phát triển, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, 13 (3): 445-454. Viện Dược Liệu. (2006), Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý của thuốc từ thảo dược, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, trang 311-320, 355-368, 377-387. 211
Chen, X., Liu, H., Wang, J.F and Chen, C.Y. (2006). Database of traditional Chinese medicine and its application to studies of mechanism and to prescription validation. British Journal of Pharmacology, 149: 1092-1103. Kennedy, G.L., Ferenz, R.L. and Burgess, B.A. (1986). Estimation of acute oral toxicity in rats by determination of the approximate lethal dose rather than the LD 50. J Appl Toxicol 6: 145-148. OECD. (2002). OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. Section 4: Health Effects Test No. 423: Acute Oral Toxicity Acute Toxic Class Method. Paris, France: Organization for Economic Cooperation and Development. Olson, H., Betton, G., Robinson, D., Thomas, K., Monro, A., Kolaja, G., Lilly, P., Sanders J, Sipes G., Bracken W., Dorato M., Deun K.V., Smith P., Berger B. and Heller, A. (2000). Concordance of toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals. Regul Toxicol Pharmacol 32: 56-67. Giknis, M.L.A. and Clifford, C.B. (2008). Clinical Laboratory Parameters for Crl: WI (Han) Rats. Charles River Laboratory, pp. 17. Hilaly, J.E., Israili Z.H. and Lyoussi B. (2004). Acute and Chronic Toxicological Studies of Ajuga Iva in Experimental Animals. J Ethnopharmacol, 91 (1) :43-50. 212