Fabricating Vascular Grafts by Combination of Decellularization Porcine Cartoid Arteries and Human Adipose Derived Cells

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017<br /> Phan Thị Nhàn*; Bùi Quốc Thắng**; Phạm Thọ Tuấn Anh**<br /> Trần Lê Bảo Hà*; Trần Công Toại***; Lê Quang Trí****<br /> TÓM TẮT<br /> Đặt vấn đề: khử tế bào mạch máu là phương pháp loại bỏ hoàn toàn thành phần tế bào trong<br /> mạch máu để tạo ống ghép mạch máu có bản chất là protein tự nhiên của mạch máu. Sau khi<br /> khử tế bào, ống ghép mạch máu có cấu trúc, thành phần tương tự như mô tự nhiên, số lượng<br /> mẫu lớn, ít gây đáp ứng miễn dịch. Hướng nghiên cứu này rất phát triển trên thế giới và chưa<br /> phát triển tại Việt Nam. Phương pháp: sử dụng động mạch cảnh lợn để khử tế bào. Động mạch<br /> cảnh sau khi thu nhận được xử lý SDS 0,5%, triton X100 0,1%, nước cất và đánh giá bằng<br /> phương pháp nhuộm HE và Trichrome. Đánh giá độc tính mạch máu vô bào in vitro theo tiêu<br /> chuẩn ISO 10993-5. Đánh giá tăng sinh tế bào gốc từ mô mỡ trên lòng mạch máu vô bào bằng<br /> phương pháp MTT. Kết quả: phương pháp kết hợp SDS 0,5% trong 24 giờ và nước cất 24 giờ đ<br /> khử hoàn toàn tế bào và bảo tồn tốt khung nền ngoại bào. Đồng thời, mạch máu vô bào không<br /> gây độc tế bào nguyên bào sợi in vitro và giúp cho tế bào gốc từ mô mỡ người phát triển từ ngày<br /> 1 tới ngày 7. Kết luận: tạo thành công ống ghép mạch máu từ động mạch cảnh lợn.<br /> * Từ khóa: Khử tế bào mạch máu; Ống ghép động mạch cảnh.<br /> <br /> Fabricating Vascular Grafts by Combination of Decellularization<br /> Porcine Cartoid Arteries and Human Adipose Derived Cells<br /> Summary<br /> Introduction: Decellularization of blood vessels is a method removing all cells in blood<br /> vessels to obtain vascular grafts containing native proteins of vessels. After decellularizing,<br /> acellular vascular grafts have structure, components similar to native vessels, could be<br /> produced largely and evoke less immune response. Methods: Porcine carotid arteries were<br /> treated with SDS 0.5% in 24 hours or Triton X100 0.1% in 24 hours or distilled water in<br /> 24 hours. Decellularization efficiency was tested by HE and Trichrome staining. Cytotoxicity test<br /> was conducted according to ISO 10993-5. Proliferation of hADSC was measured by MTT<br /> assay. Results: Combination of SDS 0.5% for 24 hours and distilled water for 24 hours is the<br /> best effective decellularization removing total cells and reserving a large amount of extracellular<br /> matrix. Moreover, acellular carotid grafts aren’t poisonous for fibroblast in vitro and could<br /> support cell growth. Conclusion: Acellular carotid arterial grafts were generated successfully.<br /> * Keywords: Decellularization of blood vessel; Acellular carotid arterial graft.<br /> * Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP. HCM<br /> ** Bệnh viện Chợ Rẫy<br /> *** Trường Đại học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch<br /> **** Bệnh viện Quân y 7A<br /> Người phản hồi (Corresponding): Tô Minh Quân (tomquan@hcmus.edu.vn)<br /> Ngày nhận bài: 25/07/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 26/08/2017<br /> Ngày bài báo được đăng: 30/08/2017<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Mỗi năm có > 600.000 ca bắc cầu động<br /> mạch thực hiện ở Mỹ, gần tương đương<br /> 196<br /> <br /> với can thiệp mạch máu [1, 3]. Hiện nay,<br /> mạch máu tự thân là tiêu chuẩn vàng<br /> trong bắc cầu động mạch. Tuy nhiên, 1/3<br /> số bệnh nhân (BN) không có mạch máu<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017<br /> với chất lượng phù hợp. Các loại vật liệu<br /> ghép trên thị trường như Dacron, PTFE<br /> không phù hợp đối với mạch máu đường<br /> kính nhỏ (đường kính < 5 mm) như động<br /> mạch vành [6].<br /> Khử tế bào là một phương pháp mới<br /> hiện nay. Mô, cơ quan được cấu tạo bởi<br /> 2 thành phần: tế bào và khung nền ngoại<br /> bào (extracellular matrix - ECM). Tế bào<br /> là đơn vị cấu trúc và chức năng của mô.<br /> Trong quá trình sống, tế bào tiết ra bên<br /> ngoài tế bào những phân tử ngoại bào<br /> như protein, polysaccharide, proteoglycan…<br /> Những phân tử này tạo thành khung nền<br /> ngoại bào (ECM) [4]. Phương pháp khử<br /> tế bào nhằm loại đi thành phần tế bào<br /> bên trong mô, cơ quan và giữ lại ECM.<br /> ECM của mỗi mô, cơ quan là mảnh ghép<br /> tốt đối với mô, cơ quan đó [11]. Ống ghép<br /> mạch máu được tạo ra bằng phương pháp<br /> khử tế bào có cấu trúc, hình dạng tương<br /> tự như mạch máu tự thân, số lượng lớn<br /> nhưng có khả năng gây ra đáp ứng miễn<br /> dịch [7].<br /> Tế bào gốc từ mô mỡ (hADSC) là nguồn<br /> tế bào tự thân được quan tâm nhiều hiện<br /> nay. Một số nghiên cứu cho rằng hADSC<br /> có khả năng biệt hóa thành 2 dòng tế bào<br /> quan trọng trong mạch máu là tế bào nội<br /> mô và tế bào cơ trơn [5]. Đặc biệt, thiếu<br /> tế bào nội mô sẽ làm cho ống ghép mạch<br /> máu bị đông máu trong lòng mạch, điều này<br /> ảnh hưởng tới tính mạng của BN. Tế bào<br /> hADSC khắc phục được nhược điểm lớn<br /> nhất của 2 dòng tế bào trên, hADSC có<br /> khả năng thu nhận tự thân dễ dàng với số<br /> lượng lớn.<br /> Hiện nay, ở Việt Nam, nghiên cứu khử<br /> tế bào mạch máu để thu nhận ống ghép<br /> mạch máu vẫn chưa phát triển. Mục tiêu<br /> <br /> của nghiên cứu: Thử nghiệm phương pháp<br /> khử tế bào hiệu quả đối với động mạch<br /> cảnh lợn và thử nghiệm đánh giá tăng<br /> sinh tế bào hADSC trên ống ghép mạch<br /> máu vô bào.<br /> ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Đối tượng nghiên cứu.<br /> Động mạch cảnh lợn và tế bào gốc từ mô<br /> mỡ người (hADSC) (Trường Đại học Y Khoa<br /> Phạm Ngọc Thạch cung cấp).<br /> 2. Phương pháp nghiên cứu.<br /> Theo phương pháp thực nghiệm miêu tả.<br /> * Phương pháp khử tế bào:<br /> Vận chuyển mạch máu về phòng thí<br /> nghiệm trong dung dịch PBS ở 40C, sau đó<br /> tách bỏ các lớp cơ, mỡ xung quanh trong điều<br /> kiện vô trùng. Xử lý mạch máu với từng hóa<br /> chất để khử tế bào: nước cất trong 24 giờ<br /> hoặc SDS 0,5% trong 24 giờ hoặc triton X100<br /> 0,1% trong 24 giờ. Đánh giá hiệu quả khử tế bào<br /> bằng<br /> phương<br /> pháp<br /> nhuộm<br /> heamatoxylin/eosin (HE) và Trichrome.<br /> * Phương pháp đánh giá độc của mạch<br /> máu vô bào:<br /> Đánh giá độc tính tế bào theo tiêu<br /> chuẩn ISO 10993-5. Ống ghép mạch máu cắt<br /> thành những mảnh 0,3 x 0,3 cm 2. Cấy<br /> nguyên bào sợi lên đĩa 4 giếng với nồng độ 3 x<br /> 104 tế bào/giếng. Sau 1 ngày, đặt mảnh ống<br /> ghép lên lớp tế bào trong đĩa (1 mảnh/giếng<br /> tế bào). Sau 1 ngày, loại bỏ mảnh ống ghép,<br /> tiến hành quan sát hình dạng tế bào trên đĩa<br /> và thực hiện phương pháp MTT đối với đĩa thí<br /> nghiệm và đĩa đối chứng (đĩa tế bào không<br /> đặt mảnh ống ghép).<br /> 198<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017<br /> * Phương pháp đánh giá tăng trưởng tế<br /> bào hADSC trên lòng mạch máu vô bào:<br /> <br /> cấy tế bào) và 3 mảnh ống ghép đối chứng<br /> (mảnh không được cấy tế bào).<br /> <br /> Cắt mạch máu khử tế bào thành các đoạn<br /> 0,4 x 0,4 cm2. Thu nhận tế bào hADSC thế hệ<br /> P4, chỉnh về mật độ 2 x 105 tế bào/ml và cấy<br /> lên bề mặt lòng trong mảnh ghép với thể tích<br /> 10 µl/mảnh.<br /> Đánh giá tăng sinh tế bào bằng phương<br /> pháp MTT qua các mốc thời gian 1, 3, 5, 7, 9,<br /> 11 ngày. Mỗi ngày tiến hành đánh giá MTT<br /> với 3 mảnh ống ghép thí nghiệm (mảnh được<br /> <br /> Quy trình MTT: thay môi trường trong<br /> giếng, bổ sung MTT 5 mg/ml vào môi trường<br /> nuôi, ủ 37oC trong 4 giờ, sau đó hút bỏ môi<br /> trường cũ, thêm vào DMSO (thể thích tương<br /> đương với môi trường nuôi) để hòa tan tinh<br /> thể và tiến hành đo OD ở bước sóng 595 nm.<br /> Đánh giá bám dính tế bào bằng kính hiển vi<br /> điện tử quét (SEM).<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU<br /> 1. Kết quả khử tế bào động mạch.<br /> <br /> Hình 1: Động mạch lợn sau xử lý.<br /> A<br /> <br /> B<br /> <br /> Hình 2: Kết quả nhuộm mô học mạch máu tự nhiên (x100).<br /> (A: Nhuộm HE; B: Nhuộm trichrome)<br /> <br /> 199<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017<br /> A<br /> <br /> B<br /> <br /> C<br /> <br /> D<br /> <br /> Hình 3: Kết quả nhuộm mô học HE mạch máu xử lý với các chất tẩy tế bào (x100).<br /> (A: Nước cất 24 giờ; B: Tritonx100 0,1% 24 giờ; C: SDS 0,5% 24 giờ;<br /> D: SDS 0,5% 24 giờ và nước cất 24 giờ)<br /> A<br /> <br /> C<br /> <br /> B<br /> Ph<br /> ân<br /> lập<br /> và<br /> nu<br /> ôi<br /> cấ<br /> y<br /> D<br /> tă<br /> ng<br /> a<br /> sin<br /> h<br /> <br /> Hình 4: Kết quả nhuộm mô học Trichrome mạch máu xử lý với các chất tẩy tế bào (x100).<br /> (A: Nước cất 24 giờ; B: Tritonx100 0,1% 24 giờ; C: SDS 0,5% 24 giờ;<br /> D: SDS 0,5% 24 giờ và nước cất 24 giờ)<br /> 199<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017<br /> Bảng 1: Tóm tắt hiệu quả khử tế bào và bảo tồn collagen của các phương pháp<br /> khác nhau.<br /> Tác nhân khử tế bào<br /> <br /> Hiệu quả khử tế bào<br /> <br /> Hiệu quả bảo tồn collagen<br /> <br /> Nước cất 2 lần<br /> <br /> +<br /> <br /> ++++<br /> <br /> Triton x100<br /> <br /> +<br /> <br /> ++++<br /> <br /> SDS<br /> <br /> ++++<br /> <br /> +++<br /> <br /> SDS kết hợp với nước cất 2 lần<br /> <br /> +++++<br /> <br /> +++<br /> <br /> (+: 0 - 20%; ++: 20 - 40%; +++: 40 - 60%; ++++: 60 - 80%; +++++: 80 - 100%)<br /> Động mạch thu được có kích thước<br /> trung bình 9 cm. Sau khi khử tế bào, động<br /> mạch có màu trắng, vẫn duy trì hình dạng<br /> và kích thước như ban đầu (hình 1). Kết quả<br /> nhuộm HE cho thấy mạch máu sau xử lý<br /> vẫn duy trì được cấu trúc ba lớp như mạch<br /> đối chứng (hình 2, 3). Kết quả nhuộm<br /> Trichrome cho thấy mạch máu sau xử lý<br /> vẫn duy trì protein collagen trong 3 lớp tế<br /> bào (hình 2, 4). Tuy nhiên, kết quả nhuộm<br /> HE và Tricrhome cho thấy hiệu quả khử<br /> tế bào và duy trì collagen của các tác nhân<br /> <br /> khác nhau không giống nhau (bảng 1).<br /> SDS 0,5% trong 24 giờ là phương pháp<br /> khử tế bào hiệu quả nhưng cũng là phương<br /> pháp biến tính collagen mạnh nhất. Nước<br /> cất trong 24 giờ là phương pháp giữ<br /> collagen tốt nhất nhưng cũng là phương<br /> pháp khử tế bào kém nhất. Khi kết hợp<br /> 2 phương pháp lại với nhau (SDS 24 giờ<br /> và nước cất 24 giờ) sẽ có phương pháp<br /> khử tế bào hiệu quả nhất: tế bào được<br /> loại bỏ hoàn toàn và collagen được bảo<br /> tồn tốt.<br /> <br /> 2. Kết quả đánh giá độc tính tế bào.<br /> <br /> Hình 5: Kết quả thử nghiệm độc tính tế bào của mạch máu vô bào (x40).<br /> 200<br /> <br />