Ghép thực nghiệm mảnh san hô mang nguyên bào xương để tái tạo khuyết hổng xương: Mô hình thực nghiệm trên thỏ

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 1 * 2013<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> GHÉP THỰC NGHIỆM MẢNH SAN HÔ MANG NGUYÊN BÀO XƯƠNG<br /> ðỂ TÁI TẠO KHUYẾT HỔNG XƯƠNG: MÔ HÌNH THỰC NGHIỆM TRÊN THỎ<br /> Huỳnh Duy Thảo*, Ciro Gargiulo**, Trần Thị Thanh Thủy*, Nguyễn Khánh Hòa*, Lê Thanh Hùng***,<br /> Trần Công Toại*<br /> <br /> TÓMTẮT<br /> ðặt vấn đề: Nhu cầu ghép xương để điều trị cho các khuyết hõng xương lớn do bệnh lý hoặc tai nạn lao động<br /> ngày càng tăng cao nhưng số lượng mô xương ghép lại hạn chế, không cung cấp đủ nhu cầu cho người bệnh. Từ đó,<br /> nhóm chúng tôi nghiên cứu đề tài này với mục đích sử dụng san hô Porites lutea để mang các tế bào gốc được thu<br /> nhận từ tủy xương thỏ và kích thích biệt hóa các tế bào gốc này thành các nguyên bào xương để tạo ra vật liệu sinh<br /> học dùng để ghép thay xương không những là một giá thể để thay thế cấu trúc xương mà còn bổ sung thêm yếu tố<br /> tế bào để giúp quá trình liền xương diễn ra nhanh hơn và chất lượng lành xương hiệu quả hơn.<br /> ðối tượng và phương pháp nghiên cứu: Thỏ được chia làm hai nhóm nghiên cứu. Một nhóm ghép san hô có<br /> mang nguyên bào xương và chỉ có ghép san hô (mẫu đối chứng). Kết quả ghép được đánh giá bằng hình ảnh học<br /> (X-Quang) và nhuộm mô học H&E.<br /> Kết quả: Kết quả nghiên cứu cho thấy nhóm ghép san hô có mang nguyên bào xương thì quá trình liền<br /> xương xảy ra nhanh hơn và chất lượng lành xương là tốt hơn so với nhóm đối chứng.<br /> Kết luận: Với kết quả đạt được thì đây sẽ một mô hình nghiên cứu rất tốt khi có những bước tiến hành<br /> nghiên cứu trên người.<br /> Từ khóa: Tế bào gốc trung mô, tủy xương thỏ, giá thể san hô, khuyết hổng xương.<br /> <br /> ABSTRACT<br /> RABBIT MODEL OSTEOBLAST FROM BONE MARROW CULTURE AND DIFFERENTIATE ON<br /> CORAL AUTOGRAFT FOR BONE DEFECTED<br /> Huynh Duy Thao, Ciro Gargiulo, Tran Thi Thanh Thuy, Nguyen Khanh Hoa, Le Thanh Hung,<br /> Tran Cong Toai * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 - No 1 - 2013: 9 - 15<br /> Introduction: Demand bone graft for the treatment of large bone defects due to pathology or accident are<br /> increasing but the amount of bone grafts are limited, do not supply the needs of the patient. Since then, Our group<br /> studied the subject for the purpose of using coral Porites lutea to bring stem cells derived from rabbit bone marrow<br /> and stimulates the differentiation of this stem cell into osteoblasts to produce biomaterial used for bone graft<br /> replacement not only a scaffold to replace the bone structure but also have brought cells to help the bone healing<br /> process takes place faster and more effective healing of bone quality.<br /> Materials and methods: Rabbits were divided into two groups. A group of coral transplants bring<br /> osteoblasts and only coral transplantation (control samples). Results of transplantation was assessed by imaging<br /> (X-ray) and histological staining H & E.<br /> <br /> * Bộ môn Mô-Phôi-Di truyền, ðH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch<br /> ** University of Western Autralia School of Anatomy and Human Biology, Perth, Australia<br /> *** Khoa Răng-Hàm-Mặt, ðH Y Dược TP.HCM<br /> Tác giả liên lạc: BS Lê Thanh Hùng, ĐT: 0918.686.151,<br /> Email: ranghammat@gmail.com<br /> <br /> 9<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 1 * 2013<br /> <br /> Results: Research results showed that coral transplantation group brings osteoblasts, the bone healing<br /> process occurs faster and the quality of bone healing is better than the control group.<br /> Conclusion: With the results obtained, this will be a good research model when conducting research on<br /> human.<br /> Keywords: Mesenchymal Stem Cells, Rabbit Bone Marrow, Coral Scaffold, Bone Defect.<br /> <br /> ðẶTVẤNĐỀ<br /> <br /> ðỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU<br /> <br /> Mô xương có khả năng tự lành trong các<br /> trường hợp khuyết xương nhỏ. Tuy nhiên, trong<br /> các trường hợp mất xương dẫn đến khuyết hụt<br /> xương lớn do các tai nạn hoặc bệnh lý thì mô<br /> xương không có khả năng tự sửa chửa. ðể có thể<br /> điều trị hiệu quả trong các trường hợp này thì<br /> phải tiến hành ghép xương để lắp đầy các chổ<br /> hổng khuyết(17). Xương ghép có thể thu từ chính<br /> cơ thể người bệnh (ghép xương tự thân) hoặc từ<br /> người hiến (ghép xương đồng loại) hoặc có nguồn<br /> gốc không phải từ người (ghép xương dị loại).<br /> <br /> Thỏ<br /> <br /> Có nhiều loại vật liệu thay thế xương có<br /> nguồn gốc từ kim loại, gốm, sứ, các loại<br /> polymer sinh học hoặc tổng hợp... Bên cạnh đó,<br /> để cải thiện chất lượng mảnh ghép các nhà<br /> nghiên cứu tạo ra các mảnh ghép có mang các<br /> tế bào xương hay tế bào tiền thân tạo xương để<br /> tạo ra một mô ghép xương vừa có các đặc tính<br /> cơ học của mô xương vừa mang các tế bào để<br /> giúp quá trình tái tạo và sửa chữa mô xương<br /> diễn ra nhanh chóng và hiệu quả hơn(3,7,9).<br /> Do đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu sử<br /> dụng san hô Porites lutea để sử dụng làm giá<br /> thể ghép có mang các nguyên bào xương thu<br /> từ tế bào gốc tủy xương tạo ra mô hình thực<br /> nghiệm ghép xương sử dụng giá thể san hô<br /> mang các nguyên bào xương tự thân trên đối<br /> tượng thỏ để thay thế các khuyết hổng xương<br /> được tạo ra trên thân xương đùi(1,2,3,4,8,9,11,12,15,17).<br /> Từ đó, nghiên cứu hoàn thiện quy trình ghép<br /> mảnh san hô thay xương trên thỏ để làm cơ sở<br /> cho các bước tiến hành nghiên cứu trên người<br /> trong các nghiên cứu tiếp theo của nhóm<br /> chúng tôi.<br /> <br /> 10<br /> <br /> Thỏ sử dụng trong nghiên cứu này là loại thỏ<br /> nâu, thu từ các trang trại ở Việt Nam. Thỏ trong<br /> nhóm nghiên cứu là các thỏ đực, khỏe mạnh,<br /> trong lượng từ 2,0 - 2,5 kg. ðược nuôi và chăm sóc<br /> trong các điều kiện nuôi nhốt như nhau.<br /> <br /> Thu nhận tủy xương<br /> Thỏ được tiến hành gây mê bằng Zoletil 50<br /> (VIRBAC Lboratories, France). Sau đó, cắt lông<br /> phần đầu khớp xương gối, sử dụng Betadine<br /> (Zuellig Pharma) để sát trùng vùng lấy tủy. Sử<br /> dụng bơm và đầu kim 18G (Vihanmedico, HN,<br /> VN) để chọc hút dịch tủy. Mỗi lần thu nhận<br /> khoảng 2ml dịch tủy xương. Sau đó cho nhanh<br /> vào tube 15ml vô trùng (Corning, USA) và<br /> chuyển nhanh về phòng thí nghiệm. Tất cả các<br /> thao tác được tiến hành tại Trung tâm phẫu<br /> thuật thực nghiệm, ðH Y Dược TP. HCM, các<br /> bước tiến hành được đảm bảo tối đa yêu cầu về<br /> vô trùng.<br /> <br /> Phân lập tế bào gốc<br /> Tế bào gốc được thu nhận theo phương pháp<br /> lắng dựa vào tỉ trọng bằng dung dịch FicollHypaque (Amersham, Germany). Tủy xương<br /> được pha loãng với dung dịch PBS (Gibco, USA)<br /> theo tỉ lệ 1:2 (1 tủy xương: 2 PBS, v/v). Sau đó, đặt<br /> hỗn hợp dịch tủy xương trên lớp dịch Ficoll theo<br /> tỉ lệ 1:2 (1 dịch tủy xương: 2 Ficoll, v/v). Tiến hành<br /> quay ly tâm với tốc độ 2000 vòng/phút trong 20<br /> phút. Thu nhận lớp tế bào đơn nhân nằm giữa<br /> lớp Ficoll và lớp huyết tương.<br /> Nuôi cấy tế bào với mật độ khoảng 105 tế<br /> bào/ml vào chai cấy 25 cm2 (Nunc, Wiesbaden,<br /> Germany) và đem ủ trong tủ ủ ấm ở nhiệt độ<br /> 370C, 5% CO2. Sau 3 ngày thay môi trường mới.<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 1 * 2013<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Biệt hóa tế bào gốc thu từ tủy xương thành<br /> nguyên bào xương<br /> <br /> hóa của tế bào gốc thành nguyên bào xương<br /> tiến hành nhuộm alkaline phosphatase.<br /> <br /> Biệt hóa thành các nguyên bào xương bằng<br /> hỗn hợp môi trường cảm ứng tạo xương gồm<br /> DMEM/F12, 10% FBS, Dexamethasone 10-8M<br /> (Sigma), 10 mM/ml β-Glycerol phosphate<br /> (Sigma), 50 ng/ml Acid ascorbic (Sigma), 10ng/ml<br /> FGF-9<br /> (Sigma),<br /> 10-7M<br /> Vitamin<br /> D2<br /> (MekomPharma, HCM City, VN) và Pen/strep<br /> (100UI/0,1mg/ml). Môi trường cảm ứng tạo xương<br /> được thay mới mỗi 3 ngày. Sau khoảng thời gian<br /> nuôi từ 14-21 ngày tiến hành xác định tế bào sau<br /> biệt hóa bằng phương pháp nhuộm mô học bởi<br /> Alizarin Red, Von kossa và alkaline<br /> phosphatase.<br /> <br /> Ghép thực nghiệm in vivo mảnh san hô<br /> mang nguyên bào xương tự thân trên thỏ<br /> <br /> Chuyển tế bào gốc lên giá thể san hô<br /> San hô sử dụng trong nghiên cứu là loài<br /> Porites lutea lấy từ Phòng thí nghiệm Vật liệu<br /> sinh học, Bộ môn Mô-Phôi-Di truyền, Trường ðại<br /> học Y khoa Phạm Ngọc Thạch.<br /> San hô được thu nhận, xử lý và vô trùng theo<br /> quy trình của phòng thí nghiệm vật liệu sinh học<br /> để tạo ra giá thể dùng để mang các tế bào gốc thu<br /> nhận từ tủy xương thỏ.<br /> Tế bào gốc được chuyển lên giá thể san hô có<br /> kích thước 0,5 x 0,5 x 0,5 cm với mật độ tế bào 1 x<br /> 105 tế bào/ml. Tế bào được chuyển lên giá thể san<br /> hô dựa vào phương pháp ly tâm.<br /> Mảnh san hô sau khi quay ly tâm được đặt<br /> vào chai nuôi, bổ sung môi trường DMEM/F12,<br /> 10%FBS, kháng sinh và ủ ở 370C, 5% CO2. Sau<br /> một ngày nuôi tiến hành thay môi trường nuôi<br /> mới bằng môi trường cảm ứng tạo xương. Tiếp<br /> theo thay mới môi trường nuôi mỗi 3 ngày.<br /> <br /> Đánh giá sự phát triển và biệt hóa của tế bào<br /> trên giá thể san hô<br /> ðể đánh giá khả năng phát triển, tăng<br /> trưởng và biệt hóa của tế bào gốc thành nguyên<br /> bào xương trên giá thể san hô. Tiến hành<br /> nhuộm mô học H&E, chụp SEM để khảo sát sự<br /> phát triển, bám dính của tế bào trên vùng bề<br /> mặt của khối san hô. ðể đánh giá khả năng biệt<br /> <br /> Từ kết quả nghiên cứu in vitro, tiến hành<br /> lấy tủy xương thỏ, nuôi cấy và biệt hóa các tế<br /> bào gốc tủy xương thành nguyên bào xương<br /> trên giá thể san hô. Sau đó, sẽ tiến hành phẫu<br /> thuật ghép tự thân các mẫu san hô này trở lại<br /> cho thỏ.<br /> Thí nghiệm được chia làm hai nhóm:<br /> Nhóm 1: ghép tự thân nguyên bào xương<br /> thỏ trên giá thể san hô.<br /> Nhóm 2: chỉ ghép san hô trên thỏ.<br /> Thỏ được theo dõi tại các thời điểm 1, 3 và<br /> 6 tháng. Tại các mốc thời gian này, thỏ sẽ được<br /> đánh giá bằng hình ảnh học (chụp X-Quang)<br /> và thu nhận mẫu mô để làm mô học H&E.<br /> Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.<br /> <br /> KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN<br /> Kết quả nuôi cấy tế bào gốc tủy xương thỏ<br /> Kết quả cho thấy, đây là các tế bào bám<br /> dính, có hình dạng giống với các nguyên bào<br /> sợi, đó là những tế bào có hình dạng thon dài,<br /> hoặc hình thoi, bầu dục (Hình 1).<br /> <br /> Khả năng biệt hóa in vitro tế bào gốc tủy<br /> xương thành nguyên bào xương<br /> Các tế bào gốc từ tủy xương thỏ được biệt<br /> hóa thành các nguyên bào xương. Sau khoảng<br /> thời gian nuôi cấy từ 14-21 ngày, đánh giá các<br /> tế bào sau biệt hóa là các nguyên bào xương<br /> bằng các phương pháp nhuộm mô học như<br /> Alirazin Red, Von kossa và đánh giá sự biểu<br /> hiện của enzyme alkaline phosphatase(10,13,15,16).<br /> Từ kết quả nhuộm cho thấy đã biệt hóa<br /> thành các nguyên bào xương in vitro.<br /> <br /> Khả năng biệt hóa, bám dính và phát triển<br /> của tế bào trên giá thể san hô<br /> Kết quả nhuộm Giemsa và H&E<br /> Mẫu san hô mang nguyên bào xương được xử<br /> <br /> 11<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 1 * 2013<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> lý trong dung dịch cố định (Neutral Buffer<br /> Formalin 10%-NBF 10%) và nhuộm với thuốc<br /> <br /> nhuộm Giemsa và H&E (Hình 2).<br /> <br /> B<br /> <br /> A<br /> <br /> C<br /> <br /> Hình 1: Kết quả nuôi cấy tế bào gốc thu nhận từ tủy xương thỏ. (A). Sau 3 ngày nuôi(10X). (B). Sau một tuần<br /> nuôi cấy(10X). (C). Tế bào được nhuộm Giemsa sau một tuần nuôi cấy.<br /> <br /> A<br /> <br /> B<br /> <br /> Hình 2: Nhuộm Giemsa và H&E cho tế bào gốc tủy xương nuôi trên khối san hô. (A). Hình chụp khối san hô<br /> nhuộm H&E. (B). Hình chụp khối san hô nhuộm Giemsa.<br /> hồng, do sự hoạt động của enzyme alkaline<br /> phosphatase (Hình 3).<br /> <br /> Kết quả đánh giá sự biểu hiện enzyme alkaline<br /> phosphatase<br /> Nhuộm khối san hô với thuốc nhuộm Fast<br /> Red violet LB salt (sigma), nếu các tế bào gốc<br /> trung mô (MSC) biệt hóa được thành các nguyên<br /> bào xương thì các tế bào này sẽ phản ứng lại với<br /> thuốc nhuộm và trong bào tương xuất hiện màu<br /> <br /> Các tế bào này hoàn toàn đã biệt hóa thành<br /> nguyên bào xương sau thời gian nuôi cấy và kích<br /> thích biệt hóa thành nguyên bào xương với môi<br /> trường biệt hóa phù hợp.<br /> <br /> A<br /> <br /> B<br /> <br /> Hình 3: Mảnh san hô mang nguyên bào xương được nhuộm Fast Red Violet LB salt. (A). Tế bào gốc tủy xương<br /> thỏ biệt hóa thành nguyên bào xương trên khối san hô nhuộm alkaline phosphatase (4X) (B). Nguyên bào xương<br /> bắt màu hồng đậm do hoạt tính của enzyme alkaline phosphatase phản ứng với thuốc nhuộm Fast Red Violet LB<br /> salt (10X).<br /> <br /> 12<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 1 * 2013<br /> ðánh giá dựa vào hình ảnh học (X-Quang)<br /> Nhóm 1: Thỏ ghép san hô có mang nguyên<br /> bào xương tự thân<br /> Kết quả ghép san hô có mang nguyên bào<br /> xương tự thân theo thời gian 1, 3 và 6 tháng được<br /> đánh giá bằng hình ảnh học (X-Quang) và mô<br /> học H&E.<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> Kết quả ghép san hô theo thời gian 1, 3 và 6<br /> tháng được đánh giá bằng hình ảnh học (XQuang) và mô học H&E.<br /> Dựa vào kết quả chụp X-Quang cho thấy, 2<br /> tuần sau khi ghép chưa có cal xương.<br /> Sau 4 tuần ghép, kết quả X-Quang cho thấy,<br /> bắt đầu có cal xương.<br /> <br /> Kết quả chụp X-Quang cho thấy, 2 tuần sau<br /> khi ghép chưa thấy cal xương vào mảnh ghép.<br /> <br /> Sau 8 tuần ghép, quá trình lành xương diễn<br /> ra tốt, san hô bị thay thế dần.<br /> <br /> Sau 4 tuần ghép, kết quả X-Quang cho thấy<br /> bắt đầu có cal xương.<br /> <br /> Sau 12 tuần, nơi khối san hô ghép thay thế<br /> dần bởi xương chủ<br /> <br /> Sau 8 tuần ghép, quá trình lành xương diễn<br /> ra có cal xương khá hơn.<br /> <br /> Sau 18 tuần ghép, sự thay thế chưa hoàn toàn<br /> kết thúc.<br /> <br /> Sau 12 tuần, nơi khối san hô ghép bắt đầu<br /> diễn ra quá trình thay thế xương chủ gần hoàn<br /> toàn.<br /> <br /> Sau 24 tuần ghép. Mảnh san hô ghép đã thay<br /> thế dần thành màng xương của mô xương chủ.<br /> <br /> Sau 18 tuần ghép, còn thấy ít san hô.<br /> Sau 24 tuần ghép. Vị trí nơi ghép đã hoàn<br /> toàn được thay thế bằng mô xương chủ.<br /> Nhóm 2: Thỏ chỉ được ghép san hô (mẫu đối<br /> chứng).<br /> <br /> ðánh giá dựa vào cấu trúc mô học<br /> Nhóm 1: Thỏ ghép san hô có mang nguyên<br /> bào xương tự thân.<br /> Kết quả ghép san hô có mang nguyên bào<br /> xương tự thân theo thời gian 1, 3 và 6 tháng được<br /> đánh giá bằng nhuộm mô học H&E (Hình 4).<br /> <br /> A<br /> <br /> B<br /> <br /> C<br /> <br /> D<br /> <br /> Hình 4: Kết quả đánh giá hình ảnh nhuộm H&E trên thỏ ghép san hô có mang nguyên bào xương tự thân. (A).<br /> Kết quả ghép sau 1 tháng. (B). Kết quả ghép sau 3 tháng. (C). Kết quả ghép sau 5 tháng. (D). Kết quả ghép sau 6<br /> tháng.<br /> tạo xương trên khối san hô diễn ra đều khắp trên<br /> Một tháng sau khi ghép mẫu san hô có mang<br /> khối san hô (xảy ra ở hai đầu xương nơi tiếp giáp<br /> nguyên bào xương thỏ tự thân, mạch máu xâm<br /> với mảnh ghép san hô và trên khối san hô).<br /> nhập vào bên trong khối san hô, quá trình hủy và<br /> <br /> 13<br /> <br />