GIÁO TRÌNH BỆNH TRUYỀN NHIỄM THÚ Y (PHẦN ĐẠI CƯƠNG) part 6

Chia sẻ: ágffq ằefgsd | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:22

Thêm vào BST

Báo xấu

176
lượt xem 46
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Ngƣng kết thấy rõ ở những ống nghiệm có nồng độ kháng nguyên và kháng thể gần bằng nhau, vì vậy ở những ống có nồng độ kháng thể cao (đầu dãy) có thể không thấy ngƣng kết. Nhờ phản ứng này ta có thể xác định đƣợc hiệu giá kháng thể trong huyết thanh bị kiểm. Hiệu giá kháng thể là độ pha loãng lớn nhất của huyết thanh (hoặc nhũ thanh,...) còn cho phản ứng dƣơng tính. Phản ứng ngƣng kết có thể thực hiện theo chiều khác để phát hiện kháng nguyên đặc hiệu tức là xác...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: GIÁO TRÌNH BỆNH TRUYỀN NHIỄM THÚ Y (PHẦN ĐẠI CƯƠNG) part 6

108 dƣơng tính thể hiện ở dạng các tế bào vi khuẩn ở ống tƣơng ứng ngƣng tụ lại làm đục cả ống nghiệm, trong khi ở các ống âm tính vi khuẩn (kháng nguyên) chìm xuống đáy ống làm dịch trở nên trong. Ngƣng kết thấy rõ ở những ống nghiệm có nồng độ kháng nguyên và kháng thể gần bằng nhau, vì vậy ở những ống có nồng độ kháng thể cao (đầu dãy) có thể không thấy ngƣng kết. Nhờ phản ứng này ta có thể xác định đƣợc hiệu giá kháng thể trong huyết thanh bị kiểm. Hiệu giá kháng thể là độ pha loãng lớn nhất của huyết thanh (hoặc nhũ thanh,...) còn cho phản ứng dƣơng tính. Phản ứng ngƣng kết có thể thực hiện theo chiều khác để phát hiện kháng nguyên đặc hiệu tức là xác định typ/dạng huyết thanh học của vi khuẩn hoặc vi sinh vật khác. Khi đó thƣờng phải có bộ kháng huyết thanh đa giá (xác định nhóm) và đơn giá (xác định typ). Trong thực tế các virut đƣợc coi là kháng nguyên hòa tan và không thể thực hiện phản ứng ngƣng kết. Tuy vậy, bằng cách gắn kết virut lên hồng cầu ngƣời ta có thể tạo đƣợc kháng nguyên hữu hình đặc hiệu virut có tính ngƣng kết hoàn hảo với kháng thể và đƣợc áp dụng trong một biến thể của phản ứng huyết thanh học, phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp phát hiện và bán định lƣợng kháng thể. Đồng thời, kháng nguyên này cũng còn đƣợc sử dụng trong phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gián tiếp phát hiện kháng nguyên bằng cách lấy kháng huyết thanh chuẩn cho t iếp xúc trƣớc với bệnh phẩm chứa kháng nguyên nghi rồi đo lại hàm lƣợng (hiệu giá) kháng thể bằng phản ứng ngƣng kết hồng cầu gián tiếp. Sự sụt giảm hiệu giá kháng thể trong kháng huyết thanh chuẩn chứng tỏ có kháng nguyên đặc hiệu trung hòa kháng thể đó. 1.3. Phản ứng cố định bổ thể Phản ứng cố định bổ thể (CFR) hay còn gọi là phản ứng kết hợp bổ thể là phản ứng huyết thanh học phát hiện tổ hợp kháng nguyên - kháng thể thông qua vận dụng thuộc tính gây dung giải tế bào, kể cả tế bào hồng cầu, của hệ thống bổ thể (các enzym trong huyết tƣơng động vật có vai trò trong miễn dịch không đặc hiệu) một khi hệ thống này đƣợc hoạt hóa nhờ kháng thể khi kháng thể hình thành tổ hợp kháng nguyên - kháng thể. Phản ứng này gồm hai hệ thống: 1) hệ thống phản ứng chính và 2) hệ thống phản ứng hiển thị (hệ thống phụ, hay hệ thống dung huyết). Bổ thể là một hệ thống gồm 9 protein (C1 đến C9) hòa tan trong huyết tƣơng ở trạng thái vô hoạt và có thể đƣợc hoạt hóa theo phản ứng dây chuyền từ C1 đến C9 một khi C1 đƣợc hoạt hóa (con đƣờng cổ điển)
109 hoặc C3 đƣợc hoạt hóa (con đƣờng nhánh). Yếu tố C1 đƣợc hoạt hóa nhờ phần Fc của kháng thể khi kháng thể kết hợp với kháng nguyên (Fc từ trạng thái vô hoạt sang trạng thái hoạt động của một enzym). Khi tổ hợp bổ thể đƣợc hoạt hóa một số yếu tố sản phẩm của bổ thể đƣợc hình thành và gắn kết lên cấu trúc màng tế bào chất làm hình thành tổ hợp tấn công màng (MAC - membrane attacking complex) là những lỗ khổng bất thƣờng trên màng tế bào chất qua đó tế bào chất bị thoát ra ngoài (dung bào) (bên cạnh các phản ứng quá mẫn, viêm và hoạt hóa thực bào,...). Tuy nhiên, các bổ thể là những protein mẫn cảm với nhiệt. Đun ở 56 - 58 °C nhanh chóng làm biến tính bổ thể, trong khi nếu đun ở nhiệt độ này sau 30 phút kháng thể vẫn giữ nguyên hoạt tính. Ở hệ thống phản ứng chính ngƣời ta trộn kháng nguyên chuẩn (1 ml) với huyết thanh (1 ml) cần kiểm đã đƣợc đun nóng vô hoạt bổ thể rồi thêm vào đó một lượng ở nồng độ làm việc của bổ thể là huyết thanh chuột lang tƣơi mới. Sau khi ủ 15 phút ở 37 °C thì cho thêm vào đó một lƣợng nhất định (1 ml) hỗn hợp hệ thống phụ pha sẵn. Lại ủ nhƣ trên, sau 15 phút kiểm tra kết quả. Phản ứng chính dƣơng tính thể hiện dƣới dạng hồng cầu chìm xuống đáy ống nghiệm (phản ứng phụ âm tính). Ngƣợc lại, phản ứng chính âm tính thể hiện dƣới dạng dịch trong ống nghiệm có màu đỏ của hemoglobin (phản ứng phụ dƣơng tính). Nồng độ làm việc của bổ thể được xác định trước (vào đầu ngày làm việc) nhờ dãy ống pha loãng dần huyết thanh chuột lang trong nƣớc sinh lý (1 ml mỗi ống) rồi cho vào tất cả các ống trong dãy một lƣợng (1 ml) hỗn hợp hệ thống phụ pha sẵn. Trong hệ thống phụ này có kháng nguyên là huyền dịch 6% tế bào hồng cầu cừu trộn đều với kháng thể là kháng huyết thanh thỏ tối miễn dịch (mẫn hóa) với hồng cầu cừu gọi là hemolysin. Sau khi ủ 15 phút ở 37 °C, trong ống nghiệm có đủ bổ thể sẽ thấy dung huyết (dịch đỏ đều) còn các ống có nồng độ bổ thể quá thấp sẽ không xuất hiện dung huyết (hồng cầu chìm xuống đáy ống, dịch trên trong). Nồng độ làm việc của bổ thể là ở ống có độ pha loãng lớn nhất còn cho phản ứng dung huyết. Pha huyết thanh chuột lang tƣơi mới ở nồng độ này ta sẽ có dung dịch bổ thể ở nồng độ làm việc. Lượng làm việc của bổ thể đƣợc giữ ổn định (1 ml) trong quá trình thực hiện phản ứng. 1.4. Phản ứng HI (ngăn trở ngƣng kết hồng cầu) Nhiều virut có thuộc tính ngƣng kết hồng cầu. Chúng có thụ thể tƣơng ứng với thụ thể có trên bề mặt hồng cầu, do đó kết nối các hồng cầu liền kề lại với nhau thành mạng đa chiều không chìm xuống đáy tự nhiên
110 nhờ tỷ trọng của hồng cầu cao hơn tỷ trọng dung dịch sinh lý. Phản ứng ngƣng kết hồng cầu của virut giúp ta phát hiện đƣợc sự hiện diện cũng nhƣ bán định lƣợng virut tƣơng ứng. Đồng thời, ngƣời ta còn lợi dụng đặc tính này của virut để xác định sự hiện diện cũng nhƣ hiệu giá kháng thể đặc hiệu trong huyết thanh cần kiểm dƣới dạng phản ứng ngăn trở ngƣng kết hồng cầu (HI: hemagglutination inhibition reaction). Trƣớc tiên ngƣời ta phải thực hiện phản ứng ngƣng kết hồng cầu để xác định hiệu giá của virut chuẩn rồi trên cơ sở đó pha dịch virut làm việc với hiệu giá 4 đơn vị ngƣng kết (4 HA). Phản ứng này đƣợc thực hiện trên khay nhựa vi chuẩn độ (Microtitration plate) 96 lỗ (mỗi lỗ chứa khoảng 0,4 ml) đáy U hoặc V. Cho vào mỗi lỗ 50 μl nƣớc sinh lý NaCl rồi cho vào lỗ thứ nhất 50 μl virut, trộn và chuyển sang lỗ thứ hai, rồi tiếp tục trộn chuyển nhƣ vậy đến hết lỗ thứ 10 thì vứt bỏ 50 μl. Hai lỗ 11 và 12 dùng làm đối chứng âm tính chỉ chứa nƣớc sinh lý để xác định thời điểm đọc kết quả tốt nhất. Cho 50 μl huyền dịch hồng cầu thích hợp (0,5% hoặc 1%, khối lƣợng tƣơi trên thể tích, luôn ở trạng thái khuấy đều). Trộn đều rồi để yên ở nhiệt độ phòng 15 đến 60 phút, đọc kết quả khi hai lỗ 11 và 12 có hồng cầu chìm xuống tâm đáy lỗ hoàn toàn. Hồng cầu ngƣng kết tạo mạng đa chiều không chìm xuống tâm đáy lỗ khay mà dàn trải đều khắp lỗ hoặc nếu chìm chúng cũng tỏa rộng và thƣờng tạo một lớp nhăn nheo khắp mặt đáy lỗ. Hiệu giá kháng thể là độ pha loãng lớn nhất còn cho kết quả dƣơng tính. Nồng độ virut làm việc phải chứa 4 HA chính là nồng độ của virut ở độ pha loãng cách đó hai lỗ khay (22=4). Pha virut gốc để có nồng độ này rồi kiểm tra lại với phản ứng trong 4 lỗ khay có nồng độ 2 HA, 1 HA, 1/2 HA và 1/4 HA. Nếu dịch virut bị nhạt (tức ít nhất có một trong hai lỗ nửa bên trái không ngƣng kết) thì pha thêm virut cho đủ sao cho hai lỗ đầu có ngƣng kết rõ còn hai lỗ sau không thấy ngƣng kết. Ngƣợc lại nếu virut quá đặc (có ít nhất ba lỗ ngƣng kết) thì pha thêm nƣớc sinh lý để vừa đủ tạo ngƣng kết ở hai lỗ. Phản ứng HI cũng đƣợc tiến hành trên khay nhựa vi chuẩn độ 96 lỗ, mỗi dãy lỗ khay cho một phản ứng. Đầu tiên pha huyết thanh theo cấp số 2. Cho vào mỗi lỗ 50 μl nƣớc sinh lý NaCl rồi cho vào lỗ thứ nhất 50 μl huyết thanh kiểm, trộn và chuyển sang lỗ thứ hai, rồi tiếp tục trộn chuyển nhƣ vậy đến hết lỗ thứ 10 thì vứt bỏ 50 μl. Cho vào mỗi lỗ từ lỗ 1 đến lỗ 11 (đối chứng âm) 50 μl dịch virut làm việc 4 HA, trộn đều và ủ 5 - 10 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó cho vào tất cả các lỗ (lỗ 1 đến 12) 50 μl
111 huyền dịch hồng cầu đã dùng để xác định hiệu giá HA. Hai lỗ 11 và 12, nhƣ vậy, dùng làm đối chứng âm tính (chứa chỉ virut và hồng cầu) và dƣơng tính (chứa chỉ nƣớc sinh lý và hồng cầu). Để ở nhiệt độ phòng và đọc kết quả sau 15 đến 60 phút phụ thuộc vào kết quả chìm hồng cầu ở lỗ thứ 12 (đối chứng HI dƣơng tính: hồng cầu phải chìm hoàn toàn xuống tâm đáy lỗ khay). Hiệu giá kháng thể là độ pha loãng cao nhất của huyết thanh mà ở đó còn thấy ngăn trở đƣợc ngƣng kết (hồng cầu chìm xuống đáy lỗ). 1.5. Các phƣơng pháp kháng thể đánh dấu Các phƣơng pháp kháng thể đánh dấu gồm phƣơng pháp miễn dịch huỳnh quang, miễn dịch phóng xạ, miễn dịch enzym và miễn dịch ferritin. Phƣơng pháp cuối cùng áp dụng với kính hiển vi điện tử để kiểm tra cấu trúc phân tử trên bề mặt tế bào hoặc tổ chức nhờ mật độ điện tử cao của ferritin, không phổ biến trong chẩn đoán. Bản chất các phƣơng pháp này là sử dụng các kháng thể (thƣờng là kháng thể đơn dòng) đƣợc gắn kết (đánh dấu) với một chất phát huỳnh quang (kháng thể đánh dấu huỳnh quang), hoặc chất phóng xạ (kháng thể đánh dấu phóng xạ), hoặc một enzym chuyển hóa làm cơ chất không màu phát màu (kháng thể đánh dấu enzym). Chúng còn đƣợc gọi chung là conjugat (conjugate). Ta có conjugat trực tiếp nếu đó là kháng thể đặc hiệu epitop của mầm bệnh hay đối tƣợng cần nghiên cứu, hoặc là conjugat gián tiếp nếu đó là kháng thể đặc hiệu gamma-globulin của loài động vật cần nghiên cứu. Phản ứng miễn dịch huỳnh quang trực tiếp bắt đầu bằng việc cố định kháng nguyên cần kiểm lên phiến kính hiển vi (thƣờng bằng aceton lạnh), sau đó phủ conjugat trực tiếp 30 phút trong buồng ẩm. Rửa bằng nƣớc rồi soi kính hiển vi huỳnh quang (trong tối) với bức xạ kích thích thích hợp với thuốc nhuộm huỳnh quang gắn conjugat, nếu thấy tiêu bản phát màu huỳnh quang đặc hiệu là kết quả dƣơng tính. Phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp bắt đầu bằng việc cố định kháng nguyên chuẩn nếu để phát hiện kháng thể (hoặc kháng nguyên cần kiểm) lên phiến kính hiển vi, sau đó phủ huyết thanh cần kiểm (hoặc kháng huyết thanh chuẩn), cho tiếp xúc 30 phút ở trong buồng ẩm, rửa bằng nƣớc rồi lại phủ bằng conjugat huỳnh quang gián tiếp chống gamma- globullin loài cho huyết thanh lần phủ trƣớc. Sau 30 phút tiếp xúc lại rửa, để khô và hiển vi huỳnh quang. Kết quả dƣơng tính tƣơng tự phƣơng pháp miễn dịch huỳnh quang trực tiếp. Tuy nhiên, phƣơng pháp gián tiếp có độ
112 nhạy cao hơn và tiện hơn do có thể nghiên cứu kháng nguyên lẫn nghiên cứu kháng thể. Phản ứng miễn dịch phóng xạ sử dụng conjugat phóng xạ. Tiến trình cũng bắt đầu bằng việc cố định (trên phiến kính hoặc trên màng), phủ và rửa tƣơng tự phản ứng miễn dịch huỳnh quang. Tuy nhiên, kết quả phản ứng đƣợc đọc nhờ ép bản phản ứng lên một phim X-quang, để khoảng 30 - 60 phút thì rửa hiển thị phim. Vệt đen trên phim tƣơng ứng vị trí tiêu bản cho phép kết luận kết quả dƣơng tính. Cũng có thể đọc kết quả nhờ ống đo phóng xạ (scintillation counter) bằng cách cho tiêu bản tiếp xúc với đầu dò đọc của thiết bị. Phản ứng miễn dịch enzym gồm nhiều biến thể, sử dụng khay nhựa polystyren để hấp phụ protein (ELISA) hoặc cố định protein lên màng nitrocelluloza hay nylon (immunoanalysis, hay Western analysis). Các biến thể này đều có thể sử dụng conjugat trực tiếp lẫn conjugat gián tiếp. Phản ứng trực tiếp chỉ phát hiện đƣợc kháng nguyên trong khi phản ứng gián tiếp phát hiện đƣợc cả kháng nguyên (nếu có kháng thể đặc hiệu) và kháng thể (nếu có kháng nguyên đặc hiệu). Phƣơng pháp ELISA trực tiếp bắt đầu từ việc cố định (hấp phụ) protein kháng nguyên cần kiểm lên đáy và thành của lỗ khay chuyên dụng (khay ELISA) nhờ phản ứng kiềm của môi trƣờng trong một đêm. Sau khi rửa khay bằng dung dịch PBS (3 lần, có pha Tween 20 ở mức 0,5%), khay đƣợc phủ bổ sung bằng dung dịch protein huyết thanh bê hoặc albumin trứng (blocking), rửa lại rồi cho conjugat trực tiếp tiếp xúc kháng nguyên trong khoảng 1 giờ, rửa rồi cho dung dịch cơ chất của enzym vào lỗ. Nếu phản ứng kháng nguyên - kháng thể dƣơng tính, cơ chất enzym sẽ chuyển từ không màu sang có màu và có thể đo đƣợc bằng quang phổ kế. Phản ứng chuyển màu có thể dừng bằng dung dịch NaOH hoặc H2SO4. Enzym có thể là phosphataza kiềm hoặc peroxidaza. Cơ chất enzym có thể là tetramethyl benzidin hoặc axit 5-aminosalicylic đối với enzym peroxidaza. Các chất này đều phải pha mới và pha thêm H2O2 3% trƣớc khi dùng hiển thị phản ứng. Phƣơng pháp ELISA trực tiếp còn có thể thực hiện dƣới dạng phản ứng sandwich ("bánh mỳ kẹp thịt"), khi đó lỗ khay đƣợc gắn sẵn kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên cần kiểm để tăng hiệu quả gắn kết kháng nguyên với lỗ khay. Đầu tiên cho kháng nguyên tiếp xúc với kháng thể gắn trong lỗ khay khoảng 30 phút rồi rửa các lỗ khay. Tiếp theo sau là phủ lỗ khay bằng conjugat đặc hiệu và các bƣớc rửa và hiển thị nhƣ đã mô tả ở
113 trên. Trong lỗ khay cho phản ứng dƣơng tính nhƣ vậy có ba lớp, một lớp kháng nguyên giữa hai lớp kháng thể, nên phƣơng pháp đƣợc gọi là "bánh mỳ kẹp thịt". Phƣơng pháp ELISA gián tiếp sử dụng conjugat gián tiếp, tức là kháng thể đặc hiệu với gamma-globulin loài cung cấp kháng huyết thanh đặc hiệu (trong phát hiện kháng nguyên) hoặc huyết thanh cần kiểm (trong phát hiện kháng thể) đƣợc đánh dấu enzym. Tƣơng tự phƣơng pháp ELISA trực tiếp, trong phƣơng pháp ELISA gián tiếp để phát hiện kháng nguyên ban đầu ngƣời ta cố định dịch bệnh phẩm hay kháng nguyên (hấp phụ trong dịch pH cao, thƣờng qua đêm) vào lỗ khay, rửa rồi phủ bổ sung (blocking) bằng dịch protein (không kháng thể, ở nhiệt độ thấp). Sau đó phủ kháng nguyên bằng kháng huyết thanh đặc hiệu mầm bệnh, rửa rồi lại phủ bằng dịch conjugat gián tiếp. Sau khi rửa kỹ, phủ lỗ khay bằng cơ chất enzym thích hợp. Phản ứng màu giúp ta xác định sự hiện diện của kháng nguyên đặc hiệu. Để phát hiện kháng thể bằng phƣơng pháp ELISA gián tiếp, cần cố định kháng nguyên đặc hiệu vào lỗ khay, hấp phụ bổ sung bằng protein không kháng thể, sau khi rửa ngƣời ta cho huyết thanh cần kiểm vào cho tiếp xúc với kháng nguyên. Sau bƣớc rửa, cho dịch conjugat gián tiếp, lại rửa kỹ rồi cho cơ chất enzym thích hợp để hiển thị. Phản ứng phát màu của cơ chất giúp ta xác nhận sự hiện diện của kháng thể đặc hiệu trong huyết thanh cần kiểm. 1.6. Phƣơng pháp điện di miễn dịch Đây là phƣơng pháp kiểm tra sự hiện diện kháng thể đặc hiệu virut có bề mặt tích điện âm mạnh và virut tích điện âm mạnh. Nếu cho kháng nguyên và huyết thanh cần kiểm đƣợc điện di song song trong một bản keo (gel) agarose hoặc agar thì nếu trong huyết thanh có kháng thể đặc hiệu sẽ xuất hiện vết kết tủa ở dải giữa hai làn điện di. Phƣơng pháp này thƣờng để kiểm tra bệnh cảm nhiễm virut Aleutian ở chồn mink. 2. Chẩn đoán bằng phản ứng quá mẫn muộn Phản ứng quá mẫn muộn để phát hiện miễn dịch tế bào ở trong cơ thể và vận dụng với một số bệnh thú y hình thành miễn dịch tế bào nhƣ bệnh lao, bệnh tỵ thƣ, bệnh Johne (á lao) và bệnh sẩy thai truyền nhiễm. Lấy dịch chiết từ lứa cấy tế bào vi khuẩn nuôi cấy lâu ngày ta đƣợc "dị ứng nguyên quá mẫn muộn", với bệnh lao gọi là tubercullin, với bệnh sẩy thai
114 truyền nhiễm là brucellin, với bệnh tỵ thƣ là mallein và với bệnh Johne là johnin. Ngoài ra phản ứng này còn thực hiện với bệnh sán lá gan, sán nang (Echinococcus), bệnh cảm nhiễm Toxoplasma, bệnh cảm nhiễm nấm Histoplasma và bệnh nấm sợi của da (do Trichophyton),... Các phản ứng này phát hiện cảm nhiễm trong quá khứ nhƣng nhiều khi là bệnh đang tiến triển. Tiêm tubercullin vào trong da (nội bì) nếu phản ứng dƣơng tính ta thấy chỗ tiêm viêm tấy đỏ và cứng vào khoảng 72 giờ. Các dị ứng nguyên quá mẫn muộn khác cũng có thể áp dụng và cho kết quả tƣơng tự. Ngoài ra, ở động vật để tiện thực hiện, phản ứng có thể là dƣới da (tiêm kháng nguyên vào dƣới da), trong mắt (nhỏ kháng nguyên vào niêm mạc mắt). Phản ứng dƣới da có thể xác định kết quả nhờ đo độ dày chỗ da bị tiêm trƣớc khi tiêm và sau khi tiêm 1 - 3 ngày và có thể vận dụng với hầu hết tất cả các bệnh nêu trên. Riêng bệnh tỵ thƣ ở ngựa phản ứng trong mắt khá tiện lợi, buộc ngựa cần kiểm tra vào chỗ tránh gió lùa, nhỏ kháng nguyên vào một mắt để mắt kia làm đối chứng âm. Phản ứng dƣơng tính biểu hiện viêm kết mạc mắt (sau một ngày) kèm theo dòng ghèn trắng đục, nhầy và dính chảy ra từ khóe mắt. IV. Chẩn đoán phân tử thông qua phân tích gen 1. Phương pháp lai phân tử (hybridization) Các phƣơng pháp lai phân tử (hybridization) có nguyên lý chung là nếu ADN hai sợi và ARN hai sợi đƣợc biến tính bởi nhiệt hoặc kiềm thì trở thành một sợi. Nếu hỗn hợp axit nucleic một sợi này với axit nucleic một sợi khác thì khi gặp điều kiện nhiệt độ nhất định các đoạn axit nucleic một sợi có trình tự nucleotid tƣơng bổ sẽ kết hợp với nhau nhờ liên kết hydro. Vì hình thành axit nucleic lai tạp (hybrid) nên phƣơng pháp đƣợc gọi là hybridization (phƣơng pháp lai, để thuận tiện tron g tiếng Việt thƣờng gọi lai phân tử). Với nguyên lý này, nếu có một đoạn ADN hoặc ARN có trình tự nucleotid đặc hiệu virut hoặc vi khuẩn ta có thể đánh dấu bằng (cho kết hợp với) đồng vị phóng xạ, biotin, hoặc digoxygenin rồi kiểm tra xem nó có lai với ADN hoặc ARN (ở trạng thái một sợi) trong bệnh phẩm hay không ta có thể phát hiện đƣợc sự hiện diện của mầm bệnh trong bệnh phẩm. ADN hoặc ARN một sợi đƣợc đánh dấu gọi là "dò" hay "mẫu dò" (probe). Phƣơng pháp kiểm xuất biotin lợi dụng avidin và phƣơng pháp kiểm xuất digoxygenin lợi dụng kháng thể đánh dấu enzym,... là những
115 phƣơng pháp phi phóng xạ đƣợc khai phát đã làm các phƣơng pháp lai phân tử trở nên khả thi trong chẩn đoán. Các phƣơng pháp này so với dùng đồng vị phóng xạ có nhiều lợi điểm nhƣ khả năng bảo quản dò đƣợc lâu và có thể áp dụng trong các phòng thí nghiệm thông thƣờng, không lo ô nhiễm phóng xạ nên có thể tiếp xúc dễ dàng. Tuy nhiên do có độ nhạy thấp so với phƣơng pháp PCR (sau đây) nên chúng chỉ đƣợc sử dụng trong việc đồng định hoặc định typ vi sinh vật đã phân lập thuần khiết. Phƣơng pháp lai phân tử thông thƣờng cần cố định axit nucleic có trong bệnh phẩm lên màng nylon hoặc nitrocelluloza rồi cho phản ứng với dò đặc hiệu. Sau đó rửa bỏ các thành phần (kể cả dò) không gắn kết do không có trình tự tƣơng bổ đặc hiệu với axit nucleic đã cố định và cho hiển thị dò đặc hiệu. Nếu không thấy đƣợc dò chứng tỏ không có sự tƣơng đồng trong trình tự nucleotid của dò và của axit nucleic đã cố định. Tùy thuộc vào phƣơng pháp cố định mà ta có những biến thể dƣới đây. 1.1. Lai khuẩn lạc (colony hybridization) Phƣơng pháp này dùng để đồng định vi khuẩn mầm bệnh đã phân lập hình thành khuẩn lạc trên môi trƣờng thạch. Đặt màng nylon lên mặt môi trƣờng thạch sẽ làm khuẩn lạc in lên màng, hoặc là lấy cặn vi khuẩn phết lên màng, sau đó bằng phƣơng pháp kiềm làm biến tính axit nucleic rồi cho phản ứng với dò. Do có thể không cần cấy chuyển và bồi dƣỡng thuần khiết nên có thể thực thi nhanh việc chẩn đoán. Tuy nhiên, do nhiều thành phần của tế bào nên phản ứng có thể bị trở ngại và làm việc phán định kết quả khó khăn. 1.2. Lai đốm (dot hybridization) Còn gọi là phƣơng pháp thẩm đốm (dot blot), phƣơng pháp này bắt đầu bằng việc chiết xuất axit nucleic từ bệnh phẩm rồi nhỏ giọt (đốm) lên màng và cố định axit nucleic trên đó rồi cho phản ứng với dò. Tuy cần nuôi cấy phân lập lứa cấy thuần vi khuẩn mầm bệnh nhƣng là phƣơng pháp nhanh chóng do sử dụng axit nucleic không cần tinh khiết đƣợc chiết xuất bằng phƣơng pháp đơn giản. 1.3. Lai Southern (Southern hybridization) Phân tử ADN cần kiểm có thể để nguyên hoặc đƣợc cắt bằng enzym hạn chế rồi điện di để phân đoạn trên gel agarose, sau đó chuyển các phân đoạn ADN từ gel sang màng nylon rồi cho phản ứng với dò. Bằng phƣơng pháp này có thể phân tích một cách chi tiết đoạn ADN nào
116 phản ứng với dò nên không chỉ dùng để đồng định mà còn sử dụng để giám biệt typ. Hơn nữa với các loại mầm bệnh có ADN lớn nhƣ vi khuẩn, nguyên trùng, ký sinh trùng,... thì sau khi phân cắt bằng enzym hạn chế rồi điện di thì số phân đoạn quá nhiều làm khó phân tích nhƣng với phƣơng pháp này có thể phân tích đƣợc các mô hình, hay kiểu dạng (pattern), do số phân đoạn phản ứng với dò trở nên hạn chế tức là chỉ những đoạn ADN đặc hiệu đƣợc hiển thị vị trí trong làn gel điện di. Sự khác biệt của các kiểu dạng của các đoạn cắt bởi enzym hạn chế phản ứng với dò đƣợc gọi là tính đa hình độ dài phân đoạn hạn chế (restriction fragment length polymorphism). 1.4. Lai khay vi thể (microplate hybridization) Chiết xuất axit nucleic từ vi sinh vật mầm bệnh, cho hấp phụ cố định vào đáy lỗ khay vi thể rồi cho phản ứng với dò. Nếu sử dụng phƣơng pháp kháng thể đánh dấu để phát hiện dò thì phƣơng pháp này tƣơng tự phản ứng ELISA, có thể phán định và xử lý kết quả tƣơng tự, đồng thời có thể xử lý chẩn đoán số lƣợng lớn mẫu bệnh phẩm. Hơn nữa, các axit nucleic từ vi khuẩn mầm bệnh không chỉ có ADN mà còn có ARN thông tin vốn rất nhiều trong tế bào cũng phản ứng với dò nên độ nhạy của phƣơng pháp cao. 2. PCR (Phản ứng chuỗi polymeraza) 2.1. Nguyên lý và ứng dụng PCR Phản ứng chuỗi polymeraza (PCR: polymerase chain reaction) là kỹ thuật dựa trên phản ứng tổng hợp ADN nhờ enzym DNA-polymeraza lặp đi lặp lại mà chỉ một đoạn nhất định của ADN đặc hiệu trong bệnh phẩm đƣợc tăng lƣợng. DNA-polymeraza (DNA-polymerase) là enzym lấy ADN một sợi làm khuôn để tổng hợp sợi ADN tƣơng bổ. Quá trình tổng hợp ADN đƣợc thực hiện nối dài một hƣớng từ đầu 5' đến đầu 3' và tại vị trí xuất phát của quá trình tổng hợp phải có mặt một đoạn ngắn ADN một sợi gọi là mồi (primer) tƣơng bổ với ADN khuôn. Nếu tổng hợp đƣợc hai mồi (một cặp) tƣơng bổ với hai vị trí trên hai sợi khác nhau của một ADN hai sợi và hƣớng của phản ứng từ một mồi ngƣợc với hƣớng phản ứng từ mồi kia, tức là kẹp một đoạn cần tăng lƣợng của ADN, thì nếu cho cặp primer với lƣợng gấp bội vào dịch chứa bệnh phẩm thì phản ứng DNA- polymeraza sẽ thực hiện lặp đi lặp lại nhiều lần. Kết quả là từ vị trí một mồi ADN đƣợc kéo dài rồi trong chu kỳ tiếp theo lại làm khuôn cho mồi có chiều ngƣợc lại tổng hợp kéo dài ADN đến quá vị trí của mồi trƣớc.
117 Quá trình tổng hợp lặp đi lặp với một cặp mồi làm cho chỉ đoạn ADN nằm giữa (tức đƣợc kẹp giữa) hai mồi đƣợc tăng lƣợng theo cấp số nhân. Nếu số chu kỳ nhiệt là 30 thì đoạn ADN này tăng là 230 (tức khoảng 109) lần. Để thực hiện phản ứng cần có DNA-polymeraza chịu nhiệt và thiết bị luân nhiệt (thermocycler) tự động hóa, và mỗi chu kỳ phản ứng phải qua ba bƣớc 1) biến tính ADN hai sợi thành một sợi bằng nhiệt (94 - 95 °C), 2) nhiệt độ thích hợp để mồi gắn vào trình tự nucleotid đặc hiệu của ADN bệnh phẩm và 3) nhiệt độ thích hợp phản ứng kéo dài chuỗi ADN nhờ DNA-polymeraza. Nhiệt độ chu kỳ 2) và 3) phụ thuộc vào thành phần nucleotid của mồi và khuôn nhƣng có thể vận dụng nhiệt độ gắn mồi khoảng 60 °C, nhiệt độ phản ứng kéo dài khoảng 70 °C. Thành phần dịch phản ứng gồm DNA-polymeraza chịu nhiệt (Taq polymerase), hỗn hợp deoxyribonucleotid triphosphat (dNTP, gồm 4 loại dATP, dTTP, dCTP và dGTP), cặp mồi (primer), dung dịch đệm và ADN khuôn (template DNA). Sản phẩm PCR đƣợc điện di để xác nhận độ dài đặc hiệu của ADN theo lý luận phải có, thƣờng nhờ điện di song song với ADN dấu phân tử lƣợng (molecular weight marker DNA). Đôi khi sản phẩm đƣợc lai Southern để kiểm tra tính đặc hiệu. Để điện di thƣờng dùng gel agarose 0,8% trong dung dịch đệm acetat-tris, nhuộm ADN bằng ethidium bromid (~50 g/ml) pha vào agarose trƣớc khi đổ bản gel hoặc pha vào dung dịch điện di sau khi điện di. Thời gian gần đây nhờ phát triển kỹ thuật chế primer đánh dấu huỳnh quang chỉ phát quang khi gắn kết vào ADN và thiết bị phân t ích huỳnh quang tự động ngƣời ta đã phát triển PCR thông thƣờng thành PCR thực thời (real-time PCR) với năng lực chẩn đoán và phân tích định lƣợng rất tiện lợi. Nhờ PCR có thể tăng lƣợng bất kỳ ADN nào có trong bệnh phẩm nên ta có thể chẩn đoán thông qua phát hiện sự hiện diện của gen đặc hiệu mầm bệnh mà không cần nuôi cấy phân lập mầm bệnh. Điều này làm cho việc chẩn đoán các mầm bệnh không nuôi cấy đƣợc trở nên khả thi. Phƣơng pháp PCR còn đƣợc phối hợp với các kỹ thuật sinh học phân tử khác trong nghiên cứu nhƣ mô tả dƣới đây. 2.2. PCR-RFLP (Phản ứng chuỗi polymeraza - đa dạng độ dài đoạn ngẫu nhiên) PCR-RFLP là phƣơng pháp so sánh các kiểu dạng (hay mô hình: pattern) các phân đoạn của sản phẩm PCR đƣợc phân cắt bởi enzym hạn chế đƣợc phân tách bằng điện di trong gel.
118 2.3. RT-PCR (Phản ứng phiên ngƣợc - chuỗi polymeraza) RT-PCR là phƣơng pháp kết hợp phản ứng tổng hợp ADN tƣơng bổ (cDNA) trên khuôn ARN nhờ enzym phiên ngƣợc (RT: reverse transcriptase) hay enzym tổng hợp ADN phụ thuộc ARN (RNA-dependent DNA-polymerase) sau đó ADN đƣợc tổng hợp nhờ cặp mồi đặc hiệu trong hàng loạt chu kỳ luân nhiệt tiếp theo. Nhờ phản ứng này genom của các virut ARN trở nên có thể tổng hợp bằng PCR. 2.4. PCR-SSCP (Phản ứng chuỗi polymeraza - đa dạng cấu hình lập thể chuỗi đơn) Nếu một ADN hai sợi đƣợc biến tính thành một sợi thì ADN một sợi phụ thuộc vào trình tự nucleotid mà có cấu trúc bậc cao khác nhau và đặc hiệu. Nếu điện di ADN một sợi này trong gel polyacrylamid phi biến tính có gia nhiệt thì các cấu trúc bậc cao khác nhau phản ứng khác nhau, tức cùng độ dài nhƣng dịch chuyển trong điện trƣờng với tốc độ khác nhau phụ thuộc vào cấu hình lập thể. Phƣơng pháp này gọi là phân tích đa dạng cấu hình lập thể chuỗi đơn (SSCP: single strand conformation polymorphism). Có thể phân biệt đƣợc tối thiểu 1 bazơ khác biệt tồn tại trong các đoạn ADN dài hàng trăm bazơ. Nếu áp dụng kỹ thuật phân tích này để phân tích sự sai khác có thể có trong trình tự nucleotid của các sản phẩm PCR thì phƣơng pháp này đƣợc gọi là PCR-SSCP. 2.5. RAPD (ADN sao chép ngẫu nhiên đa hình) ADN đa hình đƣợc khuyếch đại ngẫu nhiên (random amplified polymorphic DNA) còn gọi là tổ hợp mơ hồ tính đa hình độ dài khuyếch đại hay ALP-HA (amplified fragment length polymorphism hazy association), PCR đƣợc mồi ngẫu nhiên hay AP-PCR (arbitrarily primed PCR) hay lấy vân tay khuyếch đại ADN (DNA amplification fingerprinting),... Đây là phƣơng pháp đồng định mầm bệnh hoặc định typ nhờ sử dụng các cặp mồi có tính đặc hiệu tƣơng đối thấp hoặc mồi chế từ các trình tự lặp trong genom mầm bệnh để thực thi PCR, kết quả là có hàng loạt sản phẩm PCR với độ dài khác nhau đƣợc hình thành và nhờ điện di phân tách thành các băng dƣới dạng mã vạch tạo ra những mô hình (kiểu dạng) đặc trƣng. 3. Điện di axit nucleic Điện di axit nucleic chiết xuất từ mầm bệnh có thể sử dụng trong chẩn đoán. Phƣơng pháp này thƣờng áp dụng sau khi phân lập và đồng định vi sinh vật mầm bệnh và dùng để khu biệt dạng/typ huyết thanh học,
119 và đôi khi trong một dạng huyết thanh học cũng có thể tách biệt tiếp t hành những nhóm nhỏ hơn. Với trƣờng hợp virut ARN hai sợi phân đoạn nhƣ reovirut và rotavirut có thể phân biệt các virut thuộc các typ huyết thanh học khác nhau nhờ kiểu dạng điện di ARN phân đoạn. Với các virut ADN hai sợi nhƣ herpesvirut và adenovirut thì chiết xuất ADN, phân cắt bằng enzym hạn chế rồi điện di để phân biệt typ dựa vào kiểu dạng enzym hạn chế. Với vi khuẩn gây bệnh và plasmid đã đƣợc chiết xuất thì điện di, xác định độ lớn và số lƣợng, phân tích so sánh có thể phân biệt typ huyết thanh học và typ kháng thuốc. Những phân tích này còn có thể dùng để phân tích dịch tễ học xác định mối quan hệ giữa các vụ dịch. V. Phân tích dịch tễ học bệnh truyền nhiễm Khi nhận biết bệnh phát sinh trong tập đoàn động vật, việc truy tìm nguyên nhân phát sinh bệnh đó có ý nghĩa đối với việc khống chế và dự phòng bệnh. Quy trình nghiên cứu thực nghiệm xác định mầm bệnh đã đƣợc Koch phát biểu trong "Định đề Koch" gồm bốn điểm phải thỏa mãn. Tuy nhiên, trong thực tế, việc vận dụng định đề Koch không thể thực hiện đƣợc với nhiều loại bệnh khác nhau. Khi đó, các phƣơng pháp dịch (tễ) học (epidemiological study) là phƣơng pháp hữu hiệu có thể tuân thủ trong nghiên cứu mầm bệnh. Nghiên cứu dịch học bao gồm nhiều phƣơng pháp và có thể nhóm thành hai nhóm: 1) nghiên cứu dịch tễ học mô tả và 2) nghiên cứu dịch học phân tích. Điều tra bệnh trong tập đoàn gọi là điều tra dịch (tễ) học hay nghiên cứu dịch (tễ) học mô tả. Bên cạnh mô tả hiện tƣợng bệnh (mô tả ca bệnh, mô tả loạt ca bệnh), nghiên cứu dịch tễ học mô tả còn bao gồm quan sát các điều kiện mà bệnh tật hoặc trở ngại sức khỏe phát sinh. Để biết thực trạng bệnh tật nhất thiết phải biết bệnh phát sinh trong quần thể nhƣ thế nào, cho nên khi nắm bắt tình trạng bệnh trong quần thể cần biết những thông tin liên quan đến toàn bộ quần thể. Vì vậy, nghiên cứu mô tả thƣờng theo dõi tỷ lệ mới mắc, tỷ lệ hiện mắc hay lƣu hành bệnh so với tổng đàn, tỷ lệ chết, tuổi, giống, loài mắc, mùa vụ, thời gian, không gian mắc của bệnh, tập quán chăn nuôi, tỷ lệ động vật đã được tiêm phòng,... trong các nhóm đàn động vật và giải thích các đặc điểm phát sinh của bệnh trong quần thể động vật. Trên cơ sở những kết quả đó đƣa ra giả thuyết về nguyên nhân (mầm bệnh) và những điều kiện phát sinh bệnh. Giả thuyết này sẽ đƣợc dùng để làm cơ sở cho nghiên cứu dịch tễ học phân tích. Nghiên cứu phân tích có thể là nghiên cứu hồi cứu (còn gọi là nghiên cứu bệnh chứng - case-control study), trong đó lấy tập đoàn bệnh
120 và tập đoàn chứng không bệnh làm thành hai nhóm đối tƣợng và truy tìm khả năng tiếp xúc với yếu tố nguy cơ (mầm bệnh theo giả thuyết) nhƣ thế nào trong quá khứ. Khi có đƣợc một hệ số tƣơng quan thuận cao thì khả năng kết luận đúng về nguyên nhân bệnh là cao. Nghiên cứu phân tích cũng có thể là nghiên cứu theo dõi (còn gọi là nghiên cứu thuần tập - cohort study), trong đó ngƣời nghiên cứu ghi nhận hai nhóm động vật (cùng loài) có tiếp xúc và không tiếp xúc với yếu tố nguy cơ (theo giả thuyết) và theo dõi trong thời gian sau đó. Nghiên cứu này thƣờng đòi hỏi theo dõi kéo dài với số lƣợng động vật lớn để đạt độ tin cậy cao. Mối quan hệ nhân quả có thể là thuyết phục nếu hệ số tƣơng quan thuận cao. Nghiên cứu phân tích cũng còn có thể là nghiên cứu ngang (cross- sectional study) nghiên cứu các cá thể có mặt trong thời gian nghiên cứu và tất cả số liệu đƣợc thu thập trong thời gian nghiên cứu nhằm tìm ra mối liên hệ giữa hiện tƣợng bệnh và yếu tố nguy cơ (mầm bệnh, theo giả thuyết, đối với bệnh truyền nhiễm). Trong nghiên cứu ngang để có số liệu thuyết phục cần có những xét nghiệm có độ nhạy cũng nhƣ độ đặc hiệu cao (phân lập và đồng định mầm bệnh, xét nghiệm kháng thể đặc hiệu, xét nghiệm kháng nguyên đặc hiệu, xác nhận ADN hay ARN đặc hiệu,...). Tƣơng tự các nghiên cứu phân tích khác, quan hệ nhân quả là thuyết phục nếu hệ số tƣơng quan thuận cao. Dƣới đây trình bày một số phương pháp phân tích số liệu dịch tễ học để xác nhận mối quan hệ nhân quả (bệnh - mầm bệnh) và đánh giá hiệu quả của biện pháp (phòng bệnh bằng một vacxin nào đó,...) ứng dụng trong thực tiễn thú y. Phân tích nghiên cứu bệnh - chứng: Sau khi quan sát mô tả và hình thành một giả thuyết nhân quả giữa bệnh và một yếu tố nguy cơ ta có thể xác nhận quan hệ nhân quả giả thuyết đó. Căn cứ vào giả thuyết nhân quả đó, nghiên cứu bệnh chứng tiến hành phân tích nhằm tìm ra đƣợc sự khác biệt giữa nhóm bệnh và nhóm không bệnh trong quan hệ với yếu tố đƣợc giả thiết là nguyên nhân (yếu tố mầm bệnh). Phân tích nghiên cứu bệnh - chứng là so sánh tần số cảm nhiễm một yếu tố (đƣợc coi là) nguy cơ ở nhóm bệnh và nhóm chứng đƣợc lấy ngẫu nhiên để tính toán về mối kết hợp này. Số liệu dịch tễ học đƣợc thể hiện ở dƣới dạng bảng liên thông, nhƣ sau:
121 Bệnh Không bệnh Bộc lộ với yếu tố nguy cơ a b a+b Không bộc lộ c d c+d Cộng a+c b+d a+b+ c+d Trong đó: a là số động vật bị bệnh mà ta hồi cứu thấy có tiếp xúc yếu tố nguy cơ, b là số động vật không bệnh nhƣng có tiếp xúc yếu tố nguy cơ, c là số động vật bệnh nhƣng không tiếp xúc yếu tố nguy cơ, d là số động vật không bệnh cũng không tiếp xúc yếu tố nguy cơ, a+b là tổng số cảm nhiễm yếu tố nguy cơ, c+d là tổng số không cảm nhiễm yếu tố nguy cơ, a+c là tổng số động vật mắc bệnh, b+d là tổng số động vật không mắc bệnh. Đại lƣợng nguy cơ tƣơng đối (relative risk) RR=[a/(a+b)]/[c/(c+d)] =a(c+d)/c(a+b) là đại lƣợng giúp xác định mức độ kết hợp giữa bệnh và bộc lộ với yếu tố nguy cơ. RR>1 nói lên rằng có sự liên quan giữa bệnh và yếu tố nguy cơ, RR=1 cho thấy không có sự liên quan giữa bệnh và cảm nhiễm yếu tố nguy cơ, còn RR1 nói lên sự kết hợp và giá trị này càng cao thì sự kết hợp càng mạnh. OR=1 cho thấy không có sự liên quan giữa bệnh và cảm nhiễm yếu tố nguy cơ, còn OR
122 Tƣơng tự nhƣ trên, đại lƣợng nguy cơ tƣơng đối RR=[a/(a+b)]/[c/(c+d)] =a(c+d)/c(a+b) cũng là đại lƣợng giúp xác định mức độ kết hợp giữa bệnh và bộc lộ với yếu tố nguy cơ. RR>1 nói lên rằng có sự liên quan giữa bệnh và yếu tố nguy cơ, RR=1 cho thấy không có sự liên quan giữa bệnh và cảm nhiễm yếu tố nguy cơ, còn RR1 nói lên sự kết hợp và giá trị này càng cao thì sự kết hợp càng mạnh, tức yếu tố nguy cơ (mầm bệnh) giả thuyết là nguyên nhân của bệnh là có xu hƣớng khẳng định. Đánh giá ảnh hưởng của tiêm vacxin đối với tỷ lệ mắc bệnh: là một trong những bài toán thực tiễn đòi hỏi ngay cả khi vacxin đã đƣợc nhà sản xuất thực nghiệm và khuyến cáo sử dụng. Một trong những phƣơng pháp là phân tích tính phụ thuộc giữa tỷ lệ gia súc đƣợc tiêm vacxin và tỷ lệ mắc bệnh (sau khi vacxin theo lý luận phải có hiệu lực) hàng năm. Ví d ụ dữ liệu thu thập đƣợc 10 năm (1990 - 1999) trong bảng sau giúp ta giải quyết vấn đề này. Năm 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 Tỷ lệ tiêm vacxin (%) 55 57 63 64 62 68 71 75 74 77 Tỷ lệ mắc bệnh (%) 1,8 1,7 2,1 1,6 1,2 1,4 0,9 0,8 0,8 0,6 Có một số phƣơng pháp xác định mối phụ thuộc giữa hai dãy số liệu trên. Trong đó, phƣơng pháp xác định hệ số liên quan thứ bậc rrange là phƣơng pháp khá tiện lợi. Hệ số liên quan thứ bậc rrange = 1-{6∑d2/[(n(n- 1)(n+1)]} mang giá trị từ -1 đến +1. Giá trị dƣơng chỉ mối tƣơng quan thuận, tức cùng tăng cùng giảm, giá trị âm chỉ mối tƣơng quan nghịch. Giá trị từ 0 đến 0,5 chỉ mối phụ thuộc yếu, từ 0,5 đến 0,8 chỉ mức trung bình, lớn hơn 0,8 đến 1 chỉ mối quan hệ phụ thuộc mạnh. Trƣớc hết cần lập bảng xác định thứ bậc, nhƣ sau: Tỷ lệ Số thứ tự bậc Tỷ lệ tiêm d2 Năm bệnh Y d (=X-Y) X (%) X Y (%) 1990 55 1,8 10 2 +8 64 91 57 1,7 9 3 +6 36 92 63 2,1 7 1 +6 36 93 64 1,6 6 4 +2 4 94 62 1,2 8 6 +2 4
123 95 68 1,4 5 5 0 0 96 71 0,9 4 7 -3 9 97 75 0,8 2 8 -6 36 98 74 0 ,8 3 9 -6 36 99 77 0,6 1 10 -9 81 ∑d2=306 Hệ số liên quan thứ bậc rrange =1-{6×306/(10×9×11)}=1-1,85=- 0,85. Điều này nghĩa là tỷ lệ tiêm phòng bằng vacxin và tỷ lệ mắc bệnh có mối tƣơng quan nghịch mạnh. Hay nói cách khác, tiêm vacxin giảm đáng kể tỷ lệ mắc bệnh ở gia súc. Đánh giá so sánh hiệu giá kháng thể các tập đoàn: Phƣơng pháp phân tích này áp dụng khi thử nghiệm hai hay nhiều loại vacxin dự phòng cùng một bệnh. Khi đó số mẫu thu thập đƣợc cần phải xét nghiệm bằng cùng một phƣơng pháp thậm chí trong nhiều trƣờng hợp phải đƣợc xử lý bằng một lô kháng nguyên đặc hiệu nhất định trong cùng một đợt xét nghiệm để bảo đảm tính so sánh. Nguyên nhân của điều kiện này là do kết quả xét nghiệm xác định hiệu giá kháng thể phụ thuộc vào nồng độ của epitop kháng nguyên tham gia phản ứng. Nồng độ epitop kháng nguyên chuẩn cao làm giảm kết quả hiệu giá vì phản ứng thể hiện rõ khi tỷ số giữa "hóa trị" của kháng nguyên và của kháng thể xung quanh giá trị 1. Từ số liệu hiệu giá kháng thể của hai tập đoàn thu thập đƣợc, chỉ số có thể dùng để so sánh là giá trị trung bình nhân hiệu giá (GMT: geometric mean titre). Giá trị trung bình cộng các hiệu giá không thể dùng để đánh giá hiệu quả đáp ứng miễn dịch vì, chẳng hạn, nếu trong một nhóm 10 cá thể đƣợc nghiên cứu chỉ có một cá thể có hiệu giá cao (103) còn 9 cá thể khác không có kháng thể, trong khi đó ở nhóm khác cả 10 cá thể đều có hiệu giá kháng thể vừa đủ bảo vệ (102) thì trung bình cộng hiệu giá của hai nhóm là bằng nhau. Mặc dù vậy, nếu công cƣờng độc bằng mầm bệnh tƣơng ứng thì chỉ một cá thể thuộc nhóm thứ nhất đƣợc bảo vệ trong khi ở nhóm thứ hai cả 10 cá thể đều miễn dịch. Giá trị trung bình nhân hiệu giá kháng thể đƣợc tính theo công thức: GMT= (T1×T2×...×Tn)1/n. Trên thực tế để tiện phân tích và tránh cho vế phải bằng không (0) ngƣời ta vận dụng lôgarit hóa cả hai vế. Khi đó, logGMT=(logT1+logT2+...logTn)/n; trong đó T1, T2,... và Tn là các hiệu giá riêng rẽ. Chú ý khi đọc kết quả phản ứng cần gán cho các mẫu âm tính hoàn toàn (với huyết thanh nguyên, không pha) giá trị logT=-1, còn mẫu huyết thanh cho kết quả dƣơng tính chỉ khi không pha loãng có giá trị logT=0 (tức a0=1). Bằng phép đối lôgarit xác định đƣợc giá trị GMT. Chú
124 ý rằng trong các thí nghiệm dạng này cần phải thực hiện xét nghiệm với mẫu huyết thanh không pha loãng để tránh sai số do bỏ mất các giá trị logT=-1. Tuy nhiên, giá trị này có thể bỏ qua khi nghiên cứu tập đoàn lớn vẫn bảo đảm ý nghĩa so sánh. CÂU HỎI ÔN TẬP CHƢƠNG 3 1. Chẩn đoán là gì? đặc điểm chẩn đoán bệnh truyền nhiễm? 2. Các bƣớc trong hẩn đoán bệnh nguyên học? 3. Kiểm nghiệm thể bệnh nguyên có khác phân lập và đồng định bệnh nguyên? 4. Phân lập và đồng định vi khuẩn mầm bệnh? 5. Phân lập và đồng định virut mầm bệnh? 6. Mục đích của phƣơng pháp huyết thanh học? Phƣơng pháp huyết thanh học trong kiểm nghiệm thể bệnh nguyên và đồng định mầm bệnh có gì khác nhau? 7. Phản ứng kết tủa? 8. Phản ứng ngƣng kết? 9. Phản ứng cố định bổ thể? 10. Phản ứng HI (ngăn trở ngƣng kết hồng cầu)? 11. Các phƣơng pháp kháng thể đánh dấu? 12. Phản ứng quá mẫn muộn? 13. Các phƣơng pháp lai phân tử (hybridization)? 14. Nguyên lý và ứng dụng PCR? 15. Các chỉ tiêu của nghiên cứu dịch (tễ) học mô tả? 16. Các phƣơng pháp nghiên cứu dịch tễ học phân tích?
125 CHƢƠNG 4 PHÒNG CHỐNG BỆNH TRUYỀN NHIỄM I. Các phương pháp phòng bệnh truyền nhiễm 1. Nguyên tắc chung của công tác phòng chống dịch bệnh truyền nhiễm Nguyên lý công tác phòng chống dịch bệnh truyền nhiễm là vận dụng những kiến thức về ba pha của chu trình truyền lây mầm bệnh và các giai đoạn của quá trình sinh dịch vào công tác thực tiễn. Bệnh truyền nhiễm xảy ra đƣợc là do ba khâu của quá trình sinh dịch: nguồn bệnh, các nhân tố trung gian truyền bệnh và động vật cảm thụ, và sự liên hệ giữa ba khâu đó. Thiếu một trong ba khâu hoặc thiếu sự liên hệ giữa hai trong ba khâu đó thì dịch không xảy ra đƣợc. Nguồn bệnh là khâu đầu tiên và chủ yếu, là xuất phát điểm của quá trình sinh dịch. Nhân tố trung gian truyền bệnh nối liền nguồn bệnh với cơ thể cảm thụ làm cho quá trình sinh dịch thực hiện thuận lợi. Động vật cảm thụ là yếu tố làm cho dịch biểu hiện ra, đồng thời nó lại biến thành nguồn bệnh làm cho quá trình sinh dịch đƣợc nhân lên, đƣợc thúc đẩy mạnh hơn. Trên cơ sở phân tích vai trò và sự liên hệ giữa các khâu trên, công tác phòng chống bệnh truyền nhiễm phải nhằm thực hiện cho đƣợc việc xóa bỏ một hoặc nhiều khâu, hoặc cắt đứt sự liên hệ giữa các khâu với nhau trong quá trình sinh dịch. Chỉ cần cắt đứt một khâu hoặc cắt đứt sự liên hệ giữa những hai khâu, cũng đủ làm cho quá trình sinh dịch không thực hiện được. Đó là nguyên lý cơ bản của mọi biện pháp phòng chống bệnh. Đƣơng nhiên, chỉ giải quyết đƣợc một cách căn bản việc đó khi nhận thức của con ngƣời đƣợc nâng cao. Khi chƣa có dịch các biện pháp phòng bệnh truyền nhiễm đều nhằm đề phòng dịch xuất hiện. Chủ chăn nuôi, chủ động vật chuyên chở phải chấp hành các yêu cầu thực hiện các biện pháp phòng dịch đƣợc quy định trong Pháp lệnh thú y, các Nghị định thi hành Pháp lệnh và Điều lệ phòng chống dịch bệnh cho động vật, trong đó việc xây dựng vùng, cơ sở an toàn dịch bệnh là trách nhiệm của mọi cá nhân, tổ chức và cơ quan quản lý nhà nƣớc liên quan ngành chăn nuôi. Các cá nhân và tổ chức chăn nuôi động vật phải đăng ký xây dựng vùng, cơ sở an toàn dịch bệnh động vật và phải chấp hành các quy định của pháp luật về thú y đối với vùng, cơ sở an toàn dịch bệnh động vật. Các tổ chức, cá nhân có hoạt động liên quan vùng an toàn dịch bệnh động vật phải chấp hành các quy định của pháp luật về
126 thú y đối với vùng, cơ sở an toàn dịch bệnh động vật. Chính phủ có chƣơng trình quốc gia về khống chế, thanh toán một số bệnh truyền nhiễm nguy hiểm của động vật, nhằm bảo đảm hiệu quả khống chế và thanh toán các dịch bệnh nguy hiểm của động vật và những bệnh từ động vật lây sang ngƣời, đáp ứng yêu cầu xuất khẩu động vật và sản phẩm động vật, bảo đảm giảm dần số ổ dịch, số động vật mắc bệnh, tiến tới thanh toán dịch bệnh. Trong việc xây dựng chƣơng trình này Chính phủ có chỉ đạo các các bộ, ngành có liên quan phối hợp Bộ Nông nghiệp và PTNT và Bộ Thủy sản trong việc xây dựng chƣơng trình quốc gia về khống chế, thanh toán dịch bệnh động vật. Bộ Nông nghiệp và PTNT và Bộ Thủy sản xây dựng chƣơng trình quốc gia về khống chế, thanh toán dịch bệnh động vật trình Chính phủ phê duyệt và chỉ đạo thực hiện chƣơng trình. Các cơ quan quản lý nhà nƣớc về thú y ở trung ƣơng (Cục Thú y đối với dịch bệnh động vật trên cạn và Cục Quản lý chất lƣợng, an toàn vệ sinh và thú y thủy sản đối với dịch bệnh động vật dƣới nƣớc và lƣỡng cƣ), UBND các cấp, Chi cục Thú y và Chi cục Quản lý chất lƣợng, an toàn vệ sinh và thú y thủy sản, các tổ chức và cá nhân chăn nuôi động vật tùy theo quyền hạn và trách nhiệm của mình có trách nhiệm hƣớng dẫn thực hiện, thanh tra, kiểm tra và đánh giá việc thực hiện, tổ chức thực hiện, tuyên truyền phổ biến hƣớng dẫn và thực hiện các biện pháp khống chế, thanh toán dịch bệnh động vật. Khi dịch đã xuất hiện, muốn phòng bệnh lây lan rộng thì cần thực hiện các biện pháp chống dịch nhằm dập tắt dịch, bao gồm, một mặt, tiêu diệt nguồn bệnh (điều trị bệnh cho các động vật bệnh hoặc giết hủy hay giết mổ bắt buộc động vật bệnh) và, mặt khác, phòng bệnh cho các động vật chƣa mắc bệnh. Các biện pháp phòng dịch và biện pháp chống dịch liên quan mật thiết với nhau. Các biện pháp tiêu diệt nguồn bệnh một mặt là để thanh toán dịch nhƣng đồng thời cũng bảo đảm cho động vật khỏe không bị lây bệnh nên phòng ngừa dịch lan rộng. Các biện pháp phòng bệnh truyền nhiễm ở nƣớc ta đã đƣợc quy định trong Điều lệ phòng chống dịch bệnh cho gia súc và gia cầm trƣớc đây và Pháp lệnh thú y hiện nay, cũng nhƣ các văn bản liên quan do Nhà nƣớc ban hành. Để thực hiện các biện pháp phòng dịch cần thực hiện những biện pháp tổng hợp tác động đến nhiều khâu của quá trình phát sinh dịch: đối với nguồn bệnh (vật mang trùng khi chƣa có dịch, cũng nhƣ vật mang trùng và vật bệnh khi có dịch), đối với đƣờng truyền lây và đối với động vật mẫn cảm.
127 2. Đối sách đối với nguồn bệnh 2.1. Với vật mang trùng Đối với nguồn bệnh phải tiêu diệt hoặc hạn chế nguồn bệnh gieo rắc mầm bệnh ra ngoài. Khi chƣa có dịch phát ra, nguồn bệnh chỉ có thể là những vật mang trùng. Khi đó, đối với vật mang trùng cần phải thực hiện các biện pháp dƣới đây. Phát hiện sớm, chủ động và tích cực. Phải có kế hoạch định kỳ phát hiện vật mang trùng. Phát hiện động vật mang trùng rất khó. Có thể dùng phƣơng pháp vi sinh vật học để xét nghiệm các chất bài tiết, bài xuất,... nhƣng kết quả thƣờng không chắc chắn vì con vật mang trùng chỉ bài xuất mầm bệnh một cách định kỳ. Có thể dùng phƣơng pháp huyết thanh học phát hiện kháng thể và kháng nguyên đặc hiệu trong một khoảng thời gian nhất định. Tuy nhiên, cần chú ý rằng các phản ứng huyết thanh học phát hiện kháng thể tuy dễ thực hiện nhƣng kết quả thƣờng khó giải thích. Phát hiện kháng nguyên đặc hiệu thƣờng dễ giải thích hơn nhƣng việc thực hiện thƣờng khó hơn do phản ứng thƣờng có độ nhạy thấp hơn và sự bài xuất mầm bệnh (kháng nguyên) từ vật sống mang trùng không phải khi nào cũng xảy ra. Mầm bệnh có thể phát hiện một cách tƣơng đối chắc chắn hơn nhờ phƣơng pháp chẩn đoán dị ứng đối với những bệnh có phản ứng dị ứng nhƣ lao, tỵ thƣ, sẩy thai truyền nhiễm,... Phƣơng pháp cho kết quả nhanh và nhạy hơn cả là các phƣơng pháp phân tích axit nucleic đặc hiệu mầm bệnh (PCR, RT-PCR, PCR-RFLP,...) nhƣng cũng còn nhiều trở ngại do sự bài xuất mầm bệnh từ vật mang trùng không ổn định, xét nghiệm lại đòi hỏi tuyệt đối không đƣợc bị ô nhiễm từ những xét nghiệm cũ trƣớc đó và, vì vậy, thƣờng đắt tiền. Vì vậy, phát hiện kháng nguyên bằng các phản ứng huyết thanh học trực tiếp từ bệnh phẩm hoặc từ lứa cấy vi sinh vật mầm bệnh đã đƣợc phân lập còn tiếp tục có thể là biện pháp đƣợc lựa chọn trong điều kiện hiện nay. Cách ly triệt để những con vật đã phát hiện có mang trùng. Ở nhiều nƣớc, những con vật có phản ứng dƣơng với bệnh lao, sẩy thai truyền nhiễm, tỵ thƣ đƣợc tập trung thành đàn và nuôi riêng trong những trang trại cách ly. Nếu số lƣợng động vật mang trùng ít thì có thể giết thịt. Việc cách ly con vật mang trùng với con khỏe ở nƣớc ta còn gặp nhiều khó khăn. Tuy nhiên, các cơ sở chăn nuôi tập trung bắt buộc phải có khu chuồng nuôi cách ly. Nông hộ có thể vận dụng biện pháp cách ly gián tiếp nhƣ khi mua thịt chợ đƣa về nhà trong mọi trƣờng hợp loại bỏ một cách triệt để lá hoặc giấy bao gói hoặc thực phẩm nguồn gốc động vật khác mua