Giáo trình CÔNG NGHỆ DNA TÁI TỔ HỢP - Chương 2

Chia sẻ: Doc Tai | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:25

Thêm vào BST

Báo xấu

165
lượt xem 53
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Chương 2 Điện di gel I. Nguyên lý chung đại thước/ được dùng để phân tách và một đôi khi để tinh sạch -đặc biệt là các protein và acidkích , và cấu hình . Khi các phân tử tích điện được đặt trong một điện trường, chúng sẽ dịch chuyển hướng đến cực dương (+) hoặc cực âm (-) tùy theo điện tích của chúng. Ngược với protein, loại phân tử có điện tích thực hoặc dương hoặc âm, các nucleic acid có một điện tích âm không đổi nhờ khung phosphate của mình, và vì thế chỉ dịch chuyển hướng đến cực...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Giáo trình CÔNG NGHỆ DNA TÁI TỔ HỢP - Chương 2

Chương 2 di gel I. Nguyên lý chung được dùng để phân tách và một đôi khi để tinh sạch đại -đặc biệt là các protein và acid- kích thước/ và cấu hình , . Khi các phân tử tích điện được đặt trong một điện trường, chúng sẽ dịch chuyển hướng đến cực dương (+) hoặc cực âm (-) tùy theo điện tích của chúng. Ngược với protein, loại phân tử có điện tích thực hoặc dương hoặc âm, các nucleic acid có một điện tích âm không đổi nhờ khung phosphate của mình, và vì thế chỉ dịch chuyển hướng đến cực dương. Các phân tử protein và nucleic acid có thể được chạy điện di trên một khuôn đỡ (support matrix) như giấy, cellulose acetate, gel tinh bột, agarose hoặc polyacrylamide gel. Trong đó gel của agarose và polyacrylamide được sử dụng phổ biến nhất. Thông thường, gel là một khuôn đúc dạng phiến mỏng có các giếng để nạp (loading) mẫu. Gel được ngâm trong đệm điện di cung cấp các ion để dẫn truyền dòng điện và một vài loại đệm để duy trì pH ở một giá trị không đổi tương đối. I Agarose (polysaccharide) có khối lượng phân tử xấp xỉ 120.000 Da (Hình 2.1) là một trong hai thành phần chính của agar1 chiếm khoảng 70%, phần kia là agaropectin chiếm khoảng 30%. Agarose là một polymer mạch thẳng không bị sulphate hóa chứa hai gốc xen kẽ nhau là D-galactose và 3,6- anhydro-L-galactose. Agarose gel là một chất trong suốt (transparent) hoặc trong mờ (transluent) giống như agar, được tạo thành khi hỗn hợp agarose và nước (hoặc đệm điện di) được đun nóng tới >100oC và sau đó được làm lạnh; dạng gel xuất hiện ở khoảng 40-45oC. Agarose gel được ứng dụng rộng rãi để làm giá thể cho các nucleic acid trong kỹ thuật điện di ngang 1 Agar: một galactan phức hợp tách chiết từ một số loài tảo đỏ như Gelidium và Gracilaria spp., được sử dụng rộng rãi ở dạng gel làm giá thể rắn hoặc bán rắn cho môi trường nuôi cấy vi sinh vật và thực vật. Công nghệ DNA tái tổ hợp 24
(horizontal electrophoresis) hoặc làm giá thể cho môi trường nuôi cấy bacteriophage (top agarose). AGAROBIOSE MONOMER O CH2 OH CH2OH O OH O O OH O Hình 2.1. Cấu trúc phân tử của agarose. Đơn vị agarobiose (ví dụ: hai phân tử đường) là một monomer trong agarose polymer. Có khoảng 400 monomer trên một chuỗi polymer. phân tử nucleic acid c , (EtBr) và (ultraviolet-UV). : - Ước lượng kích thước của các phân tử DNA sau khi thực hiện phản ứng cắt hạn chế (ví dụ: lập bản đồ hạn chế của DNA được tạo dòng…). - Phân tích các sản phẩm PCR (ví dụ: trong chẩn đoán di truyền phân tử hoặc in dấu di truyền…). - Phân tách DNA hệ gen đã được cắt hạn chế trước khi thẩm tích Southern, hoặc RNA trước khi thẩm tích Northern. Ưu điểm của phương pháp này là gel được rót dễ dàng, không gây biến tính mẫu, và bền vững vật lý hơn polyacrylamide. Mẫu cũng dễ thu hồi. Nhược điểm là agarose gel có thể bị nóng chảy trong quá trình điện di, đệm có thể bị tiêu hao, và các dạng khác nhau của nucleic acid có thể chạy không ổn định. Công nghệ DNA tái tổ hợp 25
yếu tố khối lượng 2.2). Do đó, 10 các phân tử DNA có kích thước càng lớn (khối lượng phân tử lớn) thì tốc độ dịch chuyển càng chậm. đệm: 0,5 x TBE – 0,5 μg/mL EtBr điện di: 1 V/cm trong 16 giờ 5 Log10 của các cặp nucleotide 4 0,5% 0,7% 3 0,9% 1,2% 1,4% 2 1 2 3 4 5 6 2.2 ( ( : log   log o  K r Trong đó Công nghệ DNA tái tổ hợp 26
o . Kr . 2.1). Nồng độ agarose cao có khả năng phân tách các đoạn DNA nhỏ, trong khi đó nồng độ agarose thấp lại cho phép phân tách các đoạn DNA lớn hơn. ng agarose gel (%) trong gel 0,3 60-5 0,6 20-1 0,7 10-0,8 0,9 7-0,5 1,2 6-0,4 1,5 4-0,2 2,0 3-0,1 Hình 2.3 minh họa sự dịch chuyển của tập hợp các đoạn DNA trong hai mẫu ở ba nồng độ khác nhau của agarose, tất cả chúng ở trong một khay gel và được điện di ở cùng một điện áp (voltage) trong một thời gian xác định. Kết quả cho thấy, các đoạn lớn được phân tách tốt hơn ở gel 1%, trong khi các đoạn nhỏ thích hợp với gel 2%. Công nghệ DNA tái tổ hợp 27
A B C 1 2 1 2 1 2 Hình 2.3. Điện di các mẫu DNA giống nhau ở các nồng độ agarose khác nhau. A: 1%, B: 1,5% và C: 2%. - - - . Nhìn chung, DNA của các plasmid mạch vòng dịch chuyển nhanh hơn DNA của plasmid cùng loại nhưng có dạng mạch thẳng. Hầu hết plasmid mạch vòng chứa ít nhất hai dạng DNA có cấu trúc không gian khác nhau là dạng vòng đóng (siêu xoắn) và vòng đứt. Hình 2.4 minh họa kết quả điện di với plasmid mạch vòng bên trái và plasmid cùng loại mạch thẳng ở bên phải. Dạng vòng đứt Dạng vòng đóng DNA mạch vòng DNA mạch thẳng Hình 2.4. Điện di các plasmid có cấu hình khác nhau Công nghệ DNA tái tổ hợp 28
4oC đến 30o . thường được dùng Tr - - - - - - - . Các đoạn DNA sẽ dịch chuyển với các tốc độ hơi khác nhau một chút trong ba loại đệm trên do sự khác nhau về cường lực ion của đệm. Đệm không những thiết lập một giá trị pH, mà còn cung cấp các ion để hỗ trợ cho độ dẫn (conductivity). Nếu chúng ta dùng nước thay vì là đệm trong quá trình điện di, thì sẽ không có sự dịch chuyển cần thiết của DNA trong gel. Ngược lại, nếu sử dụng đệm nồng độ đậm đặc (ví dụ: dung dịch stock ×10), thì nhiệt độ trong gel có thể tăng cao và làm nóng chảy nó. -- t - - -- . Công nghệ DNA tái tổ hợp 29
) (50) TAE 0,04 M Tris-acetate 0,002 M EDTA 242 g Tris base 57,1 mL acetic acid băng 100 mL EDTA 0,5 M (pH 8) (10) TPE 0,08 M Tris-phosphate 0,008 M EDTA 108 g Tris base 15,5 mL H3PO4 85% (1,679 g/mL) 40 mL EDTA 0,5 M (pH 8) (5) TBE 0,089 M Tris-borate 0,002 M EDTA 54 g Tris base 27,5 g boric acid 20 mL EDTA 0,5 M (pH 8) không cao. Sau khi nhuộm, EtBr sẽ xen vào giữa các base của nucleic acid và cho phép phát hiện dễ dàng chúng ở trong gel. (0,5  agarose gel để phản ứng nhuộm xảy ra trong suốt quá trình điện di điện di chạy điện di hoặc RNA Công nghệ DNA tái tổ hợp 30
2 (0,5  . . Vì thế, gây . sulphate hoạt tính (RE, ligase, kinase, polym khối lượng < , khi khối lượng ). Có nhiều phương pháp thu hồi và tinh sạch DNA từ agarose gel, dưới đây là một vài phương pháp chính: 2.4.1. Dùng agarose có nhiệt độ nóng chảy thấp (low melting temperature) Mẫu agarose gel có nhiệt độ nóng chảy thấp chứa đoạn DNA quan tâm được cắt ra khỏi bản gel và cho vào trong đệm với tỷ lệ 1:1, bổ sung muối đến nồng độ 0,5 M, sau đó được nóng chảy ở 70oC để hòa tan hoàn toàn trong đệm. Dung dịch gel có DNA được chiết bằng phenol/chloroform và kết tủa. Lưu ý DNA được tách chiết bằng phương pháp này không thích hợp cho mọi phương thức thao tác tiếp theo, do sự hiện diện của các nhân tố ức chế trong agarose. 2.4.2. Ly tâm Mẫu agarose gel có chứa băng DNA quan tâm được cắt ra và cho vào đệm chiết, làm nóng để hòa tan hoàn toàn, sau đó cho dung dịch gel lên trên một lớp (màng) bông thủy tinh đã silicon hóa đặt trong một cột lọc nhỏ loại Công nghệ DNA tái tổ hợp 31
0,5 mL (còn gọi là spin column). Cột này được cho vào một tube vi ly tâm loại 1,5 mL và được ly tâm ở tốc độ cao 10.000-15.000 rpm trong 10-15 phút. DNA sẽ liên kết với màng còn dung dịch đệm sẽ đi qua lớp bông thủy tinh vào tube vi ly tâm. Cho đệm rửa vào cột và rửa cột vài lần bằng cách ly tâm nhanh. Thay tube vi ly tâm mới, cho đệm hòa tan DNA vào cột và ly tâm để dung ly (elution) DNA ra khỏi màng vào tube. Dung dịch DNA thu được có thể được tinh sạch thêm nếu cần. Cũng có thể đông lạnh mẫu gel trước khi dùng phương pháp ly tâm để cải thiện hiệu suất thu hồi DNA. 2.4.3. Điện di vào bẫy Một cái rãnh nhỏ được cắt trong agarose gel ngay phía trước của băng DNA quan tâm. Rãnh này được làm đầy bằng glycerol và gel được điện di nhanh trở lại để chuyển DNA từ gel vào trong dung dịch glycerol (quá trình điện di có thể được kiểm soát bằng UV). Dung dịch glycerol-DNA sau đó được chiết bằng pipette. Hoặc sau khi điện di, một khe nhỏ được cắt trong gel ngay phía trước băng DNA quan tâm và đặt trong khe một mẫu giấy loại NA-45. Gel sau đó được điện di trở lại và băng DNA quan tâm sẽ dịch chuyển vào trong mẫu giấy. Mẫu giấy sau đó được rửa và DNA được dung ly trong đệm bằng cách đun nóng mẫu giấy tới 70oC. DNA sau đó có thể được tách chiết bằng phenol và kết tủa. 2.4.4. Dùng hạt thủy tinh Mẫu gel quan tâm được hòa tan trong dung dịch muối NaI (một loại chaotropic salt) ở nồng độ khoảng 4 M. Các hạt thủy tinh sau đó được bổ sung vào dung dịch để liên kết hiệu quả với các đoạn DNA được phóng thích ở nồng độ đã cho của NaI. RNA, protein và các tạp chất khác không liên kết với các hạt thủy tinh. Tiếp theo là các chu kỳ rửa và kết tủa tiểu thể, DNA tinh sạch được dung ly khỏi hạt thủy tinh trong đệm muối thấp. Tuy nhiên, phương pháp này mặc dù nhanh và hiệu quả nhưng lại có phạm vi tối ưu hẹp. Thu hồi các đoạn DNA nhỏ (500-800 bp) là không hiệu quả lắm và các đoạn lớn (>15 kb) có thể liên kết với các hạt thủy tinh khác nhau và các sợi DNA có thể bị phá vỡ trong suốt các chu kỳ rửa. Công nghệ DNA tái tổ hợp 32
0,5 Cho 1% type- - 100 mL 60o - . : DNA (1 g/1 µL) 1 L 1 L (10 loading dye) 9 L Nước 11 L Tổng số 11 L . Lưu ý  m . 0,5 g micropipette loại 20-200  đen. Khi tăng điện áp của quá trình điện di, các đoạn DNA lớn thường dịch chuyển nhanh hơn so với các đoạn nhỏ. Tuy nhiên, để có độ phân giải (resolution) tốt nhất đối với các đoạn DNA có kích thước lớn hơn 2 kb thì đ áp chứ (Hình 2.5). 0,5  - Công nghệ DNA tái tổ hợp 33
- o 4 . Dung dịch agarose gel Lược Vị trí gắn lược Giếng Băng dính c. Lược được gắn trong a. Khuôn đổ gel b. Đổ agarose gel vào khuôn khuôn gel Nguồn điện di Micropipette Cable Đệm điện di Nắp Buồng điện di d. Nạp mẫu DNA vào giếng e. Chạy điện di Hình 2.5. Sơ đồ minh họa các bước trong quá trình điện di agarose gel ( = 302 nm) (Hình 2.6) để phân tích và lưu trữ hình ảnh DNA (Gel Documentation System). . Công nghệ DNA tái tổ hợp 34
Giếng Chiều dịch chuyển của DNA 1 2 3 SM Hình 2.6. Hình ảnh điện di DNA chạy trên agarose gel 1%, 3 Volts/cm và nhuộm bằng EtBr. Các băng DNA có màu sáng. SM: Chuẩn kích thước của DNA (1 kb ladder). Các đường 1, 2 và 3: mẫu plasmid DNA được cắt bằng 3 enzyme hạn chế khác nhau. I : CH2 = CH – C – NH2 O (N,N,N’,N’-tetramethylethylene- persulphate . Khi bisacrylamide ( N,N’- - . 20%). Công nghệ DNA tái tổ hợp 35
Ngoài protein, polyacrylamide gel cũng được dùng để điện di DNA (kể cả RNA và DNA/RNA) . Gel ph (gel spacers) (Hình 2.7 - . Mẫu Đệm điện di Giếng cathode Khung kính giữ gel anode Đệm điện di Hình 2.7. Sơ đồ và hình ảnh của buồng điện di polyacrylamide gel Phạm vi kích thước phân tử và độ phân giải của quá trình phân tách tùy thuộc vào nồng độ của acrylamide và bis-acrylamide (và tỷ lệ của chúng) do chúng tạo ra khuôn gel với các phần trăm khác nhau của acrylamide và bậc của liên kết chéo. Nồng độ thấp tạo ra các lỗ có kích thước lớn hơn và vì thế có thể phân tách các phân tử lớn hơn. Liên kết chéo của các monomer và các tác nhân liên kết có thể được điều chỉnh để kiểm soát mức độ xốp của khuôn gel. Điều này cho phép tối ưu hóa một khuôn gel để phân tách một phạm vi kích thước đặc biệt của các phân tử protein. 1. Điện di nucleic acid Điện di p á từ 5-2.000 bp. Nồng độ polyacrylamide gel được Công nghệ DNA tái tổ hợp 36
sử dụng trong khoảng - DNA quan tâm. H : - tách . bằng urea và formamide (sequencing - gel) tách . Phần này chỉ giới thiệu polyacrylamide gel không biến tính là loại gel hay được sử dụng nhất. tách DNA trong loại gel này 2.3), kích thước và điện tích vào (B của DNA. tách DNA trong polyac Acrylamide (% w/v) ch (nucleotide) 3,5 1.000-2.000 5,0 80-500 8,0 60-400 12,0 40-200 15,0 25-150 20,0 6-100 1. 20 cm - DNA (>1  : 1.1.1. : Công nghệ DNA tái tổ hợp 37
- -acrylamide) - 1 TBE - 10% ammonium persulphate 1. silicon lúc . để 1. miếng đệm 2.4). 35  1. . 3,5% 5,0% 8,0% 12,0% 20,0% 30% acrylamide 11,6 16,6 26,6 40,0 66,6 -acrylamide) 67,6 62,7 52,7 39,3 12,7 5 TBE 20,0 20,0 20,0 20,0 20,0 10% ammonium persulphate 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 1. . , rút lược 1.1.6. Sau Công nghệ DNA tái tổ hợp 38
1 Pasteur pipette 1 TBE. 6 gel- 1. . . 1. 1. thidium bromide (0,5 g/mL EtBr trong 1 - . Sau đó l ultraviolet transilluminator (Gel Documentation System nh. 1.2.2. Nhuộm bằng thuốc nhuộm bạc Thuốc nhuộm bạc được sử dụng từ những năm 1980, cho phép phát hiện một lượng protein rất nhỏ ở dạng vết trong polyacrylamide gel. Sau đó, loại thuốc nhuộm này được hoàn thiện và mở rộng phạm vi ứng dụng cho các phân tử nucleic acid. Hai phương pháp nhuộm bạc thường được sử dụng là: 1) Dùng các dung dịch diamine silver hoặc ammonical silver cho thấm vào gel và pha loãng các dung dịch acid của formaldehyde để phát triển hình ảnh. 2) Thấm dung dịch silver nitrate vào gel trong môi trường acid yếu và dùng formaldehyde khử có chọn lọc các ion bạc thành bạc kim loại dưới điều kiện kiềm. Nhìn chung, phương pháp diamine kiềm kém nhạy hơn Công nghệ DNA tái tổ hợp 39
nhưng thích hợp đối với các gel dày, trong khi phương pháp acid nhanh và bắt màu tốt hơn đối với các gel mỏng. Thuốc nhuộm bạc được sử dụng hiệu quả để phát hiện một lượng nhỏ (picogram, pg) nucleic acid. Giới hạn phát hiện DNA sợi đôi khi quan sát bằng mắt thường là vào khoảng 1 pg/mm2 mặt cắt ngang của băng DNA, nhạy gấp 1.000-10.000 lần phương pháp nhuộm bằng EtBr. Mức độ phát hiện này có thể so sánh với phương pháp đánh dấu đồng vị phóng xạ hoặc huỳnh quang. Quá trình nhuộm bao gồm các bước sau: - Cố định nucleic acid trong acetic acid 7,5% tối thiểu 5 phút để ngăn cản sự khuếch tán của các phân tử nucleic acid đã được phân tách trong gel, loại bỏ và trung hòa các hóa chất không mong muốn (urea và đệm). - Rửa gel trong nước khử ion tối thiểu 2 phút để loại bỏ acetic acid, các chất bẩn dạng vết và phần thừa của các thành phần gel hòa tan sau khi cố định. - Nhuộm gel trong dung dịch bạc với sự có mặt của formaldehyde để cải thiện độ nhạy và độ tương phản. Thời gian nhuộm tối ưu khoảng 20 phút. Tuy nhiên, đối với loại gel có tấm đỡ polyester (8×10 cm) thì chỉ cần 10 phút là đủ để có chất lượng hình ảnh cao mà không làm giảm độ nhạy. - Rửa gel sau khi nhuộm bạc để loại bỏ thuốc nhuộm thừa có thể gây ra kết tủa màu nâu trong quá trình phát triển màu. Thông thường, có thể dùng dung dịch phát triển màu để rửa gel. - Phát triển màu của gel bằng hỗn hợp dung dịch sodium carbonate (4g/L), sodium thiosulfate (4 µM) và formaldehyde (khoảng 0,028-0,111%) để giảm các background không đặc hiệu một cách hiệu quả. Nhiệt độ rửa thích hợp từ 8-10oC, thời gian rửa thay đổi tùy thuộc vào thành phần của dung dịch phát triển màu trong khoảng từ vài giây đến vài phút. - Dừng phản ứng phát triển màu khi thu được hình ảnh tối ưu càng nhanh càng tốt bằng cách dùng acetic acid lạnh (4oC) 7,5%. 1.2.3 +K . Nếu chỉ muốn quan sát kết quả điện di thì có thể tiến hành nhanh như sau: Công nghệ DNA tái tổ hợp 40
- . - - o -70 . + . - . - . (sấy o ở 80 C trong điều kiện chân không từ 1-2 giờ)  35 dấu 32 ) (Hình 2.8). 1. ép và ngâm” (crush and soak) polyacrylamide gel không biến biến tính (1977): - .X . - . Công nghệ DNA tái tổ hợp 41
- -tube (eppendorf tube) . - 1-2 th (0,5 M ammonium acetate, 10 mM magnesium acetate, 1 -tube. 37o - (< - - . Hình 2.8. Hình ảnh điện di DNA có đánh dấu 32P trên polyacrylamide gel ở phim X-quang 4o - - . - - hai i nhau. o - hai 4 4oC. Công nghệ DNA tái tổ hợp 42
200 L 25 L - Hòa t 3 M sodium acet hai . - hòa 10 L. - 10 L 2 L - . 2. Điện di protein 2.1. Điện di SDS-PAGE 2.1.1. Phương thức Điện di trên polyacrylamide gel với sự có mặt của SDS (sodium dodecyl sulfate) là kỹ thuật dùng trong hóa sinh, di truyền và sinh học phân tử để phân tách các protein theo tính linh động điện di của chúng (phụ thuộc vào chiều dài của chuỗi polypeptide hoặc khối lượng phân tử, cấu hình (xoắn) của protein, các biến đổi hậu dịch mã và các nhân tố khác). Điện SDS cho phép phân ly các phân tử protein có khối lượng khác nhau. SDS có điện tích âm rất lớn và có khả năng liên kết với mạch peptide để biến tính các cấu trúc bậc hai và bậc ba (không liên kết bằng cầu disulfide) của protein bằng cách bọc xung quanh khung polypeptide. Như vậy, số lượng SDS tương tác với protein tỷ lệ với khối lượng/kích thước phân tử protein và điện tích của SDS bám vào có thể làm bất cứ phân tử protein nào cũng chuyển động trong điện trường từ cực âm (-) sang cực dương (+). Do đó, bằng phương pháp điện di, có thể phân tách riêng biệt các phân tử protein có khối lượng phân tử khác nhau. Không có SDS, các protein khác nhau có khối lượng phân tử tương tự sẽ dịch chuyển khác nhau do sự khác nhau về cuộn xoắn, bởi vì những khác nhau trong các kiểu cuộn xoắn sẽ làm cho một vài phân tử protein thích hợp tốt hơn với khuôn gel so với những phân tử protein khác. Bổ sung SDS giúp giải quyết vấn đề này, vì nó làm cho các phân tử protein trở thành mạch thẳng sao cho chúng có thể phân tách hoàn toàn theo khối lượng phân tử Công nghệ DNA tái tổ hợp 43