Giáo trình Thực hành Di truyền học thực vật: Phần 1

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:57

Thêm vào BST

Báo xấu

41
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Giáo trình Thực hành Di truyền học thực vật có nội dung gồm 3 phần và 8 bài thực hành. Phần 1 là phần A của giáo trình - Cơ sở tế bào của tính di truyền gồm 4 bài học như nguyên tắc và kỹ thuật chuẩn bị tiêu bản hiển vi, phương pháp làm tiêu bản nén tạm thời, phương pháp làm tiêu bản phấn hoa, xác định sức sống của phôi và hạt phấn.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Giáo trình Thực hành Di truyền học thực vật: Phần 1

ii
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Nguyễn Thanh Tuấn GIÁO TRÌNH THỰC HÀNH DI TRUYỀN HỌC THỰC VẬT NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP – 2018 i
LỜI NÓI ĐẦU Giáo trình thực hành Di truyền học thực vật đƣợc biên soạn để sử dụng làm tài liệu học tập cho sinh viên các chuyên ngành: Chọn giống cây trồng, Bảo vệ thực vật, Khoa học cây trồng, Khoa học cây dƣợc liệu, Nông nghiệp, Rau hoa quả và Cảnh quan của khoa Nông học. Đồng thời giáo trình cũng có thể đƣợc dùng cho một số chuyên ngành khác của các Khoa thuộc Học viện Nông nghiệp Việt Nam nhƣ: Công nghệ sinh học, Sƣ phạm kỹ thuật nông nghiệp… Mục đích của các bài thực hành là cung cấp cho sinh viên các phƣơng pháp thực hiện mẫu để quan sát dƣới kính hiển vi một số hiện tƣợng di truyền cơ bản, giúp sinh viên củng cố những kiến thức cơ bản trong học phần lý thuyết Di truyền thực vật đại cƣơng. Vì vậy, sinh viên cần phải xem kỹ phần cơ sở lý thuyết và phƣơng pháp thực hành trƣớc khi thực tập, đồng thời, cần nắm vững những thao tác trong phòng thí nghiệm đã đƣợc giảng dạy trong các học phần đại cƣơng và cơ sở có liên quan nhƣ phƣơng pháp sử dụng kính hiển vi, thao tác sử dụng dụng cụ và hóa chất, nguyên tắc an toàn vệ sinh trong phòng thí nghiệm. Giáo trình thực hành Di truyền học thực vật đƣợc bố cục với 3 phần: Phần A. Cơ sở tế bào học của tính di truyền; Phần B. Các quy luật di truyền và biến dị; Phần C. Gây đột biến nhân tạo và di truyền quần thể. Trong đó, các bài thực hành bao gồm: Bài 1. Phƣơng pháp chuẩn bị tiêu bản hiển vi; Bài 2. Phƣơng pháp làm tiêu bản nén tạm thời, nghiên cứu các pha nguyên phân và bộ nhiễm sắc thể của loài; Bài 3. Phƣơng pháp làm tiêu bản phấn hoa, nghiên cứu các pha giảm phân và đôi nhiễm sắc thể tiếp hợp; Bài 4. Xác định sức sống và độ hữu dục của hạt phấn; Bài 5. Phân tích di truyền tính trạng chất lƣợng; Bài 6. Phân tích di truyền liên kết, trao đổi chéo và thiết lập bản đồ di truyền; Bài 7. Phƣơng pháp gây tạo và phát hiện đột biến ở thực vật; Bài 8. Di truyền quần thể. Giáo trình đã đƣợc biên soạn và cập nhật những kiến thức mới nhất về di truyền. Tuy nhiên, do là lần đầu đƣợc biên soạn nên nội dung cuốn sách khó tránh khỏi những khiếm khuyết, rất mong nhận đƣợc những ý kiến quý báu của các nhà khoa học, ngƣời học và độc giả để giáo trình hoàn thiện hơn ở những lần tái bản sau này. iii
Tác giả xin chân thành cảm ơn GS.TS. Trần Tú Ngà cùng các nhà khoa học đã tham gia phản biện, thẩm định cuốn giáo trình, đặc biệt là PGS.TS. Nguyễn Hồng Minh đã đóng góp những ý kiến quý báu để cuốn giáo trình đƣợc hoàn thiện. Cũng xin gửi lời cảm ơn tới tập thể các nhà khoa học đã giúp đỡ và cho phép tác giả đƣợc sử dụng các tài liệu cho tham khảo cho cuốn sách. Cuối cùng xin chân thành cảm ơn Bộ môn Di truyền và Chọn giống cây trồng, Khoa Nông học, Nhà xuất bản Học viện Nông nghiệp cũng nhƣ lãnh đạo Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã hỗ trợ để giáo trình đƣợc xuất bản. Xin trân trọng cảm ơn! TÁC GIẢ TS. NGUYỄN THANH TUẤN iv
MỤC LỤC PHẦN A - CƠ SỞ TẾ BÀO CỦA TÍNH DI TRUYỀN ............................................. 1 Bài 1. NGUYÊN TẮC VÀ KỸ THUẬT CHUẨN BỊ TIÊU BẢN HIỂN VI ..................... 1 1.1. Chọn đối tƣợng và chuẩn bị mẫu cố định ............................................................... 1 1.2. Cố định mẫu vật ...................................................................................................... 3 1.3. Rửa và đúc khối parafin .......................................................................................... 9 1.4. Cắt, ép vật liệu ...................................................................................................... 10 1.5. Nhuộm tiêu bản..................................................................................................... 11 1.6. Nguyên tắc và phƣơng pháp chuẩn bị tiêu bản nén .............................................. 14 1.7. Chuyển tiêu bản tạm thời thành tiêu bản cố định ................................................. 16 Bài 2. PHƢƠNG PHÁP LÀM TIÊU BẢN NÉN TẠM THỜI, NGHIÊN CỨU CÁC PHA CỦA NGUYÊN PHÂN VÀ BỘ NHIỄM SẮC THỂ CỦA LOÀI.................................... 18 2.1. Nguyên phân (phân chia nguyên nhiễm) .............................................................. 18 2.2. Các bƣớc làm tiêu bản nén tạm thời, quan sát các pha của nguyên phân và đếm số lƣợng nhiễm sắc thể ..................................................................................................... 26 Bài 3. PHƢƠNG PHÁP LÀM TIÊU BẢN PHẤN HOA, NGHIÊN CỨU CÁC PHA CỦA GIẢM PHÂN VÀ ĐÔI NHIỄM SẮC THỂ TIẾP HỢP ................................................... 33 3.1. Giảm phân (phân chia giảm nhiễm) ...................................................................... 33 3.2. Các bƣớc làm tiêu bản phấn hoa và quan sát các pha của giảm phân................... 38 YÊU CẦU ĐỐI VỚI SINH VIÊN ............................................................................... 42 Bài 4. XÁC ĐỊNH SỨC SỐNG CỦA PHÔI VÀ CỦA HẠT PHẤN ............................... 43 4.1. Đặc điểm, sức sống và sự nảy mầm của hạt phấn................................................. 43 4.2. Phƣơng pháp xác định sức sống của phôi và của hạt phấn ....................................... 44 PHẦN B - QUY LUẬT DI TRUYỀN CỦA TÍNH TRẠNG .................................. 51 Bài 5. PHÂN TÍCH DI TRUYỀN TÍNH TRẠNG CHẤT LƢỢNG ................................ 51 5.1. Phƣơng pháp và nguyên tắc phân tích di truyền ................................................... 51 5.2. Các quy luật di truyền ........................................................................................... 56 5.3. Thực hành phân tích di truyền các tính trạng........................................................ 79 YÊU CẦU ĐỐI VỚI SINH VIÊN ............................................................................... 90 Bài 6. PHÂN TÍCH DI TRUYỀN LIÊN KẾT, TRAO ĐỔI CHÉO VÀ THIẾT LẬP BẢN ĐỒ DI TRUYỀN ..................................................................................................... 91 6.1. Đặc điểm của di truyền liên kết gen và xác định tần số trao đổi chéo .................. 91 6.2. Thực hành phân tích di truyền liên kết gen và thiết lập bản đồ di truyền .......... 106 v
YÊU CẦU ĐỐI VỚI SINH VIÊN ............................................................................. 122 PHẦN C - GÂY ĐỘT BIẾN NHÂN TẠO VÀ DI TRUYỀN QUẦN THỂ .. 123 Bài 7. PHƢƠNG PHÁP GÂY TẠO VÀ PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN Ở THỰC VẬT ...... 123 7.1. Các phƣơng pháp xử lý đột biến ở thực vật ................................................. 123 7.2. Phát hiện và phân tích các biến dị ở các thế hệ ........................................... 128 7.3. Phân lập các dạng đột biến hình thái ở thực vật .......................................... 134 YÊU CẦU ĐỐI VỚI SINH VIÊN ............................................................................. 136 Bài 8. DI TRUYỀN QUẦN THỂ ................................................................................... 137 8.1. Cấu trúc di truyền của quần thể ..................................................................... 137 8.2. Thực hành phân tích di truyền quần thể ....................................................... 156 YÊU CẦU ĐỐI VỚI SINH VIÊN ............................................................................. 163 TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................. 164 PHỤ LỤC ....................................................................................................................... 167 vi
PHẦN A - CƠ SỞ TẾ BÀO CỦA TÍNH DI TRUYỀN Bài 1. NGUYÊN TẮC VÀ KỸ THUẬT CHUẨN BỊ TIÊU BẢN HIỂN VI Nghiên cứu tế bào không thể tách rời việc chuẩn bị các tiêu bản hiển vi. Muốn khảo sát hình thái, cấu tạo và các thành phần của tế bào, khảo sát và đếm số lượng nhiễm sắc thể, nghiên cứu quá trình giao phối của các giao tử trong thụ tinh, tìm hiểu quá trình phát triển của ống phấn trong vòi nhụy... phải có những tiêu bản với độ dày từ 10 – 20 µm. Chỉ với những tiêu bản như vậy mới có thể chụp ảnh cấu tạo của tế bào và các thành phần chính của nó. Vì vậy vấn đề cơ bản nhất trong kỹ thuật nghiên cứu tế bào và phôi thai học là kỹ thuật làm tiêu bản hiển vi. Quá trình chuẩn bị tiêu bản gồm các bước chính sau đây: 1) Chọn đối tượng và chuẩn bị mẫu cố định; 2) Cố định mẫu vật; 3) Rửa và đúc khuôn parafin; 4) Cắt, ép vật liệu; 5) Nhuộm tiêu bản. 1.1. CHỌN ĐỐI TƢỢNG VÀ CHUẨN BỊ MẪU CỐ ĐỊNH 1.1.1. Chọn đối tƣợng Khi nghiên cứu tế bào việc đầu tiên là lựa chọn các cơ quan, các mô cần thiết. Ví dụ muốn nghiên cứu phân chia nguyên nhiễm có thể sử dụng các mô phân sinh đầu rễ non, các rễ chính của hạt nảy mầm, đỉnh sinh trƣởng của cây và các lá non là tốt nhất. Thông thƣờng sử dụng các mô ở chóp để nghiên cứu phân chia nguyên nhiễm, vì ở đó tập trung các vùng tế bào phân chia rất mạnh, hình dáng tế bào lại đƣợc định hƣớng thích hợp. Để nghiên cứu hình thái và đếm số lƣợng nhiễm sắc thể trong phân chia giảm nhiễm thƣờng dùng các tế bào mẹ của tiểu bào tử đƣợc cố định sau lúc nhú bông vài ngày. Ở đậu và các loại cây khác thì dùng các nụ hoa nhỏ lúc chƣa có màu đặc trƣng. Nhiều trƣờng hợp sử dụng các bao phấn non, ví dụ ở lúa sẽ cố định các bông mới nhú ra khỏi đòng khoảng một phần năm bông, khi nghiên cứu thì sử dụng các loại hoa ở giữa bông vì các hoa này có độ thành thục tốt, số tế bào mẹ hạt phấn đang bƣớc rộ vào giai đoạn giảm phân. Để các buổi thực hành đạt kết quả tốt cần chọn đối tƣợng đáp ứng những tiêu chuẩn sau: Dễ phá vỡ màng tế bào và màng nhân; 1
Nhiễm sắc thể có kích thƣớc lớn, các nhiễm sắc thể dễ phân biệt với nhau. Càng có nhiều dạng nhiễm sắc thể khác nhau trong bộ nhiễm sắc thể thì càng tốt; Dễ trồng, phổ biến trong thời vụ để tiện việc thu lƣợng mẫu lúc cần thiết. 1.1.2. Chuẩn bị mẫu cố định Sau khi chọn đƣợc mẫu cần thiết để nghiên cứu phải chú ý đảm bảo đúng quy trình chuẩn bị để cố định. Bởi tính chính xác của thí nghiệm phụ thuộc rất nhiều vào điều này. Ví dụ để làm ra các tiêu bản quan sát sự phân chia tế bào ở chóp rễ non, phải tạo điều kiện cực thuận về nhiệt độ, chế độ nƣớc, chế độ ánh sáng cho rễ cây phát triển bình thƣờng. Mặt khác tùy thuộc vào mục đích quan sát của thí nghiệm mà khống chế nhiệt độ, thời gian sinh trƣởng, phát triển của đối tƣợng nghiên cứu khi đƣa cố định. Đối với chóp rễ non, khi quan sát thời gian bắt đầu phân chia nguyên nhiễm đầu tiên thấy rằng, ở cùng một nhiệt độ 23 – 25°C các phân chia nguyên nhiễm đầu tiên của các loại cây khác nhau là không giống nhau: Ở Crepis capillaris (L.) phân chia nguyên nhiễm đầu tiên xảy ra lúc rễ có độ dài 2 – 3 mm, ở Vicia faba (L.) là 12 – 17 mm, ở Nigelladamascena (L.) là 2 – 4 mm, ở Triticum aestivum là 8 – 10 mm, ở hành tây (Allium cepa) là 6 – 12 mm. Nhiều nghiên cứu cho thấy số tế bào phân chia vào các giờ khác nhau trong ngày cũng không giống nhau. Vì vậy để nhận đƣợc kết quả cần phải lƣu ý đến chu kì phân chia nguyên nhiễm để cố định mẫu vật vào từng thời điểm khác nhau tùy theo đối tƣợng và mục đích nghiên cứu. Khi nghiên cứu phân chia nguyên nhiễm và đếm số lƣợng nhiễm sắc thể có thể trồng các đối tƣợng đạt tiêu chuẩn trên trong điều kiện đồng ruộng, ngoài vƣờn trƣờng, trong chậu hoặc trên các đĩa petri, khay men có để giấy thấm. Khống chế nhiệt độ ổn định trong khoảng 23 – 25°C trong tủ ấm hoặc dƣới ánh đèn điện. Sau vài ngày để rễ mọc dài rồi cố định rễ vào những thời điểm có độ dài rễ khác nhau tùy theo từng đối tƣợng. Ví dụ, ở đậu Vicia faba thì phân chia nguyên nhiễm tối đa ở các rễ non dài 1 – 1,5 cm; ở đậu Hà Lan là 1,5 – 2 cm, còn ở rễ hành tây 1,2 – 1,5 cm và ở lúa nƣớc là 0,8 – 1 cm. Ở một số trƣờng hợp nếu hạt quá nhỏ nhƣ hành tây, cà chua, thuốc lá… có thể cố định cả hạt nảy mầm. Cần lƣu ý trƣớc khi cố định các hạt đã nảy mầm cần rửa qua nƣớc lạnh để khử độ chua. Trong thời gian cố định và giữ mẫu vật, nếu thấy nƣớc cố định hay nƣớc giữ mẫu vật vẩn đục phải thay dung dịch ngay. Đối với cây trồng trong chậu, cần phải đảm bảo độ chiếu sáng, độ ẩm, độ tơi xốp của đất, tránh làm ảnh hƣởng đến tốc độ phát triển của hệ rễ. Sau một thời gian nhất định (từ một đến hai tuần), rễ đã mọc đúng kích thƣớc bắt đầu cố định trong điều kiện bóng râm để rễ không bị héo. Trong phòng thí nghiệm, muốn cố định rễ của các thực vật sinh sản bằng thân rễ (căn hành), thân củ, hom, cần đặt chúng trong cát ẩm ở nhiệt độ 25°C hoặc trồng chúng trong dung dịch dinh dƣỡng nhân tạo. 2
1.1.3. Xử lý mẫu vật trƣớc khi cố định Việc xử lý mẫu vật trƣớc khi cố định là khâu quan trọng. Đối với những trƣờng hợp khó đếm nhiễm sắc thể hoặc nhiễm sắc thể quá dài, trƣớc lúc cố định phải xử lý bằng những chất đặc hiệu nhƣ: 8 – oxiquinolin, cloral hydrat, conchixin (colchicine), paradiclorobenzene (băng phiến)… 8 – oxiquinolin có thể dùng để xử lý sơ bộ mẫu nghiên cứu hoặc có thể dùng nhƣ một thành phần của thuộc tính cố định. Ở trƣờng hợp đầu, dung dịch 8 – oxiquinolin pha với nồng độ 0,002M trong điều kiện nhiệt độ 60°C. Khi sử dụng, hạ thấp nhiệt độ xuống khoảng 10 – 14°C, mẫu vật để trong dung dịch đó khoảng 3 giờ, rồi rửa sạch mẫu vật bằng nƣớc cất và chuyển mẫu vào dung dịch cố định. Dùng 0,58 g thuốc 8 – oxiquinolin hòa tan trong 200 ml nƣớc cất ấm. Khi xử lý sơ bộ dung dịch này sẽ làm tăng độ lớn của nhiễm sắc thể lên 1,5 lần mà không làm thay đổi chiều dài nhiễm sắc thể, thậm chí các eo sơ cấp và eo thứ cấp còn hiện hình rõ hơn. Nếu làm lạnh mẫu vật ở 0°C trong thời gian 24 giờ, rồi xử lý 8 – oxiquinolin thì nhiễm sắc thể sẽ co ngắn lại, rất thuận tiện cho việc đếm các nhiễm sắc thể dài. Kagava (1929) đã sử dụng dung dịch cloral hydrat ở nồng độ 0,3 – 1%, ngâm các rễ non vào dung dịch đó khoảng 1 giờ, sau đó, rửa qua nƣớc máy 1 giờ và bỏ vào buồng ấm 2 – 4 giờ, rồi mới cố định. Phƣơng pháp này cũng làm cho các nhiễm sắc thể co ngắn lại. Ngoài ra, trƣớc khi cố định mẫu thƣờng dùng conchixin ở nồng độ thấp 0,01 – 0,05% để xử lý mẫu vật làm ngừng quá trình phân chia nguyên nhiễm, tăng khả năng bắt gặp các tế bào đang bƣớc vào giai đoạn kì giữa. Ví dụ, trƣớc khi cố định, các rễ, các lá non Crepis capillaris (L.) đƣợc ngâm trong dung dịch conchixin có nồng độ nhất định khoảng 2 giờ. Bên cạnh đó có thể sử dụng paradiclorobenzene tinh thể hòa tan trong 500 ml nƣớc cất, để trong bình đậy kín đặt vào tủ ấm ở nhiệt độ 60°C khoảng 10 – 12 giờ. Hạ thấp nhiệt độ dung dịch trên xuống 12 – 16°C rồi xử lý các mẫu vật nghiên cứu trong khoảng 2 – 3 giờ. Cũng có thể sử dụng conchixin kết hợp với việc xử lý bằng hỗn hợp dung dịch paradiclorobenzene đậm đặc và 8 – oxiquinolin 0,02M (tỉ lệ 1:1) để phân tích kiểu nhân (karyotype). Theo kết quả nghiên cứu của một số phòng thí nghiệm trên thế giới cho thấy, nếu làm lạnh đột ngột các tế bào nghiên cứu trƣớc khi cố định trong 24 giờ, ở nhiệt độ – 2°C sẽ có tác dụng làm ngắn rõ rệt nhiễm sắc thể. Một số trƣờng hợp, để nghiên cứu hình thái nhiễm sắc thể, trƣớc lúc cố định sẽ xử lý mẫu vật theo một trong hai phƣơng pháp sau: (1) Đƣa mẫu vật vào dung dịch cumarin (coumarin) 2% trong 2 giờ đồng hồ ở nhiệt độ 12 – 16°C; (2) Dùng hỗn hợp cumarin (coumarin) và 8 – oxiquinolin (theo tỉ lệ 1:1) trong 2 giờ ở nhiệt độ 12 – 16°C. 1.2. CỐ ĐỊNH MẪU VẬT 1.2.1. Các loại chất cố định và tác dụng của chúng Mục đích của việc cố định là giết chết tế bào của mẫu vật sống cần cố định một cách nhanh chóng bằng các chất độc mà vẫn giữ nguyên cấu trúc của nó, tránh các biến 3
đổi khi định hình và không sinh ra cấu trúc giả. Trên thực tế không có chất cố định nào là không làm biến đổi vật sống. Vì thế thƣờng dùng chất cố định kép để mỗi một chất cố định giữ đƣợc một mặt của cấu tạo. Chất cố định có tác dụng đẩy không khí ra, làm vững chắc mô, đông đặc nhanh chóng các thành phần của mẫu vật, tạo điều kiện thuận lợi cho nhuộm màu. Muốn cố định đạt hiệu quả cao thì mẫu vật phải tƣơi, chất cố định phải ngấm nhanh chóng, đều đặn, phải cố định đƣợc từng bộ phận riêng biệt của tế bào. Tùy thuộc vào đối tƣợng và mục đích thí nghiệm mà sử dụng các loại chất cố định khác nhau. Đối với các thí nghiệm tế bào học và phôi thai học thƣờng sử dụng chất cố định nhân của Navaxin, của Carnoy. Muốn cố định tốt các ty thể và lạp thể thì dùng chất cố định của G. A. Levitski. Trong thành phần chất cố định nhân có axit axetic, formalin, clorofom (chloroform), axit formic, cồn… Vì tác dụng một mặt của nó nên thƣờng dùng chất cố định kép, ít khi dùng chất cố định đơn. 1.2.1.1. Tác dụng của một số chất cố định a. Axit axetic Có tác dụng xâm nhập nhanh chóng vào các mô, gây nên sự kết tủa của axit nucleic. Theo G. I. Roskin và L. B Levinson (1967) thì axit axetic giữ tốt hình dạng nhiễm sắc thể nhƣng lại phá hủy thể hạt sợi và tiểu thể gôngi. Có thể dùng axit axetic là một thành phần, hay có thể dùng độc lập nhƣ một chất cố định. b. Axit cromic Axit này ngấm vào mẫu vật không mạnh nhƣng có thể làm đông đặc protein, giữ lại các chi tiết cấu tạo của nhân, của tế bào chất cũng nhƣ thể hạt sợi, tiểu thể gôngi. c. Axit formic Ngấm vào đối tƣợng chậm, đôi khi không đều, nhƣng ít gây biến đổi trong kết cấu của tế bào chất và nhân, dùng axit này có thể cố định các thể hạt sợi. d. Formalin Nhƣ một thành phần của các chất cố định nhân, nó giữ đƣợc cấu trúc tinh vi của tế bào chất, thể hạt sợi v.v… Nhƣng có nhƣợc điểm bắt màu cacmin kém khi cố định bằng chất trên. Các chất cố định đều đƣợc pha trong cồn hoặc trong nƣớc. Các chất cố định pha trong cồn ngấm nhanh vào các mô và giữ đƣợc mẫu vật trong đó từ 30 phút đến 12 giờ. Các chất cố định pha trong nƣớc thì ngấm vào các mô chậm hơn. Tùy thuộc vào mục đích và đối tƣợng nghiên cứu mà chọn chất cố định cho thích hợp. Đối với những nụ hoa nhỏ, rễ non rất bé thì dùng chất cố định pha trong nƣớc. Còn những nụ hoa to, rễ lớn, màng xenluloza dày thì dùng chất cố định pha trong cồn. Đối với những đối tƣợng khó ngấm chất cố định (bao phấn, búp non…) để đạt hiệu quả cao đầu tiên thƣờng xử lý bằng chất cố định pha cồn, sau đó vài phút cố định trong chất cố định pha trong nƣớc. 1.2.1.2. Thành phần của một số chất cố định a. Chất cố định Navaxin (10:4:1) (Уткина, 2001; Барыкина và cs., 2000): Đƣợc dùng để cố định các rễ non và các đối tƣợng nhỏ về phôi thai học. Chất cố định Navaxin 4
tác dụng nhẹ, đặc biệt là giữ tốt cấu trúc của nhân và nhiễm sắc thể. Chất cố định này thâm nhập chậm vào mô, các mẫu phôi lớn (nụ hoa, hoa, noãn...) nên cần phải tách và cắt thành các phần nhỏ. Thời gian cố định 24 giờ trong tối, ở nhiệt độ phòng. Thành phần chất cố định gồm: Axit cromic 1%: 10 phần; Formalin 16: 4 phần; (Formalin ở thị trƣờng là 40%) Axit axetic đậm đặc (98%): 1 phần. Chất cố định đƣợc điều chế ngay trƣớc khi dùng vì thuốc mau hỏng, dễ phân hủy. Dùng chất này cố định những vật mềm rất tốt, nhƣng không nên dùng để cố định những vật lớn và rắn vì nó ngấm rất chậm tiêu bản nói chung. Chất này có tác dụng giữ tốt nhiễm sắc thể. b. Chất cố định Carnoy (6:3:1) (Барыкина và cs., 2000): Là một trong những thuốc đƣợc sử dụng rộng rãi nhất cho việc phân tích tế bào học và phôi thai học. Khi chuẩn bị cho các tiêu bản cắt lát cố định và tiêu bản nén, thời gian cố định từ 2 – 12 giờ (có thể để qua đêm nhƣng đặt trong tủ lạnh). Nếu độ dày của mẫu vật từ 1 – 2 mm thì thời gian cố định khoảng 2 giờ, nếu mẫu vật có độ dày từ 3 – 5 mm, thời gian cố định từ 3 đến 6 giờ. Thành phần chất cố định: Cồn etylic tuyệt đối (100%): 6 phần; (hoặc cồn etylic 96%) Clorofom: 3 phần; Axit axetic: 1 phần. Chất cố định ngấm rất nhanh vào các mẫu vật của hầu hết các đối tƣợng nhƣng vì hoạt động của nó quá mạnh nên chỉ dùng nó để cố định những vật lớn, còn những loại mẫu vật bé và mềm thì ít dùng hỗn hợp này. c. Chất cố định Carnoy biến đổi (3:1) (hay Carnoy axetic hoặc Clarke (3:1)) (Барыкина và cs., 2000): Đƣợc sử dụng trong các nghiên cứu tế bào học và phôi thai học để làm các tiêu bản nén. Có tác dụng giống nhƣ chất cố định Carnoy. Mẫu vật đƣợc cố định từ 2 – 12 giờ, đôi khi có thể để lâu hơn ở nhiệt độ 0 – 3°C. Thành phần chất cố định gồm: Cồn etytic tuyệt đối: 3 phần; (hay cồn etylic 96%) Axit axetic đá: 1 phần. Trong chất cố định Carnoy và Clarke có thể thay axit axetic bằng propionic. Dƣới đây là một số chất cố định theo kiểu đó cho đối tƣợng thực vật: 5
+ Axit propionic: 1 phần; cồn etylic 95%: 3 phần; + Axit propionic: 1 phần; clorofom: 4 phần; cồn etylic tuyệt đối: 3 phần; + Formalin: 1 phần; cồn etylic 95%: 15 phần; axit propionic: 2 phần; + Axit propionic: 100 ml; cồn etylic 95%: 100 ml; sắt hyđroxit: 0,4 g. Ở trƣờng hợp 2 và 3 cứ 10 ml hỗn hợp trên thêm vào vài giọt cacmin trƣớc khi cho mẫu vật vào chất cố định. Chất cố định 3 có tác dụng trong 1 – 2 giờ và đƣợc dùng cho cả đối tƣợng động vật và thực vật. d. Chất cố định Flemming (Барыкина và cs., 2000): Đƣợc dùng để cố định cho các đối tƣợng phôi kích thƣớc nhỏ với độ dày không quá 2 mm. Nó đƣợc xem là chất cố định tốt nhất trong các loại chất cố định đƣợc sử dụng trong công nghệ vi mô. Đặc biệt sử dụng tốt cho nghiên cứu về cấu trúc nhân và nhiễm sắc thể trong quá trình phân chia tế bào. Thành phần chất cố định gồm: Axit cromic 1%: 25 ml; Axit osmic 2%: 5 ml; Axit axetic đá: 10 ml; Nƣớc cất: 60 ml. Mẫu vật đƣợc cố định trong chất này từ 1 – 2 ngày trong bóng tối, sau đó rửa sạch bằng nƣớc máy từ 4 đến 24 giờ rồi đem nhuộm. e. Chất cố định Nyukomera (Нъюкомера) (6:3:1:1:1) (Барыкина và cs., 2000; Пухальский và cs., 2007): Đƣợc sử dụng rộng rãi để nghiên cứu phân chia giảm nhiễm ở các cây ngũ cốc khi làm tiêu bản nén. Cố định các bông non, rễ non trong 24 giờ, ở nhiệt độ phòng, sau đó thay chất cố định mới và cất giữ trong tủ lạnh cho đến khi dùng. Các phần bao phấn của các cây ngũ cốc sau khi cố định đƣợc nhuộm bằng axeto cacmin. Ngoài việc chuyên dùng để cố định các bao phấn chất cố định trên cũng có thể dùng để cố định các rễ con. Thành phần chất cố định gồm: Cồn isopropyl: 6 phần; 6
Axit propionic : 3 phần; Dioxan: 1 phần; Ete petrol: 1 phần; Axeton: 1 phần. 1.2.2. Nguyên tắc cố định Để việc cố định cho kết quả tốt trƣớc khi thực hiện cố định cần chú ý đến một số nguyên tắc chung nhƣ sau: – Chọn chất cố định phải phù hợp với mục đích nghiên cứu. – Thể tích dung dịch chất cố định phải nhiều hơn lƣợng mẫu từ 50 – 100 lần. – Mẫu vật cố định (rễ non, búp hoa) phải tƣơi, phải cố định mẫu ngay chỗ gieo trồng để tránh rễ non lộ ra nắng. – Đối với các mẫu vật lớn thì trƣớc khi cố định phải cắt ra từng phần, loại bỏ những bộ phận không cần thiết (lá, lá dài, râu, gai, v.v…) làm ảnh hƣởng đến sự thấm chất cố định vào mẫu vật nhanh chóng. – Cố định vào thời điểm nào trong ngày cần căn cứ vào từng trƣờng hợp cụ thể. Đối với rễ non thì cố định vào những giờ có phân chia nguyên nhiễm tối đa. Thời gian cố định còn phụ thuộc vào nhiệt độ môi trƣờng trong ngày. Sau khi thực hiện đầy đủ các nguyên tắc trên chuyển sang cố định mẫu vật bằng việc thực hiện các nội dung công việc sau: – Để đảm bảo cho các tế bào phân chia bình thƣờng cần phải tƣới cho cây trồng trong các chậu 1 – 2 giờ trƣớc khi cố định và đặt chậu vào chỗ ẩm, nhiệt độ không khí vào khoảng 23 – 25°C. Nếu gieo hạt trên đĩa petri thì dƣới đáy đĩa cần phải để giấy thấm cho hơi nƣớc bão hòa ở nhiệt độ 24 – 25°C trong tủ ấm 1 – 2 giờ đồng hồ trƣớc lúc cố định. – Phải chuẩn bị sẵn các ống nghiệm có nút bấc và có nhãn bằng giấy để cố định và ghi kí hiệu mẫu vật. Cỡ ống nghiệm lớn hay bé phụ thuộc vào lƣợng mẫu vật cần cố định. Trên các nhãn cần ghi rõ số kí hiệu mẫu, ngày, giờ cố định. – Trong sổ ghi chép về các mẫu cố định phải ăn khớp với đối tƣợng và công thức nghiên cứu có ghi trên các chậu, có lô ở đồng ruộng, hoặc trên các đĩa petri. Ngoài ra trong sổ cần ghi rõ mục đích, phƣơng pháp cố định và những tài liệu cần thiết để xử lí các kết quả thu đƣợc. – Các ống nghiệm sạch đã đƣợc chuẩn bị có nhãn phải đặt đúng theo công thức nghiên cứu để tránh nhầm lẫn. – Chuẩn bị chất cố định: Hỗn hợp Navaxin hoặc Carnoy là 2 chất cố định hay dùng nhất. Ví dụ khi cố định mẫu vật trong dung dịch Navaxin cần tiến hành theo các bƣớc sau: 7
+ Pha axit cromic 1%: Lấy 1 g anhydrit cromic hòa tan trong nƣớc cất và cuối cùng bổ sung nƣớc cất đến 100 ml. + Pha dung dịch formalin 16%: Lấy 16 ml formalin thị trƣờng (40%) đổ thêm nƣớc cất đến 40 ml. + Lúc sử dụng trộn 10 phần axit cromic 1% với 4 phần formalin 16% và 1 phần axit axetic đá. + Đổ 7 – 10 ml dung dịch trên (có thể nhiều hơn tùy thuộc vào lƣợng mẫu cố định) vào ống nghiệm sẽ đựng mẫu vật cố định. Sau đó đƣa mẫu vật vào chất cố định rồi nhanh chóng đem mẫu vật đang cố định vào chỗ tối tránh sự phân hủy chất cố định ngoài ánh sáng. Các chất pha trong cồn có thể chuẩn bị trƣớc một vài giờ, lúc chƣa dùng bảo quản trong tủ lạnh (4°C). + Nếu cây trồng trong chậu cần lật chậu lại, nhanh chóng dùng kéo cắt lấy rễ non và rửa sạch bằng nƣớc lạnh (nƣớc đã đƣợc làm lạnh trong tủ lạnh vài giờ) rồi chuyển ngay vào dung dịch chất cố định, khuấy rễ trong dung dịch chất cố định bằng đũa thủy tinh hay lắc nhẹ. Theo La Cour khi đã cố định đủ số rễ, để lọ đựng mẫu vật dƣới phễu của bơm chân không 2 – 3 phút nhằm khử sạch bọt khí làm giảm bớt khả năng ngấm của thuốc cố định. Cần lưu ý: Sau khi cố định xong, mẫu vật phải đƣợc rửa và làm mất nƣớc. Ví dụ, khi dùng chất cố định Carnoy, Navaxin qua từng thời gian nhất định phải rửa sạch mẫu vật. Dùng chất cố định pha trong nƣớc và trong cồn khác nhau thì việc rửa cũng phải không giống nhau. Sau khi cố định bằng chất cố định pha nƣớc thì rửa mẫu vật dƣới vòi nƣớc từ 1 – 3 giờ cho sạch vết của chất cố định. Các đầu rễ cố định bằng hỗn hợp Navaxin thì sau khi đã rửa phải có màu xanh. Không nên rửa mẫu vật đã cố định lâu trong nƣớc. Vì làm nhƣ vậy khi nhuộm tiêu bản nhiễm sắc thể sẽ bắt màu kém, các mép xung quanh rễ sẽ bị tua ra. Rửa trong nƣớc xong lại tiếp tục làm mất nƣớc mẫu vật dần dần bằng cách cho vào cồn etylic. Để mẫu vật không bị quăn lại phải làm mất nƣớc từ từ. Lẫy mẫu vật đã rửa qua nƣớc cho vào lọ cồn 20% trong 30 phút rồi chuyển chúng lần lƣợt qua cồn 40%, 60% và 80%. Mỗi lần chuyển mẫu vật đƣợc giữ lại ở mỗi nồng độ cồn trên 30 phút. Sau đó giữ mẫu vật trong cồn 80% trong các chai nâu có nút nhám hoặc bằng bần có gắn chặt parafin bảo quản ở điều kiện lạnh. Sau khi cố định bằng chất cố định pha cồn thì rửa mẫu vật 3 lần, mỗi lần 1 – 2 giờ trong cồn 80% cho đến lúc sạch mùi axit axetic. Muốn nhƣ vậy cần phải chuẩn bị ba lọ cồn có cùng một nồng độ, rồi nhanh chóng đƣa mẫu vật đã cố định vào từng lọ cồn kể trên, mỗi lọ để mẫu vật trong đó 1 – 2 giờ. Mẫu vật đã rửa sạch axit axetic có thể cất giữ trong cồn 70% hoặc 80%. Cũng có thể làm mất nƣớc nhanh trong cồn 96% nếu sau đó mẫu vật lại đƣợc xử lý tiếp tục ngay. Để khử sạch nƣớc khỏi mẫu vật đã cố định mà mẫu vật đã để trong cồn 70 – 80%, chỉ việc chuyển chúng 4 lần nữa vào cồn (2 lần trong cồn 96% và 2 lần trong cồn 100%) mỗi lần chuyển khoảng 1 giờ. 8
1.3. RỬA VÀ ĐÚC KHỐI PARAFIN 1.3.1. Rửa mẫu vật Sau khi mẫu vật đã cố định đủ khoảng thời gian cần thiết, cần phải đem rửa mẫu vật thật kỹ để khử hết những phần còn dính lại của chất cố định và những chất này có thể gây nên hiện tƣợng phân hóa trong tế bào, nếu không rửa sạch chất cố định thì có thể gây nên những hậu quả đáng tiếc nhƣ mẫu vật trở nên rắn, dòn, có trƣờng hợp lại bị rữa nát. Nếu chất cố định đƣợc dùng là nƣớc thì phải rửa mẫu vật trong dòng chảy từ 1 – 24 giờ (phụ thuộc vào kích thƣớc của mẫu vật, vào tốc độ dòng nƣớc và nhiệt độ nơi làm thí nghiệm. M. C. Навашин (1936) và La Cour và cs. (1958) cho rằng đối với rễ non thời gian rửa tốt nhất là từ 3 – 4 giờ, nếu để lâu hơn nhiễm sắc thể sẽ nhuộm màu kém hơn và xung quanh nhiễm sắc thể thƣờng bị rữa nát. Việc rửa mẫu vật trong dòng nƣớc chảy có thể thực hiện bằng cách bỏ mẫu vật vào vải màu, rồi lấy dây buộc túm lại hoặc bỏ mẫu vật vào ống nghiệm không đậy, dùng vải màu buộc 2 đầu lại sau đó bỏ vào bình hoặc chậu cho nƣớc chảy vào liên tục. Sau khi rửa chuyển mẫu vật qua cồn (đƣợc chuẩn bị nhiều nồng độ khác nhau 20%, 40%, 60%, 80%, 96%, 100%), vật ngâm trong cồn từ loại nồng độ thấp đến nồng độ cao, cho đến cồn 80%. Giữ mẫu vật trong dung dịch cồn khoảng 30 phút đến 1 giờ. Có thể giữ mẫu vật lâu trong cồn 80% nếu chƣa có điều kiện nghiên cứu ngay, nhƣng muốn vậy phải chú ý thay cồn mới nếu không nồng độ cồn giảm xuống sẽ ảnh hƣởng đến chất lƣợng của mẫu vật. Nếu sau này mẫu vật đƣợc cắt hay ép bằng tay thì quá trình rửa mẫu vật có thể kết thúc ở đây. Nhƣng nếu mẫu vật sẽ phải cất bằng microtome thì quá trình rửa vẫn phải tiếp tục, cụ thể là phải khử hết nƣớc trong mẫu vật bằng cách chuyển mẫu vật ngâm vào trong cồn 96%, cồn 100% rồi sau đó đƣa mẫu vật ngâm vào trong parafin. 1.3.2. Đúc khối parafin Có hai phƣơng pháp đúc khối parafin: + Dùng lƣỡi dao cạo cắt khối parafin thành từng cục nhỏ dạng khối bốn cạnh có mẫu vật ở giữa và gắn lên một đế gỗ có kích thƣớc 1,5 × 2 × 2,5 cm. Trong các khối này mẫu vật phải đƣợc định hƣớng nhất định và xung quanh phải có parafin dày 1 – 2 mm. + Dùng ―phƣơng pháp chôn vùi‖ của M. C. Навашин: Phƣơng pháp này có kết quả khi đúc rễ con và hoa nhỏ, tiến hành qua mấy bƣớc sau: Lấy những thỏi parafin đã đƣợc chuẩn bị từ trƣớc có hình que nhỏ, dài hơ trên ngọn lửa đèn cồn cho nóng chảy rồi nhỏ giọt parafin lỏng lên mặt đế gỗ cũng đã đƣợc hơ nóng trƣớc; Khi nhỏ parafin phải nhỏ vào chính giữa mặt đế gỗ, làm sao cho đƣờng kính của giọt parafin trên đế gỗ là lớn nhất. Tiếp tục nhỏ parafin cho đến khi khối parafin có chiều cao từ 3 – 4 mm. 9
Dùng panh lấy mẫu vật đã đƣợc tẩm parafin (mẫu vật cùng parafin đã đƣợc hơ nóng từ trƣớc trong đĩa petri) đặt vào giữa khối parafin lỏng trên giá gỗ, sau đó nhỏ thêm một vài giọt parafin lỏng nữa cho kín mẫu vật và để nguội sẽ đƣợc khối parafin. Sau khi khối đã cắt gọt xong có thể đƣa lên máy cắt lát. Chú ý: Việc đặt mẫu vật vào giữa khối parafin phải làm thật nhanh để tránh parafin đông đặc lại. Khi đặt xong phải dùng panh hơ nóng sửa lại mẫu vật cho ngay ngắn theo yêu cầu thí nghiệm. Xung quanh mẫu vật, parafin phải lỏng (để gắn chặt mẫu vật vào parafin), trong suốt và đồng nhất để khi cắt không bị vỡ. Khối parafin vừa nhỏ giọt xong đƣợc ngâm vào chậu nƣớc lạnh, sau khi nguội hẳn dùng dao trích hay lƣỡi dao lam gọt xung quanh, chỉ chừa lại khối parafin chứa mẫu vật trong dạng khối chữ nhật hay khối hình thang cân. 1.4. CẮT, ÉP VẬT LIỆU Tế bào có kích thƣớc rất bé (từ 10 – 100 µm). Nếu muốn khảo sát tế bào, cần phải có những lát cắt rất mỏng từ cơ thể sinh vật mình muốn nghiên cứu (từ 4 – 10 µm), trƣờng hợp không có, sẽ không thấy đƣợc những cấu tạo của nó. Muốn có những lát cắt mỏng nhƣ vậy, có thể dùng máy cắt microtome nhƣng muốn cắt đƣợc mẫu vật phải đƣợc đúc trong parafin. Máy cắt có hai loại: Kiểu bàn trƣợt và kiểu quay tay. Phổ biến nhất là máy cắt kiểu bàn trƣợt. Dƣới đây sẽ trình bày trình tự các bƣớc tiến hành khi làm việc với máy cắt lát kiểu bàn trƣợt: Lau sạch bụi và phôi parafin trên máy cắt lát, bôi vazơlin vào bộ phận chuyển động cho trơn. Đặt đèn vào buồng cỏ máy cắt lát để hơ nóng lƣỡi dao và khối parafin trong mùa lạnh. Lƣỡi dao đã mài sắc kiểu mặt bằng. Mặt lõm để thành một góc nghiêng nhất định sao cho mép dao song song với mặt khối parafin và thẳng góc với hƣớng chuyền động. Trong khi cắt phải lau sạch lƣỡi dao bằng giẻ tẩm xylen (xylene). Kẹp chặt giá gỗ có parafin vào bàn kẹp mẫu vật để có thể cắt đƣợc lát cắt ngang hoặc lát cắt dọc. Cẩn thận tiếp cận mép lƣỡi dao với mặt trên của khối parafin. Dùng ốc vi cấp để xác định độ dày của lát cắt tùy theo đối tƣợng và mục đích nghiên cứu. Bắt đầu cắt khối parafin: Nâng giá kẹp mẫu vật ở mặt trƣớc dao lên bằng chiều dài lát cắt. Sau đó kéo bàn trƣợt với cả lƣỡi dao về phía mình sẽ cắt đƣợc một lớp đúng theo yêu cầu. Cứ nhƣ thế cắt tiếp các lát cắt còn lại. Trong quá trình cắt, nếu lƣỡi dao kêu chứng tỏ góc nghiêng của dao chƣa đạt yêu cầu cần phải điều chỉnh lại. Lấy các lát cắt khỏi dao bằng chổi lông mềm và đặt lên đáy mặt đen của hộp dài nhƣng không sâu. Chú ý đặt nhãn vào để không bị lẫn. Sau đó dán các tiêu bản lên lam kính. Sau khi sử dụng cần lau sạch máy cắt lát và bảo quản dao cắt. 10
Ngoài hai loại máy trên hiện nay còn có máy cắt lát đông lạnh dùng khí CO2 để cắt vật tƣơi trực tiếp. Nếu không có máy cắt cũng có thể dùng dao cắt bằng tay, cắt tay cũng có thể đạt đƣợc đến mức độ dày < 10 µm. Ngoài ra đối với những vật bé, mềm (nhƣ rễ hành, tỏi, túi phấn…) có thể ép bằng 2 miếng kính lam hay bằng 1 lamen. Bằng cách này cũng có thể thu đƣợc những tiêu bản rất tốt. 1.5. NHUỘM TIÊU BẢN 1.5.1. Phƣơng pháp pha chế một số loại thuốc nhuộm Các thuốc nhuộm dùng để nhuộm tiêu bản không phải có sẵn mà trƣớc khi dùng phải tiến hành pha chế theo một quy trình nhất định. Dƣới đây là một số loại thuốc nhuộm thông dụng: 1.5.1.1. Pha dung dịch axeto cacmin Axeto cacmin là thuốc nhuộm chính đƣợc sử dụng chủ yếu để nhuộm các cấu trúc của nhân tế bào. Phƣơng pháp phổ biến nhất là lấy 1 g (có thể dùng 2 g hoặc hơn nữa tùy nhu cầu thí nghiệm) cacmin hòa tan vào 45 ml axit axetic đậm đặc và 55 ml nƣớc cất. Tất cả cho vào bình cầu có thiết bị làm nguội. Bình cầu đƣợc đặt trên bếp đun cách thủy trong 30 – 60 phút. Trong trƣờng hợp không có thiết bị làm nguội thì đặt một ống thông lên bình cầu qua một lỗ nhỏ trên nút. Đun xong để nguội và lọc trên phễu giấy lọc. Dung dịch đƣợc lọc xong đổ sang chai nâu đậy nút nhám cho vào tủ lạnh. Cặn cacmin còn thừa lại trên giấy lọc có thể sử dụng lại đƣợc. Nhiều trƣờng hợp thuốc nhuộm cacmin đƣợc chuẩn bị trong cồn etylic có thêm HCl nhƣ sau: Lấy 4 g cacmin hòa tan vào 15 ml nƣớc nóng cho thêm 1 ml HCl. Để nguội rồi đổ vào 95 ml cồn 85% và lọc. 1.5.1.2. Pha dung dịch axeto ocxein (Orcein) Axeto ocxein nhuộm màu rất tốt các cấu trúc nhân của nấm và thực vật bậc cao. Phƣơng pháp pha chế: Hòa 1 g orcein vào 45 ml axit axetic xong rồi làm lạnh. Sau đó cho thêm 55 ml nƣớc cất. Lắc nhẹ, lọc và bảo quản trong lọ nâu có nút nhám. 1.5.1.3. Pha axeto lacmoit Cân 2 g lacmoit, hòa vào 100 ml axit axetic 45% đem đun sôi 2 giờ trong bình cầu có thiết bị ngƣng lạnh. Sau khi bốc hơi cho thêm axit axetic cho đến khối lƣợng ban đầu rồi lọc và bảo quản trong lọ nâu có nút nhám. 1.5.1.4. Pha xanh metylen Xanh metylen hòa tan tốt trong nƣớc, rƣợu và glycerin. Phƣơng pháp pha chế: Lấy 100 – 500 mg xanh metylen hòa vào 100 ml nƣớc cất. Lƣu ý: Khi dùng các loại thuốc nhuộm trên thì mẫu vật đƣợc cố định trong cồn axetic theo tỉ lệ 3:1. 11
1.5.2. Kỹ thuật nhuộm tiêu bản 1.5.2.1. Khử parafin Nếu tiêu bản không có parafin (tiêu bản ép tay hay cắt bằng dao tay) thì có thể đem nhuộm ngay. Còn nếu tiêu bản cắt bằng microtome có đúc vật trong parafin thì trƣớc hết phải khử parafin ra khỏi tiêu bản bằng xylen hay toluen, sau đó rửa sạch xylen hay toluen khỏi tiêu bản bằng cồn, tiếp tục lại rửa sạch cồn khỏi tiêu bản bằng nƣớc cất rồi đem nhuộm. 1.5.2.2. Các phương pháp nhuộm tiêu bản Tính chất, màu sắc và khả năng hoạt động của các loại thuốc dùng để nhuộm tế bào rất khác nhau. Vì vậy muốn có tiêu bản tốt phải tùy theo mục đích nghiên cứu mà lựa chọn thuốc nhuộm. Sau khi nhuộm xong phải rửa lại bằng nƣớc cất và nếu muốn giữ tiêu bản đƣợc lâu phải cố định tiêu bản trong keo canada. a. Nhuộm tiêu bản bằng tím gentian (theo Newton) Phƣơng pháp nhuộm tiêu bản bằng tím genxian là phƣơng pháp nhuộm nhanh, thƣờng đƣợc áp dụng trong các nghiên cứu tế bào học, phôi học và di truyền học. Bằng phƣơng pháp này nhiễm sắc thể đƣợc nhuộm màu tím, còn các thành phần khác hầu nhƣ trong suốt. Trình tự công việc đƣợc tiến hành nhƣ sau: – Nhúng lam kính có các lát cắt vào xylen I (Dimetylbenzen) khoảng 10 – 30 phút, sau đó chuyển sang xylen II (o–Xylen hay 1,2–Dimetylbenzen) trong 5 – 6 phút. – Dùng cồn 96% rửa tiêu bản bằng ống nhỏ giọt, sau đó ngâm tiêu bản trong cồn 96% trong khoảng 10 – 15 phút. – Rửa tiêu bản bằng nƣớc cất trong 3 – 5 phút. – Nhúng vào dung dịch tím gentian 1% (1 g tím geatian nguyên chất pha trong l00 ml nƣớc cất) trong 5 – 15 phút tùy theo đối tƣợng. – Rửa lại trong nƣớc cất khoảng từ 3 – 5 giây. Sau đó nhúng vào dung dịch gồm 1 g iốt và 1 g kali iôđua trong l00 ml cồn 80% (nếu không có cồn dùng nƣớc cất) khoảng 30 phút. – Rửa tiêu bản bằng cồn 96% và ngâm trong khoảng 2 – 3 giây. – Rửa lại bằng cồn 100%, rồi ngâm trong khoảng 2 – 3 giây. Nếu tiêu bản nhiều nƣớc thì có thể để lâu hơn. – Tiến hành phân hóa bằng dầu cẩm chƣớng hoặc cũng có thể phân hóa trong hỗn hợp dầu cẩm chƣớng và xylen theo tỉ lệ 1:1). – Nhúng lam kính có tiêu bản vào xylen III (m–Xylen hay 1,3–Dimetylbenzen) khoảng từ 3 – 5 giây rồi cho vào xylen IV (p–Xylen hay 1,4–Dimetylbenzen) khoảng 3 phút. Phƣơng pháp trên rất thích hợp đối với việc đếm các nhiễm sắc thể dài xếp chồng lên nhau. 12
b. Nhuộm tiêu bản bằng axeto cacmin Theo N.V. Favorski có 2 phƣơng pháp chính: – Phương pháp 1 gồm những bước như sau: Nhỏ 1 – 2 giọt axeto cacmin 3% lên tiêu bản cắt lát đã khử parafin bằng xylen và rửa sạch bằng nƣớc cất trong 3 – 5 phút, kết hợp với việc hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn vài lần. Rửa tiêu bản đã nhuộm bằng nƣớc để loại bỏ axeto cacmin còn lại, rồi phân hóa trong dung dịch amiac thị trƣờng 0,5% dƣới kính hiển vi. Rửa lại tiêu bản trong nƣớc cất 5 phút rồi khử nƣớc trong cồn 90% và 100%. Chuyển tiêu bản qua xylen rồi dán bằng keo Canada. – Phương pháp 2 gồm những bước sau: Các lát cắt sau khi đã khử parafin bằng xylen và rửa sạch bằng nƣớc cất nhƣ phƣơng pháp trên và đƣa mẫu vật nhuộm bằng axeto cacmin trong 5 phút. Rửa mẫu vật đã nhuộm bằng nƣớc cất, rồi chuyển vào dung dịch phèn sắt – amoni 3 – 5% và hơ nóng trên ngọn lửa đèn cồn cho đến lúc bốc hơi. Rửa lại mẫu vật trong nƣớc cất, rồi khử nƣớc trong cồn 90% và 100%. Chuyển tiêu bản vào xylen. Nhiễm sắc thể nhuộm theo phƣơng pháp này thì có màu đen. c. Nhuộm tiêu bản bằng axeto fucxin (fuchsine) Lấy 1 g fucxin basic hòa vào 50 ml axit axetic 40%. Đun nóng dung dịch đến 50 C để fucxin tan ra hết, sau đó làm lạnh đến 25 – 30oC và lọc bằng giấy lọc. Các đối o tƣợng đƣợc cố định trong axit axetic 45% khoảng 10 – 30 phút ở nhiệt độ 15oC, rồi làm mủn trong HCl (1N) khoảng 10 – 30 giây ở nhiệt độ 60°C. Nhuộm mẫu vật bằng axeto fucxin trong các lọ nhỏ có nút đậy kín 1 – 3 giờ. Đối với tiêu bản nén đƣợc chuẩn bị trong axit axetic 30% là hóa chất có khả năng làm sáng tế bào chất. Nhiễm sắc thể trong trƣờng hợp này nhuộm màu tím đậm. d. Nhuộm tiêu bản bằng lacmoit propionic: Thuốc nhuộm lacmoit propionic đƣợc sử dụng để nhuộm các tiêu bản tạm thời của rễ non, bao phấn thực vật. Thành phần của hợp chất này nhƣ sau: 5 g lacmoit cho vào 50 ml axit propionic 50%. Đặt dung dịch này vào chỗ tối khoảng 3 – 5 ngày và thƣờng xuyên lắc đều. Sau đó lọc và dùng để nhuộm nhƣ một dung dịch chuẩn. Cho các đầu rễ dài 2 – 4 mm vào các ống nghiệm đáy bằng đã đựng sẵn 5 – 10 giọt dung dịch chuẩn, ngâm trong 2 giờ. Sau đó chuyển đầu rễ vào 0,5 ml axit propionic 40% và đun sôi từ từ trong khoảng 5 – 30 giây để làm mủn đối tƣợng. Chuyển rễ lên lam kính sạch, nhỏ thêm một giọt axit propionic 40%. Đậy lamen lại và ép nát tiêu bản. Để nâng cao độ tƣơng phản của nhiễm sắc thể cần nghiên cứu trên các tiêu bản đã chuẩn bị trƣớc đó khoảng 30 phút. Nếu nhuộm bằng phƣơng pháp này nhiễm sắc thể có màu nâu. 13